CN1613504A - 亲水亲脂自封闭小体液相核心空化形成囊泡的方法及应用 - Google Patents

Abstract

亲水亲脂两性分子自封闭小体液相核心空化形成囊气泡的方法，它是将成膜材料溶解于氯仿和/或甲醇中，在抽真空状态下，在凝胶态向液晶态相转变温度上喷雾干燥成膜于可生物降解水溶性的微小粉状颗粒载体上；将水溶性微小粉状颗粒装容器内，置真空并封口，在低于凝胶态向液晶态相转变温度下，先后注入一定容积的气体和水性介质，手动震荡至水溶性的微小粉状颗粒溶解，形成液相核心空化的亲水亲脂两性分子自封闭小体囊气泡。本发明成本低廉、安全无毒、采用干粉剂型易于制备和分装、使用效果最好；作为临床治疗用途，可用于静脉输氧。

Description

亲水亲脂自封闭小体液相核心空化成囊泡的方法及应用

技术领域

本发明涉及一种使亲水亲脂两性分子自封闭小体液相核心空化形成囊气泡的方法。本发明微小囊气泡应用在医疗诊断上用于超声造影成像，在临床治疗上用于静脉输氧治疗缺氧性疾病。

背景技术

微小囊气泡或称壳包裹的微气泡(囊气泡)，在医疗领域有着广泛的应用。近几年发现经静脉注射微气泡或壳包裹的微气泡，能显著提高超声成像对比性。超声造影是用超声造影剂使超声反射或散射增强的一种技术，超声造影中使用的造影剂所含有的或产生的微泡内气体与周围液体和组织相比，在超声声场中与周围组织、血液成分相比具有指数级的压缩性差异，产生强烈的反射界面，微泡呈颗粒状回声增强或云雾状回声，造影剂的回声增强作用能更清楚地显示心腔或血管内的血液，这就是超声造影成像的原理。

早期的超声造影剂微小气泡直径均大于10微米，不能通过肺循环的毛细血管，即右心造影剂，且为自由气泡，如双氧水超声造影，是经静脉注射双氧水，在红细胞内过氧化氢酶的作用，分解释放出氧气，其中部分与血红蛋白结合，其余呈游离状态弥散于血液中，造成超声界面反射；如二氧化碳超声造影，是碳酸氢钠溶液与各种酸性溶液(醋酸、盐酸、维生素C等)混合，经静脉注射后释放二氧化碳气体形成超声界面反射。

由于自由气泡的不稳定性和气泡直径的限制，研究者注意力逻辑上自然集中在可自发封闭形成微小球形液相小体的亲水亲脂两性分子上。目前，能在液相环境里，能自发封闭形成微球样小体总体上称为亲水亲脂两性分子自封闭小体，主要有两类：一类称为脂质体(Liposome)，另一类称为基于非离子表面活性剂的液相小体(Non-ionic Surfactant based Vesicles，Niosome，参见文献：UchegbuIF，Vyas S Non-ionic surfactant based vesicles(niosomes)in drugdelivery，International Journal of Pharmaceutics 172(1998)33-70)简称为非离子表面活性小体。另外还有制备时两者混合形成的非离子表面活性磷脂质混合小体。实际上形成这种的亲水亲脂两性分子自封闭小体的两性分子都属于表面活性剂范畴。大量的表面活性剂，包括很多非离子表面活性剂分子、各种类脂质分子特别是磷脂均为亲水亲脂两性双分子层样结构。这些表面活性剂分子，在加入一定的膜添加剂后，其亲水亲脂两性分子在水性介质中，导入一定的机械能量搅动，可自发封闭形成具有液相核心的亲水亲脂双分子层微球体样结构。这些物理化学性质，决定了它们具有非常合适的膜包裹气体的应用前景。问题的关键是如何使其液相核心空化而形成微小囊气泡。

非离子表面活性小体最先于70年代为化妆工业的研究者发现。这类非离子表面活性小体和脂质体类似，由非离子表面活性剂亲水亲脂两性分子在水性介质中，导入一定的机械能量搅动，可自发封闭形成双分子层微球体样结构。由于非离子表面活性小体的形成与亲水亲脂平衡值(HLB，hydrophilic-lipophilicbalance value)有密切关系，一般认为HLB值在4-10之间适合于非离子表面活性小体的形成。因此对于高HLB值的表面活性剂，往往与低HLB值的其他类型表面活性剂混合调配出合适的HLB值，如将卵磷脂加入非离子表面活性剂调配合适的HLB，这种情况下形成的小体严格意义上应为磷脂质-非离子表面活性混合小体。同样，在制备脂质体时，往往也需要添加某些非离子型表面活性剂作为膜修饰。此也可认为是前述的混合小体。亲水亲脂两性分子自发封闭小体(非离子表面活性小体和脂质体)制备方法都类似，如旋转蒸发、声振处理等。常规的非离子表面活性小体和脂质体的制备分两步骤进行：1)成膜：将调配好HLB值的非离子表面活性剂成膜材料和/或脂质体成膜材料溶于有机溶液内，并置于旋转蒸发仪内，旋转蒸发，成膜于容器底部；2)成体：将已被膜的容器内注入水性介质，机械搅动1小时以上，形成具有亲水亲脂双分子层的液相核心小体。应强调的是无论非离子表面活性小体还是脂质体，无论成膜过程还是成小体过程，均是在凝胶态向液晶态相转变温度上进行，这样才能形成液相核心的小体结构。从科学严格的概念上，一般意义的脂质体(Liposome)、非离子表面活性小体(Niosome)或两者混合形成的磷脂质-非离子表面活性混合小体是液相概念，其亲水亲脂两性分子层内外均为液相环境。这类小体的直径约可达到3-5微米范围。因此要使亲水亲脂两性分子自封闭小体液相核心空化形成微小囊气泡，必须采用与一般制备脂质体(Liposome)、非离子表面活性小体(Niosome)或两者混合形成的磷脂质-非离子表面活性混合小体不同的方法。

目前国内外制备膜包裹微气泡的方法主要有三类：1)声振：利用声振仪探头直接插入含某种成膜表面活性剂的液体内，引入高强度超声振动，利用超声空化效应达到膜包裹微小气泡的目的，如由中国发明专利公开说明书，申请号02133720.9、发明专利申请号96106566.4和发明专利申请号01103726.1、发明专利申请号98105120.0等涉及的超声造影剂，均采用声振仪进行声振空化形成微小气泡；2)冷冻干燥：如意大利超声造影剂Sonovue以及如发明专利申请号98105120.0，利用冷冻干燥的方法，使磷脂质体或声振白蛋白微气泡维持空泡化的空间结构状态；3)采用特制设备进行脂质体空化，如发明专利申请号94192405.X所涉及的填充气体脂质体的发明。

此三类方法，以声振仪制备最为常用，但超声探头在极高能量振动下，易在振动液体内残留钛金属残粒，而且制备过程较繁琐，不易方便制备和分装。而且已经制备出的微小囊气泡，在分装和存储过程中，不可避免的要丢失和破裂部分，没有即刻准备的气泡丰富。因此在使用时只用手动震荡的能量就能产生微米级的气泡是最为理想的途径。另外，国内发明专利申请号02133720.9和Sonovue所用磷脂成膜材料与国内发明申请号02133720.9一致，造价昂贵。冷冻干燥方法，虽然利于分装，但工艺要求高，且批量生产的冷冻干燥设备投入也昂贵，如Sonovue，一支Sonovue的价格国内约为730元。发明专利申请号94192405.X所涉及的填充气体脂质体的发明，需要特制的设备和特殊的工艺，制备也更繁琐，投入大。

另外在生命活动即新陈代谢的过程，机体需要不断地消耗氧气，如出在临床上急性、慢性心脑血管病变、呼吸肌麻痹、窒息性病变，往往造成全身或局部组织氧含量明显降低，处于缺氧状态。缺氧会导致机体组织种种损害，如细胞变性、坏死、血管内皮损伤、血栓形成、全身炎症反应等，甚至导致机体死亡。如人脑灰质的毛细血管半径25微米，毛细血管间平均距离60微米，正常情况下，溶解氧的有效弥散半径30微米，氧分压为2Kpa，不存在缺氧区。若发生供氧不足、氧弥散能力下降，当氧分压降为1.33Kpa时即出现临床症状，氧分压降至0.53Kpa以下时发生意识丧失。多年来有许多人构思过静脉通路给氧，输血就是一种重要的辅助疗法。在19世纪70年代有人用双氧水、紫外线照射血液治疗缺氧性疾病。人工血的研制如氟碳化合物、动物血红蛋白以及人工合成的携带氧的络合物(卟啉化合物)等，能溶解高浓度氧的物质，但由于存在种种缺点和造价昂贵等原因终未推广。近年有研究者采用，溶氧罐或高氧液的静脉输氧装置，是通过往复式透光血袋经多光谱等光照作用后产生一定浓度的活性氧，但溶解氧的浓度有限，往体内输注时，压力降低，往往溶解率更为下降；因此，现在并无较好的方式实现静脉输氧。

发明内容

本发明的目的在于克服上述背景技术中制备微气囊或微气泡的不足之处而提供一种简易的使亲水亲脂两性分子自封闭小体液相核心空化形成微小囊气泡的方法；

本发明的另一个目的涉及所述微小囊气泡在临床上的应用，如用于超声造影和经静脉输氧。

用上述方法制备的微小囊气泡用料便宜、无毒性、可生物代谢的、易于保存和分装，不存在金属物污染、直径在10微米以下。

本发明的目的是通过如下措施来达到的：一种使亲水亲脂两性分子自封闭小体液相核心空化形成囊气泡的方法，所述亲水亲脂两性分子自封闭小体是指由非离子表面活性剂、胆固醇和/或磷脂类成膜材料组成；

所述形成微小囊气泡的方法包括如下步骤：

(1)将成膜材料溶解于氯仿和甲醇等有机溶液中，在抽真空状态下，在凝胶态向液晶态相转变温度上，利用喷雾干燥成膜于可生物降解水溶性微小粉状颗粒载体上，所述成膜材料：水溶性载体质量比是1∶50-500000；

(2)将上述可生物降解水溶性微小粉状颗粒，装入一定容积的容器内，置真空，并封口，在低于凝胶态向液晶态相转变温度下，先后注入特定气体和水性介质，常温下手动震荡，在水溶性的微细颗粒溶解后，包裹膜塌陷，液气界面的强烈震荡使气体进入亲水亲脂两性分子自封闭小体，进而形成液相核心空化的亲水亲脂两性分子自封闭小体。

在上述技术方案中所述液相核心空化的亲水亲脂两性分子自封闭小体是指非离子表面活性小体(Niosome)或脂质体(Liposome)或两者混合形成的磷脂质非离子表面活性混合小体。

在上述技术方案中所述非离子表面活性小体(Niosome)，所用非离子表面活性剂选以下类型中的一种或几种调配并与胆固醇类膜表面添加剂组成；(1)司班(Span)系列非离子型表面活性剂，如司班20、司班40、司班60、司班80、司班85等；(2)吐温(Tween)系列非离子型表面活性剂，如吐温20，吐温40、吐温60、吐温80、吐温81、吐温85等；(3)Brij系列非离子型表面活性剂，如Brij 30，Brij 40，Brij 60、Brij 76、Brij78、Brij93等；(4)其他：CremophorEL，Pluronic F68、白蛋白。

在上述技术方案中所述脂质体，包括以下诸种磷脂和其他膜添加剂构成，诸如包括以下诸种磷脂或类脂，诸如：卵磷脂、磷脂酰二醇胺、胆固醇、胆固醇乙酰脂、β-谷甾醇、牛胆酸钠、蛋磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、神经鞘磷脂、鞘髓磷脂、二鲸醋磷脂、肉豆蔻酰卵磷脂、硬脂酰胺，油酸单磷脂、维生素E及其他人工合成磷脂如：1，2-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸甘油基-钠盐(DPPGNa)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DSPC)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸甘油酸钠盐(DPPANa)、1，2-棕榈酰基-sn-甘油基-3-3-磷脂酰胆碱(DPPC)，或上述部分化合物的混合物。

在上述技术方案中所述磷脂质-非离子表面活性混合小体中磷脂类亲水-亲脂两性分子和非离子表面活性剂亲水亲脂两性分子调配比率为1-500∶1。

在上述技术方案中所述可生物降解水溶性粉状微小颗粒载体为以下任一一种或几种的混合物：聚乳酸(PLA)、聚丙交酯、聚己内酯(PCL)、聚乙醇酸(PGA)、聚羟丁酸(PHB)、聚羟戊酸(PVAC)、聚癸酸(PDA)，聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物PLGA、聚乳酸和聚羟丁酸的共聚物PH-BV、聚氰基丙烯酸异己酯(PIHCA)、聚丙交酯乙交酯(PLCG)等、聚酸酐、半固态聚原酸酯(POE)、聚乙二醇(如聚乙二醇1000，聚乙二醇2000，聚乙二醇3000，聚乙二醇4000，聚乙二醇5000，聚乙二醇6000，聚乙二醇8000)、聚乙烯吡咯酮、二丁基羟基甲苯、山梨醇、羧甲基纤维素钠、羟乙基淀粉、人羧甲淀粉钠、海藻酸盐；葡萄糖、半乳糖、果糖、麦牙糖、蔗糖、麦芽糖糊精，葡聚糖、水溶性壳聚糖及其衍生物；山梨醇；氯化钠。

在上述技术方案中所述可生物降解水溶性粉状微小颗粒载体和膜包裹可生物降解水溶性粉状微小颗粒载体的粒径分布在微米级和/或纳米级。

在上述技术方案中所述注入气体为氟代烷烃类气体(如全氟甲烷气体、全氟乙烷气体、全氟丙烷)、空气、氧气、氮气、二氧化碳气、一氧化氮气、氢气、丙烷、丁烷中的一种任一一种或几种，所述微小囊气泡直径分布在微米和/或纳米级。

在上述技术方案中所述囊气泡医疗诊断上作为超声造影剂应用于超声造影成像。

在上述技术方案中所述包裹氧气的囊气泡，在临床治疗上应用于静脉输氧。

考虑到临床应用的安全性和成本，优选方案主要选择以下四种已经经美国食品和药物管理局批准可安全的作为胃肠外营养的经静脉注射的亲水亲脂两性分子表面活性剂作为成膜材料：卵磷脂、吐温20、吐温80、Cremophor EL。以胆固醇作为膜表面修饰添加剂进行调配。由作为超声造影应用，采用稳定性好的全氟丙烷气体。作为静脉输氧的临床应用，则采用氧气包裹。可生物降解水溶性粉状微小颗粒载体采用葡萄糖晶体，水性介质采用生理盐水。

本发明为达到液相核心空化的目的，采用了三点不同于常规的方法：1)首先于凝胶态向液晶态相转变温度上成膜于可生物降解的水溶性的粉状微小颗粒载体上，由于水溶性的粉状颗粒的粒径分布在微米级和/或纳米级，实际上是将脂质体(Liposome)或非离子表面活性小体(Niosome)或两者混合形成的磷脂质-非离子表面活性混合小体的液相核心首先固态化，这样同时有利于保存和分装；2)在使用时注入水性介质，在凝胶态向液晶态相转变温度下短时手动强力震荡，是避免高温下膜相变过程包裹液体成分。在手动震荡下，固性可溶性颗粒核心溶解，膜在支撑颗粒溶解时塌陷，同时震荡形成频繁的液、膜、气接触界面，气体进入膜内并自发封闭从而达到液相核心空化的目的，且形成的囊气泡也最为丰富。3)本发明采用真空-气体置换方法，可使液相空化达到特定气体空化的目的，有利于根据特定的用途选定特定的气体。

通过本发明，将液相核心氟代烷烃类气体空化的微小囊气泡经静脉注射，由于直径小于10微米，可顺利通过肺循环，可形成稳定的超声造影介面而达到左心、右心以及腹部实质性脏器造影的目的。

通过本发明，将液相核心氧气空化的微小囊气泡经静脉输注，同时结合血红蛋白以及人工合成的携带氧的络合物(卟啉化合物)一起输注。由于核心空化的脂质体或称膜包裹的微气泡，在超声声波振动下，可发生空化作用而破裂。因此在输入液相核心氧气空化的微小囊气泡的同时，在体外，利用超声探头在局部探照，局部微小囊气泡的破裂，一方面可使局部毛细血管动脉血中氧分压远高于组织中氧分压，另一方面可使缺氧组织明显提高氧气的弥散，从而改善缺氧组织的供氧。含有一定浓度的活性氧可抑制自由基的大量产生，调节细胞钙离子浓度，提高机体免疫能力，增加机体对缺氧的耐受力，并可缓解由缺血再灌注造成的组织损伤。可迅速提高血氧分压和血氧饱和度，改善组织缺血缺氧状态，提高红细胞的变形能力，降低血小板的凝聚力，增加纤维蛋白溶解度，调节细胞Ca++离子浓度，有效保护损伤组织，并提高机体的免疫力和抗感染能力，适用于诸如脑血管病变，心肌缺血性病变，急性窒息等心脑血管疾病病人的抢救和治疗。

本发明最终制剂形态包括三部分：1)一支一定容积的真空状态的容器，其内含一定质量的膜包裹的可生物降解水溶性粉状微小颗粒；和2)一包含特定气体容积的气袋或注射器，其容积与上述容器相等；和3)一支含一定容量的水性介质的注射器或容器。最终制剂形态也可简化为两部分：1)一支一定容积的已经经过真空-气相转换的容器，其内含一定质量的膜包裹的可生物降解水溶性粉状微小颗粒和特定气体的容器；和2)一支含一定容量的水性介质的注射器或容器。

综上所述，本发明制备的液相核心空化的亲水亲脂两性分子自封闭形成的微小囊气泡与现有其他微气泡性超声造影剂相比具有以下明显的优点：1)成本低廉。本发明优选方案所用的卵磷脂是磷脂类表面活性剂中最为常用也最为便宜的膜材料；吐温80、吐温20、葡萄糖晶体以及胆固醇国内外已经有大量厂家生产，产品价格便宜，且易于采购；2)安全无毒，本发明所采用所有材料均为人体可生物代谢或已经经美国食品和药物管理局批准可作为胃肠外营养的可静脉注射亲水亲脂两性分子表面活性剂作为成膜材料，因此具有极高的安全性；3)由于采用干粉剂型易于制备和分装；且在使用时再经手动震荡溶解，形成的囊气泡最为丰富，使用效果最好；3)囊气泡粒径分布在3-5微米范围，可顺利通过肺循环，可经静脉或动脉注射达到实质脏器和心脏造影的目的；4)易于存储，常温下就可保持所有物理化学特性；5)作为临床超声影像诊断应用其造影效果显著，造影维持时间长，可维持半小时以上；6)无金属颗粒污染的危险；7)作为临床治疗用途，可用于静脉输氧。

附图说明

图1为实施例3的液相核心全氟丙烷气体空化的非离子表面活性小体20倍显微镜图。

图2为实施例3的计算机图像分析核心全氟丙烷气体空化的非离子表面活性小体直径大小的正态分布曲线图。

图3为实施例4的液相核心一般空气空化的脂质体20倍显微镜图。(图中箭头表示破裂气泡)

图4为实施例5的核心全氟丙烷气体空化的脂质体。

图5为实施例6的液相核心空化的非离子-磷脂混合小体的显微镜图。(图中未见破裂的囊气泡)

图6为实施例7的液相核心全氟丙烷气体空化的非离子-磷脂混合小体的20倍显微镜图。

图7为实施例7的计算机图像分析核心全氟丙烷气体空化的磷脂质-非离子表面活性混合小体直径大小的正态分布曲线图。

图8A为动物实验造影前肾脏能量图图像，8B造影后肾脏能量图图像。

图9为液相核心气体空化的非离子-磷脂混合小体20倍显微镜图。

具体实施方式

下面通过实施例和相关实验来详细说明本发明的实施情况：

实施例1：制备液相核心空化的非离子表面活性小体

首先将1克麦芽糖糊精研磨至微米级的粉状颗粒，将100mg司班60与20mg胆固醇混溶于氯仿有机溶液中，并装入喷雾器中。引入50毫升圆底磨口烧瓶，喷雾于麦芽糖糊精上，接入旋转蒸发仪，在60度水浴下抽真空，旋转蒸发30分钟，成膜于麦芽糖糊精粉状颗粒上。取出膜覆盖的麦芽糖糊精，常温下风干12小时。将上述膜包裹麦芽糖糊精迅速溶于10毫升生理盐水中，手动振荡30秒，取混悬液于显微镜下观察，核心空化非离子表面活性小体直径约在7-8微米，一个高倍视野分布约90％。在常温，不密封的情况下，微小囊气泡于烧瓶内可保持3天不消失和破裂；密封状态下，微小囊气泡可保持至少1周。

实施例2：调配HLB值制备液相核心空化的非离子表面活性小体

将1克麦芽糖糊精研磨至微米级的粉状颗粒。将司班80和吐温80的HLB值按各自HLB值重量加权平均计算调配出HLB值为6复合乳化剂，其中司班80(166mg)重量占83％，吐温80(34mg)重量占17％，将上述复合乳化剂与20mg胆固醇混溶于氯仿有机溶液中，并装入喷雾器中。引入50毫升圆底磨口烧瓶，喷雾于麦芽糖糊精上，接入旋转蒸发仪，在60度水浴下抽真空，旋转蒸发30分钟，成膜于麦芽糖糊精粉状颗粒上。取出膜覆盖的麦芽糖糊精，常温下风干12小时。将上述膜包裹麦芽糖糊精迅速溶于10毫升生理盐水中，取混悬液于显微镜下观察，核心空化非离子表面活性小体直径约在7-8微米，一个高倍视野分布约90％。在常温，不密封的情况下，微小囊气泡于烧瓶内可保持1天不消失和破裂。密封状态下，微小囊气泡可保持至少1周。

实施例3：调配HLB值制备液相核心全氟丙烷气体空化的非离子表面活性小体

将1克麦芽糖糊精研磨至微米级的粉状颗粒。将司班80和吐温80的HLB值按各自HLB值重量加权平均计算调配出HLB值为6复合乳化剂，其中司班80(166mg)重量占83％，吐温80(34mg)重量占17％，将上述复合乳化剂与20mg胆固醇混溶于氯仿有机溶液中，并装入喷雾器中。引入50毫升圆底磨口烧瓶，喷雾于麦芽糖糊精上，接入旋转蒸发仪，在60度水浴下抽真空，旋转蒸发30分钟，成膜于麦芽糖糊精粉状颗粒上。取出膜覆盖的麦芽糖糊精，常温下风干12小时。将上述膜包裹麦芽糖糊精分装于小玻璃瓶内，抽取真空，并密封。以先后次序分别注入全氟丙烷的气体(气体容积和前述容器容积一致)和10毫升生理盐水，手动震荡30秒后，取混悬液于显微镜下观察，核心全氟丙烷气体空化的非离子表面活性小体直径约在3-8微米，一个高倍视野分布约95％，见图1，为20倍镜下所见，95％的微小囊泡直径在7-8微米左右，仅少量囊气泡直径稍大于10微米。图2为实施例3的计算机图像分析核心全氟丙烷气体空化的非离子表面活性小体直径大小的正态分布曲线图。由正态曲线分布图可见，65％的囊气泡的直径在2-6微米范围分布，99％的囊气泡小于10微米。平均囊气泡直径为4微米。采用全氟丙烷气体空化的囊气泡稳定性大大提高，在不密封状态，微小囊气泡可维持3-4天，密封状态下包裹全氟丙烷的微小囊气泡至少保持1月。

实施例4：制备液相核心空化的脂质体

100毫克卵磷脂和40毫克胆固醇混溶于5毫升氯仿有机溶液，并装入喷雾器中喷雾于1克葡萄糖微细晶体，并置入50毫升圆底磨口烧瓶，接入旋转蒸发仪，60度水浴下抽真空，旋转蒸发成膜于烧瓶底部。30分钟后，取出膜覆盖葡萄糖微细晶体，常温下风干12小时。将上述膜包裹麦芽糖糊精迅速溶于10毫升生理盐水中，手动强烈振荡，取混悬液于显微镜下观察，核心空化的脂质体直径约在3-8微米，一个高倍视野分布约90％。常温下，保持不封口，微小囊气泡维持时间约6小时。但单纯卵磷脂双分子层的核心空化的脂质体结构显示不够稳定，易于破裂。图3为实施例4的液相核心一般空气空化的脂质体20倍显微镜下所见，此为20倍镜下所见，90％的微小囊泡直径在5微米左右，仅少量囊气泡直径稍大于10微米，但单纯卵磷脂双分子层的核心空化的脂质体结构显示不够稳定，易于破裂，见图3中箭头所指。

实施例5：制备液相核心全氟丙烷气体空化的脂质体

100毫克卵磷脂和40毫克胆固醇混溶于5毫升氯仿有机溶液，并装入喷雾器中喷雾于1克葡萄糖微细晶体，并置入50毫升圆底磨口烧瓶，接入旋转蒸发仪，60度水浴下抽真空，旋转蒸发成膜于烧瓶底部。30分钟后，取出膜覆盖葡萄糖微细晶体，常温下风干12小时。将上述膜包裹葡萄糖微细晶体分装于小玻璃瓶内，抽取真空，并密封。以先后次序分别注入全氟丙烷的气体(气体容积和前述容器容积一致)和10毫升生理盐水，强力震荡30秒后，取混悬液于显微镜下观察，核心全氟丙烷气体空化的脂质体直径约在3-8微米，一个高倍(20×)视野分布约95％，稳定性显著提高，不密封状态下，微小囊气泡，可保持3-4天左右。密封状态下包裹全氟丙烷的微小囊气泡至少保持1月。图4为实施例5的核心全氟丙烷气体空化的脂质体直径约在3-8微米，一个高倍视野分布约95％，全视野内未见破裂的囊气泡稳定性显著提高。

实施例6：制备液相核心空化的磷脂质-非离子表面活性混合小体

100毫克卵磷脂、50毫克吐温80、30毫克胆固醇混溶于5毫升氯仿有机溶液，并装入喷雾器中喷雾于1克葡萄糖微细晶体，并置入50毫升圆底磨口烧瓶，接入旋转蒸发仪，60度水浴下抽真空，旋转蒸发成膜于烧瓶底部。30分钟后，取出膜覆盖葡萄糖微细晶体，常温下风干12小时。将上述膜包裹葡萄糖微细晶体迅速置于10毫升生理盐水中，手动强烈振荡，取混悬液于显微镜下观察，核心空化的磷脂质-非离子表面活性混合小体直径约在3-8微米，一个高倍视野分布约90％。仅包裹一般空气的液相核心空化的非离子磷脂质体结构稳定，明显优于实施例4单纯卵磷脂双分子层包裹的囊气泡。常温下，保持不封口，微小囊气泡维持时间约2-3天，密封状态可保持至少1周。见图5。图5为实施例6的液相核心空化的非离子-磷脂混合小体的显微镜下图，核心空化的磷脂质-非离子表面活性混合小体直径约在3-8微米，一个高倍(20×)视野分布约90％。未见破裂的囊气泡。

实施例7：制备液相核心全氟丙烷气体空化的磷脂质-非离子表面活性混合小体

100毫克卵磷脂、20毫克吐温80、30毫克胆固醇混溶于5毫升氯仿有机溶液，并装入喷雾器中喷雾于1克葡萄糖微细晶体，并置入50毫升圆底磨口烧瓶，接入旋转蒸发仪，60度水浴下抽真空，旋转蒸发成膜于烧瓶底部。30分钟后，取出膜覆盖葡萄糖微细晶体，常温下风干12小时。将上述膜包裹葡萄糖微细晶体分装于小玻璃瓶内，抽取真空，并密封。以先后次序分别注入全氟丙烷的气体(气体容积和前述容器容积一致)和10毫升生理盐水，强力震荡30秒后，取混悬液于显微镜下观察，核心全氟丙烷气体空化的磷脂质-非离子表面活性混合小体直径约在3-5微米，一个高倍视野分布约95％，稳定性显著提高，见图6，图7。稳定性显著提高，不密封状态下，微小囊气泡，可保持1周左右。密封状态下包裹全氟丙烷的微小囊气泡至少保持2月。图6为实施例7的液相核心全氟丙烷气体空化的非离子-磷脂混合小体的显微镜下图，核心全氟丙烷气体空化的磷脂质-非离子表面活性混合小体直径约在3-5微米，一个高倍视野分布约95％，稳定性显著提高。图7为实施例7的计算机图像分析核心全氟丙烷气体空化的磷脂质-非离子表面活性混合小体直径大小的正态分布曲线图。由正态曲线分布图可见，70％的囊气泡的直径在2-6微米范围分布，97％的囊气泡小于10微米。平均囊气泡直径为4微米。

实施例8：超声造影动物实验

动物实验，将实施7所制备的液相核心空化的混悬液1毫升经兔耳缘静脉团注入大白兔体内，数秒内，于在多普勒能量图成像模式下，可见显著的造影增强效果，见图8A，8B。图8A为造影前肾脏能量图图像，图8B为造影后肾脏能量图图像，肾实质显像显著增强。

实施例9：制备液相核心全氟丙烷气体空化的磷脂质-非离子表面活性混合小体

100毫克卵磷脂、5毫克Cremophor EL、30毫克胆固醇混溶于5毫升氯仿有机溶液，并装入喷雾器中喷雾于1克葡萄糖微细晶体，并置入50毫升圆底磨口烧瓶，接入旋转蒸发仪，60度水浴下抽真空，旋转蒸发成膜于烧瓶底部。30分钟后，取出膜覆盖葡萄糖微细晶体，常温下风干12小时。将上述膜包裹葡萄糖微细晶体分装于小玻璃瓶内，抽取真空，并密封。以先后次序分别注入全氟丙烷的气体(气体容积和前述容器容积一致)和10毫升生理盐水，强力震荡30秒后，取混悬液于显微镜下观察，核心全氟丙烷气体空化的磷脂质-非离子表面活性混合小体直径约在7-8微米，一个高倍视野(20×)分布约85％。

实施例10：制备液相核心氧气气体空化的磷脂质-非离子表面活性混合小体

100毫克卵磷脂、20毫克吐温80、30毫克胆固醇混溶于5毫升氯仿有机溶液，并装入喷雾器中喷雾于1克葡萄糖微细晶体，并置入50毫升圆底磨口烧瓶，接入旋转蒸发仪，60度水浴下抽真空，旋转蒸发成膜于烧瓶底部。30分钟后，取出膜覆盖葡萄糖微细晶体，常温下风干12小时。将上述膜包裹葡萄糖微细晶体分装于小玻璃瓶内，抽取真空，并密封。以先后次序分别注入全氟丙烷的气体(气体容积和前述容器容积一致)和10毫升生理盐水，强力震荡30秒后，取混悬液于显微镜下观察，核心氧气气体空化的磷脂质-非离子表面活性混合小体直径约在3-5微米，一个高倍视野分布约95％，不密封状态下，微小囊气泡，可保持1周左右。密封状态下包裹氧气的微小囊气泡至少保持2月。

实施例11：调配HLB值制备液相核心气体空化的磷脂质-非离子表面活性混合小体

将1克葡萄糖的粉状颗粒。将卵磷脂和吐温20的HLB值按各自HLB值重量加权平均计算调配出HLB值为9的复合乳化剂，其中吐温20(22mg)重量占11％，卵磷脂(178mg)重量占89％，将上述复合乳化剂与20mg胆固醇混溶于氯仿有机溶液中，并装入喷雾器中。引入50毫升圆底磨口烧瓶，喷雾于葡萄糖上，接入旋转蒸发仪，在60度水浴下抽真空，旋转蒸发30分钟，成膜于葡萄糖粉状颗粒上。取出膜覆盖的葡萄糖，常温下风干12小时。将上述膜包裹葡萄糖迅速溶于10毫升生理盐水中，手动强力震荡10秒后，取混悬液于显微镜下观察，核心空化磷脂质-非离子表面活性混合小体直径约在5-6微米，但气泡含量明显少于与吐温80调配所得。如图9，所示，微小囊气泡直径都在5-6微米，但与实施例6，7相比气泡含量明显减少。

实施例12：经静脉输氧动物实验

取实施例10制备的氧气核心空化的磷脂质-非离子表面活性混合小体的混悬液5毫升，采用经大白兔耳缘静脉输注的方式，以每分钟0.05毫升的速度输注。在20分钟的输注过程中，未见任何气体栓塞征象，明显提高了兔血氧含量。

需要说明的是：对于所属领域的技术人员来说，在不改变本发明原理的前提下还可以对本发明作出若干的改变或变形，例如在成膜材料上标记某些特异性的抗体或包裹特殊的药物成分，以达到靶向释放、靶向造影、靶向治疗的目的。这同样属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1、亲水亲脂两性分子自封闭小体液相核心空化形成囊气泡的方法，所述亲水亲脂两性分子自封闭小体是由非离子表面活性剂、胆固醇和/或磷脂类成膜材料组成；

其特征在于所述方法包括如下步骤：

(1)将成膜材料溶解于氯仿和/或甲醇中，在抽真空状态下，在凝胶态向液晶态相转变温度上喷雾干燥成膜于可生物降解水溶性的微小粉状颗粒载体上，所述成膜材料：水溶性载体质量比是1∶50-500000；

(2)将上述已包裹膜的水溶性微小粉状颗粒，装入一定容积的容器内，置真空，并封口，在低于凝胶态向液晶态相转变温度下，以先后次序注入一定容积的气体和水性介质，手动震荡至水溶性的微小粉状颗粒溶解，包裹膜塌陷使气体进入亲水亲脂两性分子自封闭小体，进而形成液相核心空化的亲水亲脂两性分子自封闭小体囊气泡。

2、根据权利要求1所述的亲水亲脂两性分子自封闭小体液相核心空化形成囊气泡的方法，其特征在于所述液相核心空化的亲水亲脂两性分子自封闭小体是指非离子表面活性小体(Niosome)或脂质体(Liposome)或两者混合形成的脂质非离子表面活性混合小体。

3、根据权利要求1或2所述的一种使亲水亲脂两性分子自封闭小体液相核心空化形成囊气泡的方法，其特征在于所述非离子表面活性小体(Niosome)，所用非离子表面活性剂选司班(Span)系列非离子型表面活性剂、吐温(Tween)系列非离子型表面活性剂、Brij非离子型表面活性剂、Cremophor EL、PluronicF68、白蛋白中的一种或几种调配并与胆固醇等膜表面添加剂组成。

4、根据权利要求1或2所述的一种使亲水亲脂两性分子自封闭小体液相核心空化形成囊气泡的方法，其特征在于所述脂质体所用磷脂类亲水亲脂两性分子选下述类型中的一种或几种调配并与胆固醇类膜表面添加剂组成；所述磷脂类亲水亲脂两性分子为卵磷脂、磷脂酰二醇胺、胆固醇、胆固醇乙酰脂、β-谷甾醇、牛胆酸钠、蛋磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、神经鞘磷脂、鞘髓磷脂、二鲸醋磷脂、肉豆蔻酰卵磷脂、硬脂酰胺，油酸单磷脂、维生素E、1，2-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸甘油基-钠盐(DPPGNa)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DSPC)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸甘油酸钠盐(DPPANa)、1，2-棕榈酰基-sn-甘油基-3-3-磷脂酰胆碱(DPPC)或上述化合物的混合物。

5、根据权利要求2所述的一种使亲水亲脂两性分子自封闭小体液相核心空化形成囊气泡的方法，其特征在于所述磷脂质非离子表面活性混合小体，其磷脂类亲水亲脂两性分子和非离子表面活性剂亲水亲脂两性分子质量调配比率为1-500∶1。

6、根据权利要求1所述的一种使亲水亲脂两性分子自封闭小体液相核心空化形成囊气泡的方法，其特征在于所述可生物降解水溶性粉状微小颗粒载体为以下任一一种或几种的混合物：聚乳酸(PLA)、聚丙交酯、聚己内酯(PCL)、聚乙醇酸(PGA)、聚羟丁酸(PHB)、聚羟戊酸(PVAC)、聚癸酸(PDA)，聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物PLGA、聚乳酸和聚羟丁酸的共聚物PH-BV、聚氰基丙烯酸异己酯(PIHCA)、聚丙交酯乙交酯(PLCG)、聚酸酐、半固态聚原酸酯(POE)、聚乙二醇、聚乙烯吡咯酮、二丁基羟基甲苯、山梨醇、羧甲基纤维素钠、羟乙基淀粉、人羧甲淀粉钠、海藻酸盐、葡萄糖、半乳糖、果糖、麦牙糖、蔗糖、麦芽糖糊精，葡聚糖、水溶性壳聚糖及其衍生物、山梨醇、氯化钠。

7、根据权利要求1或6所述的一种使亲水亲脂两性分子自封闭小体液相核心空化形成囊气泡的方法，其特征在于所述可生物降解水溶性粉状微小颗粒载体和膜包裹可生物降解水溶性粉状微小颗粒载体的粒径分布在微米级和/或纳米级。

8、根据权利要求1所述的一种使亲水亲脂两性分子自封闭小体液相核心空化形成微小囊气泡的方法，其特征在于所述注入气体为氟代烷烃类气体、空气、氧气、氮气、二氧化碳气、一氧化氮气、氢气、丙烷、丁烷中的任一一种或几种，所述微小囊气泡直径分布在微米和/或纳米级。

9、上述亲水亲脂两性分子自封闭小体液相核心空化形成囊气泡的应用，其特征在于所述囊气泡在医疗诊断上作为超声造影剂用于超声造影成像上的应用。

10、上述亲水亲脂两性分子自封闭小体液相核心空化形成包裹氧气的囊气泡的应用，其特征在于所述囊气泡在临床治疗用于静脉输氧上的应用。

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