CN104689348A - 包含至少两种充气微泡的造影剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种包含两种或更多种充气微粒的超声诊断造影剂及其形成方式和应用。所述充气微粒对超声压的敏感性不同。对超声压有着相对较低敏感性的微粒在超声波探头近场区域对高的超声能量产生应答,在此区域有着相对较高敏感性的微粒倾向于破裂而不活跃。有着更高敏感性的微粒在远场区域更低超声能量的环境下即有应答,在此区域低敏感微粒趋向于不显示干扰。本发明造影剂制备过程简单，反应条件温和，原料易得，具有产业化实施的可能性；在诊断用声强下造影不会轻易被破坏；且造影效果好，具有很好的应用前景。

Description

包含至少两种充气微泡的造影剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种包含至少两种充气微泡的造影剂及其制备方法与应用，属于超声成像领域。

背景技术

众所周知，超声成像是一种很有价值的诊断工具。例如对循环系统的研究，特别是对心动描记和组织微循环的研究。被研究用来提高超声影像的多种造影剂现已获得，包括固体微粒混悬体、乳化的液滴、气体微泡、包封的气体或液体。气体包容和气体产生体系的使用引起了特别的兴趣，因为在这样的体系中存在的或产生的气体的低密度和易压性能够保证特别高效的超声反向散射。

早先的研究包括通过心内注射身体可接受的物质在体内产生游离气体微泡，这种方法证明此类微泡在回声描记法中作为造影剂的潜在的可行性。然而，由于这种微泡在体内寿命极短，使这种技术被证明在实际应用中极受限制。于是更多的研究集中在为超声心动描记法和其它超声研究提供稳定气体微泡的方法上。例如，使用乳化剂、增稠剂或糖、或通过包含或包封气体或其前体成为一个体系，如一个多孔的、充满气体的微粒或一个包封了气体的微泡。例如，使用包封材料如蛋白质、聚合物或成膜表面活性剂如磷脂。

最近在这一领域的研究显示出了减少一切包封材料的稠度的趋势，人们已经认识到厚的囊壳降低了可压性，因而降低了微泡产生回声的能力。US-A-5393524中建议，由于对液体介质如血液的亲和力比空气更强，一些生物相容性碳氟化合物可以用来形成游离气体微泡。已有人提出用含有水不溶的氟化物气体、用包封或其它方法稳定的分散体系的造影剂——如WO-A-9501187所示，是关于包含了不溶于水的气体如全氟丙烷和BR1处方，一个充满六氟化硫微泡，由磷脂作稳定剂的分散系的蛋白微球。

有时，此类造影剂比起有着更厚或更硬的囊壳的造影剂来，趋向于显示出更高的回声应答和较低的衰减。它们因而也有在高的超声压下相对较低的耐受性的缺点。例如，超声波探头近场区域存在这种较高的超声压。因而在诊断用声强下造影可能会在此区域造成造影剂的大量破坏。

已有人建议在较低的声强下造影或通过使用间歇超声脉冲来克服这一问题。例如在每一第十、第二十、第三十个心率周期激发脉冲。然而，这将在超声波探头近场区域产生不透明区域来取代连续造影和/或在远场区域增加不可接收的信噪比。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种包含两种充气微泡的造影剂及其制备方法和应用。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明是基于一个发现，即使用包含两种或多种对超声波能量的耐受性，即对超声压的敏感性不同的含气微粒的造影剂能够降低或克服这样的缺点。这些微粒中对超声压有着相对较低敏感性的微粒在超声波探头近场区域将对高的超声能量产生应答，此区域有着相对较高敏感性的微粒倾向于破裂而变得不活跃。然而，有着更高敏感性的微粒在远场低超声能环境下即有应答，在此区域低敏感微粒趋向于不显示干扰。

根据本发明的一个实施方案，本发明提供了一种新的造影剂，用于同时、分别或顺序用作超声造影剂。该造影剂包含至少两种不同类型的含气微粒，上述微粒的不同在于它们对超声压的敏感性不同。

各种微粒对超声压不同的敏感性来自于它们的物理和/或化学性质的不同。这样就有可能选择仅仅大小不同的微粒，例如两种大小粒子的分布来获得所需要的对超声压敏感性地不同。然而，更常见的是采用不同的包封方法或不同的稳定法得到的体系，例如包含两种微粒，一种有着相对较软的囊壳，因而对超声压有相对较高的敏感性。另一种有着相对较硬的成囊材料或较强的稳定剂，如较硬的囊壳或较强的基质，因而对超声压有相对较低的敏感性。

进一步的，所述造影剂包含有着相对较软的囊壳的第一种含气微粒、有着相对较硬的囊壳的第二种含气微粒或含其它稳定剂。一种相对较软的囊壳，对超声压有相对较高的敏感性。另一种相对较硬的成囊材料或较强的稳定剂，如较硬的囊壳或较强的基质，对超声压有相对较低的敏感性。

可以任选合适的含气微囊作为不同的微粒种类来制备超声造影剂，这样的造影剂典型的例子包括气稳定化的微泡(例如，至少部分包封了气体)，稳定剂可以是一种抗聚集的表面膜，一种成膜蛋白质(例如一种白蛋白如人血清白蛋白，一种聚合物材料，例如一种合成的可生物降解的聚合物，一种如EP-A-0458745中描述的有弹性界面的合成聚合物膜，一种如EP-A-0441468中描述的可生物降解的聚醛微粒，聚氨基酸-多环酰亚胺的N-二羧酸衍生物微粒，或一种如WO-A-9317718或WO-A-9607434中描述的可生物降解聚合物)，一种非聚合且不能聚合的成壁材料，或一种表面活性剂(例如，聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性剂如Pluronic，一种如WO-A-9506518中描述的聚合物表面活性剂，或一种成膜表面活性剂如磷脂。 进一步的， 所述第一种含气微粒的囊壳包含至少一种磷脂，所述磷脂囊壳包含一种或多种磷脂，选自磷脂酰胆碱、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、心磷脂、神经鞘磷脂和它们中任一种的氟化类似物。

进一步的，包含两种充气微泡的造影剂的制备方法，其步骤包括：

1)含气微粒的制备

将一定质量的磷脂加入到一定量溶剂中，震荡并加热到一定温度下反应一段时间，冷却至室温，再震荡并放置；

将上述溶液转移至烧瓶中放置在恒定28℃水浴中，在密闭情况下先脱气2min，再通入所需气体；

将溶液利用转子搅拌器在23000rpm下搅拌反应一段时间，转移至密闭容器中用溶剂洗涤，再在12500rpm下离心，除去下层液体，加水重复离心几次；

然后将上层物用10％(w/w)蔗糖溶液置换，将得到的分散物按每份5ml的量装入专用于低压冻干的10ml平底小玻璃瓶中，将小瓶降温至-47℃冻干大约40-50小时，得到白色疏松固体。将小瓶置于真空室，用真空泵抽去空气，置换以所需气体。

2）包括两种微粒的造影剂的制备

含气聚合物微粒加入到含有上述中已冻干的产品的小瓶中，然后加入注射用水，用手轻轻振摇几秒钟，即得到本发明的造影剂。

其它可使用的含气微粒造影剂包括含气的固体体系，例如微粒(特别是微粒聚集体)，其中含有或带有气体(例如气体吸附在微粒表面和/或包含在微粒的空隙、孔洞或微孔中，可以预期含有此类微粒的造影剂产生的超声回声直接来自它所包含的或带有的气体，和/或气体(如，微泡)从这些固体材料中的释放(如，这些微粒结构溶解时)。

含气微粒优选最初平均粒径不得超过10μm(如，7μm或更低)以便在给药，如静脉注射后让它们能够自由通过呼吸系统。

根据本发明，包含磷脂的造影剂已被应用于，如微泡的外膜，其被一种或多种磷脂的单层、双层或多层膜所稳定。可用的磷脂的典型例子包括卵磷脂(即磷脂酰胆碱)，如天然卵磷脂、如蛋黄卵磷脂或大豆卵磷脂、人工合成或半合成卵磷脂，如二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱或二硬脂酰磷脂酰胆碱；磷脂酸；磷脂酰乙醇胺；磷脂酰丝氨酸；磷脂酰甘油；磷脂酰肌醇、心磷脂、神经鞘磷脂；上述物质的氟化类似物；上述任意物质的混合物和它们与其它脂类如胆固醇的混合物，每个这些磷脂的脂肪酰基典型地包含大约14-22个碳原子，如棕榈酰基团和硬脂酰基团。根据本发明，这些磷脂中溶血型的非常有用，术语“溶血”(lyso-)说明了磷脂只包含一个脂肪酰基团，而且它优选是在甘油的1位碳上以酯键相联接。这种溶血型和含两个脂酰基的磷脂混合使用更有利。

磷脂壳一般较软，使微粒对超声压有相对较高的敏感性。采用磷脂中绝大部分(如至少75％)中分子外带净电荷，如负电荷，例如天然的(如大豆或蛋黄中提取的)，半合成的(如部分或全部氢化了的)和全部合成的磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸和/或心磷脂更为有利。同时我们不希望被理论推导所束缚，即认为磷脂膜电荷之间的静电排斥使它的结构稳定并稳定了载体与微泡之间的界面；这些薄膜的柔顺性和变形性提高了此造影剂的回声产生能力，于是成为具有相对柔软、易挠曲囊壳的微粒的优选例子。

包含相对坚韧、不易弯曲囊壳的微粒的例子包括含气的聚合物微粒，其中的聚合物是生物可降解聚合物壳聚糖。 由变性蛋白和/或交联蛋白（如，人血清白蛋白）包封气体的微泡的造影剂，如WO-A-9217213或WO-A-9406477中所记载的，也是有着相对较硬囊壳的微粒的常见例子。

根据本发明，其它常用作造影剂的含气微粒包括糖类(如：己糖，如葡萄糖，果糖或半乳糖；双糖如蔗糖、乳糖或麦芽糖，戊糖如阿拉伯糖、木糖或核糖；二糖如蔗糖、乳糖、麦芽糖；α-，β-，γ-环糊精；多糖如淀粉、羟乙基淀粉、直链淀粉、支链淀粉、糖元、菊粉、出芽短梗孢糖(pulullan)、葡聚糖、羧甲基葡聚糖、葡聚糖磷酸酯、酮葡聚糖、氨乙基葡聚糖、藻酸盐、几丁质、脱乙酰乙丁质、透明质酸或肝素；还有糖醇，包括醛醇如甘露糖醇或山梨糖醇)，无机盐(如氯化钠)，有机盐(如柠檬酸钠，乙酸钠或酒石酸钠)，X-射线造影剂(任何市售的羧酸和非离子性酰胺造影剂，典型地具有至少一个在3和/或5位被如羧酸、氨基甲酰基、N-烷基氨基甲酰基、N-羟基烷基氨基甲酰基、酰氨基、N-烷基酰氨基或酰氨基甲基取代的2，4，6-三碘苯基，如甲泛影酸、泛影酸、异泛影酸、碘克酸、碘海醇、碘喷托、碘帕醇、碘克沙醇、碘普罗胺、甲泛葡胺、胆影酸、胆影酸葡甲胺、醋碘苯酸葡甲胺、泛影酸葡甲胺中)，还有多肽和蛋白质(如明胶和白蛋白如人血清白蛋白)。

一般来说，微泡中包含的气体可以是任何可生物相容的气体，在这里“气体”一词包括在正常人体温37℃下大部分或全部以气态形式存在(含蒸汽)的任何物质(包括混合物)。气体可以包括例如：空气、氮气、氧气、二氧化碳、氢气；惰性气体如氦气、氩气、氙气、氪气；氟化硫如六氟化硫、十氟化二硫或五氟化三氟甲基硫；六氟化硒；可选卤代的硅烷如甲基硅烷或二甲基硅烷；低分子量的烃(如包含最多7个碳原子)，例如，烷烃如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷或戊烷，环烷烃如环丙烷、环丁烷或环戊烷，烯烃如乙烯、丙烯、丙二烯或丁烯，或炔烃如乙炔或丙炔；醚如二甲醚；酮；酯；卤代低分子烷烃(如包含最多7个碳原子)；或上述任何物质的混合物。最好在任何一种卤代的气体中至少有一个卤原子是氟原子；因此，这些生物相容性卤代烃气体可选自以下气体：溴氯二氟甲烷、氯二氟甲烷、二氯二氟甲烷、溴三氟甲烷、氯三氟甲烷、氯五氟乙烷、二氯四氟乙烷、氯三氟乙烯、氟乙烯、氟乙烷、1，1-二氟乙烷和全氟化碳，例如全氟烷烃如全氟甲烷、全氟乙烷、全氟丙烷、全氟丁烷(如，全氟正丁烷、和任意其它异构体如全氟异丁烷的混合物)，全氟戊烷、全氟己烷和全氟庚烷；全氟烯烃如全氟丙烯、全氟丁烯(如全氟丁-2-烯)和全氟丁二烯；全氟炔烃如全氟丁-2-炔；和全氟环烷烃如全氟环丁烃，全氟甲基环丁烷、全氟二甲基环丁烷、全氟三甲基环丁烷、全氟环戊烷、全氟甲基环戊烷、全氟二甲基环戊烷、全氟环己烷、全氟甲基环己烷和全氟环庚烷。其它卤代气体包括氯代甲烷、氟化(如全氟化)酮如全氟化丙酮和氟化(如全氟化)醚如全氟化二乙醚。使用全氟化气体，如六氟化硫和全氟化碳，如全氟丙烷、全氟丁烷和全氟戊烷特别有利，因为含有这些气体的微泡在血液中保持了较高的稳定性。

不同类型的微泡中可以使用相同或不同的气体。

 一种在人或其它动物对象上产生增强了的影像的方法，包括给予上述造影剂的给药步骤和产生上述受试对象至少一个部分的超声图像。

所述造影剂在诊断学超声成像中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点包括：本发明造影剂制备过程简单，反应条件温和，原料易得，具有产业化实施的可能性；在诊断用声强下造影不会轻易被破坏；且造影效果好，具有很好的应用前景。

具体实施方式

鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。

根据本发明，造影剂可以通过适当地混合不同种类的微粒来制备。在干的状态下混合微粒和/或其前体来制备成产品，此产品通过选用适当的水性载体液中如灭菌注射用水溶解后给药，也可以在混合之前将一种或几种微粒混悬或用其它适宜的方法混合在水性载体液体中。通过后一种方法制备的含水制剂根据本发明可以直接作为造影剂使用，也可以根据需要干燥，如通过冷冻干燥法制成干燥的可稳定保存的并可加水复溶的制剂。

用于上述制备过程中的磷脂稳定的微球混悬体，可以通过例如在含有磷脂的含水介质中产生气体微泡来制备。这一过程可通过以合适的技术来乳化含磷脂的含水介质而实现，乳化技术包括如超声处理、震荡、高压均化、高速搅拌或高速剪切混合，例如在选定气体存在下使用定子-转子均化器。水性介质中根据需要可以加入提高粘度和/或助溶的添加物，如醇或多元醇，如甘油和/或丙二醇。

在乳化过程中使用的气体可以不是终产物中需要的气体。这是由于这些气体的大部分在随后的低压冷冻干燥过程中被去掉了，残留的一部分也将在干燥的产品中蒸发挥散，此时再以等于或高于大气压的压力加入终产物所需要的气体。因此乳化过程中气体环境的选择可以只考虑优化乳化过程，而不必考虑终产物的问题。在氟化硫如六氟化硫或氟代的低分子量烃类气体如全氟烷烃或全氟环烷烃，优选含4或5个碳原子，的存在下的乳化过程从终产物的均匀性和微泡大小分布的狭窄来说是特别有利的。

乳化过程可以在室温下，如，大约25±8℃下很方便地实现。在乳化前加热含水介质是必要的，这样可以促进水化过程，加速脂类的分散，并使介质与环境温度保持平衡。  得到的悬浊液最好进行一次或多次的洗涤步骤以分离并除去多余成分如增稠剂和助溶剂，以及无用物质如不包含气体的胶粒、太小的和/或太大的微泡。这样的洗涤可通过与本身相应的方法来完成，微泡的分离可以用浮选法或离心法等方法来分离。通过这种方法体积分级分离粒子后的微泡分散系至少95％的微泡大小可在1.5μm范围内，如，具有体积平均粒径在2-5μm范围内。

每一次低温冷冻干燥最好在一种或多种低温保护剂和/或防溶剂和/或疏松剂的存在下进行，这些保护剂应在每次洗涤后，低温冷冻干燥前加入。这些低温保护剂或防溶剂的具体目录列在《制药技术学报》Acta Pharm.Technol.34(3).PP.129-139(1998)中，其内容整体在此引用作为参考。这些保护剂包括醇(如脂肪族醇如叔丁醇)，多羟基化合物如甘油，氨基酸如甘氨酸，碳水化合物(如糖类如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖、葡萄糖、乳糖和环糊精，或多糖如葡聚糖)和聚二醇类如聚乙二醇。优选使用生理相容性良好的糖类如蔗糖(如，以一定的量来使造影剂等渗或稍高渗)。

由于冻干的成品一般在使用前复溶成悬浊液，所以混合好的产物最好在低压冻干前装入可封口的小玻璃瓶中，以便使每个小瓶装量适当。例如每瓶装入单剂量的冻干制剂，以便在使用时复溶成可供注射的形式。通过在单个小瓶中而不是整批冻干分散体，可以避免接触冻干了的产品或至少部分降解产物的危险。冻干和任何可选的蒸发气体的进一步操作以及向瓶内充入终产物造影剂微泡中含有的气体之后，将小瓶以适当方式封口。

一般地，此冻干制品将加入适当的可注射的载液复溶，如灭菌除热原水或注射用生理盐水。盛装干品的小瓶可方便的用一种隔膜塞封口，可用注射器通过它将溶剂注入。注入溶剂后最好混匀或轻轻震荡，用不超过手摇的轻微震荡就可将此冻干品复溶成含有均匀微泡的制剂。

下面的非限制性的实施例用来说明本发明：

实施例1

a)磷脂包封的全氟丁烷的制备

将500 mg氢化卵磷脂酰丝氨酸加入到100ml含5.5％(w/w)的丙二醇和甘油(2∶10w/w)混合物的水中，振摇混合物并加热到85℃保持6分钟，凉至室温，再次振摇，并在使用前放置过夜。

将50ml此溶液移入茄形烧瓶，将此烧瓶固定在一个装有控制温度的进、出水口，接28℃水浴的玻璃夹套中。溶液中插入转子搅拌器，为了防止气体泄漏，在瓶颈壁和搅拌轴之间用专门设计的金属塞子封好，此塞子安装了一个气体进出导管，用于调节进气量和瓶内压力。将气体出口联接真空泵，使瓶内溶液脱气2分钟，然后通过气体进口导入1个大气压的全氟丁烷。

将溶液在23000rpm搅拌，保持搅拌器速度使溶液面上有一个轻微的旋涡。均化10分钟后得到白色奶油状分散物，将其转移到可密闭容器中，用全氟正丁烷洗涤。然后将此分散物转移到分液漏斗中在12500rpm下离心35分钟，得到上层奶油状微泡层和下层的混浊层，弃去下层，加入水，然后在12500rpm下重复离心两次，每次18分钟。然后将上层物用10％(w/w)蔗糖溶液置换，将得到的分散物按每份5ml的量装入专用于低压冻干的10ml平底小玻璃瓶中，将小瓶降温至-47℃冻干大约45小时，得到白色疏松固体。将小瓶置于真空室，用真空泵抽去空气，置换以全氟正丁烷气体。

b)包括两种微粒的造影剂的制备

将根据WO-A-9607434中实施例3(a)-(r)的任意例子制备的含气聚合物微粒加入到含有上述实施例1(a)中已冻干的产品的小瓶中，然后加入注射用水，用手轻轻振摇几秒钟，即得到本发明的造影剂处方。

或者是，将注射用水加入到含有上述例1(a)中已冻干的成品的小瓶中，轻轻振摇小瓶得到微泡分散物，然后再加入根据WO-A-9607434中实施例3(a)-(r)的任意例子制备的含气聚合物微粒，可以以干品加入，也可以以溶于注射用水的分散物方式加入。根据本发明，得到的混合物可以直接用作造影剂处方，或低压冻干，得到干燥的可稳定贮存的产品，为以后用含水溶剂如注射用水复溶使用。

实施例2

狗心内造影

将一条16kg的狗用戊巴比妥麻醉，使其仰卧。使用ATL HDI-3000超声仪用P3-2相控阵探头对心脏进行短轴造影，以发射频率为1.8MHz，接收频率为3.5MHz作二次谐波造影。运用相对较高的功率(机械指标为0.8)

依次静脉注射两种制剂。上述实施例1(a)中的制剂A是由“外力敏感型”微泡，对超声波非常敏感，但是在高的超声压下显示出相对较低的稳定性组成。WO-A-9607434中实施例3(1)例子中的制剂B，是由在高超声压下有较高的稳定性的微粒组成的。

先以0.2μl微泡/kg的量给狗注射制剂A。心肌造影显示出此造影剂对左心室前壁的图象的提高不如对瓣膜和后壁的明显，图象中的杂色可能为异常灌注的信号。

注射制剂A后约1分钟即得到稳定的图象，然后注入12mg/ml的制剂B 3ml。可以观察到前壁的造影明显提高并好于瓣膜和后壁的造影。由于制剂B需要较高的声压才能成为有效的造影剂，因此，单独使用制剂B造影不能提供一个足够好的全面的心脏图象，不能给心脏所有部分提供一个较好的判断。制剂A和制剂B的联合使用揭示了单独使用制剂A所观察到的明显的灌流缺陷只是伪象。

应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种包含两种充气微泡的造影剂，其特征在于包含囊壳和至少两种不同类型的含气微粒，所述微粒类型不同在于其对超声压的敏感性不同。

2.根据权利要求1所述包含两种充气微泡的造影剂，其特征在于所述充气微粒分别为有着相对较软的囊壳的第一种含气微粒、有着相对较硬的囊壳的第二种含气微粒或含其它稳定剂。

3.根据权利要求2所述包含两种充气微泡的造影剂，其特征在于所述第一种含气微粒的囊壳包含至少一种磷脂，所述磷脂囊壳包含一种或多种磷脂，选自磷脂酰胆碱、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、心磷脂、神经鞘磷脂和它们中任一种的氟化类似物。

4.根据权利要求3中所述包含两种充气微泡的造影剂，其特征在于其中至少75％磷脂囊壳包含带净电荷的磷脂分子。

5.根据权利要求3中所述包含两种充气微泡的造影剂，其特征在于其中至少75％磷脂囊壳包含一种或多种合成或半合成磷脂酰丝氨酸。

6.根据权利要求2所述的包含两种充气微泡的造影剂，其特征在于所述第二种含气微粒囊壳包括生物可降解聚合物壳聚糖。

7.根据权利要求1所述包含两种充气微泡的造影剂，其特征在于所述含气微粒包含至少一种选自以下的气体：空气、氮气、氧气、二氧化碳、氢气、稀有气体、氟化硫、六氟化硒、可选卤代的硅烷、低分子量烃类、醚、酮、酯和卤代的低分子量烃类，所述何卤代烃中至少有一个卤原子是氟原子。

8.一种权利要求1-7任一项所述的包含两种充气微泡的造影剂的制备方法：其特征在于其步骤包括：

1)含气微粒的制备

将一定质量的磷脂加入到一定量溶剂中，震荡并加热到一定温度下反应一段时间，冷却至室温，再震荡并放置；

将上述溶液转移至烧瓶中放置在恒定28℃水浴中，在密闭情况下先脱气2min，再通入所需气体；

将溶液利用转子搅拌器在23000rpm下搅拌反应一段时间，转移至密闭容器中用溶剂洗涤，再在12500rpm下离心，除去下层液体，加水重复离心几次；

然后将上层物用10％(w/w)蔗糖溶液置换，将得到的分散物按每份5ml的量装入专用于低压冻干的10ml平底小玻璃瓶中，将小瓶降温至-47℃冻干大约40-50小时，得到白色疏松固体，将小瓶置于真空室，用真空泵抽去空气，置换以所需气体；

2）包括两种微粒的造影剂的制备

含气聚合物微粒加入到含有上述中已冻干的产品的小瓶中，然后加入注射用水，用手轻轻振摇几秒钟，即得到本发明的造影剂。

9.一种在人或其它动物对象上产生增强了的影像的方法，其特征在于包括给予权利要求1-7中任一项记载的造影剂的给药步骤和产生上述受试对象至少一个部分的超声图像。

10.权利要求1-7中任一项所述造影剂在诊断学超声成像中的应用。