JPH10505585A

JPH10505585A - フッ素含有殻を有する気体充填マイクロスフェア

Info

Publication number: JPH10505585A
Application number: JP8506664A
Authority: JP
Inventors: ロルフローマン，
Original assignee: モレキュラーバイオシステムズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1994-08-02
Filing date: 1995-07-31
Publication date: 1998-06-02
Also published as: EP0769969B1; DE69528270D1; WO1996004018A1; KR970704475A; US5562893A; AU703652B2; CA2196599A1; ATE224205T1; ES2183881T3; DE69528270T2; EP0769969A1; EP0769969A4; AU3153695A

Abstract

(57)【要約】改良された超音波イメージング造影剤が提供されている。これは、生体適合性のフッ素を含有する両親媒性材料の弾性殻によりカプセル化された少なくとも１種の気体(好ましくは、パーフルオロカーボン)を含有するマイクロスフェアの水性懸濁液から構成されている。また、このマイクロスフェアの製造方法およびこの改良された造影剤を用いる診断用イメージングの方法も提供されている。

Description

【発明の詳細な説明】フッ素含有殻を有する気体充填マイクロスフェア説明技術分野本発明は、超音波イメージングの分野にある。さらに特定すると、本発明は、超音波イメージングに有用なマイクロスフェア、およびこのようなマイクロスフェアの水性懸濁液、ならびにこのような懸濁液の超音波イメージングにおける使用に関し、このマイクロスフェアは、生体適合性のフッ素含有両親媒性材料から構成される殻によりカプセル化された気体の微小気泡を含有する。背景診断用超音波イメージングは、音波エネルギー波が目的の領域に集められ、かつその画像を生じるような様式で反射され得るという原理に基づいている。超音波変換器が画像化される領域に重なる身体表面上に配置され、そして音波形状の超音波エネルギーがその領域に向けられる。超音波エネルギーが身体を通って移動するにつれて、このエネルギー速度およびこのエネルギーが遭遇する体組織および物質の音響特性によって、超音波エネルギーの吸収、分散、伝播、および反射の程度が測定される。次いで、変換器により、反射した超音波エネルギーの量および特徴が検出され、そしてデータが画像に変換(translate)される。超音波がある物質から他の物質に移動する場合、その界面において、ある程度の反射が起こる。反射の程度は、界面を規定する物質の音響特性に関連する。例えば、液固界面または気液界面を用いて、これらの音響特性を変える際には、その反射の程度は高められる。この理由のために、気体を含有する造影剤は、超音波を反射するに特に有効である。それゆえ、このような造影剤は、遭遇される物質の反射の程度を増大させ、そして超音波イメージングの鮮明度を高める。 OphirおよびParkerは、(1)遊離気泡および(2)カプセル化した気泡の２種類の気体含有イメージング剤を記載しており(Ultrasound in Medicine and Biology 15(4):319〜333(1989))、後者は、前者を用いて遭遇する不安定性および毒性の問題を克服するための試みて開発された。カプセル化した気泡を、以降「マイクロスフェア」という。これは、タンパク質または他の生体適合性材料の殻に取り囲まれた気体の微小気泡から構成される。このようなイメージング剤の１つは、は空気を充填したアルブミンマイクロスフェアの懸濁液からなる。一般に、特定の気体のマイクロスフェアは、同一の気体の遊離の気泡と比べる場合、インビボにて向上した安定性を示す。しかし、ほとんどのマイクロスフェアは、依然として、造影剤としての有用性を制限するインビボでの半減期が比較的短い。このインビボでの不安定性は、圧力下での殻の崩壊または破損から生じ、その結果、気体がマイクロスフェアから急速に拡散すると考えられている。それゆえ、最近では、インビボでの安定性を増す方法として、この殻の改良に多くの試みがなされている。タンパク質の殻で覆ったマイクロスフェアに関する公知の改良としては、タンパク質の殻を界面活性剤で被覆すること(Giddy、PCT/WO 9 2/05806号)およびタンパク質の殻を化学架橋すること(Holmesら、PCT/WO92/1721 3号)が挙げられる。マイクロスフェアの安定性の改良に向けられている別の試みには、非タンパク様の殻形成材料を使用することが挙げられる。Bichonら(EPA第92/810367号)およびSchneiderら(Inv．Radiol．27：134〜139(1992))は、界面に配置したポリマーから作製されるポリマー性「マイクロバルーン(microballoon)」の製造を記載している。このポリマーは、種々の気体(例えば、二酸化炭素、亜酸化窒素、メタン、フレオン、ヘリウム、および他の希ガス)をカプセル化している。Klaveness (PCT/WO92/17212号)は、化学的に結合した非タンパク様の両親媒性部分の使用を記載しており、この部分は「空気、窒素、酸素、水素、亜酸化窒素、二酸化炭素、ヘリウム、アルゴン、六フッ化イオウ、および必要に応じてフッ素化した低分子量炭化水素(例えば、メタン、アセチレン、または四フッ化炭素)」をカプセル化している。Erbelら(米国特許第5,190,982号)は、ポリアミド−ジカルボン酸- コ-イミド誘導体の使用を記載している。さらに最近では、Schneiderら(欧州特許出願第554,213 A1号)は、ある物理的性質を有する気体を含有するマイクロスフェアが、改良された安定性を有することを示した。マイクロスフェアの不安定性は、それらが、一旦、循環系に導入されると、マイクロスフェアが曝される圧力の増大により引き起こされることが理論付けられている。Schneiderらは、観察した耐圧性の増大の原因となるメカニズムについては推測していないが、本発明者らは、それが水性環境との気体の交換速度に対する気体溶解度の影響によると考えている。ヘンリーの法則の原理によれば、圧力が増大するにつれて、一定気体の溶液への溶解度もまた増大する。溶液において、気泡が圧力を受ける場合、気泡中の気体と取り囲んでいる溶液との間の気体の交換速度は、圧力量に比例して増大し、気体の気泡は、最終的に完全に可溶化する。取り囲んでいる溶液に対して気体が不溶性になるほど、気泡の完全な可溶化にはより長い時間がかかる。気体の気泡が殻に取り囲まれている際（すなわち、マイクロスフェアの形態である際）には、マイクロスフェアの殻は、マイクロスフェア中の気体と取り囲んでいる溶液との間の接触を完全には排除しないので、依然として、気体交換の影響が認められる。従って、溶液中に懸濁したマイクロスフェアに圧力がかけられる場合、マイクロスフェア内の気体は、最終的には、取り囲んでいる溶液に可溶化して、マイクロスフェアの崩壊を生じる。超音波イメージングに有用なマイクロスフェアは、代表的には、ある程度の弾性を有する殻を備える。この特性は、２つの重要な理由から必要である。第一には、硬い殻を有するマイクロスフェアは、超音波イメージングに使用されるものよりも高い振動数で共鳴し得、それにより、造影向上剤(contrast enhancer)としての効率が低くなる。第二に、硬い殻のマイクロスフェアは、圧力に曝される場合、クラックまたは割れを生じ得、それゆえ、気体内容物が水性環境に放出される。弾性殻のマイクロスフェアは、上記問題を克服し得る一方で、残念なことに、それらがより浸透性である傾向のために、水性環境との気体交換の影響をより受けやすい。この結果、マイクロスフェア内の気体と取り囲んでいる水性環境との間の接触の程度がより大きくなり、それゆえ、気体交換が促進される。マイクロスフェアの中心における気体の、取り囲んでいる水性環境との交換を抑制するために、本発明は、マイクロスフェアの殻材料にフッ素を導入することを記載している。フッ素含有殻を有するマイクロスフェアは、低い透水性を示し、それゆえ、気体交換による圧力不安定性に対する耐性を増強させる。発明の開示本発明は、フッ素含有殻を有する新規な気体充填マイクロスフェアを用いる超音波イメージング組成物およびその方法を提供する。特に、本発明は、マイクロスフェアの水性懸濁液を含有する超音波イメージング剤として使用するための組成物を提供する。このマイクロスフェアは、少なくとも１種の生体適合性気体の微小気泡を取り囲んでいる両親媒性の生体適合性材料から形成されるフッ素含有殻を含む。気体は、好ましくは不溶性であり、より好ましくはフッ素化されており、さらにより好ましくは、C₁〜C₅のパーフルオロカーボンである。適切な過フッ素化気体としては、パーフルオロメタン、パーフルオロエタン、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン、およびパーフルオロペンタンが挙げられる。適切なフッ素含有殻材料としては、脂質、タンパク質（天然に生じるタンパク質および合成のアミノ酸ポリマーの両方を含む）、合成有機ポリマー、ならびにそれらの混合物およびコポリマーが挙げられる。この殻材料は、好ましくはタンパク質であり、さらに好ましくはヒト血清アルブミンである。本発明はまた、フッ素含有殻を有するマイクロスフェアの製造方法を提供する。この方法は、殻材料と、殻材料へのフッ素部分の導入をもたらすフッ素含有反応性化合物とを反応させる工程を包含する。本発明はさらに、超音波イメージングにおいて組織および器官のコントラストを高める方法を提供し、この方法は、上記組成物を被験体に注入する工程、および超音波画像を検出する工程を包含する。発明の実施の態様本発明は、安定化したマイクロスフェアに関し、このマイクロスフェアは、気体の微小気泡を取り囲んでいる生体適合性材料から形成されるフッ素含有殻を含む。このような殻材料は、フッ素を含有しない等価物よりも透水性が低い。さらに、特定の気体と殻との間で起こる相互作用により、マイクロスフェアがさらに安定化され得る。特に、気体もまたフッ素を含有する場合、気体と殻との間のフッ素−フッ素相互作用により、取り囲んでいる水性環境との気体交換に対してさらなる障壁が提供される。適切な殻材料は、両親媒性でなければならず、すなわち、疎水性部分と親水性部分との両方を含む。それはまた、カプセル化した気体の周囲に薄層または被覆 (skin)を形成し得ることが必要であり、一般に、外部に配向した親水基と内部に配向した疎水基が生じる。マイクロスフェアが、不溶性気体を含有するように生成される場合、マイクロスフェア形成の間の不溶性気体の存在により、この配向が高められると考えられている。このようにして形成された殻はまた、固体でなければならない。用語「固体」は、画像化される被験体の温度における物質の状態を示すように使用され、これは、液体状態または気体状態のいずれかと区別され、一般に、分離している非流体でありかつ形状(form or shape)を維持し得るように特徴付けられる。被験体が画像化される温度(イメージング温度)にて準液体である組成物、例えば、イメージング温度(体温)に近い(すなわち、15℃以内の)転移温度を有する特定の液体は、液体と固体との両方のいくつかの特徴を有する。これらの準液体もまた本発明により考慮され、用語「固体」に包含される。マイクロスフェアの殻の厚みは、主にそれを形成するときの剛性に依存するが、一般には10nm〜500nmの範囲である。マイクロスフェアの殻を形成するのに適切な種々のクラスの材料としては、脂質、タンパク質（天然に生じるタンパク質および合成のアミノ酸ポリマーの両方）、合成有機ポリマー、ならびにそれらの混合物またはコポリマーが挙げられる。脂質殻は、天然に生じる脂質または合成脂質のいずれか、例えば、リン脂質( 例えば、ホスホグリセリド、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジル-グリセロール(カルジオリピン))；糖脂質(例えば、モノ−、ジ−、およびトリヘキソシド、スルファチド、グリコスフィンゴ脂質、およびリゾホスファチジルコリンで誘導体化された、セレブロシド、ガラクトセレブロシド、グルコ-セレブロシド、スフィンゴミエリン、スフィンゴ脂質)；不飽和脂肪酸(例えば、パルミトレイン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、α−リノレン酸、およびアラキドン酸)；飽和脂肪酸(例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、およびセロチン酸)；モノ−、ジ−、およびトリグリセリド；ならびにステロイド(例えば、コレステロール、コレテロールエステル、コレスタノール、エルゴステロール、コプロスタノール、スクアレン、およびラノステロール)から形成され得る。主として脂質からなる殻は、一般に、気体に隣接する疎水性側に配向され、その一方で親水性側は、マイクロスフェアの外部表面を形成する。ほとんどの脂質の親水性部分は、極性（すなわち、カチオン性またはアニオン性(例えば、リン脂質のホスフェート部分)）を有するか、またはそれらはホスファチジルコリンのように双性イオンであり得る。あるいは、極性基を有さない脂質は、例えば、非イオン性の親水性部分(例えば、ポリエチレングリコールまたは炭水化物)を導入することにより極性にされ得る。リン脂質は、脂質殻材料の特に有用なサブクラスである。種々のリン脂質は、特徴的な相転移温度Ｔ_cを有し、この温度未満では、脂肪アシル鎖は、準結晶構造を形成し、この温度を上回ると、この鎖は、より準液体状態になる。温度の上昇と共に、準結晶から準液体に転移する能力により、インビボでさらに弾性が高いマイクロスフェアの作製が容易になり得る。例えば、25℃と37℃との間のＴ_c を有するリン脂質を用いて、室温(20℃〜25℃)で、固体殻のマイクロスフェアが形成され得る。これは、37℃のイメージング温度で軟らかくなる。これにより、殻の弾性が向上して、エコー源性が高められ得る。より低いＴ_c値を有するリン脂質(例えば、ジミリストイルまたはジペンタデカノイルグリセロホスホコリン) は、本発明のこの局面において使用するのに特に適切である。一連の合成L−α−レシチン(1,2-ジアシル-sn グリセロ-3-ホスホコリン、またはグリセロホスホコリン)のＴ_c値を比較すると、Ｔ_cが炭化水素鎖長に比例して一様に上昇することが示される。ジパルミトイルグリセロホスホコリンは、41 ℃のＴ_cを有する一方で、ジミリストイル誘導体は、23℃のＴ_cを有する。ジアステロイル誘導体およびジアキドイル誘導体は、それぞれ、55℃および66℃のＴ_c を有する。また、これらと、異なるＴ_c値を有する他のリン脂質との混合物も、マイクロスフェアの殻の所望の転移特性を達成するために使用され得ることが意図される。さらに、マイクロスフェア中の気体および殻材料へのフッ素の導入は、Ｔ_c値を変え得る。この効果は、リン脂質を選択する場合に、考慮されるべきである。脂質殻はまた、必要に応じて、殻の剛性、弾性、生分解性、および／または生体分布特性を改変するために有用な、タンパク質、アミノ酸ポリマー、炭水化物、または他の物質を混入し得る。ステロールの混入は、殻の剛性を高めるために特に有用である。殻の剛性はまた、例えば、光照射を用いる架橋により高められ得る。タンパク質殻材料としては、天然に生じるタンパク質と合成のアミノ酸ポリマーとの両方が挙げられ、これらは、本明細書中において共に、一般に「タンパク質」として記載されるクラスの殻材料に入ると言われる。天然に生じるタンパク質の例としては、γ−グロブリン(ヒト)、アポ−トランスフェリン(ヒト)、β− ラクトグロブリン、ウレアーゼ、リゾチーム、およびアルブミンが挙げられる。合成のアミノ酸ポリマーは、必要に応じて、同一の鎖または異なる鎖において疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸との両方を組み合わせるブロックコポリマーまたはランダムコポリマーの形態であり得る。タンパク質またはアミノ酸ポリマーの構造は、以下のように表わされる：ここで、Rは、アミノ酸の側鎖である(例えば、システインのRはHSCH₂である)。アミノ酸の側鎖はまた、一般にタンパク質／ポリマーのフッ素含有部分である。合成有機ポリマーもまた、マイクロスフェアの殻を形成するに適切である。これらのポリマーは、１つの繰り返し単位、またはランダム、交互、またはブロックタイプのコポリマーを形成する異なる繰り返し単位からなり得る。これらの有機ポリマーとしては、架橋した高分子電解質(例えば、ホスファゼン、イミノ置換ポリホスファゼン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリビニルアセテート、ポリビニルアミン、ポリビニルピリジン、ポリビニルイミダゾール、およびそれらのイオン性塩)が挙げられる。これらの高分子電解質の架橋は、反対の電荷を有する多価イオンとの反応により行われる。さらなる安定化は、高分子電解質と同様の電荷を有するポリマーを添加することにより達成され得る。米国特許第5,149,543号を参照のこと。これは、本明細書中で参考として援用される。本発明中の殻材料に適切なポリマーを形成するために使用され得る、別の合成有機モノマー性繰り返し単位には、ヒドロキシ酸、ラクトン、ラクチド、グリコリド、アクリル含有化合物、アミノトリアゾール、オルトエステル、無水物、エステルイミド、イミド、アセタール、ウレタン、ビニルアルコール、エノールケトン、および有機シロキサンがある。殻材料へのフッ素の導入は、任意の公知の方法により達成され得る。例えば、パーフルオロ-t-ブチル部分の導入は、米国特許第5,234,680号；SYNTHESIS OF F LUOROORGANIC COMPOUNDS(Springer-Verlag、New York、1985)；Zeifman、Y.V.ら、Uspekhi Khimii(1984)53 p.431；およびDyatkin、B.L.ら、Uspekhi Khimii(19 86)45 p.1205に記載されている。これらの方法は一般に、以下のようなパーフルオロアルキルカルボアニオンとホスト分子との反応を包含する：ここで、Rはホスト分子であり、そしてXは、良好な脱離基(例えば、Br、Cl、I、またはスルホナト基)である。当該分野で周知の方法を用いて、前述のモノマー性殻材料に残基を添加した後、次いで、パーフルオロ-t-ブチル部分は、上記のようにして、これらの誘導体化した殻材料(ホスト分子)に容易に導入され得る。種々の有機化合物にトリフルオロメチル基を導入するための別の方法が知られている。このような方法の１つは、パーフルオロアルキル−トリアルキルシランを用いる、求核性のパーフルオロアルキル化によるトリフルオロメチル基の導入を記載している(SYNTHETIC FLUORINE CHEMISTRY pp.224〜245(John Wiley & Son s，Inc.、New York、1992))。フッ素は、モノマー性またはポリマー性の形態のいずれかにて、任意の上記殻材料に導入され得る。好ましくは、フッ素部分は、モノマー(例えば、脂肪酸、アミノ酸、または重合性合成有機化合物)に導入され、次いで、マイクロスフェアの殻形成材料としてのその後の使用のために重合される。殻材料へのフッ素の導入はまた、パーフルオロカーボンガスの存在下にてマイクロスフェアを形成することにより達成され得る。例えば、機械式キャビテーションを用いて、パーフルオロカーボンガス(例えば、パーフルオロプロパン)の存在下にてタンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン)からマイクロスフェアが形成される場合、その気相に由来のフッ素は、形成時にタンパク質殻に結合される。殻材料中のフッ素の存在は、崩壊したマイクロスフェアから精製された殻の破片のNMRにより後に検出され得る。フッ素はまた、マイクロスフェアを形成する他の方法(例えば、音波破砕、噴霧乾燥、または乳化技術)を用いてマイクロスフェアの殻材料に導入され得る。殻材料にフッ素を導入し得る他の方法は、フッ素含有反応性化合物の使用によるものである。用語「反応性化合物」は、フッ素部分が殻材料に共有結合するような様式で、殻材料と相互作用し得る化合物をいう。殻形成材料がタンパク質である場合、好ましい反応性化合物は、アルキルエステルまたはアシルハライドのいずれかであり、これらはタンパク質のアミノ基と反応して、アシル化反応を経てアミド結合を形成し得る(ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY pp.417〜418(John Wil ey & Sons，Inc.、New York、New York、第４版、1992)を参照のこと)。反応性化合物は、マイクロスフェアの形成の間の任意の段階で導入され得るが、好ましくは、マイクロスフェアの形成前に気相に添加される。例えば、マイクロスフェアが、機械式または超音波キャビテーション技術を用いて作製される場合、反応性化合物は、マイクロスフェアの形成において用いられる気体(出発気体)を反応性化合物の溶液に通してバブリングすることにより、気相に添加され得る。この溶液は、所望量の反応性化合物を気相に導入するに充分な一定温度で保持される。得られる気体混合物は、その時点では、出発気体と反応性化合物とを含有し、次いで、マイクロスフェアを形成するために使用される。マイクロスフェアは、好ましくは、米国特許第4,957,656号(これは、本明細書中で参考として援用される )に記載のような、気体混合物の存在下にてヒト血清アルブミンの音波破砕により形成される。適切なフッ素含有アルキルエステルおよびアシルハライドを、表Ｉに示す：上記アルキルハライドおよび酸エステルの使用に加えて、多くの他のフッ素含有反応性化合物、例えば、パーフルオロカーボン部分(−CF₃、−C₂F₆、−C₃F₈、 −C(CF₃)₃)を含有するアルデヒド、イソシアネート、イソチオシアネート、エポキシド、スルホニルハライド、無水物、酸ハライド、およびアルキルスルホネートが合成され得ることは、合成有機化学の当業者に周知である。これらの反応性化合物は、次いで、フッ素部分の共有結合を達成するに適切な組み合わせを選択することにより使用され得、任意の上記殻材料にフッ素部分を導入する。マイクロスフェアの殻の水性環境への透過性を低下させるには、充分なフッ素が導入されるべきである。この結果、水性環境との気体交換の速度が遅くなる。このことは、耐圧性が増強することにより証明される。マイクロスフェアを安定化するのに必要とされる特定量のフッ素は、殻材料およびそれに含有される気体に依存するが、フッ素の導入後、殻材料は、好ましくは、0.5重量％〜20重量％のフッ素、そしてさらに好ましくは、１重量％〜10重量％のフッ素を含有する。本発明の使用に適切な気体は、薬理学的に許容可能である（すなわち、生体適合性であり、かつヒトに対する毒性が最小である）。用語「生体適合性」は、気体が、毒性の副生成物を形成することなく代謝される能力を意味する。用語「気体」は、イメージングが行われる温度(代表的には、通常の生理学的温度)で気体であるかまたは気体を形成し得る任意の化合物をいう。気体は、１つの化合物または化合物の混合物から構成され得る。本発明での使用に適切な気体の例には、空気、O₂、N₂、H₂、CO₂、N₂O；希ガス(例えば、アルゴン、ヘリウム、キセノン) ；炭化水素ガス(例えば、メタン、エタン、プロパン、n-ブタン、イソブタン、およびペンタン)、ならびにパーフルオロカーボンガス(例えば、パーフルオロメタン、パーフルオロエタン、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン、パーフルオロイソブタン、およびパーフルオロペンタン)がある。気体は、好ましくは水に不溶（大気圧および25℃の温度にて、水１mL当たり0.01mL未満の気体の溶解度を意図する）のパーフルオロカーボンであり、この程度の不溶性により、インビトロでの最大の安定性と、インビボでの持続性とが得られる。溶解度は、任意の適切な方法により測定され得る。例えば、Wen-Yang Wenら（1979）J．Solub ility Chem．8(3)：225〜246を参照のこと。本発明での使用に適切な好ましい不溶性気体の一部(non-exhaustive)のリストを表IIに示す。本発明のマイクロスフェアは、従来の気体充填マイクロスフェアを製造するために使用される公知の方法(例えば、音波破砕、粉砕装置を用いる機械式キャビテーション、または乳化技術)により製造され得る。このような技術は、米国特許第4,957,656号；第5,137,928号；第5,190,982号；第5,149,543号；PCT出願WO 92/17212号；WO 92/18164号；WO 91/09629号；WO 89/06978号；WO 92/17213号； GB 91/00247号；およびWO 93/02712号；ならびにEPA第458,745号および第534,21 3号に例示されており、これらは、本明細書中で参考として援用される。本発明のマイクロスフェアはエコー源性であり(すなわち、音波を反射し得る) 、血液または組織のものと顕著に異なる音響特性を有する材料から構成されている。マイクロスフェアの最大サイズ(平均直径)は、肺毛細血管を通るサイズにより定義される。ヒトの場合には、このサイズは、代表的には、約10マイクロメートル未満である。それに対応して、その最小サイズは、超音波イメージングに代表的に使用される超音波振動数において有効な音響散乱を提供するサイズである。(この振動数は、イメージングのモード(例えば、経胸腔的、経食道的)と共に変化し得、通常、２MHz〜12MHzの範囲である)。この最小サイズは、代表的には、約0.1マイクロメートルである。本発明の方法で使用されるマイクロスフェアの代表的な平均サイズは、約２マイクロメートル〜約７マイクロメートルである。このサイズにより、もし必要であれば(例えば、末梢静脈注射部位が用いられる場合)、画像化されるべき領域に達する前にフィルターがかけられることなく、毛細血管を通過することが可能となる。それゆえ、本発明のマイクロスフェアは、動脈への注射または画像化されるべき領域への直接注射を行うことなく、組織を灌流し、そして組織、器官、および良好に灌流した組織と良好に灌流されてなかった組織との間の差異の画像化を高め得る。従って、これらは、末梢静脈、または身体の他の所定の領域に注射され得、血管造影に必要とされる動脈注射よりも侵入がかなり少なくなる。本発明のマイクロスフェアは、広範な領域を画像化するのに使用され得る。これらの領域としては、心筋組織、肝臓、脾臓、腎臓、ならびに超音波技術で現在画像化される他の組織および器官が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のマイクロスフェアの使用により、このような現在得られ得る画像を高め得る。マイクロスフェアの懸濁液は、マイクロスフェアを、形成後、所望の濃度(好ましくは、１mLあたり、５×10⁷個〜５×10⁹個のマイクロスフェア)の懸濁液(これは、任意の生体適合性の水性液体であり得る)まで希釈することにより製造される。このような液体の例には、緩衝液、生理食塩水、タンパク質溶液、および糖溶液がある。本発明のマイクロスフェア懸濁液は、インビボおよびインビトロの両方で安定である。インビボでの安定性は、濃縮した懸濁液(１mL当たり、およそ１×10⁹個のマイクロスフェア)が、１平方インチ当たり40ポンド(psi)の圧力に耐える能力の関数であり、これは、この圧力で１分後、サイズ分布に測定可能な(appreciab le)変化がないことにより証明される。操作方法に関しては、問題のマイクロスフェアの使用は、従来のマイクロスフェア造影剤の使用と同様である。使用されるマイクロスフェアの量は、多くのファクターに依存する。これらのファクターとしては、液体キャリア(水、糖溶液など)の選択、所望の不透過性の程度、画像化されるべき身体の領域、注射部位、および注射回数が挙げられる。しかし、すべての場合において、超音波スキャン(scanning)の使用によって識別可能な画像の向上を達成するために、充分なマイクロスフェアが液状キャリア内で使用される。本発明を、以下の実施例によりさらに例示する。これらの実施例は、いずれの様式でも本発明を限定する意図はない。実施例１不溶性気体をカプセル化した脂質ベースの材料からなるマイクロスフェアの調製ホスファチジルコリンを、以下のようにしてフッ素化する：ω−ブロモカルボン酸エステル(Br(CH₂)_nCOOCH₂CH₃)およびパーフルオロイソブチレン((CF₃)₂CF＝ CF₂)を、室温でCsFおよびモノグリムの存在下にて反応させて、フッ素化エステル((CF₃)₃C(CH₂)_nCOOCH₂CH₃)を形成する。このエステルを加水分解して、遊離酸 ((CF₃)₃C(CH₂)_nCOOH)を形成し、これをチオニルクロリドと反応させることにより、アシルクロリド((CF₃)₃C(CH₂)_nCOCl)に転化する。このアシルクロリドを、塩基の存在下にて、グリセロホスホコリン(1,2-ジヒドロキシ-3-(2'-トリメチルアンモニウムエチル-1'-ホスフェート))と反応させて、以下のようなフッ素化グリセロホスホコリンを形成する：使用されるブロモカルボン酸エステルの炭素鎖長を、例えば、C₅とC₂₀との間で変化し得る。まず、以下の成分を乳化して水中油型（フッ素化グリセロホスホコリン(単独または他のレシチンと組み合わせのいずれか)、不溶性気体(例えば、上記の表II を参照のこと)および水）の乳濁液を形成することによりマイクロスフェアを形成する。必要に応じて、この乳濁液は、トリオレイン、コレステロール、および／またはα−トロフェロールを含有する。加圧下かつフッ素化グリセロホスホコリンの転移温度を上回る温度で、この乳濁液の均質化を行い、続いて、室温まで冷却する。実施例２出発物質としてポリマーを用いるフッ素含有合成アミノ酸ポリマーの調製以下のようにして、フッ素を含有するポリグルタミン酸ポリマー(ポリナトリウムL-グルタメート-コ-パーフルオロ-t-ブチルプロピルグルタミン)を調製した：ポリ L-グルタミン酸(分子量95,000、1.77ｇ、13.7ミリモル)を、50℃にてジメチルホルムアミド(DMF)40mLに溶解した。室温まで冷却した後、10mLのピリジン、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(1.85ｇ、13.7ミリモル)、およびパーフルオロ-t-ブチルプロピルアミン塩酸塩(2.15ｇ、6.85ミリモル)を添加した。減圧下にてピリジンをエバポレートすることにより、反応混合物を無水物にした。ジシクロヘキシルカルボジイミド(2.82ｇ、13.7ミリモル)を添加し、そしてこの溶液を室温で48時間撹拌した。濾過により、N,N'-ジシクロヘキシル尿素を除去し、そして濾液をpH 3.0に調整した水に注いだ。形成された沈殿物を濾別し、続いて、pH 8.0で水に溶解した。濾過(0.22μのメンブランフィルター)により、溶解しなかった材料を除去した。ポリマー溶液を一晩透析して、可溶性の低分子量材料を除去した。ポリマー溶液を凍結乾燥して、ポリナトリウム L-グルタメート- コ-パーフルオロ-t-ブチルプロピルグルタミンからなる白色でスポンジ状の材料を得た。得られたフッ素化ポリグルタミン酸は、以下の構造：を有し、そのフッ素化部分は、ポリマー中の約40％〜50％のグルタミン酸残基で、ランダムに存在していた。次いで、ポリマーを、例えば、１：10の比でヒト血清アルブミンに添加し、マイクロスフェアを実施例４または５に記載のように作製する。実施例３出発物質としてモノマーを用いるフッ素含有合成アミノ酸ポリマーの調製以下のようにして、フッ素含有ポリアミノ酸ポリマー(ポリ-3-(パーフルオロ- t-ブチル)-2-アミノ酪酸)を合成する：ブロモアセトアルデヒドジエチルアセタールを、CsFおよびジグリムの存在下でパーフルオロイソブチレンと反応させて、以下を得る：ジエチルアセタールの酸加水分解によりアルデヒドを得る。シアン化アンモニウムとのシュトレッカー合成により、対応するアミノニトリルを得る：加水分解により、以下のアミノ酸誘導体を得る：この化合物を、公知の方法を用いて、単独または他のアミノ酸と共に重合させて、フッ素含有合成アミノ酸ポリマーを形成する。次いで、このポリマーを、例えば、１：10の比でヒト血清アルブミンに添加し、マイクロスフェアを実施例４または５に記載のように作製する。実施例４機械式キャビテーションによるマイクロスフェアの製造方法実施例２または３の殻形成材料を用いて、以下のようにしてマイクロスフェアを作製する：５％溶液を連続した減圧下にて２時間脱気する。排気した容器に、マイクロスフェアの形成に使用される気体を充填することにより、減圧を解く。この溶液を、ライン熱交換器(line heat exchanger)を介したキャビテーションにより、アルブミンの局部的な変性を達成するに必要な温度(約68℃)に調整し、そして約100mL／分で、コロイドミル(例えば、２インチのコロイドミル(Greerco 、Hudson NH、モデルW250VまたはAF Gaulin、Everett、MA、モデル2F))にポンプで送給する。気体を、室温にて約120mL／分〜220mL／分の流速で、注入口のちょうど上流にある液体供給装置(liquid feed)に添加する。このローターとスターターとの間の間隙を、約2/1000インチに調整し、そしてアルブミン溶液を、約70 00rpmにて約73℃の処理温度で連続的に粉砕する。このようにして形成されたマイクロスフェアの濃密な白色溶液を、直ちに熱交換器により約10℃の温度まで冷却し、そしてガラス製バイアルに回収する。このバイアルを直ちに密封する。実施例５音波キャビテーションによるマイクロスフェアの製造方法実施例２または３の殻形成材料を用いて、以下のようにして、マイクロスフェアを作製する：５％溶液を連続した減圧下にて２時間脱気する。排気した容器に、マイクロスフェアの形成に使用される気体を充填することにより、減圧を解く。Cerny(米国特許第4,957,656号)に記載のようにして、連続的な音波処理を行う。このようにして形成されたマイクロスフェアの濃密な白色溶液を、直ちに熱交換器により約10℃の温度まで冷却し、そしてガラス製バイアルに回収する。このバイアルを直ちに密封する。実施例６マイクロスフェアの耐圧性上記実施例４または５に記載のようにして、フッ素含有殻を有するマイクロスフェアを調製する。リン酸緩衝生理食塩水中にて、１mL当たり約１×10⁹個のマイクロスフェアの濃度に調整した各懸濁液の10mLアリコートを、圧力ゲージを備えた10mLのガラス製の気体密閉シリンジ(Hamilton、Reno NV)内に配置する。全ての頭隙をなくし、装置を密封する。約40psiの一定圧力を約３分間付与する。クールター計数器を使用して、試料の粒子濃度および粒子分布を測定する。安定なマイクロスフェアは、圧力を付与した後も、マイクロスフェアの平均サイズを顕著に変化させない(10％未満)。実施例７弾性上記実施例４または５に記載のようにして、フッ素含有殻を有するマイクロスフェアを調製する。マイクロスフェアを、１mL当たり約１×10⁹個のマイクロスフェアの濃度まで、リン酸緩衝生理食塩水中に希釈し、そして顕微鏡のステージ上に配置した透明セルに入れる。このセルを窒素源と接続して、マイクロスフェアに３psiまでの圧力を急速に付与し、そして解くときの影響を観察可能にする。弾性を有するマイクロスフェアは、付与した圧力を解いた後も、最初の寸法に戻り得る。実施例８診断用イメージング実施例４または５に記載のようにして調製したマイクロスフェアを、以下のようにして、診断用イメージングに使用する：体重約25kgの犬に対して、１mL当たり５×10⁷個〜５×10⁹個のマイクロスフェアを含有する1.0mlの容量のマイクロスフェア懸濁液を、１秒間当たり0.3mLの速度で、末梢（頭部）静脈に注射する。経胸腔的な5.0mHzの変換器を用いるＢモードにてHewlett Packard Sonos 1500 (Andover、MA)の超音波検査機(ultrasonograph)を使用して心臓の画像を得る。この手順を通じて、１秒間当たり30フレームのフレーム速度で画像を記録し、後の処理のために、S-VHSテープに保存する。

Claims

【特許請求の範囲】１．超音波イメージング剤として使用するための組成物であって、マイクロスフェアの水性懸濁液を含有し、該マイクロスフェアが、少なくとも１種の生体適合性気体の微小気泡を取り囲んでいるフッ素を含有する両親媒性の生体適合性材料の殻を含有する、組成物。２．前記気体が、25℃および１atmにて、水１mL当たり0.01mL未満の溶解度を有する、請求項１に記載の組成物。３．前記気体がパーフルオロカーボンである、請求項２に記載の組成物。４．前記パーフルオロカーボンが、パーフルオロメタン、パーフルオロエタン、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン、およびパーフルオロペンタンからなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。５．前記気体が炭化水素である、請求項１に記載の組成物。６．前記炭化水素ガスが、メタン、エタン、プロパン、n-ブタン、イソブタン、およびペンタンからなる群から選択される、請求項５に記載の組成物。７．前記フッ素を含有する両親媒性の生体適合性材料が、脂質、タンパク質、合成有機ポリマー、ならびにそれらの混合物およびコポリマーからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。８．前記フッ素を含有する両親媒性の生体適合性材料が脂質である、請求項１に記載の組成物。９．前記脂質がリン脂質である、請求項８に記載の組成物。 10．前記フッ素を含有する両親媒性の生体適合性材料がタンパク質である、請求項１に記載の組成物。 11．前記タンパク質がヒト血清アルブミンである、請求項10に記載の組成物。 12．前記フッ素を含有する両親媒性の生体適合性材料が合成有機ポリマーである、請求項１に記載の組成物。 13．前記マイクロスフェアの殻が、0.5重量％〜20重量％のフッ素を含有する、請求項１に記載の組成物。 14．耐圧性のマイクロスフェアを製造する方法であって、以下の工程を包含する、方法： (a)フッ素含有反応性化合物を該マイクロスフェアの殻材料と反応させる工程；および (b)同時にまたは連続的にマイクロスフェアを形成する工程。 15．前記反応性化合物が、アルデヒド、イソシアネート、イソチオシアネート、エポキシド、アルキルエステル、アシルハライド、スルホニルハライド、無水物、酸ハライド、およびアルキルスルホネートからなる群から選択される、請求項14に記載の方法。 16．前記反応性化合物が、−CF₃、−C₂F₆、−C₃F₈、および−C(CF₃)₃からなる群から選択される少なくとも１種のパーフルオロカーボン部分を含有する、請求項14に記載の方法。 17．さらに、25℃および１atmにて、水１mL当たり0.01 mL未満の溶解度を有する少なくとも１種の気体の存在下で前記マイクロスフェアを形成する工程を包含する、請求項14に記載の方法。 18．前記気体がパーフルオロカーボンガスである、請求項17に記載の方法。 19．超音波イメージングにおいて、患者の組織および器官のコントラストを高める方法であって、 (a)該患者に、請求項１に記載の組成物を注入する工程；および (b)該組成物をその中に存在させながら、該組織および器官を超音波により画像化する工程；を包含する、方法。