CN110251693A - 一种脂质超声造影剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脂质超声造影剂的制备方法。该方法先将脂质分散在乙醇水溶液中；再升温至脂质分散液相变温度以上，并将其与自由气泡水混合，使脂质在气泡界面发生自组装；最后降低温度至相变温度以下，形成稳定的脂质微气泡。该制备方法简单，制备条件温和，微气泡产率高，易进行批量化生产推广。通过该方法获得的脂质超声造影剂具有良好的超声造影效果，且主要原料均为已批准的药用辅料，产品安全性高。
Description
技术领域
本发明涉及一种脂质超声造影剂的制备方法，属于医疗材料制备的技术领域。
背景技术
超声诊断技术具有安全、快捷和低成本的优势而被广泛应用。可借助超声造影剂提高超声成像分辨率，实现实时动态安全的超声造影。目前使用的超声造影剂通常是直径在10微米以下的气泡，利用微气泡对超声波的非线性效应实现与周围机体组织的区分，提供组织灌注成像方法。近年来，微气泡在靶向成像、超声分子成像、药物递送、介导基因治疗和血栓溶栓等方面表现出广阔的应用前景。
超声微气泡主要由内核气体和包裹气体的壳层材料组成。按壳层材料的不同可分为表面活性剂类、蛋白类、高分子聚合物类和脂质类。其中脂质造影剂研究应用越来越广泛，具有众多优势：1.安全，构成脂质体的磷脂膜可生物降解，对人体无害；2.稳定性好，造影剂制成冻干粉后化学性质稳定，可保持数月，同时在血液循环中更耐压，造影时间长。3.可化学修饰，通过脂质表面的修饰可制备具有靶向功能的造影剂，同时可实现靶向药物治疗。目前批准上市的超声造影剂，如美国的Definity和Imagent，欧洲的Sonovue等均属于脂质类造影剂。
目前国内外相关文献报道的脂质类超声造影剂的制备方法很多，主要包括薄膜水化法，乳剂冻干法等传统方法，以及新兴的超声空化法，微流控法、喷墨印迹法等。新兴的方法存在微泡产出率低，设备要求高等缺点，难以实现工业化批量生产和应用推广。传统方法在制备过程中大多需要引入二氯甲烷或叔丁醇等有毒的有机溶剂，且制备过程复杂，导致制备成本高，造影效果不理想。如目前国内市场可以使用的Sonovue、雪瑞欣造影剂价格比较昂贵，且有效增强显影时间较短(据报道Sonovue仅4-8分钟，雪瑞欣不到2分钟)。随着超声技术的发展，对兼具简单高效制备和优异持久造影效果的超声造影剂及新的制备方法提出需求。
已有多种自由微纳气泡的制备方法被公开(如CN 106731933 A，CN 101804309 A和CN104058492 A)，并且已经应用于农业种植、水产品养殖、水处理、矿物浮选等行业。最近，我们也公开了一种通过反复压差法(CN 109224895 A)制备微纳气泡的简单方法。这些方法制得的自由微纳气泡产率高、可重复性好，成本低。基于此，本发明提出利用脂质分子在自由气泡界面发生自组装制备脂质稳定的气泡，通过简单的脂质与自由气泡水的混合实现超声造影剂的高效制备。
发明内容
技术问题：本发明的目的是提供一种简单高效的脂质超声造影剂的制备方法，该方法通过处于相变温度以上的脂质与自由气泡混合发生自组装，再通过改变温度使磷脂发生相转变形成稳定的脂质包覆的气泡。同时提供利用该方法制备的具有造影效果的脂质超声造影剂。
技术方案：本发明的一种脂质超声造影剂的制备方法包括以下步骤：
步骤1，制备脂质材料混合液:称取脂质材料于容器中，加入乙醇水溶液，使脂质材料浓度为0.2-1.5mg/ml，超声分散至澄清透明；
步骤2，制备自由气泡水：通过溶气泵法、曝气法、超声空化法、电解水法、温差法制备或反复压差法等方法制备；
步骤3，将所述脂质材料混合液加热至相变温度以上，并往其中加入新鲜制备的自由气泡水，脂质材料混合液与气泡水体积比为1：5～1：1，迅速震荡混合使混悬液变为乳白色；
步骤4，将步骤3制得的混悬液降温至相变温度以下，获得脂质包覆的微气泡混悬液，即脂质超声造影剂。
其中，
所述脂质材料为磷脂或磷脂和附加剂的混合物，磷脂优选为相变温度高于体温的磷脂。
所述相变温度高于体温的磷脂为：二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱或二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺。
所述附加剂为：聚乙二醇修饰的磷脂、胆固醇或特异性配体。
所述乙醇水溶液包括含有乙醇的纯水、生理盐水、磷酸盐缓冲液或含丙二醇或丙三醇的纯水/注射用水。
所述乙醇水溶液中乙醇的质量含量为2％-10％。
所述乙醇水溶液中乙醇的质量含量优选为4％。
所述自由气泡水通过溶气泵法、曝气法、超声空化法、电解水法或温差法制备。
所述自由气泡水优选地通过反复压差法制备。
所述自由气泡水中的气体包括空气、二氧化碳、氧气、氮气、氢气、氙气、一氧化氮、硫化氢、六氟化硫或全氟化碳中的一种或几种。
有益效果：本发明制备方法简单，制备条件温和，制备过程中没有引入有毒的有机溶剂，主要原料均为FDA已批准的可注射药用辅料，产品安全性高，具有广阔的临床应用前景。
本发明制备方法主要基于自由气泡水的制备，微气泡浓度与自由气泡浓度正相关。而目前自由气泡水大都已经实现工业化应用，可重复性好，产泡率高。本发明所述超声造影剂容易进行规模化生产，实现简单高效制备。
本发明制备方法中绝大部分磷脂形成包覆气泡而非脂质体，磷脂利用率高，可大大降低生产成本。
附图说明
图1为脂质超声造影剂制备方法示意图。
图2为制得的脂质稳定的微气泡的显微镜图。
图3为脂质超声造影剂体外超声造影的B模式和Contrast模式图像。
具体实施方式
本发明的脂质超声造影剂的制备方法，包括下述步骤：
步骤(1)制备脂质材料混合液，所述混合液溶剂为乙醇水溶液；
步骤(2)制备自由气泡水；
步骤(3)将所述脂质材料混合液加热至脂质相变温度以上，与自由气泡水混合，获得乳白色混悬液；
步骤(4)将所述乳白色混悬液降温至相变温度以下，获得脂质稳定的微气泡混悬液。
本发明所述的脂质材料为磷脂或磷脂和附加剂的混合物。磷脂具有两亲性，能在自由气泡的气液界面发生自组装，形成包裹气体的微气泡，是脂质超声造影剂的主要成分。最常用的磷脂包括天然的，如蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂等；合成的，如磷脂酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰甘油等中的一种或几种。脂质材料中除磷脂外，还可加入一些附加剂调节膜的功能，如聚乙二醇修饰的磷脂可以增加体内长循环稳定性，胆固醇可以用调节膜的流动性，特异性配体增加体内靶向性等。
脂质材料中的磷脂，优选具有较高相变温度的磷脂，如二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC，41℃)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC，55℃)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE，74℃)等。磷脂相变温度是组成磷脂的酰基链由晶态向液态过渡时的温度，高于相变温度，酰基链活动性增加，磷脂分子容易在自由气泡的气液界面进行组装；低于相变温度时，磷脂发生相转变，形成稳定的膜结构防止内部气体溢出。选用相变温度高于使用温度的磷脂，能够提高脂质超声造影剂的稳定性，延长体内超声造影持续时间。
在所述脂质材料中加入带负电荷的磷脂，能够使微气泡表面带有强的表面负电荷，使造影剂稳定性大大提高。
本发明所述的脂质材料，至少包括一种磷脂，最好为相变温度高于体温(37℃)的磷脂；如果是多种磷脂，最好包括一种带负电荷的磷脂，有利于形成稳定的包膜微气泡结构，提高其在体内的超声造影持续时间。
脂质材料难溶于水，并且容易形成胶束或脂质体等结构。为了获得稳定均一的脂质材料混合液，需要寻求一种合适的溶剂。研究发现，乙醇水溶液能够达到要求：一方面在超声分散作用下，绝大多数脂质材料能充分溶解在乙醇水溶液中，获得澄清透明的混合液；另一方面乙醇的毒性低，使用浓度的溶剂毒性可以被忽略。超声分散过程中，加热至脂质相变温度以上，能够加速脂质的溶解，且溶解后冷却至室温不会析出。
本发明所述乙醇水溶液，包括含有乙醇的纯水、注射用水(如生理盐水、磷酸盐缓冲液等)或含一定量高渗醇类(丙二醇或丙三醇)的纯水/注射用水。高渗醇类的加入能够增加微泡在溶液中的粘滞度，减少微泡相互融合，增强稳定性。
本发明所述乙醇水溶液中乙醇的质量含量为2％-10％，优选为4％。
本发明所述的自由气泡水，通过溶气泵法、曝气法、超声空化法、电解水法、温差法等方法制备，优选地通过反复压差法(CN 109224895A)制备。
本发明所述的自由气泡内含有的气体包括空气、二氧化碳、氧气、氮气、氢气、氙气(xe)、一氧化氮、硫化氢、六氟化硫(SF6)或全氟化碳中的一种或几种。为提高脂质超声造影剂的稳定性，优选六氟化硫或全氟化碳类气体。
本发明所述制备方法，可进一步简化合并步骤(2)和(3)，具体地包括以下步骤：
(1)制备脂质材料混合液，所述混合液溶剂为乙醇水溶液；
(2)将所述混合液加热至脂质相变温度以上，并在脂质混合液中制备自由气泡，获得乳白色混悬液。
(3)将所述乳白色混悬液降温至相变温度以下，获得脂质稳定的微气泡混悬液。
本发明的脂质超声造影剂，是按照上述方法制备得到的。
为方便储存，本发明所述磷脂稳定的微气泡混悬液制备好后可加入一定的冻干保护剂，通过冷冻干燥去除溶剂得到微泡冻干粉。使用时向冻干粉中充入气体，并注入水化液重悬获得超声造影剂悬浮液。
脂质超声造影剂的制备实例：
实施例1：
脂质造影剂的制备包括以下步骤
(1)称取一定量的DSPC(磷脂)，加入到乙醇(4％w/w)水溶液(溶剂)中，超声分散，得到澄清透明的磷脂分散液。
(2)通过反复压差法制备SF6的自由气泡水溶液。
(3)将磷脂分散液加热到60℃，加入新鲜制备的自由气泡水溶液(DSPC最终浓度0.75mg/ml)，密封并震荡混合，获得乳白色气泡悬液。
(4)迅速降温至室温，制得脂质超声造影剂。
实施例2：
本实施案例基本流程步骤同实施案例1，不同之处如下：
步骤(2)和(3)合并简化为一步：将磷脂分散液加热到60℃，并通过反复压差法在磷脂分散液中直接制备SF6自由气泡，获得乳白色气泡悬液。
实施例3：
本实施案例基本流程步骤同实施案例1，不同之处如下：
步骤(1)中磷脂为DPPC，步骤(3)中加热温度为45℃。
实施例4：
本实施案例基本流程步骤同实施案例1，仅有的区别在于步骤(1)中磷脂为DSPC(50％w/w)和DPPG(50％w/w)的混合物，磷脂的含量不变。
实施例5：
本实施案例基本流程步骤同实施案例1，仅有的区别在于步骤(1)中磷脂为DSPC(17％w/w)，DPPG(17％w/w)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(2000DSPE-PEG2000,66％w/w)的混合物，磷脂的含量不变。
实施例6：
本实施案例基本流程步骤同实施案例1，仅有的区别在于步骤(1)中溶剂为乙醇(4％w/w)、甘油(10％v/v)、生理盐水(90％v/v)的混合溶液。
实施例7：
本实施案例基本流程步骤同实施案例1，仅有的区别在于步骤(2)中用溶气泵制备SF6自由气泡水溶液。
实施例8：
本实施案例装置同实施案例1，仅有的区别在于步骤(2)中制备Xe的自由气泡水溶液。
实施例9：
本实施案例装置同实施案例1，仅有的区别在于步骤(2)中制备Xe和SF6混合气体的自由气泡水溶液。
2脂质超声造影剂的表征和体外超声成像
采用光学显微镜观察制备的脂质包覆气泡的图像，具体步骤为：吸取10μL的气泡悬液滴在干净的载玻片上，并盖上盖玻片，放置在显微镜下进行观察拍照。图2为实施案例1制得的微气泡显微镜图，可以看到微泡尺寸在2μm以下，尺寸均一。
采用库尔特颗粒计数仪对微气泡的尺寸分布及浓度进行检测，具体步骤为：吸取50μL的气泡悬液加入到100mL生理盐水中，混合均匀进行检测，检测范围为0.4-12μm。重复测量三次，取平均值。实施案例1制得的微气泡尺寸分布在2μm以下，与显微镜结果一致。平均气泡尺寸约为0.9μm,气泡浓度约为1.34×109个/mL。
体外超声显影具体步骤为：自制由3％琼脂，86％蒸馏脱气水和11％甘油组成的琼脂体模，在体模中制备直径为17mm，深度为90mm的圆孔以装样品。超声成像仪为Vevo 2100(FUJIFILM VisualSonics，美国)，配备MS-250换能器，频率设定为18MHz，对比增益为30dB。以去离子水作为空白对照，然后将新制备的气泡悬液注入体膜中进行成像，以B模式和Contrast模式采集图像。结果如图3所示，表明制得的脂质超声造影剂具有良好的超声显影效果。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种脂质超声造影剂的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤1，制备脂质材料混合液:称取脂质材料于容器中，加入乙醇水溶液，使脂质材料浓度为0.2-1.5mg/ml，超声分散至澄清透明；
步骤2，制备自由气泡水：通过溶气泵法、曝气法、超声空化法、电解水法、温差法制备或反复压差法等方法制备；
步骤3，将所述脂质材料混合液加热至相变温度以上，并往其中加入新鲜制备的自由气泡水，脂质材料混合液与气泡水体积比为1：5～1：1，迅速震荡混合使混悬液变为乳白色；
步骤4，将步骤3制得的混悬液降温至相变温度以下，获得脂质包覆的微气泡混悬液，即脂质超声造影剂。
2.根据权利要求1所述的脂质超声造影剂的制备方法，其特征在于，所述脂质材料为磷脂或磷脂和附加剂的混合物，磷脂优选为相变温度高于体温的磷脂。
3.根据权利要求2所述的脂质超声造影剂的制备方法，其特征在于，所述相变温度高于体温的磷脂为：二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱或二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺。
4.根据权利要求2所述的脂质超声造影剂的制备方法，其特征在于，所述附加剂为：聚乙二醇修饰的磷脂、胆固醇或特异性配体。
5.根据权利要求1所述的脂质超声造影剂的制备方法，其特征在于，所述乙醇水溶液包括含有乙醇的纯水、生理盐水、磷酸盐缓冲液或含丙二醇或丙三醇的纯水/注射用水。
6.根据权利要求1所述的脂质超声造影剂的制备方法，其特征在于，所述乙醇水溶液中乙醇的质量含量为2％-10％。
7.根据权利要求1所述的脂质超声造影剂的制备方法，其特征在于，所述乙醇水溶液中乙醇的质量含量优选为4％。
8.根据权利要求1所述的脂质超声造影剂的制备方法，其特征在于，所述自由气泡水通过溶气泵法、曝气法、超声空化法、电解水法或温差法制备。
9.根据权利要求1所述的脂质超声造影剂的制备方法，其特征在于，所述自由气泡水优选地通过反复压差法制备。
10.根据权利要求8或9所述的脂质超声造影剂的制备方法，其特征在于，所述自由气泡水中的气体包括空气、二氧化碳、氧气、氮气、氢气、氙气、一氧化氮、硫化氢、六氟化硫或全氟化碳中的一种或几种。
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