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Die
Erfindung bezieht sich auf die Gebiete der Materialwissenschaften
und Medizin und betrifft ein diagnostisches und/oder therapeutisches
Agens, welches beispielsweise als Kontrastmittel für die
diagnostische und therapeutische Anwendung für die Lokalisierung
von Krebszellen, für die Feststellung der Art der Krebszellen
oder für die Zerstörung von Krebszellen zur Anwendung
kommen kann, sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung.
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Kontrastmittel
können in medizinischen Bildgebungsverfahren, beispielsweise
Röntgen-, Kernresonanz- oder Ultraschallbildgebung, verabreicht
werden, um den Bildkontrast in Abbildungen von Subjekten, im Allgemeinen
eines menschlichen oder tierischen Körpers, zu verstärken
oder abzuschwächen. Der dadurch gesteigerte Kontrast ermöglicht
es, unterschiedliche Organe, Gewebe arten und Körperteile deutlicher
zu beobachten oder zu identifizieren oder die Funktion der Organe
zu untersuchen. Bei der Röntgenbildgebung bewirken Kontrastmittel
eine Veränderung der Röntgenabsorptionscharakteristika der
Körperregionen, in denen sie sich verteilen. Kernresonanz-Kontrastmittel
bewirken im Allgemeinen eine Veränderung der Dichte oder
der charakteristischen Relaxationszeiten der Kerne, im Allgemeinen Protonen
des Wassers, aus deren Resonanzsignalen die Bilder erzeugt werden.
Kontrastmittel für die Positronenemissionstomographie (PET)
wirken als Quelle einer detektierbaren Strahlung. Magnetometrie-Kontrastmittel
wirken durch die Erzeugung von Störungen des magnetischen
Feldes in den Körperregionen, in denen sie sich verteilen.
Diese Störungen können beispielsweise mittels
SQUID-Magnetometern detektiert werden. Ultraschall-Kontrastmittel bewirken
eine Veränderung der Schallgeschwindigkeit oder der Dichte
in den Körperteilen, in denen sie sich verteilen.
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Die
Verbesserung von Kontrastmitteln hinsichtlich Kontrastverstärkung,
Bioverteilung (Biodistribution), Stabilität, Opazität,
Relaxitivität, Verträglichkeit usw. ist jedoch
ein zentrales Thema wissenschaftlicher Untersuchungen.
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Nach
der
DE 693 28 550
T2 ist die Verwendung von Fulleren-Derivaten in diagnostischen und/oder
therapeutischen Mitteln bekannt. Dabei werden die Fulleren-Derivate
als kontrastverstärkendes Mittel und als Träger
für signalbildende Einheiten verwendet, die an Biomoleküle
angehängt sein können.
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Weiterhin
bekannt ist ein optoakustisches Kontrastmittel und ein Anwendungsverfahren
dazu (
DE 698 31 755
T2 ). Dabei wird dem Patienten ein Mittel verabreicht, welches
ein stabilisierendes Material, ein photoaktives Mittel und ein Gas
beinhaltet. Durch Ultraschall wird das stabilisierende Material durchbrochen
und das photoaktive Mittel wird freigesetzt. Danach wird Lichtenergie
zur Aktivierung des photoaktiven Mittels angewandt.
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Aus
der
DE 600 14 124
T2 ist ein Fulleren-spezifischer Antikörper bekannt,
der spezifisch Fullerene und Fulleren-Nanoröhren binden
kann. Weiterhin ist dazu ein Verfahren zur Bestimmung der Fulleren-Konzentration
im Serum eines Patienten bekannt.
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Nach
der
DE 103 01 722
A1 ist ein Verfahren zur Herstellung von endohedralen Fullerenen
bekannt. Danach werden die endohedralen Fullerene in einem Lichtbogenreaktor
durch Zerstäuben von Graphitelektroden in einer Atmosphäre
durchgeführt, die in einem Inertgas oder Inertgasgemisch
eine aus mindestens zwei Elementen bestehende reaktive Gaskomponente
enthält.
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Fortschritte
in der Präzision der Diagnostik haben mit den Fortschritten
in der Therapie nicht Schritt halten können. Den Lösungen
des Standes der Technik ist gemeinsam, dass die derzeit bekannten
Kontrastmittel hinsichtlich Kontrastverstärkung, Bioverteilung
(Biodistribution), Stabilität, Opazität, Relaxitivität,
Verträglichkeit usw. nicht ausreichend den Erfordernissen
einer modernen Diagnostik und Therapie entsprechen.
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Die
erfindungsgemäße Lösung schließt
diese Lücke. Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht
in der Angabe eines diagnostischen und/oder therapeutischen Agens,
welches sensitiv und selektiv den Ort und die Art der zu untersuchenden
Moleküle oder Zellen erkennt und ebenso selektiv therapeutisch
eingesetzt werden kann, sowie ein effektives und selektives Verfahren
zu seiner Herstellung und seine Verwendung für unterschiedliche
Bildgebungsverfahren.
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Die
Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen angegebene Erfindung
gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der
Unteransprüche.
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Das
erfindungsgemäße diagnostische und/oder therapeutische
Agens mit mindestens einer bildgebenden Komponente auf der Transkriptionsebene
besteht mindestens aus BioShuttle-Molekülen, an die über
Peptid-basierte Moleküle endohedrale Fullerene gekoppelt
sind, wobei die endohedralen Fullerene hydrophob sind und der Formel A3-xMxZ@C2n entsprechen,
in der x = 0 bis 3 und n ≥ 34 ist,
und in der A Seltenerden
und/oder Transurane, M Metalle, Z Nichtmetalle und C Kohlenstoff
bedeuten.
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Vorteilhafterweise
enthalten die hydrophoben endohedralen Fullerene Nitridcluster aus
Metallen, Seltenerden und/oder Transuranen einzeln oder im Gemisch.
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Ebenfalls
vorteilhafterweise weisen die Metalle, Seltenerden und/oder Transurane
ein magnetisches Moment auf.
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Weiterhin
vorteilhafterweise sind als A Seltenerden. Gadolinium, Holmium,
Dysprosium, Lanthan, Ytterbium und/oder Terbium vorhanden.
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Und
auch vorteilhafterweise sind als A Transurane, Neptunium, Actinium,
Uranium und/oder Plutonium vorhanden.
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Vorteilhaft
ist es auch, wenn als M Metalle, Scandium, Yttrium, Calcium, Strontium,
Barium vorhanden sind.
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Weiterhin
vorteilhaft ist es, wenn als Z Nichtmetalle, N, P, S, B, O und/oder
Verbindungen davon und/oder deren Isotope vorhanden sind.
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Und
auch vorteilhaft ist es, wenn Z als Isotop als 17O, 18O, 34S, 35S 32P 33P
vorhanden ist.
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Ebenfalls
vorteilhaft ist es, wenn die BioShuttle-Moleküle aus einem
Transportmodul, einem Adressmodul sowie einem Cargo bestehen.
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Und
von Vorteil ist es auch, wenn als Transportmodul amphiphile Moleküle,
wie Homöobox-artige Proteinfragmente (HOX) vorhanden sind,
wobei noch vorteilhafterweise als HOX-Proteinfragmente PAn T (Antennapedia-Insekten),
PTDHIV-1/TAT (viraler Ursprung), TP1AOP/Eco (bakterieller Ursprung, z. B. Escherichia
coli), TPhuman und/oder TPvariabel vorhanden
sind.
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Von
Vorteil ist es auch, wenn als intrazelluläre Adressmoleküle
Peptidnukleinsäure-Sequenzen (PNA), Nukleinsäuren
und/oder Peptidfragmente vorhanden sind.
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Ebenfalls
von Vorteil ist es, wenn aberrante Genexpression von Zellzykluskontrollgenen,
Apoptose-Inhibitor-Genen, Matrixmetallproteinasen (MMPs), RNA wie
z. B.: Fusions-mRNA von Fusionsgenen, RNA, in Stammzellen exprimiert,
und/oder Antikörper-Fragmente, Substrate für Enzymspezifische Spaltung
vorhanden sind.
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Weiterhin
von Vorteil ist es, wenn als Adressmodul Peptidsequenzen und/oder
Antisense Peptid Nukleinsäure (AS)-PNA vorhanden sind.
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Und
auch von Vorteil ist es, wenn als Adressmodul eine durch das Enzym
Cathepsin B oder andere spezifische Protease-spaltbare Peptidsequenz vorhanden
ist.
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Vorteilhaft
ist es auch, wenn das Cargo aus endohedralen Fullerenen besteht.
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Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung
eines diagnostischen und/oder therapeutischen Agens werden hydrophobe,
endohedrale Fullerene mit BioShuttle-Molekülen über
eine irreversibel ablaufende Diels-Alder-Reaktion mit inversem Elektronenbedarf
(DARinv) gekoppelt.
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Vorteilhafterweise
wird die Kopplung durch kovalente Bindungen realisiert.
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Ebenfalls
vorteilhafterweise macht die DAR mit inversem Elektronenbedarf eine
Rückreaktion unmöglich, so dass kein chemisches
Gleichgewicht zwischen den Fullerenen und seinen Derivaten und den BioShuttle-Molekülen
eingestellt wird.
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Weiterhin
vorteilhafterweise wird der mittlere Teil des Fulleren-BioShuttles über
ein Dienophil wie Boc-K(TCT)-OH und einem Tetrazin bei Zimmertemperatur
in der Festphasensynthese hergestellt.
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Erfindungsgemäß wird
das diagnostische und/oder therapeutische Agens als Komponente für die
Molekulare Bildgebung und/oder zur selektiven und/oder vollständigen
Zerstörung von Zellen, deren Inhalten und/oder Strukturen
z. B. Zellkernen verwendet.
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Vorteilhafterweise
wird es als Komponente für die Molekulare-Bildgebung für
Röntgen-, MRT-, SPECT-, PET-Untersuchungen oder und/oder
zu Therapien wie z. B.: BNCT-Therapieansatz (Bor-Neutronen-Einfang-Therapie)
oder mit modernen Chemotherapien (reformulierte und/oder Patienten-spezifische
Therapieansätze) eingesetzt.
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Weiterhin
vorteilhafterweise wird das diagnostische und/oder therapeutische
Agens als intrazelluläres/intravitales Kontrastmittel eingesetzt.
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Und
auch vorteilhafterweise wird das diagnostische und simultan therapeutische
Agens unter Anwendung eines magnetischen Feldes zum Monitoring des
Therapieverlaufs ohne Strahlenbelastung für den Patienten
eingesetzt.
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Mit
der erfindungsgemäßen Lösung wird es erstmals
möglich, ein diagnostisches und/oder therapeutisches Agens
zur Verfügung zu stellen, welches intrazellular/intravital
agiert, sehr selektiv wirkt, eine kontrastreiche Molekulare Bildgebung
(Molecular Imaging = Bildgebung von metabolischen Prozessen auf der
Transkriptionsebene) realisiert und in bestimmten Fällen
auch therapeutisch wirken kann. Mangels Sensitivität war
es bisher mittels MR Tomographie nicht möglich, selektiv
intrazelluläre Prozesse abzubilden. Eine Differenzierung
von z. B. Tumorgewebe und umgebendem gesundem Gewebe sowie eine
Unterscheidung zu nekrotischen Bereichen waren bisher nicht möglich.
Ebenfalls war die Darstellung von Mikrometastasen mit den bisherigen Methoden
deshalb auch nicht möglich.
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Dieses
durch die erfindungsgemäße Lösung-vermittelte
bildgebende Verfahren ermöglicht jetzt durch den Einsatz
des erfindungsgemäßen diagnostischen und/oder
therapeutischen Agens (als intrazellulares Kontrastmittel) die tomographische
Darstellung von Organen auch auf metabolischer Ebene. Durch das
erfindungsgemäße Verfahren wird es erstmals möglich,
hydrophobe, endohedrale Fullerene an BioShuttle-Moleküle
zu binden, so dass Bio- und Adress-Module vorhanden sind, die über
kovalente Bindungen, irreversibel an die Fullerene gebunden, vorliegen.
Damit wird bei Einbringung des erfindungsgemäßen
Agens beispielsweise in einen menschlichen oder tierischen Körper
das Agens in die jeweils gewünschte Zelle (Targetzelle)
geschleust und kann dort, nach Hybridisierung mit der jeweiligen aberrant
exprimierten Ziel-mRNA (hier CTBS mRNA = überexprimiertes
Cathepsin B), über die hydrophoben endohedralen Fullerene
bildgebend lokalisiert werden.
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Struktur
und Zusammensetzung der hydrophoben endohedralen Fullerene können
an den jeweiligen Verwendungszweck (molekulares Target) angepasst
werden.
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Der
besondere Vorteil der erfindungsgemäßen hydrophoben
endohedralen Fullerene besteht darin, dass sie im Inneren des Kohlenstoffkäfigs
Seltenerden und/oder Transurane, Metalle und Nichtmetalle enthalten
können. die sich insgesamt für eine sehr gute
Bildgebung auf molekularer Ebene (Transkriptionsebene) eignen. Dabei
können durchaus für den menschlichen oder tierischen
Körper schädliche Stoffe eingesetzt werden. Da
diese sicher durch den Kohlen stoffkäfig „gefangen” gehalten
werden und dadurch auch kein direkter Kontakt zu Zellen und deren aktiven
Bestandteile wie Enzyme von menschlichen und tierischen Körper
besteht.
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Während
es sich bei den bisherigen handelsüblichen Kontrastmitteln
um Stoffe handelte, die nicht die Zellmembran durchdringen können,
sind folgende Anwendungen der erfindungsgemäßen
Lösung u. a. die Verwendung sowohl als Kontrastmittel in
den verschiedensten Diagnoseverfahren als auch als Therapeutikum
neu und vorteilhaft. Dabei dringt das erfindungsgemäße
Agens in die jeweils gewünschten Zellen, beispielsweise
Krebszellen, gezielt ein und sammelt sich dort (erhöhte
lokale Konzentration) an. Spezielle Peptidsequenzen bilden dabei
ein Substrat für zellimmanente Mechanismen, die einen aktiven Transport
z. B. in den Zellkern hinein ermöglichen (Nuclear Localization
Sequence = NLS; oder Mitochondrien Localization Sequence = MLS).
Mittels der hier beschriebenen bildgebenden Verfahren kann die Konzentration
des erfindungsgemäßen Agens in mehreren Zellen
(Mikrometastasen) einzelnen oder erstmals in Einzelzellen (z. B.
Tumorstammzellen) tomographisch bestimmt werden; die Zellen werden somit
sehr präzise lokalisiert; auch das Genexpressionsprofil
(Transkriptom) der jeweiligen Zelle (bösartiger oder gutartiger
Tumor) ist auf diesem Weg detektierbar und erlaubt eine deutliche
Selektion von Tumor- und umgebenden Normalgewebe. Zur Anwendung
des erfindungsgemäßen Agens für bildgebende Verfahren
ist es besonders vorteilhaft, wenn einzelne oder alle Stoffe in
den hydrophoben endohedralen Fullerenen ein magnetisches Moment
aufweisen.
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In
Abhängigkeit von den jeweiligen Zusammensetzungen der hydrophoben
endohedralen Fullerene können einzelne oder alle Bestandteile
durch spezielle Verfahren an den jeweils gewünschten Orten
aktiviert und somit beispielsweise eine Zelle oder der Zellinhalt
oder der Zellkern irreparabel zerstört werden.
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Es
sind durchaus auch andere Detektionen über Hybridisierungen
je nach Fragestellung möglich, Beispielsweise ist erstmals
ein Imaging in der MRT von Stammzellen, deren Migration auch in
der molekularen MR Bildgebung anhand des typischen Genexpressionprolfils
möglich ist, oder das Imaging (Monitoring) der Migration
von Mikrometastasen durchführbar!
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Nachstehend
ist die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher
erläutert.
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Dabei
zeigt
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1 die
schematische Zusammenstellung von Transport-, Adressmodul und Cargo
des erfindungsgemäßen Agens; Transportmodul (1.
Modul = linke Spalte), Adressmodul (2. Modul) und Cargo (3. + 4.
Modul) für unterschiedliche Molekülvarianten
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2 die
schematische Struktur eines erfindungsgemäßen
Gd-Cluster@-BioShuttle mit dem Transportmodul rechts, mit dem Adressmodul
in der Mitte und dem Cargo links.
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3 den
molekularen Wirkort der transportierten PNA (ganz oben) auf die
CTSB mRNA (3' Ende von Exon 1); AC Number befindet sich im unteren
Teil der Abbildung
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Beispiel 1
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In
einem Lichtbogenreaktor werden mit Gadolinium- und Scandiummetall
modifizierte Graphitelektroden in einem Gasgemisch, das eine reaktive Gaskomponente
enthält, mit gepulstem Gleichstrom mit einer Stromstärke
zwischen 75 A und 150 A abgetragen. Die eingesetzten Graphitelektroden
besitzen eine Zusammensetzung mit dem Verhältnis Graphit:Gadolinium
und Graphit: Scandium von je 1 Mol:0,4 Mol. Das Gasgemisch besteht
aus He und NH3, wobei das NH3 die
reaktive Komponente ist. Die Anteile im Gasgemisch sind 20 kPa He
und 2 kPa NH3.
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Bei
der Durchführung dieses Verfahrens entstehen endohedrale
gemischte Gadolinium-Scandium-Nitrid-Cluster-Fullerene mit einer
Ausbeute zwischen 5 und 35%.
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Die
Synthese des Säurechlorids des Fullerens erfolgt nach einer
Vorschrift von J. Arrowsmith et al. (J. Med. Chem. 2002;
45: 5458–70). Dazu werden zunächst 2
mmol der Säure mit 10 ml Thionylchlorid am Rückfluss
gekocht, bis die Säure völlig gelöst
ist. Der Überschuss an Thionylchlorid wird abgetrennt und
der erhaltene Niederschlag über NaOH im Exsikkator über
Nacht getrocknet. Im zweiten Schritt erfolgt die Synthese des Boc-Propyldiamin-tetrazin-diens
Dazu werden 2 mmol des Säurechlorids in 20 ml abs. Dichloromethan
suspendiert und dann ein Gemisch von 2 mmol N-Boc-1,3-Diaminopropan
und 2 mmol Triethylamin langsam zu 10 ml des gleichen Lösungsmittels
bei 0–5°C zugefügt. Die erhaltene stark
gefärbte Lösung wird 4 h bei Zimmertemperatur gehalten
und anschließend die organische Phase mit Wasser, 1 N-HCL
und wieder mit Wasser gewaschen. Nach der Trocknung mit Na2SO4, der Filtration und
dem Abdampfen des restlichen Lösungsmittels wird der Rückstand
chromatographisch (auf Silicagel) mit Chloroform/Ethanol 9:1 als
Laufmittel aufgereinigt und danach aus Aceton umkristallisiert.
Die Ausbeute beträgt 70%, hängt aber immer auch
von der Qualität der jeweiligen Carbonsäure ab.
Die Massenspektrometrie (ESI) ergab: positive Ionen m/e 337.1.
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Beide
folgende Verbindungen liefern das Fulleren-(aminogebunden)-tetrazolin-dien
nach folgender Vorschrift:
0.5 mmol des mono-substitutierten
tetrazinamins und 0.5 mmol von 4-Methyl-5-oxo-2,3,4,6,8-pentazabicyclo[4.3.0]nona-2,7,9-trien-9-carboxvlsäurechlorid werden
in 5 ml Chloroform und 5 ml Triethylamin (v/v = 1:1) bei 0–5°C
gelöst. Nach 4 h bei Zimmertemperatur wird die Lösung
mit Wasser, 1N Salzsäure und wiederum mit Wasser gewaschen.
Die Reaktion läuft ungestört und liefert nach 6
h Stunden das Produkt. Nach der Trocknung und dem Abdampfen des
restlichen Lösunsgmittels wird der verbliebene Rückstand chromatographisch
mit Chloroform/Ethanol 9,5/0,5 als Laufmittel (über Silicagel)
gereinigt. Die Massenspektrometrie (ESI) ergab: positive Ionen m/e
536.3 (+Na).
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Die
Zielzellspezifität basiert auf einem in Zielzellen spezifischen
Genexpressionsprofil. Die zielzelltypischen mRNAs (hier CTSB mRNA
= Cathepsin B mRNA) werden mit komplementären PNAs (Peptid Nukleinsäuren),
im Cytoplasma hybridisiert. Da PNA/mRNA Hybride keine Substrat für
RNAse H darstellen, verbleiben diese Hybride zusammen mit den Cargo
(Gd-Sc-Cluster@) im Cytoplasma der Zielzellen gefangen (getrappt).
Darauf basiert der erste Schritt der Spezifität von Gd-Sc-Cluster@-BioShuttle.
Der zweite Schritt beruht auf der enzymatischen Spaltung der PNA
an der CTSB Schnittstelle (CTSB Protein = Enzym), die sich zwischen
der PNA und den Cargo (Gd-Sc-Cluster@) befindet. Nach Abspaltung
wird die Adresssequenz für den Zellkern (Nuklear Localization
Sequence = NLS) frei zugänglich für Moleküle,
die den aktiven Transport des Cargos (Gd-Sc-Cluster@) in den Zellkern
bewerkstelligen. Die Stabilität der PNA/RNA Hydride unter
physiologischen Bedingungen führt zu einer passiven Anreicherung
des Cargos (Gd-Sc-Cluster@) im Zytoplasma; der aktive Transport
von Gd-Sc-Cluster@ in den Zellkern von CTSB aktiver Zellen (maligner
Zellen = invasiver Zellen) führt zu einer aktiven Anreicherung des
Gd-Sc-Cluster@ in deren Zellkern und geben ein MR Signal im Gegensatz
zu Normalzellen, die das Gd-Sc-Cluster@ wegen fehlender Hybridisierungsmöglichkeiten
wieder ausscheiden. Die im Vergleich zu bekannten MR-Kontrastmitteln
(z. B. Gd-Chelate oder Eisenoxydpartikel) erhöhte Sensitivität
wird durch die besonderen Eigenschaften der Gd-Sc-Cluster@ realisiert.
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Beispiel 2
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In
einem Lichtbogenreaktor wird eine mit Gadoliniummetall modifizierte
Graphitelektroden in einem Gasgemisch, das eine reaktive Gaskomponente enthält,
mit gepulstem Gleichstrom mit einer Stromstärke zwischen
75 A und 150 A abgebrannt. Die eingesetzten Graphitelektroden besitzen
eine Zusammensetzung mit dem Verhältnis Graphit:Gadolinium von
1 Mol:0,4 Mol. Das Gasgemisch besteht aus He und NH3,
wobei das NH3 die reaktive Komponente ist. Die
Anteile im Gasgemisch sind 200 mbar He und 20 mbar NH3.
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Bei
der Durchführung dieses Verfahrens entstehen endohedrale
Gadolinium-Nitrid-Cluster-Fullerene mit einer Ausbeute zwischen
5 und 10%.
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Die
Synthese des Säurechlorids des Fullerens erfolgt nach einer
Vorschrift von J. Arrowsmith et al. (J. Med. Chem. 2002;
45: 5458–70). Dazu werden zunächst 2
mmol der Säure mit 10 ml Thionylchlorid am Rückfluss
gekocht, bis die Säure völlig gelöst
ist. Der Überschuss an Thionylchlorid wird abgetrennt und
der erhaltene Niederschlag über NaOH over im Exsikkator über
Nacht getrocknet. Im zweiten Schritt erfolgt die Synthese des Boc-Propyldiamin-tetrazin-diens
Dazu werden 2 mmol des Säurechlorids in 20 ml abs. Dichloromethan
suspendiert und dann ein Gemisch von 2 mmol N-Boc-1,3-Diaminopropan
und 2 mmol Triethylamin langsam zu 10 ml des gleichen Lösungsmittels
bei 0–5°C zugefügt. Die erhaltene stark
gefärbte Lösung wird 4 h bei Zimmertemperatur gehalten
und anschließend die organische Phase mit Wasser, 1 N-HCL
und wieder mit Wasser gewaschen. Nach der Trocknung mit Na2SO4, der Filtration und
dem Abdampfen des restlichen Lösungsmittels wird der Rückstand
chromatographisch (auf Silicagel) mit Chloroform/Ethanol 9:1 als
Laufmittel gereinigt und danach aus Aceton umkristallisiert. Die
Ausbeute beträgt 70%, hängt aber immer auch von
der Qualität der jeweiligen Carbonsäure ab. Die
Massenspektrometrie (ESI) ergab: positive Ionen m/e 337.1.
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Beide
Verbindungen liefern das Fulleren-(aminogebunden)-tetrazolin-dien
nach folgender Vorschrift:
0.5 mmol des mono-substitutierten
tetrazinamins und 0.5 mmol von 4-Methyl-5-oxo-2,3,4,6,8-pentazabicyclo[4.3.0]nona-2,7,9-trien-9-carboxylsäurechlorid werden
in 5 ml Chloroform und 5 ml Triethylamin (v/v = 1:1) bei 0–5°C
gelöst. Nach 4 h bei Zimmertemperatur wird die Lösung
mit Wasser, 1N Salzsäure und wiederum mit Wasser gewaschen.
Die Reaktion läuft ungestört und liefert nach
6 h Stunden das Produkt. Nach der Trocknung und dem Abdampfen des
restlichen Lösunsgmittels wird der verbliebene Rückstand chromatographisch
mit Chloroform/Ethanol 9,5/0,5 als Laufmittel (über Silicagel)
gereinigt. Die Massenspektrometrie (ESI) ergab: positive Ionen m/e
536.3 (+Na).
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Eine
Lösung von 0.1 mmol Gd-Cluster@) in 35 ml Toluol wird über
Nacht gerührt. Die ungelösten Anteile werden abgefiltert.
Die Lösung wird mit 28 mg Propylamin-Dihydrotetrazin versetzt
und 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung
wird dann nochmals 24 Stunden bei Raumtemperatur und anschließend über
5 Stunden bei 50°C gehalten, filtriert und eingedampft.
Abschließend erfolgt die Oxadation zum Tetrazin (Magenta).
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Mit
dem so hergestellten Gd-Cluster@BioShuttle kann das Proliferationsverhalten
von Tumorzellen am Beispiel von überexprimierter c-myc
mRNA in der MR Bildgebung dargestellt werden. Zumal die T/2 von
c-myc mRNA bei etwa 20 min liegt und eine Hybridisierung zur Hemmung
deren Abbaus führt, was bei weiterer Transkription von
c-myc RNA zu einer Anreicherung im Cytoplasma von Hybrid c-myc mRNA/PNA
führt. In Normalzellen ist c-myc m-RNA praktisch nicht
nachweisbar.
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Beispiel 3
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In
einem Lichtbogenreaktor werden Graphitelektroden in einem Gasgemisch,
das eine reaktive Gaskomponente enthält, mit gepulstem
Gleichstrom mit einer Stromstärke von 175 A abgebrannt.
Das Gasgemisch besteht aus He und CH4, wobei
das CH4 die reaktive Komponente ist. Die
Anteile im Gasgemisch sind 200 mbar He und 10 mbar CH4.
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Bei
der Durchführung dieses Verfahrens entsteht CH2@C70 als Hauptkomponente der endohedralen Fullerene,
wobei C60 und C70 den
Hauptanteil des Gesamtfullerengehalts stellen.
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Die
chemische Anbindung des BioShuttle-Moduls an das schwefelhaltige
endohedrale Fulleren erfolgt wie in Beispiel 1 angegeben.
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Beispiel 4
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In
einem Lichtbogenreaktor werden mit Lutetiummetall und Guanidiniumrhodanid
modifizierte Graphitelektroden mit gepulstem Gleichstrom mit einer
Stromstärke zwischen 75 A und 150 A abgebrannt. Die eingesetzten
Graphitelektroden besitzen eine Zusammensetzung mit dem Verhältnis
Graphit:Lutetium 1 Mol:0,4 Mol und Guanidiumrhodanid:Lutetium 0.5
Mol:1 Mol beträgt. Der Druck des He-Kühlgases
beträgt 200 mbar He.
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Bei
der Durchführung dieses Verfahrens entstehen endohedrale
Lu2S-C82-Fullerene
mit einer Ausbeute zwischen 2 und 5%.
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Die
chemische Anbindung des BioShuttle-Moduls an das schwefelhaltige
endohedrale Fulleren erfolgt wie in Beispiel 2 angegeben.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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-
Zitierte Patentliteratur
-
- - DE 69328550
T2 [0004]
- - DE 69831755 T2 [0005]
- - DE 60014124 T2 [0006]
- - DE 10301722 A1 [0007]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - J. Arrowsmith
et al. (J. Med. Chem. 2002; 45: 5458–70) [0048]
- - J. Arrowsmith et al. (J. Med. Chem. 2002; 45: 5458–70) [0053]