-
Die
Erfindung betrifft die Verwendung eines endohedrale Fullerene enthaltendes
Kontrastmittels für
die Kernspintomographie (oder auch Magnetresonanztomographie, MRT)
unter Nutzung des Overhauser-Effekts gemäß den Patentansprüchen, das geeignet
ist, die magnetische Ausrichtung von Elektronen-Spins auf benachbarte
Protonen-Spins zu übertragen.
-
Stand der Technik
-
Die
Kernspintomographie ist ein bildgebendes Verfahren, das die magnetische
Ausrichtung von Protonen-Spins in einem von Aussen angelegten Magnetfeld
ausnutzt. Die MRT hat sich in den letzten zwei Jahrzehnten zu einem
etablierten und weit verbreiteten Verfahren in der medizinischen
Diagnostik entwickelt. Im Gegensatz zu anderen Verfahren mit vergleichbarer
diagnostischer Bedeutung – insbesondere
der Computertomographie (CT) – entsteht bei
der MRT keinerlei Strahlenbelastung oder sonstige bisher bekannte
physiologische Belastung für
den Patienten. Bei MRT werden die Protonen-Spins der Wasserstoffkerne
des Gewebewassers (oder des Blutes, Lymphsystems etc.) durch ein äußeres starkes
Magnetfeld ausgerichtet. Auf Grund der geringen Polarisierbarkeit
der Protonen-Spins, die von der Stärke des angelegten statischen
Magnetfelds abhängt,
haben sich MRT Geräte
mit Magnetfeldern unter 0.2 T nicht in der klinischen Routine verbreitet.
Die verbreitetste Feldstärke
beträgt
heute 1.5 T. Durch Anlegen zeitlich gepulster magnetischer Wechselfelder,
deren Trägerfrequenz
der Resonanzfrequenz der Protonen-Spins bei der jeweiligen Feldstärke entspricht
(etwa 62 MHz bei 1.5 T), wird eine Detektion der Protonen-Spins
u. a. nach Kernspin-Relaxationszeit,
Dichte und Bewegung ermöglicht,
woraus Schlussfolgerungen auf Art und Zustand von biologischem Gewebe
möglich
sind. Durch zusätzlichen Einsatz
von Magnetfeldgradienten in verschiedenen Richtungen lässt sich
eine gute räumliche
Auflösung in
Schichtbildern oder dreidimensionalen Darstellungen erzeugen.
-
Die
Signalintensität
und damit die Bildqualität
werden insbesondere bestimmt durch die Magnetfeldstärke, die
bei einer für
derartige Geräte
sinnvollen Größe zwischen
0.5 und 3 T liegt.
-
Der
der Magnetresonanz der Protonenspins analoge Prozess für Elektronenspins
wird als Elektronenspin Resonanz (Electron Paramagnetic Resonance
EPR) bezeichnet. Dieser Effekt ist bisher nicht zur Bildgebung in
der medizinischen Diagnostik ausgenutzt worden. Beim Overhauser-Effekt
findet ein Polarisationstransfer zwischen verschiedenen Spinsystemen
statt. Sofern diese Übertragung
zwischen Elektronenspins und Protonenspins erfolgt, ist der Effekt
für die
Bildgebung nutzbar. Dies ist u. a. in [i], [ii], [iii] und [iv]
beschrieben. Hierbei erfolgt eine Verstärkung der magnetischen Resonanz
durch einen Polarisationstransfer von Elektronenspins auf die sie
umgebenden bildgebenden Kerne. Dieser Effekt beruht darauf, dass
sich Elektronen-Spins leichter magnetisch ausrichten lassen als
Protonen-Spins und ein Polarisationsübertrag auf benachbarte Protonen-Spins
erfolgen kann. Dies wird auch mit Dynamischer Kernspinpolarisation
(Dynamic Nuclear Polarisation – DNP)
vom Overhauser-Typ bezeichnet. Die so ausgerichteten Protonen-Spins
lassen sich nun mit den üblichen
bildgebenden Verfahren, wie MRT erfassen und auswerten. Bei der
Anwendung in einem bildgebenden Verfahren führt dies zu einem verstärkten MRT-Signal. Während bei
einer gewöhnlichen
Kernspintomographie Magnetfelder von über 1 T üblich sind, werden bei einer
mittels Overhauser-Effekt verstärkten
Magnet Resonanz Tomographie, im weiteren als OMRI (Overhauser-enhanced Magnetic
Resonance Imaging) bezeichnet, Felder von nur 10 mT verwandt. Die
um den Faktor 100 reduzierte Magnetfeldstärke gegenüber der konventionellen MRT
ist erforderlich, um Anregungsfelder für die Elektronenspins zu erzeugen,
die trotz des Skineffekts in tiefere Gewebeschichten einzudringen
vermögen.
Bei einem Magnetfeld von 1 T haben die Elektronenspins eine Resonanzfrequenz
von ~1010 Hz. Ein derartiges Anregungsfeld
würde aber
aufgrund des Skin-Effekts bereits an der Oberfläche absorbiert und dabei zu
einer gefährlichen
Erwärmung des
Gewebes führen.
Die erforderliche Reduzierung des Magnetfeldes entspricht zufällig der
durch den Overhauser-Effekt bewirkten Verstärkung, die ungefähr beim
Faktor 100 liegt. Man gelangt daher zu Niedrigfeldsystemen, die
eine ähnlich
gute Bildauflösung
aufweisen wie die in der Kernspintomographie üblichen, jedoch unter erheblicher
Reduzierung apparativer Ausrüstungen,
da auf supraleitende Magnete verzichtet werden kann. Dies führt zu einer
kostengünstigeren
Untersuchungsmethode. Das untersuchte Gewebe ist zudem bei klinischer
Anwendung wesentlich geringeren magnetischen Feldern ausgesetzt
und die Untersuchungen können
mit Geräten vorgenommen
werden, die einen freien Zugang zum Probanden ermöglichen,
d. h. es können
auch Patienten mit Klaustrophobie problemlos behandelt werden. Außerdem wird
eine geringere Geräuschbelastung
im Vergleich zur herkömmlichen
MRT erreicht.
-
Bei
der Kernspintomographie unter Nutzung des Overhauser-Effekts (OMRI-Verfahren)
muss eine (paramagnetische) Substanz zugeführt werden, deren Elektronenspins
durch ein angelegtes äußeres Magnetfeld
magnetisch ausgerichtet werden, und die geeignet ist, die magnetische
Ausrichtung der Elektronen-Spins auf benachbarte Protonen-Spins
zu übertragen.
Bei den Substanzen, die bislang für OMRI entwickelt wurden, handelt
es sich um paramagnetische Radikale. Es wurde bisher jedoch noch
keine Substanz weder einer systematischen, zulassungs-relevanten
toxikologischen Untersuchung unterzogen noch in eine erste oder
spätere
Phase einer vorklinischen Studie oder klinischen Entwicklung gebracht
(es gibt kein für
OMRI zugelassenes Kontrastmittel).
-
In
der
EP 0 515 458 sind
Substanzen beschrieben, bei der freie Kohlenstoffradikale vom Triarylmethyl-Typ
(Trityle) verwendet werden, um ein Kontrastmedium für die Kernspintomographie
unter Nutzung des Overhauser-Effekts herzustellen.
EP 0 832 054 beschreibt ähnliche
Methylradikale, die durch heterocyclische Aromaten substituiert
sind für den
gleichen Zweck.
-
Eine
andere Substanzklasse als Kontrastmittel für die Kernspintomographie unter
Nutzung des Overhauser-Effekts ist in der
EP 0 625 055 B1 beschrieben,
wonach Kohlenstoffallotrope und andere analoge netzartige molekulare
Strukturen als grundlegende strukturelle Bestandteile verwendet
werden.
-
In
der
WO 01/24696 wird
als Kontrastmittel für
OMRI ein Fullerol angegeben, das mindestens ein freies Elektron
aufweist. Diese Verbindung weist eine geringe Stabilität auf, weshalb
nur während
einer relativ kurzen Zeitdauer ein Polarisationsübertrag stattfinden kann.
-
In
Bezug auf ihre Eignung als OMRI Kontrastmittel sind in der Literatur
der letzten Jahre am ausführlichsten
beschrieben die o. g., unterschiedlich substituierten Triarylmethyl
und Triphenylmethyl Radikale (siehe z. B.
US 5,289,125 ;
US 4,984,573 ; und
EP 0 515 458 ).
-
Die
Eigenschaften dieser, beispielsweise in [i], [ii], [iii], [v], [vi]
beschriebenen Trityle werden daher im Folgenden als aktueller "Stand der Technik" weiter beschrieben.
-
Die
genannten Substanzen ermöglichen
teilweise zufriedenstellende in-vitro Ergebnisse [ii], die bisherigen
in-vivo Experimente an Tiermodellen zeigen jedoch ein zu geringes
praktisch erreichbares Overhauser-enhancement, um für eine klinische
Weiterentwicklung als OMRI-Substanz für allgemeine diagnostische
Bildgebung in Frage zu kommen: Hierfür sind Dosierungen in der Größenordnung
zwischen 1 mMol/kg Körpergewicht
und 5 mMol/kg Körpergewicht
notwendig [v], für
die eine klinische Entwicklung und Zulassung aus toxikologischen
und kommerziellen Gesichtspunkten nicht aussichtsreich ist. Standard-Dosierungen
konventioneller Kontrastmittel für die
MRT liegen bei max. 0.1 mMol/kg Körpergewicht, zunehmend jedoch
im μmol/kg – Bereich.
Zusätzlich zeigt
sich bei den Kohlenstoff-Radikalen eine starke Degradierung des
Overhauser-enhancement in Plasma und in Blut (gegenüber wässrigen
Lösungen), was
auf reversible Proteinbindungen der Substanzen in Blut und den Einflüssen von
Sauerstoff auf den Overhauser-Effekt zurückzuführen ist [ii]. In deoxygeniertem
Wasser wird die Stabilität
unterschiedlicher Trityle mit Halbwertszeiten zwischen einigen Stunden und
bis zu einem Jahr angegeben [ii], [iii]. Generell weisen diese Radikale
durch die freien Elektronen eine hohe chemische Reaktivität auf, die
zu einer unerwünschten
Toxizität
und zum Verlust des Effekts führen
kann.
-
Das
erzielbare Overhauser-enhancement (bei einer gegebenen eingestrahlten
Radiofrequenzleistung für
die Elektronenspinübergänge) hängt unter
anderem von den Relaxationszeiten des Elektronenspins ab.
-
Dabei
sind lange Spin-Gitter-(T1e) und Spin-Spin
Relaxationszeiten (T2e) des Elektronenspins
für OMRI-Kontrastmittel
vorteilhaft, um einen möglichst
hohen Polarisationsübertrag
während
der EPR-Anregung zu erzielen. Die Trityle sind eine in dieser Hinsicht
relativ günstige
Substanzklasse, für die
Werte in der Größenordnung
von T1e ≈ T2e ≈ 8 μs (extrapoliert
auf "unendliche" Verdünnung) bestimmt wurden
(aus [ii] Tabelle 3, S. 8, in isotoner NaCl-Lösung bei 37°C: "Perdeuteriertes Trityl": T1e ≅ 13 μs, T2e ≅ 8 μs; "Deuteriertes Hydroxy
Trityl": T1e ≅ 11 μs, T2e ≅ 8 μs, "Symmetrisches Trityl": T1e ≅ 9 μs, T2e ≅ 9 μs). Analog
zu den vergleichsweise langen elektronischen Relaxationszeiten werden
schmale EPR-Resonanzlinien dieser Substanzklasse in flüssigen Lösungen beobachtet.
In [ii] werden EPR-Lininebreiten < 1 μT in wässriger
Lösung,
wiederum bezogen auf unendliche Verdünnung, und in [i] eine inhomogen verbreiterte
EPR-Linienbreite von 6 μT,
angegeben. Sowohl die EPR-Linienbreiten als auch ursächlich die
elektronischen Relaxationszeiten sind stark abhängig von den jeweiligen Umgebungsbedingungen. Hierzu
gehören
insbesondere die vorliegende Konzentration des Kontrastmittels als
auch von in der Umgebung gelöstem
Sauerstoff. Die Relaxationszeiten des Elektronenspins und die EPR-Linienbreiten des
Moleküls
werden durch intramolekulare Hyperfeinstrukturen und eine große Verteilung
der elektronischen Spindichte über
das Molekül
negativ beeinflusst. Vorteilhaft bei den Tritylen ist dabei, dass
sie aufgrund der fehlenden Hyperfeinstruktur des ungepaarten Elektrons
mit dem zentralen Kohlenstoffatom (Kernsein von 12C:
I = 0) nur eine singuläre,
dominierende EPR Linie aufweisen. Ausserdem wurde mit den vorgeschlagenen
Substanzen eine zentrale Lokalisation der Spindichte über eine
symmetrische Molekülstruktur
sowie eine Verringerung der weiteren intramolekularen Wechselwirkungen
durch Deuterierung (Substitution von Wasserstoffkernen durch das Wasserstoff-Isotop 2H) angestrebt. Dies gelang bei den bekannten
Ansätzen
jedoch nur bedingt und, wie die Ergebnisse nahe legen, in nicht
ausreichender Form.
-
Ein
weiterer Parameter, der für
die Eignung des Kontrastmittels sowohl für OMRI als auch für konventionelle
MRT von entscheidender Bedeutung ist, stellt die Protonen-Relaxivität dar, mit
der die Verkürzung
der Relaxationszeiten von umgebenden Protonenspins in Anwesenheit
des Kontrastmittels beschrieben wird. Dabei sind möglichst
kurze Kernspinrelaxationszeiten der das OMRI-Kontrastmittel umgebenden
Protonen für
einen großen
OMRI-Effekt von Vorteil. Daraus resultiert die Forderung nach großen Werten
für die
Protonen Relaxivität
des OMRI Kontrastmittels. In der zitierten Literatur [i], [ii],
[iii] werden für
die Trityl-Derivate Relaxivitäts-Werte
zwischen 0,14 mM–1s–1 und
0,44 mM–1s–1 angegeben.
-
In
der
US 5,688,486 wird
beschrieben, dass Fullerene als Kontrastmittel für konventionelle MRT Verwendung
finden können.
Hierbei wird als Atom mit einem Kernsein ≥ ½ das Kohlenstoffisotop
13C vorgeschlagen.
-
Beschreibung der Erfindung
-
Die
Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein endohedrale Fullerene enthaltendes
Kontrastmittel für
die Kernspintomographie unter Ausnutzung des Overhausereffekts bereitzustellen,
bei dem mit möglichst
geringer Energie viele Elektronen-Spins angeregt werden, und die
geeignet sind, diese magnetische Ausrichtung mittels Polarisationstransfer
auf möglichst
viele Kern-Spins zu übertragen.
Sie sollen lange Relaxationszeiten des Elektronenspins und daraus
folgend sehr schmale und exakt begrenzte EPR-Linienbreiten aufweisen.
-
Zusätzlich besteht
für die
Eignung als OMRI-Kontrastmittel die Forderung einer möglichst
effizienten Verkürzung
von Kernsein-Relaxationszeiten der umgebenden Protonen. Dies wird
durch eine möglichst
hohe Protonen-Relaxivität
dargestellt.
-
Darüberhinaus
müssen
sie wasserlöslich, stabil
und toxisch unbedenklich sein, damit sie als Kontrastmittel für OMRI zu
Gewebeuntersuchungen an lebenden Organismen verwendet werden können.
-
Erfindungsgemäß wird diese
Aufgabe dadurch gelöst,
dass ein Kontrastmittel für
die Kernspintomographie unter Ausnutzung des Overhausereffekts aus
endohedralen Fullerenen verwendet wird, die mit atomarem Stickstoff
(N) oder mit atomarem Phosphor (P) gefüllt sind.
-
Der
Molekülkäfig der
Fullerene besteht aus ≥ 60
Kohlenstoffatomen. Damit die erfindungsgemäßen endohedralen Fullerene
als Kontrastmittel für OMRI
zu Gewebeuntersuchungen an lebenden Organismen verwendet werden
können,
müssen
diese wasserlöslich
gemacht werden.
-
Die
Solubilisierung der endohedralen Fullerene erfolgt in einer bevorzugten
Variante derart, dass an die Fullerene funktionelle chemische Gruppen
kovalent angebunden werden, die eine hohe Wasserlöslichkeit
vermitteln. Besonders bevorzugt wird die Funktionalisierung mithilfe
von Malonsäureestern,
die analog Literatur erfolgen kann [vii, viii, ix] Diese Ester werden
anschließend
verseift [x]. Die entstehenden Carbonsäuresalze sind sehr gut wasserlöslich.
-
Die
Vorteile dieser Verbindungen liegen in ihrer hohen Stabilität und geringen
Toxizität.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft daher die Verwendung eines Kontrastmittels
für die
Kernspintomographie unter Ausnutzung des Overhausereffects (OMRI)
dadurch gekennzeichnet, dass das Kontrastmittel aus endohedralen
Fullerenen (Z@Cx)-Rn besteht,
wobei
Z Stickstoff oder Phosphor bedeutet,
R eine hydrophile Gruppe
bedeutet,
n für
eine Ziffer zwischen 1–10
steht, und
X eine Ziffer zwischen 60 und 82 ist,
sowie
deren physiologisch verträgliche
Salze.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
sind die erfindungsgemäß verwendeten
endohedralen Fullerene dadurch gekennzeichnet, dass
R eine
C(COY)2 Gruppe bedeutet, die mit dem Fulleren über zwei
benachbarte C-Atome
verbunden ist und somit einen Cyclopropanring bildet und Y unabhängig voneinander
NR1R2 oder OR1 bedeutet,
wobei R1 und
R2 unabhängig
voneinander H, oder C1-C10-Alkyl,
welches
mit 1 bis 6 Hydroxylgruppen substituiert ist,
bedeuten, und
n
für eine
Ziffer zwischen 1–10
steht,
sowie deren physiologisch verträgliche Salze.
-
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
sind die erfindungsgemäß verwendeten
endohedralen Fullerene dadurch gekennzeichnet, dass
R eine
C(COY)2 Gruppe bedeutet, die mit dem Fulleren über zwei
benachbarte C-Atome
verbunden ist und somit einen Cyclopropanring bildet,
Y OR3 bedeutet und
n gleich 1 ist,
wobei
R3 ein bis zu 50 C-Atome umfassender dendrimerer verzweigter
Alkylrest ist, der von bis zu 10 N- oder O-Atomen oder -C(O)N(H)-Resten
unterbrochen sein kann und der mit bis zu 10 Hydroxy-, Carbonsäure-, oder
Carbonsäureamid-Gruppen
substituiert sein kann,
sowie deren physiologisch verträgliche Salze.
-
Die
erfindungsgemäß verwendeten
wasserlöslichen
endohedralen Fullerenen werden in einem Verfahren hergestellt, dadurch
gekennzeichnet, dass hydrophile funktionelle Gruppen kovalent an
ein endohedrales Fulleren (Z@Cx) gekoppelt
werden, wobei Z und x wie oben definiert sind.
-
Eine
andere Variante zur Solubilisierung der endohedralen Fullerene besteht
darin, dass die nackten Fullerene als Gast in einem Gast-Wirts-Komplex verwendet
werden, wobei als Wirtsmolekül
Cyclodextrin verwendet wird, das in hohem Maße wasserlöslich ist. Zum Beispiel kann
diese Komplexierung mit Cyclodextrin analog [xi] durchgeführt werden.
Dabei entstehen in der Regel keine kovalenten Bindungen zwischen
Gast- und Wirtsmolekül.
Diese Variante hat den Vorteil, dass das angewendete Verfahren einfacher
durchzuführen
ist. Bei der Verwendung des bekannten Wirtsmoleküls Cyclodextrin ist die toxikologische
Unbedenklichkeit bereits bekannt.
-
Die
erfindungsgemäß verwendeten
Verbindungen sind aufgrund ihrer Wasserlöslichkeit leicht intravenös applizierbar.
Es besteht auch die Möglichkeit
das Kontrastmittel direkt an definierten Orten zu deponieren um
einen gezielten Polarisationsaustausch zu ermöglichen.
-
Die
Vorteile der Erfindung bestehen gegenüber den bekannten Kontrastmitteln
für OMRI
unter anderem darin, dass diese endohedralen Fullerene inert sind,
d. h. sie verhalten sich chemisch als auch elektrisch faktisch neutral.
Die Einschlusselemente weisen eine stabile Hülle auf, so dass sich keine
freien Elektronen an der Außenseite
des Fullerens befinden. Daraus folgt, dass diese endohedralen Fullerene
ausschließlich über die
magnetische Dipolwirkung auf ihre Umgebung wirken. Die Einschlusselemente sind
im Gegensatz zu metallischen Einschlüssen, die an die Käfiginnenseite
anlagern, frei in der Käfigmitte des
Fullerens positioniert, wodurch keine Wechselwirkungen mit dem Fulleren-Molekül stattfinden.
Diese symmetrische und nach außen
abgeschlossene Struktur der endohedralen Fullerene bewirkt eine große Stabilität dieser
Verbindung.
-
Die
erfindungsgemäß verwendete
Substanz N@C63(COOH)6 (III)
besitzt lange Spin-Relaxationszeiten
des ungepaarten Elektrons. Mit gepulsten Spin-Echo EPR-Messungen im X-Band
(9.5 GHz EPR-Larmorfrequenz) und aus CW EPR Linienbreiten im L-Band
(1.1 GHz EPR-Larmorfrequenz) konnten sehr lange elektronische Relaxationszeiten
T1e ≅ 150 μs und T2e ≅ 22 μs in flüssiger Lösung gemessen werden
(s. 4), die mindestens eine Größenordnung länger sind
als die der Trityle. Aus [ii] Tabelle 3, S. 8, in isotoner NaCl-Lösung bei
37°C: "Perdeuteriertes Trityl": T1e ≅ 13 μs, T2e ≅ 8 μs; "Deuteriertes Hydroxy
Trityl": T1e ≅ 11 μs, T2e ≅ 8 μs, "Symmetrisches Trityl": T1e ≅ 9 μs, T2e ≅ 9 μs.
-
Die
besondere Eignung der erfindungsgemäß verwendeten endohedralen
Fullerene zeigt sich desweiteren aufgrund ihrer gegenüber dem
Stand der Technik überraschend
hohen Relaxivität,
die in standardisierter Weise mittels relaxometrischer Messungen
bestimmt wird. Die Substanz (III) weist eine Relaxivität r1 ≅ 47
mM–1s-1 (gegenüber
den Trityl-Derivaten
mit Relaxivitäts-Werten
zwischen 0,14 mM–1s–1 und
0,44 mM–1s–1 [i],
[ii], [iii]) in wässriger
Lösung
mit einer Spinkonzentration von 6 μM bei einer Lösungsmitteltemperatur
von 37°C
auf. Dieser unerwartet hohe Wert liegt bei einer Magnetfeldstärke von ca.
15 mT vor, was einer Radiofrequenz von 600 kHz und damit den für OMRI notwendigen
Bedingungen sehr niedriger Magnetfeldstärke entspricht.
-
Aufgrund
der gegenüber
dem Stand der Technik um mindestens einen Faktor 10 längeren Spinrelaxationszeiten
der erfindungsgemäß verwendeten
endohedralen Fullerene ist bei deren Verwendung als OMRI-Kontrastmittel
eine wesentlich geringere RF-Leistung für die Anregung der EPR-Übergänge notwendig.
Daher ist die gewünschte
Verstärkung
der MRT-Signale durch den Overhauser Effekt mit niedrigeren RF-Leistungen
zur EPR-Anregung möglich.
-
Zusätzlich führt die
gegenüber
den Tritylen überraschenderweise
festgestellte wesentlich höhere
Protonen-Relaxivität
der erfindungsgemäß verwendeten
Substanzen zu einer weiteren, entscheidenden Steigerung des OMRI-Effekts:
Aufgrund der gegenüber
den Tritylen um mindestens ebenfalls eine Größenordnung gesteigerten Verkürzung der Relaxationszeiten
der umgebenden Protonenspins ist es möglich, OMRI-Untersuchungen mit entsprechend geringeren
Kontrastmittel Dosierungen insbesondere im Bereich ab 0,05 mMol/kg
Körpergewicht bis
1 mMol/kg Körpergewicht,
in dem mit den Tritylen kein ausreichender OMRI-Effekt erzielt werden
kann, durchzuführen.
-
Da
die Sauerstoff-Empfindlichkeit von N@C60 und
deren Derivaten (N@Cx)-Rn gering
ist und die von P@C60 und deren Derivaten
(P@Cx)-Rn erhöht ist,
können
durch gleichzeitige oder zeitlich versetzte Messungen mit diesen
beiden Substanzen Tomographie-Bilder ohne und mit Sauerstoffnachweis
(Oximetrie) zur Darstellung von physiologischen oder pathologischen
Zuständen
erstellt werden, ähnlich
wie es mit Tritylen experimentell unter Verwendung hoher Kontrastmittel-Dosierungen
(1 bis 5 mmol/kg Körpergewicht)
demonstriert wurde [v], [vi]. Mit EPR-Messungen von P@C60 (IX)
in Toluol kann eine reversible 20fache EPR-Linienverbreiterung nach
Spülung
der Lösung
mit Sauerstoff beobachtet werden, die bei N@C60 und
Derivaten nicht auftritt (siehe 4).
-
Die
Erfindung betrifft daher die Verwendung von den erfindungsgemäß verwendeten
wasserlöslichen
endohedralen Fulleren-Derivaten, dadurch gekennzeichnet, dass zuerst
ein Kontrastmittel mit atomarem Stickstoff als Einschlusselement
(N@Cx)-Rn verwendet
wird und eine erste Kernspintomographie durchgeführt wird und zeitlich versetzt
danach ein Kontrastmittel mit atomarem Phosphor als Einschlusselement
(P@Cx)-Rn verwendet
wird und eine zweite Kernspintomographie durchgeführt wird.
-
Beispiele
-
Die
Erfindung soll nachstehend an Hand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.
Die zugehörigen
Zeichnungen stellen dar:
-
1a:
Schematische Darstellung eines endohedralen Fullerens N@C60 (I)
-
1b:
Schematische Darstellung eines endohedralen Fullerens P@C60 (IX)
-
2:
X-Band ESR Spektum von N@C60 (I) in CH2Cl2 bei 300 K
-
3:
L-Band ESR Spektum von N@C63(COOH)6 (III) in H2O bei
300 K
-
4: 4 zeigt
die reversible Sauerstoffempfindlichleit von P@C60 in Toluol
-
5:
Schemazeichnung zur Synthese der e,e,e-Hexacarbonsäure (IV)
nach Beispiel 1
-
6:
Schemazeichnung zur Synthese der Malonsäurevorstufe nach Beispiel 2
-
7:
Synthese des Dendrimers nach Beispiel 2
-
8:
Schemazeichnung zur Synthese des Dendrimer-Fullerens nach Beispiel
2
-
Die
Herstellung der endohedralen Stickstoff-Fullerene N@C60 (I)
erfolgt beispielsweise durch Ionenimplantation. [xii]
-
Die
anschließende
Trennung der gefüllten von
den leeren Fullerenen erfolgt durch High Performance Liquid Chromatography
(HPLC) [xiii].
-
Alle
folgenden Beispiele werden mit einem Gemisch aus N@C60 und „leerem" C60 durchgeführt. Für die EPR
und OMRI-Messungen ist ein Spingehalt zwischen 10–2 und
10–4 ausreichend.
In den folgend beschriebenen Beispielen ist der Spingehalt des Fullerengemisches
10–4 bis
10–2.
-
Beispiel 1 Synthese von N@C63(COONa)6 (III)
-
Zunächst werden
255 mg (0.354 mmol/1.0 equ.) N@C60 (I) unter
Argonschutz und Rühren
in 400 ml trockenem Toluol gelöst.
Anschließend
gibt man 205 mg (0.319 mmol/0.9 equ.) cyclo-[3]-Octylmalonat [xiv]
und 243 mg (0.956 mmol/2.7 equ.) Iod hinzu. Daraufhin lässt man
eine Lösung
von 404 mg (397 μl/2.65
mmol/7.5 equ.) DBU in 160 ml trockenem Toluol über 3 h zutropfen, wobei die
Farbe nach tieforange umschlägt.
Nach weiteren 10 min Rühren
bei Raumtemperatur wird das Rohgemisch einer Flash Chromatographie
auf Kieselgel (6 × 25
cm) unterworfen. Spuren nichtumgesetzten C60 wird
mit anderen Verunreinigungen zuerst mit Toluol als Laufmittel eluiert
und anschließend
mit Toluol/Ethylacetat (98:2) das gewünschte e,e,e-Trisaddukt (II) als
orange Bande eluiert. Das e,e,e-(cyclo-[3]-Octylmalonyl)-hexahydro-[60]-fulleren (II)
wird von dem in Spuren mitgebildeten trans-4,trans-4,trans-4-Isomer
mittels präparativer
HPLC auf Nucleosil (Toluol/Ethylacetat 98:2) abgetrennt, die Fraktion
im Vakuum eingedampft und das Produkt aus Dichlormethan/Pentan ausgefällt. Nach
dreifachem Waschen mit Pentan und Trocknen im Hochvakuum bei 60°C erhält man 174.0
mg (0.1282 mmol, 36.2%) orangerotes Pulver [e,e,e-(cyclo-[3]-Octylmalonyl)-hexahydro-[60]fulleren
(II).
-
Die
e,e,e-Trisaddukt-Hexacarbonsäure N@C63(COOH)6 (IV) erhält man durch
3 h Rühren
einer Lösung
von 100 mg des entsprechenden e,e,e-Trisadduktmalonats (II) in 50
ml Toluol unter Stickstoffschutz in Gegenwart eines 20fach molaren Überschusses
von NaH bei 60°C.
Damit wird das NaH homogen im Toluol dispergiert. Nach Zugabe von
1 ml Methanol fällt
das Natriumsalz der e,e,e-Trisaddukt-Malonsäure (III) unter heftiger Gasentwicklung
quantitativ als Niederschlag aus. Die flüssige Phase wird durch Zentrifugieren
entfernt und der Niederschlag bei 12 h im Vakuum bei 60°C getrocknet.
-
Die
freie Säure
(IV) kann durch Waschen des Natriumsalzes der e,e,e-Trisaddukt- Malonsäure (III) mit
Toluol, 2 M Schwefelsäure
und Wasser und anschließender
Trocknung für
12 h im Vakuum bei 60°C erhalten
werden.
-
Beispiel 2: Synthese des dendrimer-Fullerens
(VIII)
-
4-Benzyloxybutansäure
-
Zu
einer Lösung
aus (44.3 ml, 50 g, 0.58 mol) γ-Butyrolacton,
und 276 ml (396.8 g, 2.32 mol) Benzylbromid in 600 ml Toluol werden
129.9 g (2.32 mol) fein gemörsertes
85%iges Kaliumhydroxid unter Rühren
zugegeben und unter Rückfluss
mit einem Wasserabscheider für
48 Stunden erhitzt. Die erhaltene Suspension wird mit 600 ml Wasser
und 300 ml Diethylether versetzt. Die wässrige Phase wird dreimal mit
je 300 ml Diethylether extrahiert. Die gesammelten organischen Phasen
werden eingeengt und mit 50 g NaOH und 600 ml Wasser für weitere
20 Stunden unter Rückfluss
erhitzt. Die wässrige
Phase wird mit verdünnter
Schwefelsäure
angesäuert
und anschließend
dreimal mit je 300 ml CH2Cl2 extrahiert. Nach
Trocknung der organischen Phase über
MgSO4 und abdestillieren des Lösungsmittel,
werden 24 g eines hellgelben Öls
erhalten. Bei der über
Nacht erhitzten Lösung
werden die Phasen getrennt und die wässrige Phase dreimal mit je
150 ml Diethylether gewaschen. Anschließend wird die wässrige Phase mit
40 ml konz. H2SO4 in
200 ml Eis angesäuert
und dreimal mit je 300 ml CH2Cl2 extrahiert.
Die gesammelten organischen Phasen werden über MgSO4 getrocknet
und das Lösungsmittel
abgezogen. Man erhält
ein dünnflüssiges hellgelbes Öl.
-
4-Benzyloxybutansäure-t-butylester
-
35
g (0.180 mol) 4-Benzyloxybutansäure
und 20 ml CH2Cl2 werden
in einem Autoklaven gefüllt
und auf –70°C (Trockeneis/Aceton)
abgekühlt.
Anschließend
werden 90 ml flüssiges
Isobuten und 2 ml konz. H2SO4 als
Katalysator zugegeben. Der Autoklav wird verschlossen und 72 Stunden
bei Raumtemperatur gerührt.
Nach Ablassen des Drucks wird die bräunliche Lösung mit 50 ml CH2Cl2 verdünnt.
Diese Lösung wird
zuerst mit KHCO3-Lösung neutralisiert, dann mit Zitronensäure-Lösung und
Wasser gewaschen. Die milchige trübe Lösung trocknet man über MgSO4. Nach Abziehen des Lösungsmittels erhält man ein hellgelbes Öl.
-
Di-(4-tert-butoxy-4-oxobutyl)malonat
-
Diese
Reaktion wird wasserfrei und in einer Stickstoffatmosphäre durchgeführt. 12.30
g (76.80 mmol) 4-Hydroxybuttersäure-tert-butylester
und 6.08 g (76.80 mmol) trockenes Pyridin werden in 250 ml absolutem
Methylenchlorid gelöst
und unter Rühren auf
0°C gekühlt. Dann
werden langsam 5.40 g (38.40 mmol), gelöst in 10 ml absolutem Methylenchlorid) Malonyldichlorid
zugegeben. Man lässt
zwei Stunden bei 0°C
und 12 h bei RT rühren.
Anschließend
filtriert man das Reaktionsgemisch über Kieselgel, wäscht mit
Wasser und trocknet die organische Phase über MgSO4.
Das Lösungsmittel
wird abgezogen, das Produkt durch FC (Cyclohexan:Ethylacetat 5:1)
gereinigt. Man erhält
9.70 g einer gelben, öligen
Flüssigkeit.
-
Di-(4-hydroxy-4-oxobutyl)malonat
-
Zu
1.57 g Di-(4-tert-butoxy-4-oxobutyl)malonat (4.04 mmol) gibt man
15 ml 98% Ameisensäure. Der
Ester löst
sich und ist nach zweitägigem
Rühren bei
Raumtemperatur vollständig
entschützt.
Nach Entfernen der Ameisensäure
im Ölpumpenvakuum erhält man in
quantitativer Ausbeute die Disäure.
-
4-Nitro-4-[2-t-(butoxycarbonyl)ethyl]-heptandisäurediester
-
Eine
Lösung
von 16.2 ml Nitromethan (18.3 g, 0.3 mol) und drei ml Triton B (40%
in Methanol) in 60 ml Dimethoxyethan wird unter Rühren auf
70°C erhitzt.
Anschließend
werden 135 ml (119.2 g, 0.93 mol) Acrylsäure-t-butylester zugetropft,
wobei die Temperatur konstant gehalten wird. Setzt im Anschluss
eine Abkühlung
ein, so werden nochmals insgesamt sechs ml Triton B innerhalb von
fünf min
zugegeben. Dann wird die Reaktions-mischung eine Stunde bei 70°C gerührt, anschließend im
Vakuum eingeengt und in 600 ml CH2Cl2 aufgenommen. Die Lösung wird erst mit 10%iger
HCl, dann dreimal mit gesättigter
NaCl-Lösung
gewaschen und die organische Phase über MgSO4 getrocknet.
Nach Abziehen des Lösungsmittels
wird der gelbliche Rückstand
aus Ethanol umkristallisiert. Man erhält einen farblosen kristallinen
Feststoff.
-
4-Amino-4-[2-t-(butoxycarbonyl)ethyl]-heptandisäurediester
-
Man
löst 25
g (60 mmol) der Nitro-Verbindung erster Generation unter gelindem
Erhitzen in 600 ml Ethanol und hydriert mit 25 g Raney-Nickel bei
RT und Normaldruck. Die Reaktionskontrolle erfolgt mittels DC (SiO2:Hexan/EtOAc 1:2). Nach 48 Stunden wird
der Katalysator über
Celite abfiltriert und das Lösungsmittel
im Vakuum entfernt. Den gelben, öligen
Rückstand
reinigt man säulenchromatographisch
an Kieselgel (SiO2:Hexan/EtOAc 2:1). Man erhält ein weißes Pulver.
-
4-Nitro-[2-(carboxyethyl)]heptandisäure
-
Man
löst 15
g (45 mmol) NO2[G-1] in 100 ml Ameisensäure und
rührt 24
Stunden bei RT. Nach ca. 30 min beginnt ein weißer Niederschlag auszufallen. Die
Ameisensäure
wird im Vakuum abgezogen. Der weiße Feststoff wird anschließend dreimal
mit Toluol versetzt, welches jeweils wieder abdestilliert wird. Nach
dem Trocknen erhält
man ein weißes
Pulver.
-
9-Cascade:nitromethan[3]:(2-aza-3-oxypentylidyne):propionsäure-tert-butylester
-
Man
löst 4.5
g (16 mmol) 4-Nitro-[2-(carboxyethyl)]heptandisäure, 22.3 g (53.5 mmol) 4-Amino-4-[2-t-(butoxycarbonyl)ethyl]-heptandisäurediester
und 6.5 g (48 mmol) 1-Hydroxy-benzotriazol
in 350 ml absolutem DMF und versetzt diese Lösung mit 9.92 g (48 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid
(DCC) gelöst
in 50 ml absolutem DMF. Nach ca. einer Stunde beginnt sich ein weißer Niederschlag
zu bilden. Die Reaktionskontrolle erfolgt mittels DC (SiO2:Hexan/EtOAc:2:1) Nach 60 Stunden wird von
ausgefallenem DCU abfiltriert und das Lösungsmittel abdestilliert.
Der gelbliche Rückstand
wird in 500 ml Ethylacetat aufgenommen und nacheinander mit 10%iger HCl,
Wasser, 10%iger NaHCO3-Lösung und gesättigter
NaCl-Lösung
gewaschen. Die organische Phase wird über MgSO4 getrocknet
und das Lösungsmittel im
Vakuum entfernt. Nach säulenchromatographischer
Reinigung an Kieselgel (SiO2:Hexan/EtOAc 2:1)
erhält
man ein weißes
Pulver.
-
9-Cascade:aminomethan[3]:(2-aza-3-oxypentylidyne):propionsäure-tert-butylester
-
Man
löst 9.0
g (6 mmol) der Nitro-Verbindung 2. Generation in 100 ml Ethanol
und hydriert mit 5 g Raney-Nickel bei RT und Normaldruck. Nach 48 Stunden
wird der Katalysator über
Celite abfiltriert und das Lösungsmittel
abgezogen. Der gelbliche Rückstand
wird durch (SiO2:Hexan/EtOAc 1:2) gereinigt
und das Produkt schließlich
mit MeOH von der Säule
eluiert. Das Lösungsmittel
wird im Vakuum entfernt. Der Rückstand
wird in CH2Cl2 gelöst und von unlöslichem
Kieselgel abfiltriert. Nach abdestillieren des Lösungsmittels im Vakuum wird
ein sich beim Trocknen aufschäumender
weißer
Feststoff erhalten.
-
18-Cascade:dihydromethan[2]:(2-aza-7-oxa-3,8-dioxooctylidyne):(2-aza-3-oxopentyl-idyne):propansäure-tert-butylester
-
Eine
Lösung
von 436 mg (1.580 mmol) Di-(4-hydroxy-4-oxobutyl)malonat, 716 mg
(3.470 mmol) DCC, 550 mg (3.470 mmol) 1-HOBT und 5.00 g (3.47 mmol)
Amin 2. Generation in DMF werden 48 h bei Raumtemperatur unter Feuchtigkeitsausschluss
gerührt.
Nach Abfiltrieren des ausgefallenen DCU und Entfernen des DMF im
Vakuum wird der Rückstand
in Ethylacetat aufgelöst
und mit 10%-iger Zitronensäure,
Wasser, 8%-iger NaHCO3-Lösung und gesättigter
NaCl-Lösung
gewaschen. Anschließend
wird die organische Phase mit MgSO4 getrocknet
und das Lösungsmittel
abrotiert. Nach FC (Cyclohexan:Ethylacetat 1:1) erhält man einen
weißen Feststoff.
-
18-Cascade:1,2-Methano-1,2-dihydro[60]fulleren[2]:(2-aza-7-oxa-3,8-dioxooctylidyne):(2-aza-3-oxopentylidyne):propansäure-tert-butylester
-
Eine
Lösung
von 439 mg (0.610 mmol) N@C60, 102 mg (0.670
mmol) DBU, 202 mg (0.610 mmol) CBr4 und
1.90 g (0.61 mmol) 18-Cascade:dihydromethan[2]:(2-aza-7-oxa-3,8-dioxooctylidyne):(2-aza-3-oxopentyl-idyne):propansäure-tert-butylester
in 300 ml Toluol (mit N2 gesättigt) lässt man einen
Tag bei RT rühren.
Die Reaktionsmischung wird über
eine Kieselgelsäule
filtriert. Zuerst wird nicht umgesetztes N@C60 mit
Toluol eluiert, anschließend
die Mischung aus Mono- und Bisaddukten mit Toluol:Ethylacetat 1:1
eluiert. Diese Mischung wird mit FC (Ether:Hexan 6:1) getrennt und
man erhält
einen braunen Feststoff.
-
18-Cascade:1,2-Methano-1,2-dihydro[60]fulleren[2]:(2-aza-7-oxa-3,8-dioxooctylidyne):(2-aza-3-oxopentylidyne):propansäure 8
-
Man
löst und
rührt 0.648
g (0.17 mmol) in 98%-iger Ameisensäure 24 h bei RT. Nach Entfernung
der Ameisensäure
im Vakuum erhält
man ein rot-braunen Pulvers.
-
Literaturverzeichnis
-
- [i] [Golman K., Leunbach I., Ardenjaer-Larsen J.H., Ehnholm
G.J., Wistrand L.G., Petersson J.S., Järvi A. and Vahasalo S., Overhauser-Enhanced
MR Imaging (OMRI), Acta Radiologica, 39, pp. 10–17 (1998)]
- [ii] [Ardenkjaer-Larsen J.H., Laursen I., Leunbach I., Ehnholm
G., Wistrand L.-G., Petersson J.S., Golman K., EPR and DNP Properties
of Certain Novel Single Elektron Contrast Agents Intended for Oximetric
Imaging, JMR 133, 1–12
(1998)]
- [iii] [Golman K., Petersson J. S., Ardenkjaer-Larsen J.H., Leunbach
I., Wistrand L.G., Ehnholm G. and Liu Kecheng, Dynamic In Vivo Oxymetry
Using Overhauser Enhanced MR Imaging, J. Magn. Reson. Imag., 12,
pp. 929–938
(2000)]
- [iv] U. Katscher und S. Petersson, Kernspintomographie unter
Nutzung des Overhausereffekts, Phys. Bl. 56, pp. 51–54 (2000)
- [v] [Krishna, M.C.; English, S.; Yamada, K.; Yoo, J.; Murugesan,
R.; Devasahayam, N.; Cook, J. A.; Golman, K.; Ardenkjaer-Larsen,
J.H.; Subramanian, S.; Mitchell, J.B., Overhauser enhanced magnetic
resonance imaging for tumor oximetry: Coregistration of tumor anatomy
and tissue oxygen concentration, PNAS 99, p. 2216–22, (2002)]
- [vi] [Krishna M.C., Subramanian S., Kuppusamy P. and Mittchell
J.B., Magnetic resonance imaging for in vivo assessment of tissue
oxygen concentration. Semin Radiat Oncol, 1, pp. 58–69 (2001)]
- [vii] X. Camps, A. Hirsch, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1997,
11, 1595–1596.
- [viii] I. Lamparth, H. Karfunkel, A. Hirsch, Angew. Chem. 1994,
106, 453–455.
- [ix] I. Lamparth, H. Karfunkel, A. Hirsch, Angew. Chem. Int.
Ed. 1994, 33, 437–438.
- [x] I. Lamparth, A. Hirsch, J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1994,
14, 1727–1728
- [xi] [C.N. Murthy und K.E. Geckeler, The water-soluble ⎕-cyclodextrin–[60]fullerene
complex, in: Chemical Communications, Bd. 13 (2001) S. 1194–1195]
- [xii] A. Weidinger, T. Almeida Murphy, B. Mertesacker, M. Höhne, T.
Pawlik, J. -M. Spaeth und B. Pietzak, Verfahren und Vorrichtung
zur Herstellung von stabilen endohedralen Fullerenen der Struktur
(Z@Cx) mit x ≥ 60, WO 98/00363
- [xiii] Goedde, B.; Waiblinger, M.; Dinse, K.-P.; Weidinger,
A. Preparation of highly-enriched N@C60/C60 and N@C70/C70. Proceedings-Electrochemical
Society (2001), 2001–11
(Fullerenes-Volume 11: Fullerenes for the New Millennium), 304–312.
- [xiv] U. Reuther., T. Brandmuller, et al., Chem. Eur. J. 2002,
8(10), 2261–2273.