WO2006087144A2 - Kontrastmittel für die kernspintomographie unter nutzung des overhauser-effekts - Google Patents
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Definitions
- the invention relates to contrast agents for magnetic resonance imaging (or magnetic resonance imaging, MRI) using the Overhauser effect, which are suitable for transferring the magnetic alignment of electron spins to adjacent proton spins.
- Magnetic resonance imaging is an imaging technique that exploits the magnetic alignment of proton spins in an externally applied magnetic field.
- CT computed tomography
- the proton spins of the hydrogen nuclei of the tissue water (or blood, lymphatic system, etc.) are aligned by an external strong magnetic field. Due to the low polarizability of the proton spins, which depends on the strength of the applied static magnetic field, MRI devices with magnetic fields below 0.2 T have not spread in clinical routine. The most common field strength today is 1.5 T.
- the signal intensity and thus the image quality are determined, in particular, by the magnetic field strength, which is between 0.5 and 3 T at a size which makes sense for such devices.
- the electron spin process analogous to the magnetic resonance of proton spins is called Electron Paramagnetic Resonance (EPR). This effect has not been exploited for imaging in medical diagnostics.
- the Overhauser effect involves a polarization transfer between different spin systems. If this transfer occurs between electron spins and proton spins, the effect can be used for imaging. This is described inter alia in ['], [''], [ hi ] and [ ⁇ v ]. In this case, the magnetic resonance is amplified by a polarization transfer of electron spins to the surrounding imaging nuclei.
- This effect is based on the fact that electron spins are easier to align magnetically than proton spins and that a polarization transfer to neighboring proton spins can take place.
- This is also referred to as Overhauser-type Dynamic Nuclear Polarization (DNP).
- DNP Dynamic Nuclear Polarization
- the thus-oriented proton spins can now be detected and evaluated with the usual imaging methods, such as MRI. When used in an imaging procedure, this leads to an amplified MRI signal. While magnetic fields of more than 1T are common in ordinary magnetic resonance imaging, magnetic resonance tomography, hereinafter referred to as OMRI (Overhauser-Enhanced Magnetic Resonance Imaging), uses fields of only 10 mT.
- the reduced magnetic field strength by a factor of 100 compared to conventional MRI is necessary to generate excitation fields for the electron spins, which despite the skin effect are able to penetrate into deeper tissue layers.
- the electron spins At a magnetic field of 1 T, the electron spins have a resonance frequency of ⁇ 10 10 Hz.
- the required reduction of the magnetic field coincides randomly with the gain brought about by the Overhauser effect, which is about a factor of 100.
- Low-field systems are thus obtained, which have a similarly good image resolution as those customary in magnetic resonance tomography, but with a considerable reduction in apparatus equipment, since superconducting magnets can be dispensed with.
- the examined tissue is also exposed to significantly lower magnetic fields during clinical use and the examinations can be carried out with devices that allow free access to the subject, ie patients with Claustrophobia can be treated easily.
- a lower noise level compared to conventional MRI is achieved.
- a (paramagnetic) substance In nuclear magnetic resonance tomography using the Overhauser effect (OMRI method), a (paramagnetic) substance must be supplied whose electron spins are magnetically aligned by an applied external magnetic field and which is suitable for the magnetic alignment of the electron spins on neighboring proton To transfer spins.
- the substances that have been developed for OMRI so far are paramagnetic radicals.
- no substance has yet undergone a systematic, pivotal, toxicological study, nor has it been brought into a first or later phase of preclinical study or clinical development (there is no OMRI approved contrast agent).
- EP 0 515 458 substances are described in which free carbon radicals of the triarylmethyl type (tritylene) are used to produce a contrast medium for magnetic resonance tomography using the Overhauser effect.
- EP 0 832 054 describes similar methyl radicals substituted by heterocyclic aromatics for the same purpose.
- a fullerenol is indicated as the contrast agent for OMRI, which has at least one free electron.
- This compound has a low stability, which is why a polarization transfer can take place only during a relatively short period of time.
- the carbon radicals show a strong degradation of Overhauser enhancement in plasma and in blood (compared to aqueous solutions), which is due to reversible protein binding of the substances in blood and the influence of oxygen on the Overhauser effect [ii].
- the stability of different trityls is reported with half-lives between a few hours and up to one year [ii], [iii].
- these free-electron radicals have high chemical reactivity, which can lead to undesirable toxicity and loss of effect.
- the achievable Overhauser enhancement depends, among other things, on the relaxation times of the electron spin.
- T 1e and T 2e spin-spin relaxation times of the electron spin are advantageous for OMRI contrast agents in order to achieve the highest possible polarization transfer during EPR excitation.
- Both the EPR linewidths and the causative electronic relaxation times are strongly dependent on the respective ambient conditions. These include in particular the present concentration of the contrast agent as well as dissolved oxygen in the environment.
- the electron spin relaxation times and the EPR linewidths of the molecule are adversely affected by intramolecular hyperfine structures and a large electronic spin density distribution across the molecule.
- the proposed substances aimed for a central localization of the spin density via a symmetric molecular structure as well as a reduction of the further intramolecular interactions by deuteration (substitution of hydrogen nuclei by the hydrogen isotope 2 H).
- this was limited in the known approaches and, as the results suggest, not in sufficient form.
- the object of the invention is to provide paramagnetic substances in which many electron spins are excited with the lowest possible energy, and which are suitable for transferring this magnetic alignment by means of polarization transfer to as many core spins as possible. They should have long relaxation times of the electron spin and consequently very narrow and exactly limited EPR line widths. In addition, suitability as an OMRI contrast agent requires the most efficient possible shortening of nuclear spin relaxation times of the surrounding protons. This is represented by the highest possible proton relaxivity.
- this object is achieved in that water-soluble paramagnetic substances as contrast agents for magnetic resonance imaging under
- Contain fullerenes which are characterized by being atomic nitrogen
- N or are filled with atomic phosphorus (P), preferably they are filled with 14 N,
- compositions and substances are useful as contrast agents for magnetic resonance imaging utilizing the Overhauser effect (OMRI) and can be used as such.
- OMRI Overhauser effect
- the molecular cage of the fullerenes fullerenes according to the invention consists of> 60 carbon atoms and preferably consists of up to 82 carbon atoms, preferably it consists of 60 carbon atoms.
- endohedral fullerenes of the invention In order for the endohedral fullerenes of the invention to be used as contrast agents for OMRI for tissue studies on living organisms, they must be made water-soluble.
- the solubilization of the endohedral fullerenes in a preferred embodiment is such that functional covalently attached to the fullerenes functional chemical groups that mediate high water solubility.
- Particularly preferred is the functionalization using Malonklam, the analog Literature [ v ⁇ i , vlil , ix ] These esters are then saponified M> The resulting carboxylic acid salts are very soluble in water.
- the present invention relates to substances consisting of endohedral fullerenes of the formula (Z @ C x ) -R n , where
- R is a hydrophilic group
- n is a number between 1-10
- X is a number between 60 and 82, as well as their physiologically acceptable salts, characterized in that
- Z means nitrogen or phosphorus
- the endohedrals according to the invention are
- R is a C (COY) 2 group, which with the fullerene over two adjacent C
- Atoms and thus forms a cyclopropane ring and Y is independently of one another NR 1 R 2 or OR 1 , where R 1 and R 2 independently of one another denote H 1 or C 1 -C 10 -alkyl which is substituted by 1 to 6 hydroxyl groups, and n is a number 1-10, and their physiologically acceptable salts.
- endohedral fullerenes according to the invention are characterized in that
- R is a C (COY) 2 group, which with the fullerene over two adjacent C
- R 3 is a dendrimeric branched alkyl radical containing up to 50 C atoms, which may be interrupted by up to 10 N or O atoms or -C (O) N (H) radicals and which may be substituted by up to 10 hydroxy, Carboxylic acid or carboxylic acid amide groups may be substituted, and their physiologically acceptable salts.
- the present invention further relates to a process for the preparation of the water-soluble endohedral fullerenes according to the invention, characterized in that hydrophilic functional groups are covalently coupled to an endohedral fullerene (Z @ C X ), wherein Z and x are as defined above.
- MRI using the Overhauser effect is critically concerned with the presence of unpaired electrons and, in particular, the specific properties of the associated electron spin.
- I contrast agent provided by the solubilization is achieved in that the naked fullerenes are used as a guest in a guest-host complex, the
- Host molecule is highly soluble in water.
- this complexation can be carried out with cyclodextrin analogous to [* '].
- cyclodextrin analogous to [* '].
- no covalent bonds are formed between host molecule and host molecule.
- This variant has the advantage that the method used is easier to carry out.
- host molecules such as cyclodextrins
- Suitable cyclodextrins are alpha, beta and gamma cyclodextrins and derivatives thereof, for example hydroxypropyl derivatives.
- Particularly preferred cyclodextrins are beta-cyclodextrin and hydroxypropyl-beta-cyclodextrin.
- calix [n] arenes and derivatives thereof (Atwood J. L et al., 1994, Nature, 368: 229-231; Bhattacharya et al., 2003, J. Phys. Chem B., 107. 11830-11834), in particular calix [4] arenes, calix [6] arenes and calix [8] arenes and derivatives thereof as host molecules.
- Suitable derivatives are in particular derivatives which contribute to the hydrophilic character of the host molecules.
- Suitable calixarene derivatives are, for example, sulfonato-calixarenes (Yang W. and de V Amsterdam, 2005, AAPS J., 7, Art. 23, E241-E248).
- the present invention thus relates to contrast agents for magnetic resonance tomography using the Overhauser bins (OMRI) wherein the contrast agent is a guest-host complex, and wherein the host molecule is highly water-soluble and the guest molecule of endohedral fullerenes of the formula (Z @Cx), where Z is nitrogen or phosphorus, and X is a digit between 60 and 82.
- the host molecule is preferably cyclodextrin, in particular a beta-cyclodextrin or a derivative thereof.
- the host molecule is a calix [n] arene, in particular a calix [4] arene, calix [6] arene or calix [8] arene or a derivative thereof.
- the invention further relates to the use of water-soluble paramagnetic substances containing endohedral fullerenes, which are characterized in that they are filled with atomic nitrogen (N) or with atomic phosphorus (P), as a contrast agent for magnetic resonance imaging using the Overhauser bins (OMRI) ,
- the invention further relates to the use of water-soluble paramagnetic substances containing endohedral fullerenes, which are characterized in that they are filled with atomic nitrogen (N) or with atomic phosphorus (P), for producing a contrast agent for magnetic resonance imaging using the Overhauser bins ( OMRI).
- N atomic nitrogen
- P atomic phosphorus
- the invention further relates to water-soluble paramagnetic substances containing endohedral fullerenes, which are characterized in that the endohedral fullerenes are filled with atomic nitrogen (N) or with atomic phosphorus (P), for use as contrast agent for magnetic resonance imaging using the Overhauser bins ( OMRI).
- N atomic nitrogen
- P atomic phosphorus
- the compounds of the invention are easily administered intravenously due to their water solubility. It is also possible to deposit the contrast agent directly at defined locations in order to enable a targeted polarization exchange.
- the advantages of the invention over the known contrast agents for OMRI include the fact that these endohedral fullerenes are inert, ie they behave chemically and electrically neutral in fact.
- the inclusion elements have a stable shell, so that there are no free electrons on the outside of the fullerene. It follows that these endohedral fullerenes exclusively act on their environment via the magnetic dipole effect.
- the inclusion elements unlike metallic inclusions, which attach to the inner cage side, freely positioned in the cage center of the fullerene, whereby no interactions with the fullerene molecule take place. This symmetric and externally closed structure of the endohedral fullerenes causes a high stability of this compound.
- the particular suitability of the endohedral fullerenes according to the invention is further demonstrated by their surprisingly high relaxivity compared with the prior art, which is determined in a standardized manner by means of relaxometric measurements.
- the substance (III) has a relaxivity T 1 ⁇ 47 mM "1 s '1 (compared with the trityl derivatives with relaxivity values between 0.14 mM ⁇ V 1 and 0.44 mM " 1 s ' 1 [i], [ii], [iii]) in aqueous solution with a spin concentration of 6 ⁇ M at a solvent temperature of 37 ° C.
- This unexpectedly high value is present at a magnetic field strength of about 15 mT, which corresponds to a radio frequency of 600 kHz and thus the necessary conditions for OMRI very low magnetic field strength.
- the spin-relaxation times of the endohedral fullerenes according to the invention are at least 10 times greater than those of the prior art, their use as OMRI contrast agents necessitates a significantly lower RF power for the excitation of the EPR junctions. Therefore, the desired amplification of the MRI signals is possible through the Overhauser effect with lower RF powers for EPR excitation.
- the significantly higher proton relaxivity of the substances according to the invention surprisingly found in comparison with the tritylene leads to a further, decisive increase in the OMRI effect: Because of the shortening of the relaxation times of the surrounding proton spins compared to the tritylene by at least an order of magnitude, it is possible to Investigations with correspondingly lower contrast agent dosages, in particular in the range from 0.05 mmol / kg body weight to 1 mmol / kg body weight, in which it is not possible to achieve a sufficient OMRI effect with the tritylene.
- the invention therefore relates to the use of the water-soluble endohedral fullerene derivatives according to the invention, characterized in that first a contrast agent with atomic nitrogen is used as the inclusion element (N @ C x ) -R n and a first magnetic resonance tomography is carried out and a contrast agent is added after a time delay is used with atomic phosphor as an inclusion element (P @ C x ) -R n and a second magnetic resonance tomography is performed.
- Fig. 3 L-band ESR spectrum of N @ C 63 (COOH) 6 (III) in H 2 O at 300 K
- Figure 4 shows the reversible oxygen sensitivity of P @ C60 in toluene
- FIG. 5 Schematic diagram for the synthesis of the e, e, e-hexacarboxylic acid (IV) according to Example 1
- FIG. 6 Schematic drawing for the synthesis of the malonic acid precursor according to FIG.
- FIG. 7 Synthesis of the dendrimer according to Example 2
- FIG. 8 Schematic drawing for the synthesis of the dendrimer fullerene according to FIG
- the e, e, e- (cyclo- [3] -octylmalonyl) -hexahydro [60] fullerene (II) is prepared from the trans-4, trans-4, trans-4 isomer co-formed by preparative HPLC Nucleosil (toluene / ethyl acetate 98: 2) separated, the fraction was evaporated in vacuo and the product was precipitated from dichloromethane / pentane.
- the e, e, e-tris-adduct hexacarboxylic acid N @ C63 (COOH) 6 (IV) is obtained by stirring a solution of 100 mg of the corresponding e, e, e-trisadduct malonate (II) in 50 ml of toluene under nitrogen protection for 3 h Presence of a 20-fold molar excess of NaH at 60 0 C. Thus, the NaH is homogeneously dispersed in toluene. After addition of 1 ml of methanol, the sodium salt of e, e, e-tris-adduct-malonic acid (III) precipitates quantitatively with vigorous evolution of gas as a precipitate. The liquid phase is removed by centrifuging and the precipitate is dried at 60 ° C. under reduced pressure for 12 hours.
- the free acid (IV) can be obtained by washing the sodium salt of e, e, e-trisadduct malonic acid (III) with toluene, 2 M sulfuric acid and water and then drying for 12 h in vacuo at 60 ° C.
- Example 2 Synthesis of dendrimer fullerene (VHI)
- the aqueous phase is acidified with dilute sulfuric acid and then extracted three times with 300 ml of CH 2 Cl 2 . After drying the organic phase over MgSO 4 and distilling off the solvent, 24 g of a pale yellow oil are obtained. In the overnight solution, the phases are separated and the aqueous phase washed three times with 150 ml of diethyl ether. Subsequently, the aqueous phase with 40 ml of conc. Acidified H 2 SO 4 in 200 ml of ice and extracted three times with 300 ml of CH 2 Cl 2 . The collected organic phases are dried over MgSO 4 and the solvent stripped off. A thin, light yellow oil is obtained.
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Abstract
Die Erfindung betrifft Kontrastmittel für die Kernspintomographie (oder auch Magnetresonanztomographie, MRT) unter Nutzung des Overhauser-Effekts, die geeignet sind, die magnetische Ausrichtung von Elektronen-Spins auf benachbarte Protonen-Spins zu übertragen.
Description
f
Kontrastmittel für die Kernspintomographie Jntef Nutzung- {des Overhauser-Effekts
Die Erfindung betrifft Kontrastmittel für die Kernspintomographie (oder auch Magnetresonanztomographie, MRT) unter Nutzung des Overhauser-Effekts, die geeignet sind, die magnetische Ausrichtung von Elektronen-Spins auf benachbarte Protonen-Spins zu übertragen.
Stand der Technik
Die Kernspintomographie ist ein bildgebendes Verfahren, das die magnetische Ausrichtung von Protonen-Spins in einem von Außen angelegten Magnetfeld ausnutzt. Die MRT hat sich in den letzten zwei Jahrzehnten zu einem etablierten und weit verbreiteten Verfahren in der medizinischen Diagnostik entwickelt. Im Gegensatz zu anderen Verfahren mit vergleichbarer diagnostischer Bedeutung - insbesondere der Computertomographie (CT) - entsteht bei der MRT keinerlei Strahlenbelastung oder sonstige bisher bekannte physiologische Belastung für den Patienten. Bei MRT werden die Protonen-Spins der Wasserstoffkerne des Gewebewassers (oder des Blutes, Lymphsystems etc.) durch ein äußeres starkes Magnetfeld ausgerichtet. Auf Grund der geringen Polarisierbarkeit der Protonen-Spins, die von der Stärke des angelegten statischen Magnetfelds abhängt, haben sich MRT Geräte mit Magnetfeldern unter 0.2 T nicht in der klinischen Routine verbreitet. Die verbreitetste Feldstärke beträgt heute 1.5 T. Durch Anlegen zeitlich gepulster magnetischer Wechselfelder, deren Trägerfrequenz der Resonanzfrequenz der Protonen-Spins bei der jeweiligen Feldstärke entspricht (etwa 62 MHz bei 1.5 T), wird eine Detektion der Protonen-Spins u.a. nach Kernspin- Relaxationszeit, Dichte und Bewegung ermöglicht, woraus Schlussfolgerungen auf Art und Zustand von biologischem Gewebe möglich sind. Durch zusätzlichen Einsatz von Magnetfeldgradienten in verschiedenen Richtungen lässt sich eine gute räumliche Auflösung in Schichtbildern oder dreidimensionalen Darstellungen erzeugen.
Die Signalintensität und damit die Bildqualität werden insbesondere bestimmt durch die Magnetfeldstärke, die bei einer für derartige Geräte sinnvollen Größe zwischen 0.5 und 3 T liegt.
Der der Magnetresonanz der Protonenspins analoge Prozess für Elektronenspins wird als Elektronenspin Resonanz (Electron Paramagnetic Resonance EPR) bezeichnet. Dieser Effekt ist bisher nicht zur Bildgebung in der medizinischen Diagnostik ausgenutzt worden. Beim Overhauser-Effekt findet ein Polarisationstransfer zwischen verschiedenen Spinsystemen statt. Sofern diese Übertragung zwischen Elektronenspins und Protonenspins erfolgt, ist der Effekt für die Bildgebung nutzbar. Dies ist u.a. in ['], [''], [hi] und [ιv] beschrieben. Hierbei erfolgt eine Verstärkung der magnetischen Resonanz durch einen Polarisationstransfer von Elektronenspins auf die sie umgebenden bildgebenden Kerne. Dieser Effekt beruht darauf, dass sich Elektronen-Spins leichter magnetisch ausrichten lassen als Protonen-Spins und ein Polarisationsübertrag auf benachbarte Protonen-Spins erfolgen kann. Dies wird auch mit Dynamischer Kernspinpolarisation (Dynamic Nuclear Polarisation - DNP) vom Overhauser-Typ bezeichnet. Die so ausgerichteten Protonen-Spins lassen sich nun mit den üblichen bildgebenden Verfahren, wie MRT erfassen und auswerten. Bei der Anwendung in einem bildgebenden Verfahren führt dies zu einem verstärkten MRT- Signal. Während bei einer gewöhnlichen Kernspintomographie Magnetfelder von über 1T üblich sind, werden bei einer mittels Overhauser-Effekt verstärkten Magnet Resonanz Tomographie, im weiteren als OMRI (Overhauser-enhanced Magnetic Resonance Imaging) bezeichnet, Felder von nur 10 mT verwandt. Die um den Faktor 100 reduzierte Magnetfeldstärke gegenüber der konventionellen MRT ist erforderlich, um Anregungsfelder für die Elektronenspins zu erzeugen, die trotz des Skineffekts in tiefere Gewebeschichten einzudringen vermögen. Bei einem Magnetfeld von 1 T haben die Elektronenspins eine Resonanzfrequenz von ~1010 Hz. Ein derartiges Anregungsfeld würde aber aufgrund des Skin-Effekts bereits an der Oberfläche absorbiert und dabei zu einer gefährlichen Erwärmung des Gewebes führen. Die erforderliche Reduzierung des Magnetfeldes entspricht zufällig der durch den Overhauser-Effekt bewirkten Verstärkung, die ungefähr beim Faktor 100 liegt. Man gelangt daher zu Niedrigfeldsystemen, die eine ähnlich gute Bildauflösung aufweisen wie die in der Kernspintomographie üblichen, jedoch unter erheblicher Reduzierung apparativer Ausrüstungen, da auf supraleitende Magnete verzichtet werden kann. Dies führt zu einer kostengünstigeren Untersuchungsmethode. Das untersuchte Gewebe ist zudem bei klinischer Anwendung wesentlich geringeren magnetischen Feldern ausgesetzt und die Untersuchungen können mit Geräten vorgenommen werden, die einen freien Zugang zum Probanden ermöglichen, d. h. es können auch Patienten mit
Klaustrophobie problemlos behandelt werden. Außerdem wird eine geringere Geräuschbelastung im Vergleich zur herkömmlichen MRT erreicht.
Bei der Kernspintomographie unter Nutzung des Overhauser-Effekts (OMRI-Verfahren) muss eine (paramagnetische) Substanz zugeführt werden, deren Elektronenspins durch ein angelegtes äußeres Magnetfeld magnetisch ausgerichtet werden, und die geeignet ist, die magnetische Ausrichtung der Elektronen-Spins auf benachbarte Protonen-Spins zu übertragen. Bei den Substanzen, die bislang für OMRI entwickelt wurden, handelt es sich um paramagnetische Radikale. Es wurde bisher jedoch noch keine Substanz weder einer systematischen, zulassungs-relevanten toxikologischen Untersuchung unterzogen noch in eine erste oder spätere Phase einer vorklinischen Studie oder klinischen Entwicklung gebracht (es gibt kein für OMRI zugelassenes Kontrastmittel).
In der EP 0 515 458 sind Substanzen beschrieben, bei der freie Kohlenstoffradikale vom Triarylmethyl-Typ (Trityle) verwendet werden, um ein Kontrastmedium für die Kernspintomographie unter Nutzung des Overhauser-Effekts herzustellen. EP 0 832 054 beschreibt ähnliche Methylradikale, die durch heterocyclische Aromaten substituiert sind für den gleichen Zweck.
Eine andere Substanzklasse als Kontrastmittel für die Kernspintomographie unter Nutzung des Overhauser-Effekts ist in der EP 0 625 055 B1 beschrieben, wonach Kohlenstoffallotrope und andere analoge netzartige molekulare Strukturen als grundlegende strukturelle Bestandteile verwendet werden.
In der WO 01/24696 wird als Kontrastmittel für OMRI ein Fullerol angegeben, das mindestens ein freies Elektron aufweist. Diese Verbindung weist eine geringe Stabilität auf, weshalb nur während einer relativ kurzen Zeitdauer ein Polarisationsübertrag stattfinden kann.
In Bezug auf ihre Eignung als OMRI Kontrastmittel sind in der Literatur der letzten Jahre am ausführlichsten beschrieben die o.g., unterschiedlich substituierten Triarylmethyl und Triphenylmethyl Radikale (siehe z.B. US 5,289,125; US 4,984,573; und EP 0 515 458).
-A-
Die Eigenschaften dieser, beispielsweise in [i], [ii], [Hi], [v], [vι] beschriebenen Trityle werden daher im Folgenden als aktueller "Stand der Technik" weiter beschrieben.
Die genannten Substanzen ermöglichen teilweise zufriedenstellende in-vitro Ergebnisse [ii], die bisherigen in-vivo Experimente an Tiermodellen zeigen jedoch ein zu geringes praktisch erreichbares Overhauser-enhancement, um für eine klinische Weiterentwicklung als OMRI-Substanz für allgemeine diagnostische Bildgebung in Frage zu kommen: Hierfür sind Dosierungen in der Größenordnung zwischen 1mMol/kg Körpergewicht und 5mMol/kg Körpergewicht notwendig [v], für die eine klinische Entwicklung und Zulassung aus toxikologischen und kommerziellen Gesichtspunkten nicht aussichtsreich ist. Standard-Dosierungen konventioneller Kontrastmittel für die MRT liegen bei max. 0.1mMol/kg Körpergewicht, zunehmend jedoch im μmol/kg - Bereich. Zusätzlich zeigt sich bei den Kohlenstoff-Radikalen eine starke Degradierung des Overhauser-enhancement in Plasma und in Blut (gegenüber wässrigen Lösungen), was auf reversible Proteinbindungen der Substanzen in Blut und den Einflüssen von Sauerstoff auf den Overhauser-Effekt zurückzuführen ist [ii]. In deoxygeniertem Wasser wird die Stabilität unterschiedlicher Trityle mit Halbwertszeiten zwischen einigen Stunden und bis zu einem Jahr angegeben [ii], [iii]. Generell weisen diese Radikale durch die freien Elektronen eine hohe chemische Reaktivität auf, die zu einer unerwünschten Toxizität und zum Verlust des Effekts führen kann.
Das erzielbare Overhauser-enhancement (bei einer gegebenen eingestrahlten Radiofrequenzleistung für die Elektronenspinübergänge) hängt unter anderem von den Relaxationszeiten des Elektronenspins ab.
Dabei sind lange Spin-Gitter- (T1e) und Spin-Spin Relaxationszeiten (T2e) des Elektronenspins für OMRI-Kontrastmittel vorteilhaft, um einen möglichst hohen Polarisationsübertrag während der EPR-Anregung zu erzielen. Die Trityle sind eine in dieser Hinsicht relativ günstige Substanzklasse, für die Werte in der Größenordnung von T1e = T2e a 8 μs (extrapoliert auf "unendliche" Verdünnung) bestimmt wurden (aus [ii] Tabelle 3, S. 8, in isotoner NaCI-Lösung bei 37° C: "Perdeuteriert.es Trityl": T1e = 13μs, T2e = 8μs; "Deuteriertes Hydroxy Trityl": T1 e ≡ 11 μs, T2e = 8μs, "Symmetrisches Trityl": T1e = 9μs, T2e ≡ 9μs). Analog zu den vergleichsweise langen elektronischen Relaxationszeiten werden schmale EPR-Resonanzlinien dieser Substanzklasse in flüssigen Lösungen beobachtet. In [ii] werden EPR-Linienbreiten < 1μT in wässriger
Lösung, wiederum bezogen auf unendliche Verdünnung, und in [i] eine inhomogen verbreiterte EPR-Linienbreite von 6 μT, angegeben. Sowohl die EPR-Linienbreiten als auch ursächlich die elektronischen Relaxationszeiten sind stark abhängig von den jeweiligen Umgebungsbedingungen. Hierzu gehören insbesondere die vorliegende Konzentration des Kontrastmittels als auch von in der Umgebung gelöstem Sauerstoff. Die Relaxationszeiten des Elektronenspins und die EPR-Linienbreiten des Moleküls werden durch intramolekulare Hyperfeinstrukturen und eine große Verteilung der elektronischen Spindichte über das Molekül negativ beeinflusst. Vorteilhaft bei den Tritylen ist dabei, dass sie aufgrund der fehlenden Hyperfeinstruktur des ungepaarten Elektrons mit dem zentralen Kohlenstoffatom (Kernspin von 12C: I = 0) nur eine singuläre, dominierende EPR Linie aufweisen. Außerdem wurde mit den vorgeschlagenen Substanzen eine zentrale Lokalisation der Spindichte über eine symmetrische Molekülstruktur sowie eine Verringerung der weiteren intramolekularen Wechselwirkungen durch Deuterierung (Substitution von Wasserstoffkernen durch das Wasserstoff-Isotop 2H) angestrebt. Dies gelang bei den bekannten Ansätzen jedoch nur bedingt und, wie die Ergebnisse nahe legen, in nicht ausreichender Form.
Ein weiterer Parameter, der für die Eignung des Kontrastmittels sowohl für OMRI als auch für konventionelle MRT von entscheidender Bedeutung ist, stellt die Protonen- Relaxivität dar, mit der die Verkürzung der Relaxationszeiten von umgebenden Protonenspins in Anwesenheit des Kontrastmittels beschrieben wird. Dabei sind möglichst kurze Kernspinrelaxationszeiten der das OMRI-Kontrastmittel umgebenden Protonen für einen großen OMRI-Effekt von Vorteil. Daraus resultiert die Forderung nach großen Werten für die Protonen Relaxivität des OMRI Kontrastmittels. In der zitierten Literatur [i], [ii], [iii] werden für die Trityl-Derivate Relaxivitäts-Werte zwischen 0,14 mM'1s'1 und 0,44 mM"V1 angegeben.
Beschreibung der Erfindung
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, paramagnetische Substanzen bereitzustellen, bei denen mit möglichst geringer Energie viele Elektronen-Spins angeregt werden, und die geeignet sind, diese magnetische Ausrichtung mittels Polarisationstransfer auf möglichst viele Kern-Spins zu übertragen. Sie sollen lange Relaxationszeiten des Elektronenspins und daraus folgend sehr schmale und exakt begrenzte EPR- Linienbreiten aufweisen.
Zusätzlich besteht für die Eignung als OMRI-Kontrastmittel die Forderung einer möglichst effizienten Verkürzung von Kernspin-Relaxationszeiten der umgebenden Protonen. Dies wird durch eine möglichst hohe Protonen-Relaxivität dargestellt.
Darüber hinaus müssen sie wasserlöslich, stabil und toxisch unbedenklich sein, damit sie als Kontrastmittel für OMRI zu Gewebeuntersuchungen an lebenden Organismen verwendet werden können.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, dass wasserlösliche paramagnetische Substanzen als Kontrastmittel für die Kernspintomographie unter
Ausnutzung des Overhausereffekts (OMRI) verwendet werden, die endohedrale
Fullerene enthalten, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie mit atomarem Stickstoff
(N) oder mit atomarem Phosphor (P) gefüllt sind, vorzugsweise sind sie gefüllt mit 14N,
15N, und 31P. Die endhoderalen Fullerene werden entweder durch kovalente Modifikation wasserlöslich gemacht. Sie können jedoch auch durch nicht-kovalente
Modifikation wasserlöslich gemacht werden.
Diese Zusammensetzungen und Substanzen sind als Kontrastmittel für die Kernspintomographie unter Ausnutzung des Overhausereffekts (OMRI) geeignet und können als solche verwendet werden.
Der Molekülkäfig der erfindungsgemäßen Fullerene Fullerene besteht aus >60 Kohlenstoffatomen und besteht vorzugsweise aus bis zu 82 Kohlenstoff atomen, bevorzugt besteht er aus 60 Kohlenstoff atomen.
Damit die erfindungsgemäßen endohedralen Fullerene als Kontrastmittel für OMRI zu Gewebeuntersuchungen an lebenden Organismen verwendet werden können, müssen diese wasserlöslich gemacht werden.
Die Solubilisierung der endohedralen Fullerene erfolgt in einer bevorzugten Ausführungsform derart, dass an die Fullerene funktionelle chemische Gruppen kovalent angebunden werden, die eine hohe Wasserlöslichkeit vermitteln. Besonders bevorzugt wird die Funktionalisierung mithilfe von Malonsäureestem, die analog
Literatur erfolgen kann [vιi, vlil, ix] Diese Ester werden anschließend verseift M> Die entstehenden Carbonsäuresalze sind sehr gut wasserlöslich.
Die Vorteile dieser Verbindungen liegen in ihrer hohen Stabilität und geringen Toxizität.
Die vorliegende Erfindung betrifft in einer weiteren Ausführungsform Substanzen bestehend aus endohedralen Fullerenen der Formel (Z@Cx)-Rn , wobei
R eine hydrophile Gruppe bedeutet, n für eine Ziffer zwischen 1-10 steht, und X eine Ziffer zwischen 60 und 82 ist, sowie deren physiologisch verträgliche Salze, dadurch gekennzeichnet dass
Z Stickstoff oder Phosphor bedeutet,
In einer bevorzugten Ausführungsform ist sind die erfindungsgemäßen endohedralen
Fullerene dadurch gekennzeichnet, dass
R eine C(COY)2 Gruppe bedeutet, die mit dem Fulleren über zwei benachbarte C-
Atome verbunden ist und somit einen Cyclopropanring bildet und Y unabhängig voneinander NR1R2 oder OR1 bedeutet, wobei R1 und R2 unabhängig voneinander H1 oder Ci-C10-Alkyl, welches mit 1 bis 6 Hydroxylgruppen substituiert ist, bedeuten, und n für eine Ziffer 1-10 steht, sowie deren physiologisch verträgliche Salze.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist sind die erfindungsgemäßen endohedralen Fullerene dadurch gekennzeichnet, dass
R eine C(COY)2 Gruppe bedeutet, die mit dem Fulleren über zwei benachbarte C-
Atome verbunden ist und somit einen Cyclopropanring bildet, Y OR3 bedeutet und n gleich 1 ist, wobei
R3 ein bis zu 50 C-Atome umfassender dendrimerer verzweigter Alkylrest ist, der von bis zu 10 N- oder O-Atomen oder -C(O)N(H)-Resten unterbrochen sein kann und der mit bis zu 10 Hydroxy-, Carbonsäure-, oder Carbonsäureamid-Gruppen substituiert sein kann,
sowie deren physiologisch verträgliche Salze.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen wasserlöslichen endohedralen Fullerenen, dadurch gekennzeichnet, dass hydrophile funktionelle Gruppen kovalent an ein endohedrales Fulleren (Z@CX) gekoppelt werden, wobei Z und x wie oben definiert sind.
Hydrophile Fullerene wurden bereits in US 2003/0220518 beschrieben. US 2003/0220518 offenbart jedoch nur in generischer Weise dass andere Atome in den endohedralen Fullerenen enthalten sein können, wie beispielsweise „NMR active atoms (e.g. 3He, 31P, 13C, 15N, 11B, 19F)". Es ist jedoch aus der Auswahl der spezifischen Isotope und der Eigenschaft "NMR active atoms" offensichtlich, dass solche endohedralen Fullerene nur zur Detektion mit konventioneller MRI vorgeschlagen werden, wofür Atome mit einem Kernspin ≥ Vi benötigt werden. Insbesondere mit der expliziten Nennung des Isotops 13C, das im Unterschied zum häufigsten natürlich vorkommenden Kohlenstoff Isotop 12C die genannte Voraussetzung erfüllt, wird dieser Aspekt belegt, denn für die Verwendung als OMRI Kontrastmittel ist das Vorhandensein eines Kernspins ≥ Vz bei dem Atom, dem ein oder mehrere ungepaarte Elektronen zugeordnet werden, in keiner Weise notwendig, wie beispielsweise in US 5,530,140 für OMRI Substanzen offenbart: die dort genannten Kohlenstoffradikale (Triarylmethyl Radikale) sind nicht an die Verwendung des „NMR aktiven" 13C Isotops gebunden. Gleichermaßen zeigt sich dieser Aspekt in der Nennung des Stickstoff Isotops 15N in US 2003/0220518 und der Auslassung des von 14N, welches in der vorliegenden Erfindung als Einschlusselement einbezogen ist.
In der Kernspintomographie unter Ausnutzung des Overhausereffekts (OMRI) geht es jedoch entscheidend um das Vorliegen von ungepaarten Elektronen und insbesondere den spezifischen Eigenschaften des damit einhergehenden Elektronenspin.
Daher ist die erfindungsgemäße Verwendung von wasserlöslichen, paramagnetische Substanzen, die endohedrale Fullerene enthalten, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie mit atomarem Stickstoff (N) oder mit atomarem Phosphor (P) gefüllt sind, als Kontrastmittel für die Kernspintomographie unter Ausnutzung des Overhausereffekts (OMRI) bislang nicht im Stand der Technik beschrieben worden oder nahe gelegt worden.
Weiterhin sind auch die erfindungsgemäßen Substanzen, die zum Einen durch die spezifischen kovalenten Modifikationen des Fullerenkäfigs gekennzeichnet sind und zum Anderen durch die spezifische Beladung des Käfigs mit atomarem Stickstoff oder Phosphor gekennzeichnet sind, durch die generische Offenbarung in US 2003/0220518 weder offenbart noch nahe gelegt.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden wasserlösliche
I Kontrastmittel bereitgestellt indem die Solubilisierung dadurch erreicht wird, dass die nackten Fullerene als Gast in einem Gast-Wirts-Komplex verwendet werden, wobei das
Wirtsmolekül in hohem Maße wasserlöslich ist. Zum Beispiel kann diese Komplexierung mit Cyclodextrin analog [*'] durchgeführt werden. Dabei entstehen in der Regel keine kovalenten Bindungen zwischen Gast- und Wirtsmolekül. Diese Variante hat den Vorteil, dass das angewendete Verfahren einfacher durchzuführen ist. Bei der Verwendung bekannter Wirtsmoleküle wie z. Beispiel der Cyclodextrine ist die toxikologische Unbedenklichkeit bereits bekannt. Geeignete Cyclodextrine sind alpha-, beta- und gamma-Cyclodextrine und Derivate davon, beispielsweise Hydroxypropyl- Derivate. Besonders bevorzugte Cyclodextrine sind beta-Cyclodextrin und Hydroxypropyl-beta-Cyclodextrin. Weitere geeignete Gast-Wirts-Komplexe können unter Verwendung von Calix[n]arenen und Derivaten davon (Atwood J. L et al., 1994, Nature, 368: 229-231 ; Bhattacharya et al., 2003, J. Phys. Chem. B., 107. 11830- 11834), insbesondere Calix[4]arenen, Calix[6]arenen und Calix[8]arenen und Derivaten davon als Wirtsmoleküle, hergestellt werden. Geeignete Derivate sind insbesondere Derivate die zum hydrophilen Charakter der Wirtsmoleküle beitragen. Geeignete Calixaren-Derivate sind beispielsweise sulfonato-Calixarene (Yang W. und de Villiers, 2005, AAPS J., 7, Art. 23, E241-E248).
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung also Kontrastmittel für die Kernspintomographie unter Ausnutzung des Overhausereffekts (OMRI) wobei das Kontrastmittel ein Gast-Wirts-Komplex ist, und wobei das Wirtsmolekül in hohem Maße wasserlöslich ist und das Gastmolekül aus endohedralen Fullerenen der Formel (Z@Cx) besteht, wobei Z Stickstoff oder Phosphor bedeutet, und X efne Ziffer zwischen 60 und 82 ist.
Bevorzugt ist das Wirtsmolekül Cyclodextrin, insbesondere ein beta-Cyclodextrin oder ein Derivat davon.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Wirtsmolekül ein Calix[n]aren, insbesondere ein Calix[4]aren, Calix[6]aren oder Calix[8]aren oder ein Derivat davon.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung von wasserlöslichen paramagnetischen Substanzen die endohedrale Fullerene enthalten, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie mit atomarem Stickstoff (N) oder mit atomarem Phosphor (P) gefüllt sind, als Kontrastmittel für die Kernspintomographie unter Ausnutzung des Overhausereffekts (OMRI).
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung von wasserlöslichen paramagnetischen Substanzen die endohedrale Fullerene enthalten, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie mit atomarem Stickstoff (N) oder mit atomarem Phosphor (P) gefüllt sind, zur Herstellung eines Kontrastmittel für die Kernspintomographie unter Ausnutzung des Overhausereffekts (OMRI).
Die Erfindung betrifft weiterhin wasserlösliche paramagnetischen Substanzen, die endohedrale Fullerene enthalten, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die endohedralen Fullerene mit atomarem Stickstoff (N) oder mit atomarem Phosphor (P) gefüllt sind, zur Verwendung als Kontrastmittel für die Kernspintomographie unter Ausnutzung des Overhausereffekts (OMRI).
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind aufgrund ihrer Wasserlöslichkeit leicht intravenös applizierbar. Es besteht auch die Möglichkeit das Kontrastmittel direkt an definierten Orten zu deponieren um einen gezielten Polarisationsaustausch zu ermöglichen.
Die Vorteile der Erfindung bestehen gegenüber den bekannten Kontrastmitteln für OMRI unter anderem darin, dass diese endohedralen Fullerene inert sind, d. h. sie verhalten sich chemisch als auch elektrisch faktisch neutral. Die Einschlusselemente weisen eine stabile Hülle auf, so dass sich keine freien Elektronen an der Außenseite des Fullerens befinden. Daraus folgt, dass diese endohedralen Fullerene ausschließlich
über die magnetische Dipolwirkung auf ihre Umgebung wirken. Die Einschlusselemente sind im Gegensatz zu metallischen Einschlüssen, die an die Käfiginnenseite anlagern, frei in der Käfigmitte des Fullerens positioniert, wodurch keine Wechselwirkungen mit dem Fulleren-Molekül stattfinden. Diese symmetrische und nach außen abgeschlossene Struktur der endohedralen Fullerene bewirkt eine große Stabilität dieser Verbindung.
Die erfindungsgemäße Substanz N(^C63(COOH)6 (III) besitzt lange Spin- Relaxationszeiten des ungepaarten Elektrons. Mit gepulsten Spin-Echo EPR- Messungen im X-Band (9.5 GHz EPR-Larmorfrequenz) und aus CW EPR Linienbreiten im L-Band (1.1 GHz EPR-Larmorfrequenz) konnten sehr lange elektronische Relaxationszeiten T1e .=150 μs und T2e = 22 μs in flüssiger Lösung gemessen werden (s. Figur 4), die mindestens eine Größenordnung länger sind als die der Trityle. Aus [ii] Tabelle 3, S. 8, in isotoner NaCI-Lösung bei 37° C: "Perdeuteriertes Trityl": T1e ≡ 13μs, T2e ≡ 8μs; "Deuteriertes Hydroxy Trityl": T-ie ≡ 11μs, T2e = 8μs, "Symmetrisches Trityl": T16 ≤ 9μs, T2e = 9μs.
Die besondere Eignung der erfindungsgemäßen endohedralen Fullerene zeigt sich des Weiteren aufgrund ihrer gegenüber dem Stand der Technik überraschend hohen Relaxivität, die in standardisierter Weise mittels relaxometrischer Messungen bestimmt wird. Die Substanz (III) weist eine Relaxivität T1 ≤ 47 mM"1s'1 (gegenüber den Trityl- Derivaten mit Relaxivitäts-Werten zwischen 0,14 mM~V1 und 0,44 mM"1s'1 [i], [ii], [iii]) in wässriger Lösung mit einer Spinkonzentration von 6μM bei einer Lösungsmitteltemperatur von 37°C auf. Dieser unerwartet hohe Wert liegt bei einer Magnetfeldstärke von ca. 15 mT vor, was einer Radiofrequenz von 600 kHz und damit den für OMRI notwendigen Bedingungen sehr niedriger Magnetfeldstärke entspricht.
Aufgrund der gegenüber dem Stand der Technik um mindestens einen Faktor 10 längeren Spinrelaxationszeiten der erfindungsgemäßen endohedralen Fullerene ist bei deren Verwendung als OMRI-Kontrastmittel eine wesentlich geringere RF-Leistung für die Anregung der EPR - Übergänge notwendig. Daher ist die gewünschte Verstärkung der MRT-Signale durch den Overhauser Effekt mit niedrigeren RF-Leistungen zur EPR- Anregung möglich.
Zusätzlich führt die gegenüber den Tritylen überraschenderweise festgestellte wesentlich höhere Protonen-Relaxivität der erfindungsgemäßen Substanzen zu einer weiteren, entscheidenden Steigerung des OMRI-Effekts: Aufgrund der gegenüber den Tritylen um mindestens ebenfalls eine Größenordnung gesteigerten Verkürzung der Relaxationszeiten der umgebenden Protonenspins ist es möglich, OMRI - Untersuchungen mit entsprechend geringeren Kontrastmittel Dosierungen insbesondere im Bereich ab 0,05mMol/kg Körpergewicht bis 1mMol/kg Körpergewicht, in dem mit den Tritylen kein ausreichender OMRI-Effekt erzielt werden kann, durchzuführen.
Da die Sauerstoff-Empfindlichkeit von N@C60 und deren Derivaten (N@Cx)-Rn gering ist und die von P@C6o und deren Derivaten (P@Cx)-Rn erhöht ist, können durch gleichzeitige oder zeitlich versetzte Messungen mit diesen beiden Substanzen Tomographie-Bilder ohne und mit Sauerstoffnachweis (Oximetrie) zur Darstellung von physiologischen oder pathologischen Zuständen erstellt werden, ähnlich wie es mit Tritylen experimentell unter Verwendung hoher Kontrastmittel-Dosierungen (1 bis 5 mmol/kg Körpergewicht) demonstriert wurde [v], [vi]. Mit EPR-Messungen von P@C60 (IX) in Toluol kann eine reversible 20fache EPR-Linienverbreiterung nach Spülung der Lösung mit Sauerstoff beobachtet werden, die bei N@C6o und Derivaten nicht auftritt (siehe Figur 4).
Die Erfindung betrifft daher die Verwendung von den erfindungsgemäßen wasserlöslichen endohedralen Fulleren-Derivaten, dadurch gekennzeichnet, dass zuerst ein Kontrastmittel mit atomarem Stickstoff als Einschlusselement (N@Cx)-Rn verwendet wird und eine erste Kernspintomographie durchgeführt wird und zeitlich versetzt danach ein Kontrastmittel mit atomarem Phosphor als Einschlusselement (P@Cx)-Rn verwendet wird und eine zweite Kernspintomographie durchgeführt wird.
Beispiele
Die Erfindung soll nachstehend an Hand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. Die zugehörigen Zeichnungen stellen dar:
Fig. 1a: Schematische Darstellung eines endohedralen Fullerens N@C60
(I)
Fig. 1b: Schematische Darstellung eines endohedralen Fullerens P@C60
(IX) Fig. 2: X-Band ESR Spektrum von N@C60 (I) in CH2CI2 bei 300 K
Fig. 3: L-Band ESR Spektrum von N@C63(COOH)6 (III) in H2O bei 300 K
Fig. 4: Figur 4 zeigt die reversible Sauerstoffempfindlichkeit von P@C60 in Toluol
Fig. 5: Schemazeichnung zur Synthese der e,e,e-Hexacarbonsäure (IV) nach Beispiel 1 Fig. 6: Schemazeichnung zur Synthese der Malonsäurevorstufe nach
Beispiel 2
Fig. 7: Synthese des Dendrimers nach Beispiel 2 Fig. 8: Schemazeichnung zur Synthese des Dendrimer-Fullerens nach
Beispiel 2
Die Herstellung der endohedralen Stickstoff-Fullerene N@C6o (I) erfolgt beispielsweise durch Ionenimplantation. [x"]
Die anschließende Trennung der gefüllten von den leeren Fullerenen erfolgt durch High Performance Liquid Chromatography (HPLC) [*'"].
Alle folgenden Beispiele werden mit einem Gemisch aus N@C60 und „leerem" C60 durchgeführt. Für die EPR und OMRI-Messungen ist ein Spingehalt zwischen 10"2 und 10"4 ausreichend. In den folgend beschriebenen Beispielen ist der Spingehalt des Fullerengemisches 10'4 bis 10"2.
Beispiel 1 Synthese von N(5).Cga(COONa)gjlll)
Zunächst werden 255 mg (0.354 mmol / 1.0 equ.) N@C60 (I) unter Argonschutz und Rühren in 400 ml trockenem Toluol gelöst. Anschließend gibt man 205 mg (0.319 mmol
/ 0.9 equ.) cyclo-[3]-Octylmalonat [xiv] und 243 mg (0.956 mmol / 2.7 equ.) lod hinzu. Daraufhin lässt man eine Lösung von 404 mg (397 μl / 2.65 mmol / 7.5 equ.) DBU in 160 ml trockenem Toluol über 3 h zutropfen, wobei die Farbe nach tieforange umschlägt. Nach weiteren 10 min Rühren bei Raumtemperatur wird das Rohgemisch einer Flash Chromatographie auf Kieselgel (6 x 25 cm) unterworfen. Spuren nichtumgesetzten C60 wird mit anderen Verunreinigungen zuerst mit Toluol als Laufmittel eluiert und anschließend mit Toluol/Ethylacetat (98:2) das gewünschte e,e,e- Trisaddukt (II) als orange Bande eluiert. Das e,e,e-(cyclo-[3]-Octylmalonyl)-hexahydro- [60]-fulleren (II) wird von dem in Spuren mitgebildeten trans-4,trans-4,trans-4-lsomer mittels präparativer HPLC auf Nucleosil (Toluol/Ethylacetat 98:2) abgetrennt, die Fraktion im Vakuum eingedampft und das Produkt aus Dichlormethan/Pentan ausgefällt. Nach dreifachem Waschen mit Pentan und Trocknen im Hochvakuum bei 60 0C erhält man 174.0 mg (0.1282 mmol, 36.2%) orangerotes Pulver [e,e,e-(cyclo-[3]- Octylmalonyl)-hexahydro-[60]fulleren (II).
Die e,e,e-Trisaddukt-Hexacarbonsäure N@C63(COOH)6 (IV) erhält man durch 3 h Rühren einer Lösung von 100 mg des entsprechenden e,e,e-Trisadduktmalonats (II) in 50 ml Toluol unter Stickstoffschutz in Gegenwart eines 20fach molaren Überschusses von NaH bei 60 0C. Damit wird das NaH homogen im Toluol dispergiert. Nach Zugabe von 1 ml Methanol fällt das Natriumsalz der e,e,e-Trisaddukt-Malonsäure (III) unter heftiger Gasentwicklung quantitativ als Niederschlag aus. Die flüssige Phase wird durch Zentrifugieren entfernt und der Niederschlag bei 12 h im Vakuum bei 60 0C getrocknet.
Die freie Säure (IV) kann durch Waschen des Natriumsalzes der e,e,e-Trisaddukt- Malonsäure (III) mit Toluol, 2 M Schwefelsäure und Wasser und anschließender Trocknung für 12 h im Vakuum bei 60° C erhalten werden.
Beispiel 2: Synthese des dendrimer-Fullerens (VHI)
4-Benzyloxybutansäure
Zu einer Lösung aus (44.3 ml, 50 g, 0.58 mol) γ-Butyrolacton, und 276 ml (396.8 g, 2.32 mol) Benzylbromid in 600 ml Toluol werden 129.9 g (2.32 mol) fein gemörsertes 85 %iges Kaliumhydroxid unter Rühren zugegeben und unter Rückfluss mit einem Wasserabscheider für 48 Stunden erhitzt. Die erhaltene Suspension wird mit 600 ml Wasser und 300 ml Diethylether versetzt. Die wässrige Phase wird dreimal mit je 300 ml Diethylether extrahiert. Die gesammelten organischen Phasen werden eingeengt und mit 50 g NaOH und 600 ml Wasser für weitere 20 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Die wässrige Phase wird mit verdünnter Schwefelsäure angesäuert und anschließend dreimal mit je 300 ml CH2CI2 extrahiert. Nach Trocknung der organischen Phase über MgSO4 und abdestillieren des Lösungsmittel, werden 24 g eines hellgelben Öls erhalten. Bei der über Nacht erhitzten Lösung werden die Phasen getrennt und die wässrige Phase dreimal mit je 150 ml Diethylether gewaschen. Anschließend wird die wässrige Phase mit 40 ml konz. H2SO4 in 200 ml Eis angesäuert und dreimal mit je 300 ml CH2CI2 extrahiert. Die gesammelten organischen Phasen werden über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel abgezogen. Man erhält ein dünnflüssiges hellgelbes Öl.
4-Benzyloxybutansäure-f-butylester
35 g (0.180 mol) 4-Benzyloxybutansäure und 20 ml CH2CI2 werden in einem Autoklaven gefüllt und auf -70 0C (Trockeneis/Aceton) abgekühlt. Anschließend werden 90 ml flüssiges Isobuten und 2 ml konz. H2SO4 als Katalysator zugegeben. Der Autoklav wird verschlossen und 72 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Ablassen des Drucks wird die bräunliche Lösung mit 50 ml CH2CI2 verdünnt. Diese Lösung wird zuerst mit KHCO3-Lösung neutralisiert, dann mit Zitronensäure-Lösung und Wasser gewaschen. Die milchige trübe Lösung trocknet man über MgSO4. Nach Abziehen des Lösungsmittels erhält man ein hellgelbes Öl.
Di-(4-tert~butoxy-4-oxobutyl)malonat
Diese Reaktion wird wasserfrei und in einer Stickstoffatmosphäre durchgeführt. 12.30 g (76.80 mmol) 4-Hydroxybuttersäure-teAf-butylester und 6.08 g (76.80 mmol) trockenes
Pyridin werden in 250 ml absolutem Methylenchlorid gelöst und unter Rühren auf 0 0C gekühlt. Dann werden langsam 5.40 g (38.40 mmol), gelöst in 10 ml absolutem Methylenchlorid) Malonyldichlorid zugegeben. Man lässt zwei Stunden bei 0 0C und 12 h bei RT rühren. Anschließend filtriert man das Reaktionsgemisch über Kieselgel, wäscht mit Wasser und trocknet die organische Phase über MgSO4. Das Lösungsmittel wird abgezogen, das Produkt durch FC (Cyclohexan:Ethylacetat 5:1) gereinigt. Man erhält 9.70 g einer gelben, öligen Flüssigkeit.
Di-(4-hydroxy-4-oxobutyl)malonat Zu 1.57 g Di-(4-terf-butoxy-4-oxobutyl)malonat (4.04 mmol) gibt man 15 ml 98% Ameisensäure. Der Ester löst sich und ist nach zweitägigem Rühren bei Raumtemperatur vollständig entschützt. Nach Entfernen der Ameisensäure im Ölpumpenvakuum erhält man in quantitativer Ausbeute die Disäure.
4-Nitro-4-[2-f-(butoxycarbonyl)ethyl]-heptandisäurediester
Eine Lösung von 16.2 ml Nitromethan (18.3 g, 0.3 mol) und drei ml Triton B (40 % in Methanol) in 60 ml Dimethoxyethan wird unter Rühren auf 70 0C erhitzt. Anschließend werden 135 ml (119.2 g, 0.93 mol) Acrylsäure-f-butylester zugetropft, wobei die Temperatur konstant gehalten wird. Setzt im Anschluss eine Abkühlung ein, so werden nochmals insgesamt sechs ml Triton B innerhalb von fünf min zugegeben. Dann wird die Reaktionsmischung eine Stunde bei 70 0C gerührt, anschließend im Vakuum eingeengt und in 600 ml CH2CI2 aufgenommen. Die Lösung wird erst mit 10 %iger HCl, dann dreimal mit gesättigter NaCI-Lösung gewaschen und die organische Phase über MgSO4 getrocknet. Nach Abziehen des Lösungsmittels wird der gelbliche Rückstand aus Ethanol umkristallisiert. Man erhält einen farblosen kristallinen Feststoff.
4-Amino-4-[2-f-(butoxycarbonyl)ethyl]-heptandisäυrediester
Man löst 25 g (60 mmol) der Nitro-Verbindung erster Generation unter gelindem Erhitzen in 600 ml Ethanol und hydriert mit 25 g Raney-Nickel bei RT und Normaldruck. Die Reaktionskontrolle erfolgt mittels DC (SiO2: Hexan/EtOAc 1:2). Nach 48 Stunden wird der Katalysator über Celite abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Den gelben, öligen Rückstand reinigt man säulenchromatographisch an Kieselgel (SiO2: Hexan/EtOAc 2:1). Man erhält ein weißes Pulver.
4-Nitro-[2-(carboxyethyl)]heptandisäure
Man löst 15 g (45 mmol) NO2[G-I] in 100 ml Ameisensäure und rührt 24 Stunden bei RT. Nach ca. 30 min beginnt ein weißer Niederschlag auszufallen. Die Ameisensäure wird im Vakuum abgezogen. Der weiße Feststoff wird anschließend dreimal mit Toluol versetzt, welches jeweils wieder abdestilliert wird. Nach dem Trocknen erhält man ein weißes Pulver.
9-Cascade:nitromethan[3]:(2-aza-3-oxypentylidyne):propionsäure-fe/t-butylester
Man löst 4.5 g (16 mmol) 4-Nitro-[2-(carboxyethyl)]heptandisäure, 22.3 g (53.5 mmol) 4-Amino-4-[2-f-(butoxycarbonyl)ethyl]-heptandisäurediester und 6.5 g (48 mmol) 1-
Hydroxy-benzotriazol in 350 ml absolutem DMF und versetzt diese Lösung mit 9.92 g
(48 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) gelöst in 50 ml absolutem DMF. Nach ca. einer Stunde beginnt sich ein weißer Niederschlag zu bilden. Die Reaktionskontrolle erfolgt mittels DC (SiO2: Hexan /EtOAc: 2:1) Nach 60 Stunden wird von ausgefallenem DCU abfiltriert und das Lösungsmittel abdestilliert. Der gelbliche Rückstand wird in
500 ml Ethylacetat aufgenommen und nacheinander mit 10 %iger HCl, Wasser,
10 %iger NaHCO3-Lösung und gesättigter NaCI-Lösung gewaschen. Die organische
Phase wird über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Nach säulenchromatographischer Reinigung an Kieselgel (SiO2: Hexan/EtOAc 2:1) erhält man ein weißes Pulver.
9-Cascade:aminomethan[3]:(2-aza-3-oxypentylidyne):propionsäure- tert- butylester
Man löst 9.0 g (6 mmol) der Nitro-Verbindung 2. Generation in 100 ml Ethanol und hydriert mit 5 g Raney-Nickel bei RT und Normaldruck. Nach 48 Stunden wird der Katalysator über Celite abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen. Der gelbliche Rückstand wird durch (SiO2: Hexan/EtOAc 1:2) gereinigt und das Produkt schließlich mit MeOH von der Säule eluiert. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird in CH2CI2 gelöst und von unlöslichem Kieselgel abfiltriert. Nach abdestillieren des Lösungsmittels im Vakuum wird ein sich beim Trocknen aufschäumender weißer Feststoff erhalten.
18-Cascade:dihydromethan[2]:(2-aza-7-oxa-3,8-dioxooctylidyne):(2-aza-3- oxopentyl-idyne):propansäure-terf-butylester
Eine Lösung von 436 mg (1.580 mmol) Di-(4-hydroxy-4-oxobutyl)malonat, 716 mg (3.470 mmol) DCC, 550 mg (3.470 mmol) 1-HOBT und 5.00 g (3.47 mmol) Amin 2. Generation in DMF werden 48 h bei Raumtemperatur unter Feuchtigkeitsausschluss gerührt. Nach Abfiltrieren des ausgefallenen DCU und Entfernen des DMF im Vakuum wird der Rückstand in Ethylacetat aufgelöst und mit 10%-iger Zitronensäure, Wasser, 8%-iger NaHCO3-Lösung und gesättigter NaCI-Lösung gewaschen. Anschließend wird die organische Phase mit MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel abrotiert. Nach FC (Cyclohexan:Ethylacetat 1:1) erhält man einen weißen Feststoff.
18-Cascade:1,2-Methano-1,2-dihydro[60]fulleren[2]:(2-aza-7-oxa-3,8- dioxooctylidyne): (2-aza-3-oxopentylidyne):propansäure-te/t-butylester
Eine Lösung von 439 mg (0.610 mmol) N@C60, 102 mg (0.670 mmol) DBU1 202 mg (0.610 mmol) CBr4 und 1.90 g (0.61 mmol) 18-Cascade:dihydromethan[2]:(2-aza-7- oxa-3,8-dioxooctylidyne):(2-aza-3-oxopentyl-idyne):propansäure-ferf-butylester in 300 ml Toluol (mit N2 gesättigt) lässt man einen Tag bei RT rühren. Die Reaktionsmischung wird über eine Kieselgelsäule filtriert. Zuerst wird nicht umgesetztes N@C60 mit Toluol eluiert, anschließend die Mischung aus Mono- und Bisaddukten mit ToluohEthylacetat 1 :1 eluiert. Diese Mischung wird mit FC (Ether: Hexan 6:1) getrennt und man erhält einen braunen Feststoff.
18-Cascade:1,2-Methano-1,2-dihydro[60]fulleren[2]:(2-aza-7-oxa-3,8- dioxooctylidyne): (2-aza-3-oxopentylidyne):propansäure 8
Man löst und rührt 0.648 g (0.17 mmol) in 98%-iger Ameisensäure 24 h bei RT. Nach Entfernung der Ameisensäure im Vakuum erhält man ein rot-braunen Pulvers.
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Claims
1. Kontrastmittel für die Kernspintomographie unter Ausnutzung des
Overhausereffekts (OMRI) wobei, das Kontrastmittel aus endohedralen Fullerenen (Z@CX)-R„ besteht,
R eine hydrophile Gruppe bedeutet, n für eine Ziffer zwischen 1-10 steht, und
X efne Ziffer zwischen 60 und 82 ist, sowie deren physiologisch verträgliche Salze, dadurch gekennzeichnet, dass Z Stickstoff oder Phosphor bedeutet.
2. Kontrastmittel nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass
R eine C(COY)2 Gruppe bedeutet, die mit dem Fulleren über zwei benachbarte C- Atome verbunden ist und somit einen Cyclopropanring bildet und Y unabhängig voneinander NR1R2 oder OR1 bedeutet, wobei R1 und R2 unabhängig voneinander H, oder Ci-Cio-Alkyl, welches mit bis zu 6 Hydroxylgruppen substituiert ist, bedeuten und n für eine Ziffer 1-10 steht, sowie deren physiologisch verträgliche Salze.
3. Kontrastmittel nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass R eine C(COY)2 Gruppe bedeutet, die mit dem Fulleren über zwei benachbarte C-Atome verbunden ist und somit einen Cyclopropanring bildet, Y OR3 bedeutet und n gleich 1 ist, wobei
R3 ein bis zu 50 C-Atome umfassender dendrimerer verzweigter Alkylrest ist, der von bis zu 10 N- oder O-Atomen oder -C(O)N(H)- Resten unterbrochen sein kann und der mit bis zu 10 Hydroxy-, Carbonsäure-, oder Carbonsäureamid-
Gruppen substituiert sein kann, sowie deren physiologisch verträgliche Salze.
4. Kontrastmittel für die Kemspintomographie unter Ausnutzung des Overhausereffekts (OMRI) wobei das Kontrastmittel ein Gast-Wirts-Komplex ist, und wobei das Wirtsmolekül in hohem Maße wasserlöslich ist und das Gastmolekül aus endohedralen Fullerenen der Formel (Z@CX) besteht, X eine Ziffer zwischen 60 und 82 ist, dadurch gekennzeichnet dass Z Stickstoff oder Phosphor bedeutet.
5. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gem. Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass hydrophile funktionelle Gruppen kovalent an ein endohedrales Fulleren (Z@CX) gekoppelt werden, wobei Z und x wie in Anspruch 1 definiert sind.
6.. Verwendung von Kontrastmitteln nach den Ansprüchen 1 bis 3 zur Durchführung von Oximetrie-Messungen, dadurch gekennzeichnet, dass zuerst ein Kontrastmittel mit atomarem Stickstoff als Einschlusselement (N@Cx)-Rn verwendet wird und eine erste Kernspintomographie durchgeführt wird und zeitlich versetzt danach ein Kontrastmittel mit atomarem Phosphor als Einschlusselement
(P@Cx)-Rn verwendet wird und eine zweite Kernspintomographie durchgeführt wird.
7. Verwendung von wasserlöslichen paramagnetischen Substanzen, die endohedrale
Fullerene enthalten, zur Herstellung eines Kontrastmittel für die Kernspintomographie unter Ausnutzung des Overhausereffekts (OMRI) dadurch gekennzeichnet sind, dass die endohedralen Fullerene mit atomarem
Stickstoff (N) oder mit atomarem Phosphor (P) gefüllt sind.
8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet dass die endohedralen
Fullerene mit atomarem 14N, 15N, oder 31P gefüllt sind.
9. Verwendung nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass Substanzen nach einem der Ansprüche 1 bis 4 verwendet werden.
10. Wasserlösliche paramagnetischen Substanzen, die endohedrale Fullerene enthalten, dadurch gekennzeichnet sind, dass die endohedralen Fullerene mit atomarem Stickstoff (N) oder mit atomarem Phosphor (P) gefüllt sind, zur Verwendung als
Kontrastmittel für die Kernspintomographie unter Ausnutzung des Overhausereffekts (OMRI)
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