DE69618991T2

DE69618991T2 - Ein verfahren zur bestimmung der konzentration von sauerstoff in einer probe

Info

Publication number: DE69618991T2
Application number: DE69618991T
Authority: DE
Inventors: Henrik Ardenkjaer-Larsen; Leunbach
Original assignee: Nycomed Imaging AS
Current assignee: GE Healthcare AS
Priority date: 1995-09-08
Filing date: 1996-09-06
Publication date: 2002-10-31
Anticipated expiration: 2016-09-07
Also published as: NZ316583A; JP2002502491A; CZ66998A3; ES2175123T3; AU717685B2; DE69618991D1; EP0871896B1; NO980965D0; EP0871896A1; AU6884796A; WO1997009633A1; ATE212727T1; CN1200179A; CA2231405A1; NO980965L; PL325428A1

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Sauerstoffkonzentration einer Probe, zum Beispiel eines menschlichen oder tierischen Körpers, insbesondere betrifft sie die Verwendung von elektronenspinresonanz-verstärkter magnetischer Resonanzbildgebung (OMRI) einer Probe zur Bestimmung ihrer Sauerstoffkonzentration, und insbesondere die Anwendung von OMRI für die Erzeugung von Bildern, welche die gelöste Sauerstoffkonzentration in einer Probe angeben.
Sauerstoff spielt eine Schlüsselrolle bei den metabolischen Prozessen biologischer Systeme, und zahlreiche Befunde können mit abnormalen Sauerstoffspiegeln im Körper verbunden sein. Um ein besseres Verständnis dieser metabolischen Rolle zu liefern und die klinische Diagnose zu unterstützen, besteht ganz klar Bedarf an einer Verbesserung der Mittel, mit welchen der Sauerstoffspiegel in Körpergeweben gemessen werden kann.
Herkömmliche Verfahren zur Bestimmung von Sauerstoffkonzentrationen sind nicht zufriedenstellend. Eine solche Technik beinhaltet das Einführen einer Clark-Elektrode direkt in ein Blutgefäß, um die lokale Sauerstoffkonzentration zu bestimmen. Eindeutig weist eine solche Technik einen begrenzten Anwendungsbereich auf, da sie invasiv ist und nur lokal anwendbar ist.
Nicht invasive Techniken waren langsam in ihrer Entwicklung und eignen sich allgemein nicht für die Untersuchung von Geweben, die tief unter der Oberfläche einer Probe liegen.
Das am besten entwickelte und exakteste Verfahren zur Ex-vivo-Anwendung ist das einer "Spin-Markierung-Oximetrie", in welchem Veränderungen der ESR-Linienbreite eines freien Radikals, die durch das Vorliegen von Sauerstoff verursacht werden, überwacht werden. Solche Techniken verwenden allgemein Festphasen-immobilisierte paramagnetische Spezies als die Spinmarkierung und sind somit nicht für In-vivo-Messungen geeignet.
Elektronenspinresonanz-verstärkte MRI, hierin als OMRI (Overhauser-MRI) bezeichnet, aber auch in früheren Veröffentlichungen als ESREMRI oder PEDRI bezeichnet, ist eine gut eingeführte Form von MRI, bei welcher die Verstärkung der magnetischen Resonanzsignale, aus welchen die Bilder erzeugt werden, durch dynamische Kernpolarisation (den Overhauser-Effekt), die bei der VHF-Stimulierung eines ESR-Übergangs in einem paramagnetischen Material auftritt, allgemein ein beständiges freies Radikal, bei dem untersuchten Subjekt erreicht wird. Die magnetische Resonanzsignalverstärkung kann um einen Faktor von hundert oder mehr erfolgen, wodurch ermöglicht wird, OMRI-Bilder rasch und mit relativ geringen primären Magnetfeldern zu erzeugen.
OMRI-Techniken sind von mehreren Autoren beschrieben worden, insbesondere von Leunbach, Lurie, Ettinger, Grücker, Ehnholm und Sepponen, zum Beispiel in der EP-A-296 833, EP-A-361 551, WO-A-90/13047, J. Mag. Reson. 76: 366-370 (1988), EP-A-302 742, SMRM 9: 619 (1990), SMRM 6: 24 (1987), SMRM 7: 1094 (1988), SMRM 8: 329 (1989), US-A-4719425, SMRM 8: 816 (1989), Mag. Reson. Med. 14: 140-147 (1990), SMRM 9: 617 (1990), SMRM 9: 612 (1990), SMRM 9: 121 (1990), GB-A-2227095, DE-A-40 42 212 und GB-A-2220269.
Bei der grundlegenden OMRI-Technik beinhaltet die Bildgebungssequenz die anfängliche Bestrahlung eines in ein gleichmäßiges Magnetfeld (das Primärfeld B&sub0;) gestellten Subjekts mit Strahlung, in der Regel VHF-Strahlung, einer Frequenz, die gewählt ist, um einen ESR-Übergang mit einer schmalen Linienbreite in einem paramagnetischen Verstärkungsmittel anzuregen, welches sich in dem Subjekt befindet oder an dieses verabreicht wurde. Die dynamische Kernpolarisation führt zu einem Anstieg der Populationsdifferenz zwischen dem angeregten und dem Grundzustand des Kernspins der Bildgebungskerne, d. h. jener Kerne, allgemein Protonen, die für die magnetischen Resonanzsignale verantwortlich sind. Da die MR-Signalintensität proportional zu dieser Populationsdifferenz ist, führen die nachfolgenden Stufen jeder Bildgebungssequenz, die im wesentlichen als herkömmliche MRI-Techniken durchgeführt werden, zu detektierten MR-Signalen größerer Amplitude.
Bei jedem OMRI-Experiment unter Umgebungsbedingungen hat paramagnetischer Sauerstoff einen endlichen Effekt auf das vorliegende Spinsystem. Allgemein gesprochen kann dies als Sekundäreffekt abgetan werden, verglichen mit der primären Wechselwirkung des Radikal-Elektronenspins und des Kernspinsystems. Nichtsdestotrotz wurde vorgeschlagen, dass dieser Effekt zur Bestimmung der Sauerstoffkonzentration innerhalb einer Probe verwendet werden kann. Allerdings konzentrierten sich solche Forschungen insbesondere auf den Einsatz von Nitroxid-Spinmarkierungen; Radikale, welche mit dem inhärenten Nachteil behaftet sind, dass sie ESR-Resonanzen mit breiter Linienbreite und deshalb niedrige Empfindlichkeit gegenüber den Effekten von Sauerstoff aufweisen. Daher ist der Effekt von Sauerstoff bisher nur in einem qualitativen Sinne erkannt worden, und jeder Versuch, dem Sauerstoffeffekt eine quantitative Bedeutung beizumessen, schlug fehl.
Zum Beispiel berichteten Grücker et al. (MRM, 34: 219-225 (1995)) über ein Verfahren zum Berechnen der Sauerstoffkonzentration durch Messen des Overhauser-Effekts in einem Nitroxid-Radikal und durch In-Beziehung-Setzen des nicht-linearen Effekts von Sauerstoff auf den Overhauser-Faktor zu seiner Konzentration. Dieses beinhaltete die Aufnahme von zwei Bildern, eines der An-Resonanz und eines der Aus-Resonanz, und die Verwendung einer Näherung erster Ordnung, um zu der Sauerstoffkonzentration zu gelangen. Jedoch beobachtete Grücker, dass die Korrelation zwischen der tatsächlichen und der errechneten Sauerstoffkonzentration schlecht war und deshalb das Verfahren von sich aus ungenau war. Dies war der großen Zahl an bei der Berechnung beteiligten Parametern zuzuschreiben.
Ehnholm (US-A-5289125) schlug eine OMRI-Technik vor, in welcher Signale von einem paramagnetischen Material unter mindestens zwei unterschiedlichen Reihen von Betriebsparametersätzen detektiert werden, um dadurch Bilder von verschiedenen physikalischen, chemischen oder biologischen Parametern zu erzeugen. Während die Sauerstoffspannung einer von mehreren solchen Parametern war, zeigte Ehnholm nicht den Einsatz der Technik zur Quantifizierung von gelöstem Sauerstoff.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein nicht-invasives Verfahren zur Bestimmung der Sauerstoffkonzentration einer Probe. Es beinhaltet die Manipulation des Overhauser-Effekts, bei welchem die Polarisation dynamisch an Protonen übertragen wird, wenn ein Elektronenspinresonanz-Übergang eines verabreichten beständigen freien Radikals gesättigt ist. Insbesondere basiert das Verfahren auf der Beobachtung und Manipulierung der unterschiedlichen Verstärkung eines Protonensignals aufgrund der veränderten Sättigungscharakteristika eines freien Radikals in Gegenwart von Sauerstoff.
Daher stellt die vorliegende Erfindung, von einem Aspekt her betrachtet, ein Verfahren zur Bestimmung der Sauerstoffkonzentration in einer Probe bereit, zum Beispiel einem Menschen oder einem nichtmenschlichen Wesen, vorzugsweise einem Säuger, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Einbringen in die Probe einer wirksamen Menge eines physiologisch tolerierbaren freien Radikals (allgemein ein beständiges Radikal) mit einem ESR- Übergang mit einer Linienbreite (gemessen in Wasser bei 37ºC) von bis zu 50 uT (500 mG), vorzugsweise weniger als 15 uT (150 mG); Bestrahlen der Probe mit Strahlung (allgemein hierin als VHF-Strahlung bezeichnet) einer Amplitude (d. h. Leistung) und Frequenz, die so gewählt sind, um einen Elektronenspinresonanz-Übergang des Radikals zu stimulieren; Detektieren elektronenspinresonanz-verstärkter magnetischer Resonanzsignale aus der Probe unter mindestens ersten, zweiten und dritten Bedingungen, wobei unter den ersten und zweiten Bedingungen die Strahlung eine erste Frequenz aufweist, unter den dritten Bedingungen die Strahlung eine von der ersten Frequenz verschiedene, zweite Frequenz aufweist, unter den ersten, zweiten und dritten Bedingungen die Strahlung eine erste, zweite und dritte Amplitude aufweist, wobei die erste und zweite Amplitude zumindest voneinander verschieden sind; und Manipulieren der detektierten Signale, um hierdurch die Sauerstoffkonzentration in der Probe zu bestimmen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren der Erfindung Folgendes:
(a) Einbringen des Radikals, z. B. parenteral, beispielsweise durch Injektion in das Körpergewebe oder in das Gefäßsystem;
(b) Erzeugen eines ersten OMRI-Bildes der Probe bei einer VHF-Leistung PA, Bestrahlungszeit TVHF1 und An-Resonanz (ΔH = 0) (d. h. wo die Frequenz der Strahlung so gewählt ist, dass sie die Resonanzfrequenz des ESR-Übergangs ist);
(c) Erzeugen eines zweiten OMRI-Bildes der Probe bei einer zweiten VHF-Leistung PB, Bestrahlungszeit TVHF1 und An-Resonanz (ΔH = 0);
(d) Erzeugen eines dritten OMRI-Bildes der Probe bei einer VHF-Leistung Pc (z. B. gleich PA oder PB), Bestrahlungszeit TVHF1 und Aus-Resonanz (ΔH ≠ 0, zum Beispiel 10-20 uT (100-200 mG));
(e) Manipulieren der in den Schritten (b) bis (d) erhaltenen Bilder und Kalibrieren unter Verwendung von ex vivo bestimmten Parametern, um ein Sauerstoffbild der Probe vorzusehen.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird ein viertes und fünftes OMRI-Bild zusätzlich in der Bildgebungssequenz erzeugt. Die Bedingungen für das vierte Bild sind mit dem ersten Bild identisch, doch ist die VHF-Bestrahlungszeit TVHF2 unterschiedlich (zum Beispiel zweimal so lang, d. h. TVHF2 = 2TVHF1) und das fünfte Bild wird ohne VHF-Bestrahlung erhalten, ist z. B. ein natives Bild mit der Intensität I&sub0;, erzeugt durch herkömmliche MRI mit einer Wiederholungszeit TR = TVHF.
Bei einer weiteren Ausführungsform kann ein natives Bild (d. h. ein durch herkömmliche MRI erhaltenes) der Probe (z. B. eines Körpers) erzeugt werden, um strukturelle (z. B. anatomische) Informationen vorzusehen, über welches das Sauerstoffbild aufgelegt werden kann.
Auf diese Weise wird eine präzise Lokalisierung beispielsweise eines sauerstoffarmen Tumors möglich.
Eine genaue Messung des Sauerstoffspiegels in Körpergeweben ist eine unschätzbare Hilfe für den Arzt, und das Verfahren der Erfindung besitzt eine Vielzahl an Endanwendungen. Zum Beispiel kann die Kenntnis der in Blut gelösten Sauerstoffkonzentration (durch bekannte Geschwindigkeitskonstanten) herangezogen werden, um die Konzentration von mit Hämoglobin assoziiertem Sauerstoff zu berechnen. Dies ist ein nützlicher Parameter, welcher derzeit entweder durch unerwünschte invasive Techniken oder unter Anwendung der BOLD-MR- Bildgebungstechnik gemessen wird, welche die Hochfeld-Bildgebung beinhaltet, um die Wirkung von Sauerstoff auf paramagnetisches Eisen zu ermitteln, die aber den Nachteil hat, dass zur Bestimmung der Blutsauerstoffkonzentration das Blutvolumen, in welchem die Messung erfolgte, bekannt sein muss.
Andere Anwendungsmöglichkeiten des Verfahrens der Erfindung werden für einen Fachmann leicht ersichtlich und schließen die Sauerstoffabbildung (z. B. Kartierung) beispielsweise des Herzens und von Arterien und von bösartigen Tumoren, zum Beispiel im Gehirn, der Brust, Lunge, den Lymphgeweben und Oberflächenbereichen der Leber, ein. Im Falle der Sauerstoffabbildung von Tumoren kann sich eine erfolgreiche Behandlung von bösartigen Tumoren durch Strahlentherapie im Sauerstoffspiegel in dem Gewebe wiederspiegeln (typischerweise gibt eine Sauerstoffkonzentration von weniger als 0,01 mM an, dass das Gewebe nekrotisch ist und dass die Behandlung möglicherweise unwirksam ist).
Es wird ebenfalls offensichtlich sein, dass das Verfahren der Erfindung in der Kardiologie, Chirurgie und Intensivpflege von Nutzen ist, wo Sauerstoffspiegel und gleichmäßige Perfusion in fast jeglichem Gewebe nicht-invasiv bewertet werden können.
Die Manipulierung der detektierten MR-Signale in dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugen allgemein einen Bilddatensatz (d. h. einen Datensatz, aus welchem ein Bild erzeugt werden kann), das die Radikalkonzentration anzeigt, und einen oder mehrere Bilddatensätze, welche die Radikal-Elektronen-Relaxationszeiten (allgemein T1e, T2e oder T1e·T2e) und die Manipulierung dieser Datensätze und die Kalibrierung mit Ex-vivo-Kalibrierungsdaten anzeigen unter Erhalt eines Bilddatensatzes, welcher die Sauerstoffkonzentration anzeigt. Dieser Bilddatensatz der Sauerstoffkonzentration kann in ein Sauerstoffkonzentrationsbild umgewandelt werden oder kann einem Filter für die obere oder untere Grenze unterworfen werden, um Regionen mit hoher oder niedriger Sauerstoffkonzentration auszuweisen, welche wiederum auf Wunsch als ein Bild angezeigt werden können.
Weit gefasst, hängt die Overhauser-Verstärkung des MR-Protonensignals von den Relaxationszeiten T1e und T2e des ESR-Übergangs des in dem Verfahren der Erfindung verwendeten Radikals ab. Diese Relaxationszeiten hängen selbst von den Konzentrationen des Radikals und dem gelösten Sauerstoff in der Körperflüssigkeit sowie von der Temperatur und der chemischen Beschaffenheit der Körperflüssigkeit ab. Während jedoch die Overhauser-Verstärkung leicht angewandt werden kann, um die Sauerstoffkonzentration für eine isolierte Probe mit kleinem Volumen von bekannter Radikalkonzentration ex vivo zu bestimmen, ist die Bestimmung der Sauerstoffkonzentration in vivo kompliziert, da die Overhauser-Verstärkung auch stark von der Probenstruktur für eine große, nicht isolierte Probe, wie einen lebenden Körper, u. a. aufgrund eines nicht gleichmäßigen Eindringens von Strahlung in die große Probe abhängt.
Somit ist, obwohl das Verfahren der Erfindung Kalibrierungsdaten erfordert, die für einen Bereich von Radikal- und Sauerstoffkonzentrationen in einer Fluidprobe (z. B. Blut), welche dem Körperfluid entspricht, in welchem die Oxygenierung bzw. Sauerstoffanreicherung ermittelt werden soll, und bei einer vorbestimmten Temperatur (z. B. 37ºC) erhalten werden, eine weitere Datenmanipulierung erforderlich, um die In-vivo-Sauerstoffkonzentrationen aus den für die Probe detektierten OMRI-Signalen zu extrahieren.
Die Kalibrierungsdaten werden durch Bestimmen der Overhauser-Verstärkungswerte für das Radikal in der gewählten Körperflüssigkeit bei der gewählten Temperatur und bei einem Bereich von Sauerstoff (und vorzugsweise auch Radikal-)Konzentrationen erzeugt. Die ESR- Eigenrelaxationszeiten für das Radikal können unter den gleichen Bedingungen unter Einsatz eines herkömmlichen ESR-Spektrometers, das mit einem Temperaturregler ausgestattet ist, ermittelt werden, wobei die Sauerstoffkonzentration ermittelt wird unter Anwendung des Verfahrens von Ravin et al., J. Appl. Physiol. 18: 784-790 (1964), einem Verfahren, das dafür bekannt ist, genaue und reproduzierbare Resultate zu liefern.
Im allgemeinen sollten Radikalkonzentrationen von bis zu 0,2, vorzugsweise bis zu 1,0, insbesondere von bis zu 1,5 mM und Sauerstoffkonzentrationen von bis zu 0,1, vorzugsweise bis zu 0,5 mM untersucht werden, um die Kalibrierungsdaten zu erzeugen.
Für ein bevorzugtes Radikal, das hierin als vordeuteriertes Hydroxytrityl bezeichnet wird, ergab eine solche Kalibrierung einer Blutprobe bei 37ºC eine maximale Overhauser- Verstärkung (d. h. bei unbegrenzter VHF-Leistung und unbegrenzter Radikalkonzentration) von 192 und eine T&sub1;, d. h. Protonenrelaxivität, von 0,44 mM&supmin;¹s&supmin;¹. Die Abhängigkeit von T1e und T2e von den Radikal- und Sauerstoffkonzentrationen, so fand man heraus, entspricht den nachstehenden linearen Funktionen:
2( 3γe T2e)&supmin;¹ = 20 + 21.5 Crad + 428 Co&sub2; (1)
2( 3γe T1a)&supmin;¹ = 10 + 3.6 Crad + 330 Co&sub2; (2)
(γe T1e T2e)&supmin;¹ = 15 + 6.9 Crad + 319 Co&sub2; (3)
worin γe das elektronengyromagnetische Verhältnis ist, Crad die Radikalkonzentration in mM ist, CO2 die Sauerstoffkonzentration in mM ist und T1e und T2e die Elektronenrelaxationszeiten in s sind, und die Koeffizienten in mG angegeben sind, die Einheiten, in welchen die Linienbreite gemessen wird.
Ähnliche Gleichungen können experimentell für jedes beliebige in dem Verfahren der Erfindung verwendete Radikal abgeleitet werden.
Mit diesen Kalibrierungsdaten können, wenn T1e, T2e oder T1e·T2e für ein Pixel in dem OMRI-Bild der Probe berechnet werden, die Gleichungen (1), (2) oder (3) dann leicht zur Bestimmung der Sauerstoffkonzentration für den Pixel verwendet werden. Die Radikalkonzentration kann durch Manipulierung der in dem Verfahren der Erfindung detektierten MR-Signale bestimmt werden, um dadurch einen Bilddatensatz der Radikalkonzentration zu erzeugen.
Jedoch müssen die Werte von T1e, T2e oder T1e·T2e für den Pixel aus den in dem Bildgebungsverfahren detektierten OMRI-Signalen extrahiert werden. Die in dem Verfahren der Erfindung verwendete OMRI-Bildgebungssequenz kann eine beliebige aus den herkömmlichen Sequenzen sein. Indes ist ein Beispiel einer derartigen verwendbaren Sequenz schematisch in Fig. 1 gezeigt. Diese Sequenz beinhaltet eine VHF-Bestrahlungszeit (TVHF) von etwa derselben Größe wie T&sub1; für das Wasserproton, und ein einzelnes Zeitecho TE, das viel geringer als T&sub2; ist. Die Pixelintensität (I) wird dann durch die Gleichung (4) angegeben:
Iα(1 - exp(-TVHF/T&sub1;)) (4)
Während der VHF-Bestrahlung tritt eine dynamische Protonenpolarisation < Iz> auf. Der stabile Zustand wird durch die Overhauser-Gleichung (5) bestimmt:
worin
So/Io
gleich 658 für eine dynamische Elektron: Proton-Kernpolarisation ist (I&sub0; steht hier für die Gleichgewichtsmagnetisierung);
k der Kopplungsfaktor ist (entspricht % bei niedrigem Feld);
f der Leckagefaktor ist;
und (So - < Sz> )/So der Sättigungsgrad (SAT) des Elektronenspin-Übergangs ist).
Der Leckagefaktor f ist angegeben durch die Gleichung (6)
(worin r die Relaxivität des Radikals ist;
Crad die Radikalkonzentration ist; und
T&sub1;&sub0; die Protonen-Relaxationszeit T&sub1; in Abwesenheit des Radikals ist).
Die Pixelintensität des Endbildes ist angegeben durch die Gleichung (7):
Iα(1 - exp(-TVHF/T&sub1;))(1 - 329rCradT&sub1;SAT)Io (7)
(worin Io die Intensität des Pixels eines nativen Bilds ist).
Wie anhand der Taylorschen Erweiterung der Exponentialfunktion in Gleichung (7) zu sehen ist, verschwindet mit der Maßgabe, dass TVHF wesentlich kleiner als T&sub1;&sub0; ist, T&sub1; zu einer ersten Ordnung. SAT hängt von der Stärke des anregenden VHF-Felds B1e ab und gehorcht den Blochschen Basisgleichungen. Wo der ESR-Übergang eine einzelne Lorentzsche ist, bedeutet dies, dass SAT durch die Gleichung (8) gegeben ist:
(worin α ein Umwandlungsfaktor ist;
P die VHF-Leistung ist; und
Δω der Abstand von der Resonanz der Aus-Resonanz-VHF-Anregungsfrequenz ist (wo eine An- Resonanzfrequenz verwendet wird, ist Δω selbstverständlich null)).
Der Umwandlungsfaktor α ist stark räumlich variabel bei In-vivo-Bildern von großen Proben, und somit ist die Kenntnis von P, SAT, γe und Δω nicht an sich ausreichend, um die Bestimmung der Sauerstoffkonzentration zu ermöglichen.
In den meisten Fällen ist darüber hinaus der ESR-Übergang nicht eine einzelne Lorentzsche aufgrund restlicher magnetischer Kopplungen bzw. Kopplungswirkungen innerhalb des Radikalmoleküls. Wo, wie im Falle bei Radikalen mit einer schmalen ESR-Linienbreite, wie den hierin erwähnten Tritylen, die Kopplungskonstanten viel kleiner sind als die Linienbreite, wird die Resonanz-Linienform zu einer Voigt-Funktion und SAT wird zum Integral aller Aus- Resonanzwerte, gewichtet durch eine Gaussche Funktion der Intensität wie in Gleichung (9):
(worin ΔHGpp und ΔHLpp die erste Peak-zu-Linienbreite-Ableitung der Gausschen und Lorentzschen Funktionen sind und in Feldeinheiten ΔH das Aus-Resonanz-Feld ist).
Die Gleichungen (8) und (9) beziehen sich auf einzelne ESR-Peaks, die auf homogene bzw. inhomogene Weise verbreitert werden. Für gut getrennte Peaks mit großen Kopplungswirkungen wird der Sättigungsgrad durch einen der Weit-Aus-Resonanz-Fraktion entsprechenden Faktor verringert (1/3 für Nitroxide infolge der Stickstoffkopplungswirkung und 0,8 für Trityle infolge von mehrfachen ¹³C-Kopplungswirkungen).
Bei dem Verfahren der Erfindung ist die Datenmanipulierung im Allgemeinen derart, dass sie sich an SAT anpasst, wie auf einer Pixel-um-Pixel-Basis nach einer der Gleichungen (8) oder (9) ermittelt, und dadurch T1e, T2e oder T1e·T2e extrahiert, wiederum auf einer Pixel-um- Pixel-Basis, um so eine Berechnung der Pixel-Sauerstoffkonzentration aus den Gleichungen (1), (2) oder (3) (oder der entsprechenden äquivalenten Gleichung für das in dem Verfahren verwendete Radikal) zu ermöglichen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird die Datenmanipulierung zur Berechnung der ESR-Linienbreite auf Basis einer inhomogenen Verbreiterung (Gleichung (9)) durchgeführt.
In seinem elementarsten Sinne erfordert dieses Verfahren die Erzeugung von drei OMRI-Bildern. Diese können jedoch und werden vorzugsweise durch weitere Bilder, die bei Aus-Resonanz aufgenommen wurden, ergänzt werden und werden auch vorzugsweise durch mit verschiedenen Bestrahlungszeiten aufgenommene Bilder und native Bilder ergänzt.
In der elementaren Version des Verfahrens werden die Bilder A, B und C wie folgt aufgenommen:
A: VHF-Leistung PA Δω = 0 (d. h. An-Resonanz) ΔH = 0, Bestrahlungszeit TVHF = TVHF1
B: VHF-Leistung PB (≠ PA), Δω = 0, Bestrahlungszeit TVHF = TVHF1
C: VHF-Leistung PC (z. B. = PA oder = PB), Δω ≠ 0 (d. h. Aus-Resonanz) ΔH ≠ 0 (z. B. 10-20 uT (100-200 mG)). Bestrahlungszeit TVHF = TVHF1
Unter diesen Bedingungen kann die Pixelintensität geschrieben werden als:
(worin A = Zuwachs · Protonendichte · rCradT&sub1; · (1 - exp(- TVHF/T&sub1;)) für rCradT&sub1; < < 1 (Zuwachs ist der Systemzuwachsfaktor und die Protonendichte ist die Protonendichte des Pixels); und B = Zuwachs · Protonendichte · (1 - exp(-TVHF/T&sub1;))).
Die Gleichung 10 enthält fünf Unbekannte: T&sub1;, Protonendichte, Crad, ΔH ppL = 2/ 3γe·T2e und αT1e.
Mit einer großen Verstärkung (z. B. etwa 10), einer kurzen TVHF1 Verhältnis zu T&sub1; und einer im wesentlichen gleichmäßigen Protonendichte in dem Fluidmedium, in welchem das Radikal verteilt ist, kann B weggelassen werden und die drei Unbekannten Crad, ΔHppL und αT1e können auf einer Pixel-um-Pixel-Basis aus den drei Werten von I, die von den Bildern A, B bzw. C erhalten wurden, angepasst werden. Die Radikalkonzentration (Crad) kann sodann durch Skalieren von A mit dem Zuwachs und r unter Erhalt eines Radikal-Konzentrationsbildes bestimmt werden. Unter Verwendung des ermittelten Wertes von ΔHppL und des Radikal- Konzentrationsbildes kann dann das Bild der Sauerstoffkonzentration aus der Gleichung (I) errechnet werden.
Eine genauere Bestimmung der Sauerstoffkonzentration kann unter Anwendung dieses Verfahrens erfolgen, wenn zwei weitere Bilder erzeugt werden, ein Bild D der An-Resonanz, bei einer Leistung PA und bei einer Bestrahlungszeit TVHF = TVHF2 (worin TVHF2 ≠ TVHF1 ist, z. B. TVHF2 = 2 · TVHF1), und das zweite Bild E ohne VHF-Stimulierung mit Hilfe einer herkömmlichen MR mit einer Wiederholungszeit TR = TVHF1. Das Bild E ergibt die native Intensität Io für die Pixel.
Aus den fünf Werten für die Pixelintensität können alle fünf Unbekannten errechnet werden, wiederum unter Erhalt eines Konzentrationsbildes und von ΔHppL, woraus ein Bild der Sauerstoffkonzentration mit Hilfe der Gleichung (1) bestimmt werden kann.
In diesem Verfahren kann, wenn Referenzproben, welche Körperflüssigkeit und Radikal enthalten, um die Probenoberfläche angeordnet werden (z. B. Röhrchen mit Blut, die das Radikal in der bekannten Konzentration enthalten), das Bild der Sauerstoffkonzentration eingestellt werden, um die Konzentration noch exakter auszudrücken.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung macht sich die größere Empfindlichkeit gegenüber der Sauerstoffkonzentration der Gleichung (3), d. h. des Produkts T1e·T2e, zunutze. Dieses Verfahren erfordert jedoch die Bestimmung von α, welches das magnetische VHF-Feld an dem Pixel angibt.
Bei diesem weiteren Verfahren werden die Bilder der Sauerstoffkonzentration und der Radikalkonzentration aus drei oder mehreren Bildern wie obenstehend berechnet, ein 1/T1e-Bild wird aus diesen Bildern errechnet und ein α-Bild wird durch Multiplizieren des 1/T1e-Bildes mit αT1e, wie ermittelt, errechnet. Das α-Bild wird anschließend unter Verwendung beispielsweise einer Polynom-Funktion geglättet. Es wird bevorzugt, dass Referenzproben um die zu untersuchende Probe, wie obenstehend erläutert, angeordnet werden. Wenn dies geschehen ist, kann dann das Glätten des α-Bildes unter Anwendung einer Glättungsfunktion mit festen Werten an den Referenzprobenstellen erreicht werden. Dies verringert den statistischen Fehler in den Bildern, ist gerechtfertigt, da die räumliche Abweichung von α langsam ist, und liefert, bei festen Referenzpunkten, ein genaues α-Bild.
Unter Verwendung dieses α-Bildes lässt sich das Produkt von ΔHLpp und 1/T1e errechnen, und hieraus (was von 1/T1e·T2e abhängt) und aus dem Bild der Radikalkonzentration lässt sich ein präziseres Sauerstoffbild berechnen.
Wenn Referenzprobenröhrchen nicht verwendet werden, dann kann das geglättete α- Bild immer noch errechnet werden, doch werden in diesem Fall die ermittelten α-Werte vorzugsweise bei der Berechnung der drei (oder fünf) Variablen aus den detektierten OMRI-Bildern verwendet, wobei ein weiteres geglättetes α-Bild aus dem resultierenden 1/T1e-Bild errechnet wird und die Verfahrensweise wiederholt wird, bis aufeinanderfolgend erzeugte α-Bilder im wesentlichen unverändert sind (d. h. die Verfahrensweise konvergiert zu einer Optimal- Anpassung hin).
Die verschiedenen Verfahren der Berechnung, die auf die in dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Daten angewandt werden, repräsentieren einen wichtigen Schritt vorwärts bei der genauen Bestimmung der Sauerstoffkonzentration in einer Probe. Während für Radikale (typischerweise Nitroxide) mit einer großen ESR-Linienbreite das Lorentzsche Modell eine genaue Näherung für die Liniengestalt ist, ist im Falle von Radikalen mit einer schmalen ESR-Linienbreite eine präzisere Analyse der Liniengestalt erforderlich und führt zu einer genaueren Bestimmung der Sauerstoffkonzentration.
Somit führt das Verfahren gemäß der Erfindung zu einem Übereinstimmungsfaktor zwischen der tatsächlichen und der errechneten Sauerstoffkonzentration von typischerweise weniger oder gleich zu etwa 5% für ein 3 · 3 · 10 mm-Voxel, 100 Sekunden Erfassungszeit, 0- 0,1 mM Sauerstoffkonzentration und eine Radikaldosis von 0,1-0,2 mMol/kg Körpergewicht, für Proben, die typischerweise die Größe eines menschlichen Körpers besitzen.
Lässt man die räumliche Abweichung des VHF-Magnetfeldes berechnen, ergibt das weitere obenstehend beschriebene Verfahren eine absolute Quantifizierung der Relationszeit in Längsrichtung (oder das Produkt aus der Relaxationszeit in Längsrichtung und Querrichtung). Die Relaxationszeit in Längsrichtung (und noch mehr das Produkt der Relaxationsraten in Längsrichtung und in Querrichtung) ist gegenüber Sauerstoff empfindlicher, und somit ist dieses Verfahren insgesamt die empfindlichere Technik.
Obwohl die obenstehend beschriebenen Verfahren sich auf die Anwendung der Voigt-Funktionen konzentrierten, um die verschiedenen unbekannten Parameter zu berechnen, kann das Verfahren der Erfindung gleichermaßen die Anwendung der Lorentzschen Funktionen beinhalten, wo diese ein exaktes Modell der ESR-Liniengestalt sind, und ein derartiges Verfahren bildet eine weitere Ausführungsform der Erfindung. Zum Beispiel können bei Radikalen mit großer Linienbreite (typischerweise Nitroxid-Radikale) die Auswirkungen einer Inhomogenität vernachlässigt werden und die Liniengestalt ist im wesentlichen eine Lorentzsche. Daher läuft in dieser bevorzugten Ausführungsform der Schritt der Datenmanipulierung im wesentlichen auf die Anpassung des SAT (wie auf einer Pixel-um-Pixel-Basis ermittelt) an die Gleichung (8) hinaus, unter Extrahieren von T1e, T2e und T1e·T2e auf einer Pixel-um-Pixel-Basis, wodurch die Bestimmung der Sauerstoffkonzentration aus empirischen Beziehungen, wie den Gleichungen (1), (2) und (3), ermöglicht wird.
In der Praxis kann es notwendig sein, Fließeffekte in dem Verfahren der Erfindung auszugleichen, und die entsprechenden Schritte sind dem Fachmann bekannt. Andere Parameter, wie beispielsweise die Probenviskosität, der pH-Wert, die Temperatur, die Radikal-Selbstverbreiterung etc., sind typischerweise nur Sekundäreffekte und können somit in dem Verfahren der Erfindung im Vergleich zu den Auswirkungen erster Ordnung von paramagnetischem Sauerstoff vernachlässigt werden. Die Radikal-Selbstverbreiterung wird allerdings in den Gleichungen 1 bis 3 korrigiert.
Allgemein gesprochen, kann für das vorliegende Verfahren jedes herkömmliche beständige freie Radikal verwendet werden, unter der Maßgabe, dass es unter physiologischen Bedingungen stabil ist, eine ausreichend lange Halbwertszeit hat (mindestens eine Minute, vorzugsweise mindestens eine Stunde), eine lange elektronische Relaxationszeit und eine gute Relaxivität aufweist. Durch die Erläuterung des Verfahrens der Erfindung wird offensichtlich, dass die Empfindlichkeit der Sauerstoffmessung mit Radikalen mit ESR-Übergängen mit einer schmalen Linienbreite, z. B. bis zu 50 uT (500 mG), vorzugsweise weniger als 15 uT (150 mG), insbesondere weniger als 6 uT (60 mG), verbessert wird. Zur Erläuterung würde für eine typische Sauerstoffempfindlichkeit bezüglich einer Linienverbreiterung von 50 uT/mMO&sub2; (500 mG/mMO&sub2;) ein Radikal mit einer T2e-bezogenen Linienbreite von 50 uT (500 mG) (zum Beispiel Nitroxid-Radikale des von Lurie et al. in J. Mag. Reson. 76: 366-370 (1988) vorgeschlagenen Typs) nur eine 10%ige Vergrößerung der Linienbreite für eine Erhöhung der Sauerstoffkonzentration von 0,1 mM ergeben, wohingegen es für ein Radikal mit einer Linienbreite von 5 uT (50 mG) zu einer 100%igen Vergrößerung für einen äquivalenten Anstieg der Sauerstoffkonzentration kommen würde.
Vorzugsweise sollte das für die Verwendung in dem vorliegenden Verfahren gewählte Radikal sich im wesentlichen im extrazellulären Fluid verteilen (d. h. sollte ein ECF- Mittel sein), da die Wirkungen von paramagnetischem Eisen (z. B. Eisen innerhalb der roten Blutzellen) dort vermieden werden können.
Eine weitere bevorzugte Charakteristik der Radikale zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist, dass sie einen geringen Selbstverbreiterungseffekt aufweisen, vorzugsweise von weniger als 10 uT (100 mG), insbesondere vorzugsweise zwischen 0 und 5 uT pro mM (0 und 50 mG pro mM) des Radikals selbst.
Eine besonders bevorzugte Klasse von Verbindungen, welche geringe ESR- Linienbreiten und Selbstverbreiterungseffekte zeigen, die sich besonders für das vorliegende Verfahren eignen, sind die Triarylmethyl-Radikale (im Folgenden als "Trityle" bezeichnet), wie in der WO-A-91/12024, der US-A-5530140 und der US-Patentanmeldung Serien-Nr. 08/467 273 (Nycomed Innovation AB) und der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/GB95/02151 von Nycomed Imaging AS erläutert, sowie ihre deuterierten Analoge.
Besonders bevorzugte Trityle zur Verwendung in dem Verfahren der Erfindung sind jene der Formel:
worin:
n 0, 1, 2 oder 3 ist;
R&sub1; eine Carboxylgruppe oder ein Derivat davon ist;
R&sub2; ein Wasserstoff oder eine wahlfrei hydroxylierte oder alkoxylierte C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylgruppe, wobei die Alkoxygruppe selbst hydroxyliert sein kann, vorzugsweise eine CmH&sub3;&submin;, CmH&sub2;OH- oder CmH&sub2;(OR&sub3;)-Gruppe (worin m 1 oder 2 ist, d. h. ²H Deuterium ist, und worin R&sub3; eine wahlfrei hydroxylierte C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylgruppe, vorzugsweise eine wahlfrei hydroxylierte Ethylgruppe ist) ist;
und die Salze und Vorläufer und deuterierten Analoge davon.
Natürlich wird mit dieser Definition beabsichtigt, Radikal-Vorläufer abzudecken, welche einen Radikalerzeugungsschritt kurz vor der Verabreichung oder sogar in situ unter Erzeugung des freien Radikals durchlaufen können. Radikal-Vorläufer und Radikalerzeugungsschritte sind dem Fachmann gut bekannt. Besonders bevorzugte Trityle sind diejenigen der folgenden Formeln (hierin bezeichnet als perdeuteriertes Trityl, nicht-deuteriertes Hydroxytrityl, deuteriertes Hydroxytrityl bzw. symmetrisches Trityl):
und auch die Verbindung:
und deuterierte Analoge hiervon.
Die Herstellung von freien Radikalen, geeignet zur Verwendung in dem vorliegenden Verfahren, ist in vielen Fällen ein gut bekanntes Syntheseverfahren und wird in anderen Fällen zum Beispiel erörtert in WO-A-91/12024, US-A-5 530 140 und U.S.-Patentanmeldung Serien- Nr. 08/467 273 (Nycomed Innovation AB). Perdeuteriertes Trityl kann hergestellt werden durch das Verfahren, beschrieben für die Herstellung seines nicht-deuterierten Analogs in den nachstehenden Beispielen 15 bis 20, aber mit der Verwendung von Aceton-d&sub6; anstelle von Aceton im anfänglichen Ketalisierungs-Schritt (beschrieben in Beispiel 2 von WO-A-91/12024). Deuteriertes Hydroxytrityl wird im allgemeinen durch aufeinanderfolgende Schritte der Bildung verschmolzener Ringe und deuterativer Reduktion hergestellt, gefolgt von Schritten, die analog zu denjenigen sind, beschrieben für die Herstellung des nicht-deuterierten Analogs in den nachstehenden Beispielen 23 bis 27. Es kann auch gemäß den Beispielen 33-37 hergestellt werden.
Verbindungen, welche noch einen weiteren Aspekt der Erfindung bilden, sind diejenigen der Formel:
worin:
n 0, 1,2 oder 3 ist;
R&sub1; eine Carboxylgruppe oder ein Derivat davon ist;
R&sub2; ein Wasserstoff oder eine wahlfrei hydroxylierte oder alkoxylierte C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylgruppe ist, wobei die Alkoxygruppe selbst hydroxyliert sein kann, vorzugsweise eine CmH&sub3;&submin;, CmH&sub2;OH- oder CmH&sub2;(OR&sub3;)-Gruppe (worin m 1 oder 2 ist, d. h. ²H Deuterium ist, und worin R&sub3; eine wahlfrei hydroxylierte C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylgruppe, vorzugsweise eine wahlfrei hydroxylierte Ethylgruppe ist);
mit der Maßgabe, daß wenn n 0, 2 oder 3 ist, mindestens eine R²-Gruppe eine alkoxylierte C&sub1;&submin;&sub6;- Alkylgruppe ist, wobei die Alkoxygruppe selbst hydroxyliert sein kann;
und die Salze und Vorläufer und deuterierten Analoge davon, insbesondere die Verbindung
und deuterierte Analoge davon.
Eine andere besonders nützliche Masse von Radikalverbindungen für das Verfahren der Erfindung sind die deuterierten Nitroxid-Radikale, speziell perdeuterierte 2,5-Di-t-butyl-3,4- dimethoxycarbonyl-pyrryloxyle, welche bemerkenswert niedrige Linienbreiten aufweisen. Diese Verbindungen können aus 2,5-Di-t-butyl-3,4-dimethoxycarbonylpyrryloxyl hergestellt werden durch Deuterieren der Methylestergruppe durch Umesterung mit Methanol-d&sub4; und/oder der t- Butylgruppen über eine mehrstufige Abfolge, welche mit Aceton-d&sub6; beginnt.
Für die in vivo-Bilderzeugung sollte die Radikalverbindung selbstverständlich ein physiologisch tolerierbares Radikal sein oder ein solches, das in einer physiologisch tolerierbaren Form präsentiert wird (z. B. in Lösung, eingekapselt oder als ein Vorläufer). Die Radikale können zweckmäßigerweise zusammen mit herkömmlichen pharmazeutischen Trägern oder Exzipienten in Kontrastmedien formuliert werden.
Gemäß dieser Erfindung verwendete Kontrastmedien können neben den inerten freien Radikalen (oder dem nicht-radikalischen Vorläufer, wenn eine Radikalbildung unmittelbar vor Verabreichung bewirkt werden soll) Formulierungshilfen enthalten, wie sie für therapeutische und diagnostische Zusammensetzungen in der Human- oder Tiermedizin herkömmlich sind. So können die Medien zum Beispiel Solubilisierungsmittel, Emulgatoren, Viskositätserhöher, Puffer etc. einschließen. Die Medien können in Formen vorliegen, geeignet zur parenteralen (z. B. intravenösen) oder enteralen (z. B. oralen) Anwendung, zum Beispiel zur Anwendung direkt in Körperhöhlen mit nach außen führenden Leerungsgängen (wie dem Magendarmtrakt, der Blase und der Gebärmutter), oder für Injektion oder Infusion in das kardiovaskuläre System, Muskeln oder anderes Gewebe. Allerdings werden Lösungen, Suspensionen und Dispersionen in physiologisch tolerierbaren Medien im allgemeinen bevorzugt werden.
Zur Verwendung bei der diagnostischen in vivo-Bilderzeugung kann das Medium, welches vorzugsweise im wesentlichen isotonisch sein wird, zweckmäßigerweise bei einer Konzentration verabreicht werden, ausreichend, um eine Konzentration von 1 Mikromolar bis 10 mM, bevorzugt 0,05 bis 1 mM, speziell 0,1 bis 0,3 mM an dem freien Radikal in der Bilderzeugungszone zu ergeben; jedoch werden die genaue Konzentration und Dosierung natürlich von einer Reihe von Faktoren abhängen, wie Toxizität, dem Organ-Anzielungsvermögen des Kontrastmittels und dem Verabreichungsweg. Die Optimum-Konzentration für das freie Radikal repräsentiert ein Gleichgewicht zwischen verschiedenen Faktoren. Im allgemeinen würden Optimum-Konzentrationen in den meisten Fällen im Bereich von 0,1 bis 100 mM, speziell 0,2 bis 10 mM, noch spezieller 0,5 bis 5 mM liegen. Zusammensetzungen für intravenöse Verabreichung würden vorzugsweise das freie Radikal bei Konzentrationen von 1 bis 1000 mM, speziell 5 bis 500 mM, enthalten. Für ionische Materialien wird die Konzentration besonders bevorzugt in dem Bereich von 5 bis 200 mM, speziell 10 bis 150 mM, liegen, und für nicht-ionische Materialien 20 bis 400 mM, speziell 30 bis 300 mM betragen.
Somit sieht die vorliegende Erfindung, bei Betrachtung von einem anderen Aspekt aus, die Verwendung von beständigen freien Radikalen, vorzugsweise Radikalen von niedriger intrinsischer ESR-Linienbreite, besonders bevorzugt Trityl-Radikalen, in der in vivo-Oximetrie vor.
Mit den folgenden Beispielen wird beabsichtigt, die Erfindung auf eine nicht- einschränkende Weise zu veranschaulichen.

Beispiele

Die nachfolgenden vier wasserlöslichen, Einzel-ESR-Linien-Trityle wurden mittels NMRD, Dynamischer Nuklearer Polarisation (DNP) und ESR untersucht (Beispiele 1-4).

(1) Bis-(8-natriumcarboxylat-2,2,6,6-tetrakis-(²H&sub3;methyl)-benzo[1,2-d:4,5-d']-bis(1,3)-dithiol-4- yl)-mono-(8-natriumcarboxylat-2,2,6,6-tetrakis-(²H&sub3;-methyl)-benzo[1,2-d:4,5-d']-bis(1,3)- dioxol-4-yl)methyl.

Hierin bezeichnet als perdeuteriertes Trityl (MG = 1080).

(2) Bis-(8-natriumcarboxylat-2,2,6,6-tetrahydroxymethylbenzo[1,2-d:4,5-d']-bis(1,3)-dithiol-4- yl)-mono-(8-natriumcarboxylat-2,2,6,6-tetramethylbenzo[1,2-d:4,5-d']-bis(1,3)-dioxol-4- yl)methyl.

Hierin bezeichnet als nicht-deuteriertes Hydroxytrityl (MG = 1129).

(3) Bis-(8-natriumcarboxylat-2,2,6,6-tetrakis-(hydroxy-²H&sub2;-methyl)-benzo[1,2-d:4,5-d']-bis- (1,3)-dithio 1-4-yl)-mono-(8-natriumcarboxylat-2,2,6,6-tetramethylbenzo[1,2-d:4, 5-d']-bis(1,3)- dioxol-4-yl)methyl.

Hierin bezeichnet als deuteriertes Hydroxytrityl (MG = 1145).

(4) Tris-(8-natriumcarboxylat-2,2,6,6-tetrakis-(²H&sub3;-methyl)-benzo[1,2-d:4,5-d']-bis(1,3)- dithiol)methyl.

Hierin bezeichnet als symmetrisches Trityl (MG = 1151).

Beispiel 1

Die Relaxivitäts- und DNP-Verstärkungs-Daten wurden bei 23ºC und 37ºC in Wasser, Plasma und Blut gemessen. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 und 2 angegeben. Tabelle 1 Tabelle 2

Beispiel 2

Die Elektronenspin-Relaxations-Raten wurden durch Analyse von CW-ESR-Spektren und DNP-Daten bei 23ºC und 37ºC in Wasser, isotonischer Kochsalzlösung, Plasma und Blut für das deuterierte Hydroxytrityl und in Wasser und isotonischer Kochsalzlösung für das perdeuterierte und symmetrische Trityl gemessen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 dargestellt: Tabelle 3 Tabelle 3 (Fortsetzung)

Beispiel 3

Oximetrische Kalibrierungen wurden für das perdeuterierte Trityl und das nichtdeuterierte Hydroxytrityl in Wasser und Plasma bei 37ºC mit ESR in der X-Bande bei 9 GHz vorgenommen. Das Experiment wurde auf einem Varian-X-Band-Spektrometer mit Temperaturregeleinrichtung durchgeführt. Ein Thermoelement wurde nahe der Mikrowellen-Höhlung für genaue Bestimmung der Temperatur angeordnet. Die Proben wurden für rasche Äquilibrierung mit einer strömenden Gasmischung in dünnwandige Teflonkapillaren gebracht. Ein Sensormedics Sauerstoffanalysator OM-11 wurde verwendet, um den Sauerstoff-Prozentsatz in dem strömenden Gas zu bestimmen. Der Gasdruck für die Temperaturregelung und Oxygenierung wurde bei 20 psi gehalten. Die Linienbreite und die Sättigung der Elektronenspin-Resonanz wurde gemessen. Fremys-Salz wurde als ein B&sub1;-Kalibrierungsstandard gewählt, und ein Umwandlungsfaktor von 36,6 ± 0,2 mG/ mW wurde erhalten.
Die Ergebnisse sind in den Fig. 2 und 3 gezeigt, welche die Linienbreite als eine Funktion der Sauerstoffkonzentration angeben. Die Sauerstoff-Verbreiterung des perdeuterierten Trityls in Plasma bei 37ºC beträgt 58,3 uT/mMo2 (583 mG/mMo2).

Beispiel 4

Die Sauerstoffempfindlichkeit des deuterierten Hydroxytrityls wurde bei 260 MHz in Wasser und Blut bei 23ºC und 37ºC durch ESR und DNP untersucht. Die gewünschten Sauerstoffpartialdrücke wurden in einem einfachen Schüttel-Tonometer erhalten. Die Probe von 1-2 ml Volumen wurde mit einer wassergesättigten Gasmischung, welche langsam 5 Minuten lang über die Probe strömte, geschüttelt. Die Probe und das Gas befanden sich in einem Wasserbad, welches die Temperatur aufrechterhielt. Die Gasmischungen waren von hoher Reinheit, chemisch analysiert. Die Ergebnisse sind in den Fig. 4-7 und in der Tabelle 4 gezeigt. Die Lorentzschen Linienverbreiterungen betrugen 51,1 bzw. 36,9 uT/mMo2 (511 bzw. 369 mG/mMo2) in Wasser bei 37ºC bzw. 23ºC und 32,9 uT/mM&sub0;&sub2; (329 mG/mM&sub0;&sub2;) in Blut bei 23ºC. Tabelle 4

Beispiel 5

Die folgenden Experimente wurden unter Verwendung des Hydroxytritylradikals (wie hierin zuvor definiert) ausgeführt und erfolgten auf einer Picker Nordstar MEGA 4 250-300 MR-Maschine, angepaßt zur Verwendung in ORMI durch Reduktion der primären Feldstärke von 0,1 zu 0,01 T und durch den Einbau eines VHF-Emitters zum Emittieren von VHF-Strahlung im Frequenzbereich von 200 bis 300 MHz und dem Leistungsbereich von 0 bis 100 W.

(a) Blutproben mit unterschiedlichen Radikalkonzentrationen und Sauerstoffspannung

Die Radikalkonzentration und Sauerstoffbilder wurden in Blutproben bei drei unterschiedlichen Radikaldosen, 2,0 mM, 4,0 mM und 6,0 mM, berechnet. Die Ergebnisse werden in der Fig. 8 gezeigt.

Parameter:

Abtastzeit 4 : 36 Min
TR/TE 270 ms/20 ms
Scheibe 4 mm
Pixel-Größe 0,5 · 0,5 mm²
Durchschnitt 2
T-vhf 200 ms
Probennahme-Zeit 24 ms
Prob. Freq. 21 kHz
Prob. Matrix 512 · 256 (Oversampling in Ableserichtung)
Erfass. Matrix 256 · 256

(b) OMRI-Oximetrie

Drei Bilder von 120 g wiegenden Ratten wurden erhalten, welche die in vivo- Sauerstoffkonzentration nach Inhalation von Gas von variierendem Sauerstoffgehalt zeigen. Die Radikaldosis belief sich auf 1,5 mmol/kg, injiziert in die Schwanzvene in einem Volumen von 1,5 ml und einer Injektionszeit von 10 s (10 s, bevor das erste Bild erhalten wurde). Die Ergebnisse sind in der Fig. 9 gezeigt.

Parameter:

Abtastzeit 3 : 28 Min
TR/TE 270 ms/20 ms
Scheibe 5 mm
Pixel-Größe 0,75 · 0,75 mm²
Durchschnitt 2
T-vhf 200 ms
Probennahme-Zeit 24 ms
Prob. Freq. 21 kHz
Prob. Matrix 512 · 192 (Oversampling in Ableserichtung)
Erfass. Matrix 192 · 192

(c) OMRI-Oximetrie

Fünf Bilder von 125 g wiegenden Ratten wurden erhalten, welche die in vivo- Sauerstoffkonzentration nach Inhalation von Gas von variierendem Sauerstoffgehalt zeigen. Die Radikaldosis belief sich auf 1,5 mmol/kg, injiziert in die Schwanzvene in einem Volumen von 1,5 ml und einer Injektionszeit von 15 s (15 s, bevor das erste Bild erhalten wurde). Die Ergebnisse sind in der Fig. 10 gezeigt.

Parameter:

Abtastzeit 3 : 28 Min
TR/TE 270 ms/20 ms
Scheibe 5 mm
Pixel-Größe 0,75 · 0,75 mm
Durchschnitt 2
T-vhf 200 ms
Probennahme-Zeit 24 ms
Prob. Freq. 21 kHz
Prob. Matrix 512 · 192 (Oversampling in Ableserichtung)

(Fortsetzung)

Parameter

Erfass. Matrix 192 · 192

(d) OMRI-Oximetrie

Ein Experiment wurde durchgeführt, um die Korrelation zwischen der gemessenen Sauerstoffspannung in den Lungen und dem Sauerstoffgehalt in einem inhalierten Gas zu untersuchen. Ratten mit einem Gewicht von 150 g erhielten eine Injektion mit dem Radikal in einer Dosis von 1,0 mmol/kg in einem Injektionsvolumen von 0,5 ml und bei einer Injektionszeit von 10 s (10 s, bevor das erste Bild erhalten wurde) in die Schwanzvene. Die Resultate sind in der Fig. 11 gezeigt.

Parameter:

Abtastzeit 1 : 44 Min
TR/TE 270 ms/18 ms
Scheibe 5 mm
Pixel-Größe 1,0 · 2,0 mm
Durchschnitt 2
T-vhf 200 ms
Probennahme-Zeit 24 ms
Prob. Freq. 21 kHz
Prob. Matrix 512 · 96 (Oversampling in Ableserichtung)
Erfass. Matrix 192 · 96

(e) OMRI-Oximetrie

Ein Bild bei hoher Leistung und ein errechnetes Sauerstoffbild wurden nach dem Klammern erhalten. Ratten mit einem Gewicht von 132 g erhielten in die Schwanzvene eine Injektion mit dem Radikal in einer Dosis von 2 mmol/kg in einem Injektionsvolumen von 1,0 ml und einer Injektionszeit von 60 s (15 Minuten bevor das erste Bild erhalten wurde). Die Bilderzeugung wurde 8 Minuten nach dem Klammern begonnen. Die Ergebnisse sind in der Fig. 12 gezeigt.

Parameter:

Abtastzeit 3 : 28 Min
TR/TE 270 ms/20 ms
Scheibe 8 mm
Pixel-Größe 1,0 · 1,0 mm
Durchschnitt 2
T-vhf 200 ms
Probennahme-Zeit 24 ms
Prob. Freq. 21 kHz
Prob. Matrix 512 · 192 (Oversampling in Ableserichtung)
Erfass. Matrix 192 · 192

Beispiel 6

Die ESR-Spektraleigenschaften einer Reihe von teilweise und vollständig deuterierten Nitroxiden (Verbindungen 3b-d), die ebenfalls in dem Verfahren der Erfindung nützlich sind, sind untersucht worden. Diese Radikale stammen von 2,5-Di-t-butyl-3,4-dimethoxycarbonyl- pyrryloxyl (Verbindung 3a) und wurden einhergehend mit Tempone (4-Oxo-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl, 1) und CTPO (3-Carbamoyl-2,2,5,5-tetramethyl-pyrrolin-1-yloxyl, 2a) untersucht, welche typische Beispiele von Nitroxiden sind, die häufig für Bildgebungszwecke verwendet werden.
Materialien. 4-Oxo-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl, 11 (Jansen, 95%), 4-Oxo- 2,2,6,6-tetramethylpiperidin-d&sub1;&sub6;-1-oxyl, 1-d&sub1;&sub6; (MSD-Isotope, 98 Atom-% D) und 2,2,5,5- Tetramethyl-3-pyrrolin-d&sub1;&sub3;-oxyl-3-carbonsäure, 2b-d&sub1;&sub3; (MSD-Isotope, 97,5 Atom-% D) wurden verwendet, wie erworben. 2,2,5,5-Tetramethyl-3-pyrrolin-1-oxyl-3-carbonsäure, 2b, war aus früheren Arbeiten verfügbar. Methyl-4,4-dimethyl-3-oxo-pentanoat (Aldrich, 99%) (5a), Trimethylsilyliodid (TMSI, Jansen, 97%), Aceton-D&sub6; (Glaser AG, > 99,5% D) und Methanol-d&sub4; (CIL, > 99,8% D) wurden verwendet, wie geliefert. Pinacolon-d&sub1;&sub2; wurde aus Aceton-d&sub6; hergestellt, wie beschrieben in Organic Synthesis Coll., 1, 459-462, für die nicht-deuterierten Verbindungen. Diethylether (Anhydroscan < 0,01% H&sub2;O) wurde vor der Verwendung durch neutrales Aluminiumoxid geleitet. Natriumhydrid (Aldrich, 80%ige Suspension in Mineralöl) und Nickelperoxid (Aldrich) wurden verwendet, wie erworben. Alle anderen Chemikalien waren von der höchsten im Handel erhältlichen Qualität und wurden verwendet, wie geliefert.
Instrumentierung. Die ESR-Spektren wurden mittels der Upgrade-Version ESP 3220- 200SH eines Bruker ER-200D-SRC-Instrumentes bei 22º aufgezeichnet. Die Radikalkonzentration lag im Bereich von 0,1-0,2 mM, und die Modulationsamplitude belief sich auf 10 mG. Die Mikrowellenleistung lag ziemlich unterhalb der Sättigung. Die NMR-Spektren wurden auf einem Varian XL-300-Spektrometer aufgezeichnet. Massenspektren wurden auf einem VG Quattor II- Instrument aufgezeichnet, ausgestattet mit ESPC-Elektrospray. GLC-Analysen wurden auf einem HP 5830 ser II-Instrument durchgeführt, welches ausgestattet war mit einer Quarzglassäule (30 m, 0,25 um, HP-1701). TLC-Analysen und Säulenchromatographie-Trennungen erfolgten auf Silicagel 60 unter Verwendung von Heptan/Ether als dem Elutionsmittel.
Herstellung von 5c. NaH (22,9 g, 0,77 Mol) und Dimethylcarbonat (64,1 g, 0,77 Mol) wurden behandelt mit Pinacolon-d&sub1;&sub2; (32,4 g, 0,29 Mol), wie beschrieben für die nichtdeuterierte Verbindung in J. Am. Chem. Soc 72, 1356 (1950), wodurch man 5c (28,1 g, 0,17 Mol, 59%) erhielt, das bei 98-100ºC/6 mm siedete. ¹H-NMR (CD&sub3;OD): δ 3,72 (s, 3H). ¹³C- NMR (CD&sub3;OD): δ 209,0 (-CO-), 168,8 (-COO-), 51,2 (-CH&sub3;), 43,7-42,0 (m, -CD&sub2;), 25,0-23,5 (m, -CD&sub3;).
Herstellung von 5b und 5d. Der Methyl-h&sub3;-ester (5a, 5c) wurde gelöst in CD&sub3;OD und mit 2 Mol-% NaOCD&sub3; behandelt. Nach Evaporation wurde das Verfahren wiederholt, und wenn keine Protonen aus der Methylgruppe durch NMR erkennbar waren, wurde die Umesterung als vollständig beurteilt. Die Mischung wurde evaporiert, mit Ether versetzt, evaporiert und ohne weitere Reinigung im nächsten Schritt verwendet.
Herstellung von 6d. Zu einer gerührten Suspension von Na (1,22 g, 53 mmol) in 15 ml Ether unter Ar wurde 5d (8,5 g, 49 mmol) in 30 ml Ether über 2 h zugegeben. Nach weiteren 4 h langem Rühren wurde eine Lösung von I&sub2; (6,35 g, 25 mmol) in 50 ml Ether tropfenweise über 1 h hinweg zugegeben. Die Mischung wurde über Nacht stehen gelassen und die resultierende weiße Suspension wurde auf Ether/gesättigtes wäs. NaCl gegossen. Die wäßrige Schicht wurde zweimal mit Ether extrahiert und die vereinigten organischen Schichten wurden über MgSO&sub4; getrocknet, evaporiert und chromatographiert. 4,8 g (14 mmol, 56%) 6d wurde als ein farbloses Öl aufgefangen, bestehend aus einer Mischung von Diastereomeren und mit unvollständiger Deuterierung an den zwei asymmetrischen (und sauren) Kohlenstoffatomen. ¹³C- NMR (CD&sub3;OD): 209,0 +208,1 (-CO-), 168,5+168,2 (-COO-), 53,7-53,0 (m, -CD&sub2;- + -CHD- + -CH&sub2;-), 51,7-50,7 (m, Ester-CD&sub3;), 25,0-23,5 (m, -CD&sub3;). MS(ESP&spplus;), m/z: 379 (M+39), 363 (M+23). 6a-6c wurden in ähnlicher Weise aus 5a-5c bei 40-60% Ausbeute hergestellt.
Herstellung von 7d. NaOCOCM&sub3; (1,78 g, 13,0 mmol), NH&sub2;OH · HCl (0,80 g, 11,5 mmol) in 13 ml H&sub2;O und 6d (2,80 g, 8,2 mmol.) in 35 ml CH&sub3;COOH wurden gemischt und 72 Stunden lang bei 65ºC gerührt. Die Mischung wurde gekühlt und der Großteil des Lösungsmittel wurde evaporiert. Der Rückstand wurde auf Ether/wäs. NaHCO&sub3; gegossen und die wäßrige Schicht wurde mit Ether extrahiert. Die vereinigten ätherischen Schichten wurden über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und das resultierende Öl wurde chromatographiert, wodurch man 1,6 g zurückgewonnenes Startmaterial erhielt, gefolgt von dem Oxim (0,025 g, 0,07 mmol, 2,0%) und 7d (0,065 g, 0,19 mmol, 5,4%) als weiße Kristalle, Schmp. 156-158ºC. ¹H-NMR (CD&sub3;CN): δ 9,82 (s, 1H). ¹³C-NMR(CD&sub3;CN): 168,3, 136,5, 109,3, 52,2-50,9 (m, Ester-CD&sub3;), 33,5, 30,2-28,1 (m, t-CD&sub3;). MS (ESP&supmin;), m/z: 334 (M-1). In ähnlicher Weise wurden hergestellt: 7a ¹H-NMR ((CD&sub3;)&sub2;CO): δ 9,80 (s, 1H), 3,67 (s, 6H), 1,40 (s, 18H). MS (ESP&supmin;), m/z: 310 (M-1). 7b. ¹H- NMR ((CD&sub3;)&sub2;CO): δ 9,80 (s, 1H), 1,40 (s, 18H). ¹³C-NMR ((CD&sub3;)&sub2;CO): δ 167,1, 135,3, 108,7, 45,8-44,7 (m, CD&sub3;), 33,4, 29,3. MS (ESP&supmin;), m/z: 316 (M-1). 7c. ¹H-NMR ((CD&sub3;)&sub2;CO): δ 9,87 (s, 1H), 3,63 (s, 6H). ¹³C-NMR ((CD&sub3;)&sub2;CO): δ 167,0, 135,5, 108,7, 50,9, 32,3, 29,7-28,2 (m, CD&sub3;). MS (ESP&supmin;), m/z: 328 (M-1).
Herstellung von 3a-3d. 3a wurde aus dem Methylester 5a hergestellt, wie früher für den Ethylester in Bull. Soc. Chim. France, 72, 4330 (1970) beschrieben, und 3b wurde in ähnlicher Weise über Umesterung von 5a hergestellt. Die extreme Unwilligkeit der Methylestergruppe von 3a, 6a und Z zur Umesterung und zum Durchlaufen der herkömmlichen Hydrolyse bedeutete, daß der Umesterungsschritt vor dem Dimerisierungsschritt bei der Herstellung von 3b durchgeführt wurde. Die Herstellung von 3c und 3d begann mit der Pinacolisierung von Hexadeuteroaceton, gefolgt von Pinacol-Umlagerung und Carboxylierung unter Erhalt von 5c, Umesterung, Dimerisierung und Ringschluß mit Hydroxylamin, wie zusammengefaßt im nachstehenden Schema 1. Die intermediären Oxime konnten aus der Reaktionsmischung isoliert werden (in Ausbeuten, ähnlich zu denen der ring-geschlossenen Produkte), und diese wurden separat in die Hydroxylamine umgewandelt unter ansonsten identischen Bedingungen, oder bei der nächsten Wiederholung der Synthese einfach vereinigt. Die Hydrolyse von Z wurde mit TMS 1 in CdCl&sub3; durchgeführt, wodurch man die Dicarbonsäure 4 in mäßiger Ausbeute erhielt. SCHEMA 1
Herstellung von Pyrryloxyl-Radikalen. Zu einer entgasten Lösung von 2 mg des Hydroxylamins 7a-7d in 2 ml Benzol wurden ca. 10 mg NiOOH zugegeben. Nach 5 Minuten wurde die Suspension filtriert, und die blasse grün-blaue Lösung wurde mit entgastem Benzol verdünnt, um eine für ESR geeignete Lösung zu erhalten.

Herstellung von 2,5-Di-t-butyl-N-hydroxy-pyrrol-3,4-dicarbonsäure (4)

Als 7a den obenstehend beschriebenen Umesterungs-Bedingungen unterzogen wurde, mit Schweineleber-Esterase behandelt oder Standardbedingungen der alkalischen Hydrolyse unterzogen wurde, wurde keine Reaktion beobachtet. h (0,090 g, 0,29 mmol) wurde in 10 ml trockenem CDCl&sub3; gelöst, und TMS1 (0,240 g, 1,20 mmol) wurde zugegeben. Nach Erwärmen auf 55ºC über Nacht wurde die Mischung mit 40 ml CH&sub2;Cl&sub2; verdünnt und mit gesättigtem wäßrigen NaCl, einigen wenigen Tropfen wäßrigem Na&sub2;S&sub2;O&sub4; in gesättigtem wäßrigen NaCl und schließlich gesättigtem wäßrigen NaCl gewaschen. Nachdem sie über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und eingedampft worden war, wurde der zurückbleibende Feststoff in Heptan : Ether 9 : 1 gelöst und mit Heptan trituriert, wodurch man die Dicarbonsäure 4 (0,040 g, 0,14 mmol, 49%) als farblose Kristalle erhielt. ¹H-NMR ((CD&sub3;)&sub2;CO): δ 1,50 (s). ¹³C-NMR ((CD&sub3;)&sub2;CO): δ 159,5, 141,0, 108,2, 33,7, 29,2. MS(ESP&supmin;), m/z: 264 (M-19). Nach Behandlung mit NiOOH, wie obenstehend beschrieben, wurde ein ESR-Signal mit einer Linienbreite, die fast identisch war zu der von 3b, aufgezeichnet.
ESR-Messungen. In der Tabelle 5 zusammengefaßt sind die ESR-Linienbreiten für die obenstehend erörterten Nitroxide. Alle Spektren wurden bei hoher Verdünnung in vorsichtig entgastem Benzol bei 22ºC aufgezeichnet. Eine Perdeuterierung führt zu einer Reduktion der Linienbreite um einen Faktor 2,2 für 1 und von 2,5 für 2b. Für die Nitroxide 3a-d verursacht die Deuterierung der Alkylgruppen der Ester-Einheit eine Verringerung um einen Faktor von 1,9 (3c:3d), wohingegen die Deuterierung der t-Butylgruppen allein fast keinen Einfluß hat (3a:3c). Man stellte fest, daß das vollständig deuterierte Nitroxid 3d die schmälste bislang für ein Nitroxid aufgezeichnete Linienbreite, 113 mG, und eine Stickstoff-Kopplungs-Konstante von 4,4 G (in Benzol) aufweist. Die Spindichte-Verteilungen, Stickstoff-Kopplungs-Konstanten und intrinsischen Linienbreiten für 3d werden in der Tabelle 6 mit anderen Nitroxiden verglichen.

Tabelle 5

ESR-Linienbreiten von nicht-deuterierten und perdeuterierten Nitroxiden in Benzol bei 23ºC

Verbindung Nr. Linienbreite/mG

1 602
1-d&sub1;&sub6; 266
2b 1032
2b-d&sub1;&sub3; 407
3a 228
3b 172
3c 219
3d 113 Tabelle 6
a für pO + pN ≤ 1 Beispiel 7 2,2,6,6-Tetra(ethoxycarbonyl)benzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)dithiol.
Die Reaktion wurde unter Argonatmosphäre unter Verwendung von desoxygenierten Lösungsmitteln durchgeführt. 1,2,4,5-Benzotetrathiol (1,50 g, 7,3 mmol) und K&sub2;CO&sub3; (4 g) wurden mit trockenem DMF (70 ml) vermischt, und eine Lösung von Dibromdiethylmalonat (4,26 g, 14,6 mmol) in DMF (15 ml) wurde zugegeben. Die Mischung wurde auf 60ºC erwärmt und 65 Stunden lang gerührt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung in Eiswasser gegossen und dann mit CH&sub2;Cl&sub2; (2 · 100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Wasser gewaschen (4 · 50 ml), getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und eingedampft. Ausbeute: 3,32 g (88%).
¹H-NMR(CDCl&sub3;): 6,97 (s, 2H), 4,29 (q, J = 7,2 Hz, 8H), 1,28 (t, J = 7,2 Hz, 12H). Beispiel 8 2,2,6,6-Tetra(methoxycarbonyl)-4,8-dibrombenzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3')dithiol.
2,2,6,6-Tetra(ethoxycarbonyl)benzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)dithiol (10,7 g, 20,6 mmol) wurde in Eisessig gelöst und Brom (16,5 g, 0,103 Mol) wurde zugegeben. Die Lösung wurde 17 Stunden lang bei 65ºC gerührt und wäßriges Na&sub2;S&sub2;O&sub3; wurde zugegeben. Die wäßrige Aufschlämmung wurde mit CH&sub2;Cl&sub2; (3 · 100 ml) extrahiert, die vereinigten organischen Phasen wurden mit Wasser (3 · 50 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und evaporiert. Der Rückstand wurde mit CH&sub3;CN trituriert und getrocknet. Ausbeute: 10,1 g (72%).
¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): 4,28 (q, J = 7,2 Hz, 8H), 1,21 (t, J = 7,2 Hz, 12H). Beispiel 9 4,8-Dibrombenzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)dithiol-2,6-dispiro-(4,4-dimethyl-3,5-dioxan).
2,2,6,6-Tetra(methoxycarbonyl)-4,8-dibrombenzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)dithiol (6,76 g, 10,0 mmol) wurde in trockenem THF gelöst, die Lösung wurde auf 0ºC gekühlt, und eine Lösung von DIBAL in Toluol (17,8 ml, 100 mmol) wurde tropfenweise zugegeben. Die Lösung wurde 3 Stunden lang auf Rückfluß-Temperatur erwärmt und dann auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Methanol (20 ml) wurde tropfenweise zugegeben, gefolgt von Wasser (60 ml), und der pH-Wert wurde unter Verwendung von wäßriger 6 M HCl auf 2 eingestellt. Die Lösungsmittel, außer Wasser, wurden durch Verdampfen entfernt, und das Präzipitat wurde durch Filtration aufgefangen. Das Produkt wurde mit Wasser, Acetonitril gewaschen, getrocknet und dann in trockenem Aceton (600 ml) suspendiert. BF&sub3;·Et&sub2;O (2,52 ml, 20 mmol) wurde zugesetzt, und die Lösung wurde 20 Minuten lang gerührt. Festes K&sub2;CO&sub3; (6,0 g) wurde zugesetzt, und das Rühren wurde weitere 5 Minuten lang fortgesetzt. Nach Filtrieren durch ein kurzes Polster von basischem Aluminiumoxid wurden die Lösungsmittel durch Evaporation entfernt, der Rückstand wurde mit CH&sub2;Cl&sub2; trituriert und getrocknet. Ausbeute: 1,12 g (19%).
¹H-NMR (DMSO-D&sub6;): 4,15 (S, 8H), 1,37 (S, 12H). Beispiel 10 4-Brombenzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)dithiol-2,6-dispiro-(4,4-dimethyl-3,5-dioxan).
4,8-Dibrombenzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)dithiol-2,6-dispiro-(4,4-dimethyl-3,5-dioxan) (1,14 g, 1,94 mmol) wurde in trockenem THF (270 ml) unter einer Argon-Atmosphäre gelöst. Nach Kühlen der Lösung auf -45ºC wurde eine Lösung von n-BuLi in Hexan (2,5 M, 2,02 mmol) tropfenweise zugesetzt. Nach 5 Minuten langem Rühren wurde Methanol (3 ml) zugegeben, man ließ die Lösung Raumtemperatur erreichen, und die Lösungsmittel wurden verdampft. Das Produkt wurde durch Chromatographie auf Silicagel unter Verwendung einer Mischung von CH&sub2;Cl&sub2; und Methanol (99,5 : 0,5) als dem Elutionsmittel gereinigt. Ausbeute: 0,70 g (71%).
¹H-NMR (CDCl&sub3;): 6,80 (s, 1H), 4,15(s, 8H), 1,47(s, 12H). Beispiel 11 Tris(benzo[1.2-d:4,5-d']bis(1,3)dithiol-4-yl-2,6-dispiro-(4,4-dimethyl-3,5-dioxan))methanol.
4-Brombenzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)dithiol-2,6-dispiro-(4,4-dimethyl-3,5-dioxan) (0,99 g, 1,94 mmol) wurde in trockenem Diethylether (28 ml) unter einer Atmosphäre aus Argon suspendiert. Eine Lösung von n-BuLi (2,5 M in Hexan, 1,94 mmol) wurde tropfenweise zugesetzt und nach 5 Minuten wurde eine Lösung von Diethylcarbonat (0,078 ml, 0,64 mmol) in Diethylether (3 ml) langsam zugegeben. Nach 18 Stunden langem Rühren wurde Ethanol (5 ml) zugesetzt und das Lösungsmittel wurde durch Evaporation entfernt. Das Produkt wurde durch Chromatographie auf Silicagel unter Verwendung einer Mischung von CHCl&sub3; und Ethylacetat (20 : 1) als dem Elutionsmittel gereinigt. Ausbeute: 0,65 g (76%).
¹H-NMR (CDCl&sub3;): 7,16 (s, 3H), 6,01 (s, 1H), 3,86-4,22 (m, 24H), 1,43, 1,41, 1,37, 1,32 (4 s, 36H). Beispiel 12 Tris(8-ethoxycarbonylbenzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)dithiol-4yl-2,6-dispiro-(4,4-dimethyl-3,5- dioxan)methanol.
Tris(benzo[1,2-d: 4,5-d']bis(1,3)dithiol-4-yl-2,6-dispiro-(4,4-dimethyl-3,5-dioxan))methanol (0,205 g, 0,156 mmol) wurde in trockenem Benzol (12 ml), enthaltend N,N,N',N'- Tetramethylethylendiamin (0,33 ml, 2,18 mmol), unter einer Atmosphäre von Argon gelöst. Eine Lösung von t-BuLi in Pentan (1,5 M, 2,18 mmol) wurde tropfenweise zugesetzt und das Rühren wurde 40 Minuten lang fortgesetzt. Die Lösung wurde dann in einen anderen Kolben überführt, welcher bei 0ºC gehalten wurde und Diethylpyrocarbonat (1,3 ml, 8,82 mmol) und Benzol (6 ml) enthielt. Nach 45 Minuten langem Rühren wurde ein wäßriger NaH&sub2;PO&sub4;-Puffer zugesetzt, die organische Phase wurde abgetrennt, mit Wasser gewaschen und eingedampft. Das Produkt wurde durch präparative HPLC gereinigt. Ausbeute: 55 mg (23%).
¹H-NMR (CDCl&sub3;): 6,68 (s, 1H), 4,41-4,52 (m, 6H), 3,86-4,21 (m, 24H), 1,22-1,60 (m, 45H). Beispiel 13 Tris(8-ethoxycarbonyl-2,2,6,6-tetrahydroxymethylbenzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)dithiol-4-yl)- methanol.
Tris(8-ethoxycarbonylbenzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)dithiol-4-yl-2,6-dispiro-(4,4-dimethyl- 3,5-dioxan))methanol (55 mg, 0,0359 mmol) wurde in einer Mischung aus Eisessig (20 ml) und Wasser (5 ml) gelöst, und die Lösung wurde 42 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösungsmittel wurden durch Verdampfen entfernt, Spuren von Säure wurden durch Zusetzen von Benzol, gefolgt von Evaporation, entfernt. Die HPLC-Analyse zeigte > 98% Reinheit des Produktes. Ausbeute: 42,4 mg (91%).
MS (ESP&supmin;, m/e): 1293 (M&spplus;, 68%), 1291 ([M-2]&supmin;, 100%). Beispiel 14 Tris(8-carboxy-2,2,6,6-tetrahydroxymethylbenzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)dithiol-4-yl)methyl- Natriumsalz.
Tris(8-ethoxycarbonyl-2,2,6,6-tetrahydroxymethylbenzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)dithiol-4- yl)methanol (3,4 mg, 0,0026 mmol) wurde in Acetonitril (2 ml) gelöst, und die Lösung wurde auf 0ºC gekühlt. Trifluormethansulfonsäure (0,017 ml) wurde zugesetzt, und nach 15 Minuten wurde eine Lösung von SnCl&sub2; (0,4 mg) in Acetonitril (1 ml) zugegeben. Nach weiteren 15 Minuten wurde ein wäßriger NaH&sub2;PO&sub4;-Puffer zugesetzt, und die Lösungsmittel wurden durch Verdampfen entfernt. Der Rückstand wurde in Wasser suspendiert, und der pH-Wert wurde unter Verwendung einer wäßrigen 1 M NaOH-Lösung auf 12 eingestellt. Nach 1 Stunde langem Rühren wurde die Lösung mit wäßrigem 1 M HCl neutralisiert, und das Lösungsmittel wurde durch Verdampfen entfernt. Das Produkt wurde durch präparative HPLC gereinigt. Ausbeute: 2,0 mg (60%).
ESR (1,5 mM in H&sub2;O, 100 G): Singulett, Linienbreite 100 mG.
Diese Verbindung ist ebenfalls in dem Verfahren der Erfindung verwendbar. Beispiel 15 2,2,6,6-Tetramethylbenzo[1,2-d:4,5-d']-bis(1,3)dioxol-4-carbonsäure.
2,2,6,6-Tetramethylbenzo[1,2-d:4,5-d']-bis(1,3)dioxol (10,0 g, 45,0 mmol; hergestellt gemäß WO-91/12024) wurde unter einer Argonatmosphäre in trockenem THF (200 ml) gelöst. Die Lösung wurde auf -20ºC gekühlt, und n-Butyllithium (20,0 ml, 50,0 mmol) in Hexan wurde zugegeben. Nach Erreichen der Umgebungstemperatur wurde die Reaktionsmischung auf festes Kohlendioxid (150 g) überführt und über Nacht stehen gelassen. Wasser (200 ml) wurde zugesetzt, und der pH-Wert wurde unter Verwendung von wäßriger 2 M NaOH auf 10 eingestellt. Nach Waschen mit Ether wurde die wäßrige Phase mit 2 M Chlorwasserstoffsäure auf pH 2 angesäuert und mit Ether (2 * 300 ml) extrahiert. Die organischen Phasen wurden getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und eingedampft, wodurch man das reine Produkt erhielt.
Ausbeute: 10,7 g (89%).
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 300 MHz) δ: 6,50 (s, 1H), 1,71 (s, 12H). ¹³C-NMR (CDCl&sub3;, 75 MHz) δ: 165,1, 140,9, 140,8, 119,8, 98,9, 97,3, 25,6. Beispiel 16 2,2,6,6-Tetramethylbenzo[1,2-d:4,5-d']-bis(1,3)dioxol-4-carbonsäuremethylester
2,2,6,6-Tetramethylbenzo[1,2-d:4,5-d']-bis(1,3)dioxol-4-carbonsäure (10,0 g, 38,0 mmol) wurde in trockenem DMF (100 ml) gelöst. Kaliumcarbonat (15,2 g, 110,0 mmol) wurde zugegeben, und die Reaktion wurde 30 Minuten lang auf 55ºC erwärmt. Nach Abkühlen auf Umgebungstemperatur wurde Methyliodid (15,6 g, 110,0 mmol) zugegeben, und die Lösung wurde über Nacht gerührt. Der Niederschlag wurde abfiltriert und die Lösung wurde verdampft. Der Rückstand wurde in gesättigtem wäßrigen NaHCO&sub3; und Ether gelöst. Die wäßrige Schicht wurde verworfen, und die organische Phase wurde getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;), filtriert und verdampft, wodurch man 9,4 g (88%) des reinen Produkts erhielt.
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 300 MHz)_: 6,44 (s, 1H), 3,85 (s, 3H), 1,65 (s, 12H).
¹³C NMR (CDCl&sub3;, 75 MHz)_: 163,4, 140,8, 140,6, 119,0, 99,9, 99,4, 51,9, 25,6. Beispiel 17 Bis-(2,2,6,6-tetramethlybenzo[1,2-d:4,5-d']-bis(1,3)-dithiol-4-yl)-mono-(2,2,6,6- tetramethylbenzo(1,2-d:4,5-d']-bis(1,3)dioxol-4-yl)methanol
2,2,6,6-Tetramethylbenzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)dithiol (2,86 g, 10 mmol; hergestellt gemäß WO 91/12024) wurde in wasserfreiem THF (75 ml) gelöst und auf -70ºC gekühlt. n- Butyllithium (4,4 ml, 2,5 M in Hexan) wurde zugegeben. Man ließ die Reaktionsmischung Umgebungstemperatur erreichen. 4-Methoxycarbonyl-2,2,6,6-tetramethylbenzo-[1,2-d:4,5-d']-bis- (1,3)-dioxol (1,4 g, 5 mmol) wurde als ein Feststoff zugesetzt. Nach 1 Stunde wurde die Mischung mit gesättigtem wäßrigen NaH&sub2;PO&sub4; abgeschreckt. Die wäßrige Phase wurde verworfen und die organische Schicht wurde eingedampft. Der Rückstand wurde in Dichlormethan gelöst, mit Wasser gewaschen und getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;). Das Produkt wurde durch Säulenchromatographie gereinigt (Dichlormethan : Heptan, 1 : 1), wodurch man 1,8 g (44%) reines Produkt erhielt.
¹H-NMR(CDCl&sub3;, 300 MHz)_: 7,10 (Breit s, 2H, ArH), 6,39 (s, 1H, ArH), 4,79 (s, 1H, OH), 1,82-1,56 (m, 24H, CH&sub3;), 1,53 (s, 6H, CH&sub3;), 1,46 (s, 6H, CH&sub3;). Beispiel 18 Bis-(8-ethoxycarbonyl-2,2,6,6-tetramethylbenzo(1,2-d:4,5-d']-bis(1,3)-dithiol-4-yl)-mono-(8- ethoxycarbonyl-2,2,6,6-tetramethylbenzo[1,2-d:4,5-d']-bis(1,3')dioxol-4-yl')methanol
Bis-(2,2,6,6-tetramethylbenzo[1,2-d: 4,5-d']-bis(1,3)-dithiol-4-yl)-mono-(2,2,6,6-tetramethylbenzo[1,2-d:4,5-d']-bis(1,3)dioxol-4-yl)methanol (0,50 g, 0,61 mmol) wurde in trockenem Benzol (6,0 ml) unter einer Argonatmosphäre gelöst. t-Butyllithium (2,44 ml, 1,5 M in Pentan) und TMEDA (0,545 ml, 3,66 mmol) wurden zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 25 Minuten lang Ultraschall unterworfen und wurde dann langsam zu einer Lösung von Diethylcarbonat (7,2 ml, 59,4 mmol) in trockenem Benzol (16 ml) zugesetzt. Nach Rühren während 1,5 Stunden wurde wäßriges NaH&sub2;PO&sub4; (50 ml) zugegeben. Die organische Schicht wurde abgetrennt, mit Wasser gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und evaporiert. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurden 130,0 mg (21%) reines Produkt erhalten. ¹H-NMR (CDCl&sub3;, 300 MHz)_: 4,98 (s, 1H), 4,28-4,37 (m, 6H), 1,48-1,79 (m, 36H), 1,46 (t, 6H, J 7,0 Hz), 1,38 (t, 3H, J 7,0 Hz).
¹³C-NMR (CDCl&sub3;, 75 MHz)_: 166,2, 166,0, 162,9, 141,9, 141,6, 141,2, 140,8, 140,4, 140,0, 136,6, 134,5, 129,9, 128,5, 128,1, 127,8, 127,2, 120,3, 118,9, 111,9, 101,1, 80,6, 62,1, 61,0, 60,3, 60,2, 59,8, 59,2, 34,4, 34,3, 33,5, 28,8, 28,1, 27,0, 26,9, 26,5, 25,8. Beispiel 19 Bis-(8-ethoxycarbonyl-2,2,6,6-tetramethylbenzo[1,2-d:4,5-d']-bis(1,37-dithiol-4-yl)mono-(8- ethoxycarbonyl-2,2,6,6-tetramethylbenzo[1,2-d:4,5-d']-bis(1,3)dioxol-4-yl)-methyl
Bis-(8-ethoxycarbonyl-2,2,6,6-tetramethylbenzo[1,2-d: 4,5-d']-bis(1,3)-dithiol-4-yl)-mono-(8-ethoxycarbonyl-2,2,6,6-tetramethylbenzo[1,2-d:4,5-d']-bis(1,3)dioxol-4-yl)methanol (520 mg, 0,501 mmol) wurde in trockenem entgasten Dichlormethan (15 ml) zusammen mit Zinn(II)- Chlorid (95 mg, 0,501 mmol) und Acetonitril (5 ml) gelöst. BF&sub3;·Et&sub2;O (70 ul, 0,557 mmol) wurde zugegeben und die Lösung wurde 20 Minuten lang gerührt. Nach Zugabe von Dichlormethan (80 ml) und Waschen mit entgastem Wasser (80 ml) wurde die organische Schicht abgetrennt, getrocknet (MgSO&sub4;), filtriert und eingedampft. Das Produkt wurde durch präparative HPLC gereinigt.
Ausbeute: 110 mg (22%).
ESR (THF, 200 G) Singulett, Linienbreite 325 mG. Overhauser-Verstärkung (THF, 2,1 mM): 156 bei 4 W Mikrowellenleistung.
Stabilitätsmessungen: Halbwertszeit in Acetonitril ohne Ausschluß von Luft: 2000 h. Beispiel 20 Bis-(8-kaliumcarboxylat-2,2,6,6-tetramethylbenzo-[1,2-d:4,5-d']-bis(1,31-dithiol-4-yl-mono-(8- kaliumcarboxylat-2,2,6,6-tetramethylbenzo[1,2-d:4,5-d']-bis(1,3)dioxol-4-yl)methyl
Bis-(8-ethoxycarbonyl-2,2,6,6-tetramethylbenzo[1,2-d: 4,5-d']-bis(1,3)-dithiol-4-yl)-mono-(8-ethoxycarbonyl-2,2,6,6-tetramethylbenzo[1,2-d:4,5-d']-bis(1,3)dioxol-4-yl)methyl (132 mg, 0,129 mmol) wurde in Ethanol (10 ml) gelöst. Wäßriges Kaliumhydroxid (5 ml, 1,0 M) wurde zugegeben und die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei 50ºC gerührt. Nach Verdampfen des Ethanols wurde die Mischung 1 Stunde lang bei 50ºC gerührt und wurde dann mit 2 M Chlorwasserstoffsäure angesäuert. Die wäßrige Phase wurde mit Ether extrahiert. Die organische Phase wurde abgetrennt, getrocknet (MgSO&sub4;), filtriert und eingedampft. Das Produkt wurde durch präparative HPLC gereinigt. Die Fraktionen wurden eingedampft und Wasser wurde zugesetzt. Die wäßrige Schicht wurde mit Ether extrahiert. Die organische Schicht wurde abgetrennt, getrocknet (MgSO&sub4;), filtriert und eingedampft. Das Produkt wurde durch Zugeben von Wasser und 1 M KOH (0,387 ml, 0,387 mmol) gelöst. Die Lösung wurde lyophilisiert.
Ausbeute: 101 mg (75%).
ESR (H&sub2;O, 200 G): Singulett, Linienbreite 105 mG. Overhauser-Verstärkung (H&sub2;O, 6,9 mM): 219 bei 0,012 W Mikrowellenleistung. Beispiel 21 Benzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)dithiol-2,2,6,6-tetracarbonsäuretetraethylester
1,2,4,5-Benzoltetrathiol (1,50 g, 7,28 mmol) wurde unter einer Argonatmosphäre in trockenem DMF (55 ml) gelöst, und K&sub2;CO&sub3; (4,0 g) wurde zusammen mit 2,2-Dibrommalonatethylester (4,26 g, 14,6 mmol) zugegeben. Die Lösung wurde 16 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und dann weitere 5 Stunden lang bei 60ºC. Die Reaktionsmischung wurde dann in eine Eis-Wasser-Mischung (200 g-200 ml) gegossen und mit Ethylacetat (2 · 250 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Wasser (4 · 100 ml) gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und eingedampft. Das Rohprodukt wurde zu ausreichender Reinheit gewaschen, um ohne Reinigung im nächsten Schritt verwendet zu werden. Ausbeute: 3,05 g (80%) ¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;): 6,91 (s, 2H), 4,29 (q, J = 7,2 Hz, 8H), 1,28 (t, J = 7,2 Hz, 12H). Beispiel 22 2,2,6,6-Tetra(hydroxymethyl-d&sub2;)benzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)dithiol
Eine trockene Soxhlet-Aufstellung wurde mit Benzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)dithiol-2,2,6,6- tetracarbonsäuretetraethylester (5,0 g, 9,65 mmol) in dem oberen Abteil und einer Mischung aus Lithiumaluminiumdeuterid (1,62 g, 38,6 mmol) und Diethylether (300 ml) im unteren Rundbodenkolben versehen. Der Ether wurde 20 Stunden lang auf Rückfluß-Temperatur erwärmt, und dann wurde die Mischung abkühlen gelassen. Methanol (150 ml) wurde tropfenweise mittels Wasser (50 ml) zugesetzt. Die Mischung wurde mit konzentrierter HCl (20 ml) angesäuert, und das Lösungsmittel wurde durch Verdampfen im Vakuum auf 50 ml reduziert. Der weiße Feststoff wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen (2 · 25 ml) und getrocknet. Ausbeute: 3,15 g (91%).
¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d&sub6;): 7,06 (2,2H), 5,45 (br s, 4H). Beispiel 23 2,2,6,6-Tetra(dimethylhexylsilyloxymethyl)benzo[1,2-d:45-d']bis(1,3)dithiol
Die Reaktion wurde unter Argonatmosphäre ausgeführt. 2,2,6,6-Tetra(hydroxymethyl)- benzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)dithiol (0,8 g, 2,2 mmol) wurde in DMF (20 ml) gelöst. Imidazol (1,1 g, 15,8 mmol) wurde zugesetzt und die Lösung wurde auf 0ºC gekühlt. Dimethylhexylsilylchlorid (2,8 g, 15,8 mmol) wurde tropfenweise zugesetzt (ca. 2 min). Die Lösung wurde 48 Stunden lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde in Eis/Wasser gegossen, CH&sub2;Cl&sub2; (100 ml) wurde zugesetzt, und die zwei Phasen wurden abgetrennt. Die organische Phase wurde mit 1 M HCl und Wasser (3 * 100 ml) gewaschen. Die Lösung wurde getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und eingedampft. Das Produkt wurde durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan-Heptan (1 : 9) als Elutionsmittel gereinigt.
Ausbeute: 1,1 g (52%).
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 300 MHz)_: 6,84 (s, 2H, ArH); 3,94 (s, 8H, CH&sub2;), 1,62 (Septett, 4H, J 6,8 Hz, CH), 0,88 (d, 24H, J 6,8 Hz, CH&sub3;), 0,84 (s, 24H, CH&sub3;), 0,08 (s, 24H, Si(CH&sub3;)&sub2;). ¹³C- NMR (CDCl&sub3;, 75 MHz)_: 134,3, 115,8, 74,2, 65,0, 34,2, 25,1, 20,3, 18,6, -3,6. Beispiel 24 Bis(2,2,6,6-tetra(dimethylhexylsilyloxymethyl)benzo[1,2-d:4,5-d]bis(1,3)dithiol-4-yl)- mono(2,2,6,6-tetramethylbenzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)dioxo)-4-yl)methanol
Die Reaktion wurde unter Argonatmosphäre ausgeführt. 2,2,6,6-Tetra(dimethylhexylsilyloxymethyl)benzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)dithiol (7,0 g, 7,6 mmol) wurde in trockenem THF (50 ml) gelöst. Die Lösung wurde auf -70ºC gekühlt. n-Butyllithium (5,0 ml, 1,6 M in Hexan) wurde zugesetzt, und man ließ die Temperatur Umgebungstemperatur erreichen, und es wurde 1 Stunde lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum bei Umgebungstemperatur eingedampft, und Diethylether (20 ml) wurde zugesetzt. Dann wurde 4-Ethoxycarbonyl-2,2,6,6-tetramethylbenzo[1,2-d:4,5-d']-bis(1,3)dioxol (0,8 g, 2,9 mmol) in einer Portion zugegeben, und die Reaktionsmischung wurde 12 Stunden lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Die Mischung wurde in eine NaH&sub2;PO&sub4;-Lösung gegossen, die Phasen wurden abgetrennt, und die wäßrige Phase wurde mit Diethylether (2 * 100 ml) extrahiert. Die organischen Phasen wurden getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und eingedampft. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC gereinigt.
Ausbeute: 3,7 g (62%).
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 300 MHz)_: 6,80 (s, 2H, ArH), 6,26 (s, 1H, ArH), 4,95 (s, 1H, OH), 3,8 (br m, 16H, CH&sub2;), 1,5 (br m, 20H, CH&sub3; + CH), 0,9 (d, 48 H, CH&sub3;), 0,7 (s, 48H, CH&sub3;), 0,2 (2 s, 48 H, Si(CH&sub3;)&sub2;).
¹³C-NMR (CDCl&sub3;, 75 MHz)_: 141,5, 140,3, 139,8, 139,6, 131,7, 118,6, 117,1, 108,1, 94,4, 80,0, 65,4, 34,1, 25,9, 25,0, 20,3, 18,7, -3,2. Beispiel 25 Bis(8-ethoxycarbonyl-2,6,6-tetra(hydroxymethyl)benzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)dithiol-4yl)-mono- (8-ethoxycarbonyl-2,2,6,6-tetramethylbenzo[1,2-d:4,5-d']-bis(1,3)dioxol-4-yl)methanol
Bis(2,2,6,6-tetra(dimethylhexylsilyloxymethyl)benzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)dithiol-4-yl)- mono(2,2,6,6-tetramethylbenzo[1,2-d:4,5-d']-bis(1,3)dioxol-4-yl)methanol (3,2 g, 1,54 mmol) wurde in Heptan (12,8 ml) und trockenem Benzol (10,7 ml) zusammen mit TMEDA (3,2 ml, 21,6 mmol) unter einer Argon-Atmosphäre gelöst. Die Lösung wurde auf -22ºC abgekühlt und t- BuLi (14,4 ml, 1,5 M in Pentan) wurde zugegeben. Nach 3 Stunden langem Rühren bei -22ºC wurde die Reaktionsmischung in eine Lösung von Diethylpyrocarbonat (12,8 ml, 87 mmol) in Heptan (23 ml) und trockenem Benzol (23 ml) überführt, welche bei -22ºC gehalten wurde. Man gestattete dann, daß die Reaktionsmischung Umgebungstemperatur erreichte. Nach Rühren während einer weiteren Stunde wurde eine gesättigte wäßrige Lösung von NaH&sub2;PO&sub4; (40 ml) zugesetzt. Die Mischung wurde eine Stunde lang gerührt, die organische Phase wurde abgetrennt, mit Wasser (2 * 100 ml) und Acetonitril (2 * 100 ml) gewaschen. Die Heptan/Benzol-Phase wurde eingedampft und dann in THF (25 ml) gelöst. Eine Lösung von Bu&sub4;NF in THF (20 ml, 20 mmol) wurde zugesetzt, und die Mischung wurde über Nacht gerührt. Nach Eindampfen des Lösungsmittels wurde der Rückstand zwischen Wasser (300 ml) und Ethylacetat (300 ml) partitioniert. Die organische Phase wurde mit Wasser (2* 100 ml) gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und eingedampft. Eine Reinigung mittels präparativer HPLC ergab 400 mg (22%) reines Produkt.
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 300 MHz)_: 5,78-5,92 (m, 6H), 5,03-5,52 (m, 24H), 2,98-3,21 (m, 12H), 2,90 (t, 6H, J 7,0 Hz), 2,84 (t, 3H, J 6,9 Hz). Beispiel 26 Bis(8-ethoxycarbonyl-2,2,6,6-tetra(hydroxymethyl)benzo[1,2-d:4,5-d'] bis(1,3)dithiol-4-yl)- mono(8-ethoxycarbonyl-2,2,6,6-tetramethylbenzo[1,2-d:4,5-d']-bis(1,3)dioxol-4-yl)methanol
Bis(8-ethoxycarbonyl-2,2,6,6-tetra(hydroxymethyl)benzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)ditoxol-4-yl)methanol yl)-mono(8-ethoxycarbonyl-2,2,6,6-tetramethylbenzo[1,2-d:4,5-d']-bis(1,3)dioxol-4-yl)methanol (294 mg, 0,25 mmol) wurde in Acetonitril (70 ml) unter einer Atmosphäre aus Argon gelöst. Nach Kühlen auf 0ºC wurde Trifluormethansulfonsäure (190 ul, 2,2 mmol) zugegeben. Nach 3 Minuten langem Rühren wurde Zinn(II)-chlorid (48 mg, 0,25 mmol), gelöst in Acetonitril (7 ml), zugesetzt. Nach 1 Minute wurde eine gesättigte wäßrige Lösung von NaH&sub2;PO&sub4; (50 ml) zugegeben. Die wäßrige Phase wurde mit Acetonitril (2 * 50 ml) gewaschen, die vereinigten organischen Phasen wurden getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und eingedampft. Eine Reinigung mittels präparativer HPLC ergab 176 mg (61%) des reinen Produktes.
ESR (H&sub2;O, 200 G): Singulett, Linienbreite 433 mG. Beispiel 27 Bis 8-carboxy-2,2,6,6-tetra(hydroxymethyl)benzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)dithiol-4-yl)-mono(8- carboxy-2,2,6,6-tetramethylbenzo (1,2-d:4,5-d']-bis(1,3)dioxol-4-yl)methyl-Natriumsalz
Bis(8-ethoxycarbonyl-2,2,6,6-tetra(hydroxymethyl)benzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)dithiol-4- yl)-mono(8-ethoxycarbonyl-2,2,6,6-tetramethylbenzo [1,2-d:4,5-d']-bis(1,3)dioxol-4-yl)methyl 316 mg, 0,275 mmol) wurde gelöst in einer Mischung aus wäßrigem 1 M NaOH (3 ml), Wasser (1,5 ml) und Ethanol (3 ml). Die Lösung wurde bei Umgebungstemperatur 15 Minuten lang gerührt, der Ethanol wurde durch Verdampfen entfernt, und der Rückstand wurde 2 weitere Stunden lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Nach Verdampfen fast bis zur Trockenheit wurde die reine Säure (240 mg, 82%) mittels präparativer HPLC, gefolgt von Lyophilisieren, isoliert. Die Säure wurde in das entsprechende Natriumsalz umgewandelt durch die Zugabe von Wasser (50 ml), gefolgt vom Einstellen des pH-Wertes auf 7 mit wäßrigem 1 M NaOH und Lyophilisierung.
ESR (3,4 mM in H&sub2;O, 200 G): Singulett, Linienbreite 120 mG. Overhauser-Verstärkung (wäßrige Lösung wie obenstehend): 164 bei 5 W Mikrowellenleistung.
Stabilitätsmessungen: Halbwertszeit in Wasser ohne Luftausschluß: 120 h. Beispiel 28 Tris(8-ethoxycarbonyl-2,2,6,6-tetra(hydroxyethoxy)-methylbenzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)dithiol-4- yl)methanol
Tris(8-ethoxycarbonyl-2,2,6,6-tetrahydroxymethylbenzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)dithiol-4- yl)methanol (Beispiel 13) (169 mg, 0,13 mmol) wurde in N,N-Dimethylacetamid (18 ml) zusammen mit Natriumhydrid (280 mg, 80% in Mineralöl) und 2-(2-Bromethoxy)tetrahydropyran (2,16 g, 10,3 mmol) gelöst. Die Reaktionsmischung wurde 3,5 Stunden lang bei 55ºC gerührt, abkühlen gelassen und dann auf einen wäßrigen Natriumphosphatpuffer (100 ml, pH 7) gegossen. Nach Extraktion mit Dichlormethan wurde die organische Phase getrocknet, und die Lösungsmittel wurden durch Verdampfung entfernt. Der Rückstand wurde in einer Mischung aus Methanol (30 ml) und Wasser (4 ml) gelöst, und der pH-Wert wurde dann unter Verwendung von wäßrigem 2 M HCl auf 0,8 eingestellt, und die Lösung wurde dann 15 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde unter Verwendung von wäßrigem NaHCO&sub3; neutralisiert, und die Lösungsmittel wurden durch Verdampfung entfernt. Das Produkt wurde unter Verwendung von präparativer HPLC gereinigt (RP-18, Methanol-Wasser: 40-60).
Ausbeute: 142 mg (60%).
¹H-NMR (300 MHz, CD&sub3;OD): 4,42 (6 H, q, J = 7 Hz), 3,48-4,16 (84H, m), 1,43 (9H, t, J = 7 Hz).
MS (ESP, m/e): 1822 (73%), 1821 (78%), 1820 (96%), 1819 (100%). Beispiel 29 Tris(8-carboxy-2,2,6,6-tetra(hydroxyethoxy)methylbenzo-[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)dithiol-4- yl)methyl-Natriumsalz
Tris(8-ethoxycarbonyl-2,2,6,6-tetra(hydroxyethoxy)-methylbenzo[1,2-d: 4,5-d']bis(1,3)dithiol-4-yl)methanol (40 mg, 0,022 mmol) wurde in einer Mischung von Essigsäureanhydrid (5 ml) und Pyridin (10 ml) gelöst, und die Lösung wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die organischen Lösungmittel wurden durch Verdampfen entfernt, der Rückstand wurde in Dichlormethan gelöst, was mit Wasser gewaschen wurde. Nach Entfernen des Lösungsmittels durch Verdampfen wurde der Rückstand in Dichlormethan (8 ml) gelöst und dann wurde eine Lösung aus Trifluormethansulfonsäure in Dichlormethan (0,58 mmol in 4 ml) bei 0ºC zugegeben. Nach 2 Minuten langem Rühren wurde eine Lösung von SnCl&sub2; in Acetonitril (2 mg in 2 ml) zugesetzt, und die Lösung wurde eine weitere Minute lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde auf einen wäßrigen pH 7-Natriumphosphatpuffer gegossen, die organische Phase wurde ababgetrennt und die wäßrige Phase wurde mit Dichlormethan (25 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;), und das Lösungsmittel wurde durch Verdampfen entfernt. Der Rückstand wurde in Ethanol (10 ml) gelöst, und eine wäßrige 1 M-Lösung von Hydroxid (3 ml) wurde zugesetzt. Nach 1-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde der pH-Wert unter Verwendung von wäßriger 1 M HCl auf 2 eingestellt, und dann wurde die Lösung einer Reinigung durch präparative HPLC (RP-18, CH&sub3;CN-HCl (pH 2) : 20 : 80) unterzogen. Die das reine Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und das Acetonitril wurde durch Verdampfen entfernt. Die restliche wäßrige Lösung wurde lyophilisiert, der Rückstand wurde in Wasser gelöst, die Lösung wurde unter Verwendung von wäßrigem 1 M NaOH neutralisiert und die Lösung wurde erneut lyophilisiert. Ausbeute: 24 mg (62%).
ESR: (1 mM in Wasser, 100 G): Singulett, Linienbreite 116 mG.

Beispiel 30

Die folgenden Beispiele wurden unter Verwendung des Hydroxytrityl-Radikals durchgeführt und erfolgten auf einer Picker Nordstar MEGA 4 250-300 MR-Maschine, angepaßt zur Verwendung in OMRI durch Verringern der primären Feldstärke von 0,1 zu 0,01 T und durch die Einbindung eines VHF-Emitters, um VHF-Strahlung im Frequenzbereich von 200 bis 300 MHz und einem Leistungsbereich von 0 bis 100 W zu emittieren.

(a) Morphologischer, sagittaler OMRI-Scan, welcher die Gefäße des Herz-, Gehirn-, Leber- und Drüsen-Gewebes einer Ratte visualisiert.

Es wurden Bilder von Ratten mit einem Gewicht von 125 g aufgenommen. Die Radikal- Dosis belief sich auf 1,5 mmol/kg, injiziert in die Schwanzvene in einem Volumen von 1,5 ml und einer Injektionszeit von 10 s (15 Minuten bevor das Bild aufgenommen wurde). Die Ergebnisse sind in der Fig. 13 gezeigt.

Parameter:

Abtast-Zeit 4 : 36 Min
TR/TE 270 ms/20 ms
Scheibe 4 mm
Pixel-Größe 0,5 · 0,5 mm²
Durchschnitt 4
T-vhf 200 ms

(Fortsetzung)

Parameter:

Probennahme-Zeit 24 ms
Proben-Freq. 21 kHz
Proben-Matrix 512 · 192 (Oversampling in Ableserichtung)
Erfassungs-Matrix 192 · 192
Nachverarbeitung Erneute Probenerfassung auf 348 · 348 Matrix

(b) Herzinfarkt

Es wurden Bilder von Ratten mit einem Gewicht von 110 g aufgenommen. Die Radikal- Dosis belief sich auf 2,0 mmol/kg, injiziert in die Schwanzvene in einem Volumen von 1,8 ml und einer Injektionszeit von 5 Sekunden (20 Minuten bevor das Bild aufgenommen wurde). Die Ergebnisse sind in der Fig. 14 gezeigt.

Parameter:

Abtast-Zeit 3 : 15 Min
TR/TE 190 ms/20 ms
Scheibe 4 mm
Pixel-Größe 0,5 · 0,5 mm²
Durchschnitt 4
T-vhf 125 ms
Probennahme-Zeit 24 ms
Proben-Freq. 21 kHz
Proben-Matrix 512 · 256 (Oversampling in Ableserichtung)
Erkennungs-Matrix 256 · 256
Nachverarbeitung γ-Korrektur
Kommentar Getötet 8 Minuten nach Injektion

Beispiel 31

Eine schematische Wiedergabe des "elementaren Verfahrens" gemäß der Erfindung unter Verwendung des perdeuterierten Hydroxytrityls. Die Selbst- und Sauerstoffverbreiterung ist durch Gleichung 1 bzw. eq. 1 angegeben, die inhomogene Verbreiterung ist_HppG = 60 mG, und die Relaxivität ist 0,4 mM&supmin;¹s&supmin;¹. Bilder A, B und C:

Beispiel 32

Eine schmatische Wiedergabe des bevorzugten Verfahrens gemäß der Erfindung unter Verwendung des perdeuterierten Hydroxytrityls. Die Selbst- und Sauerstoffverbeiterung ist durch Gleichung 1 bzw. eq. 1 angegeben, die inhomogene Verbreiterung ist_HppG = 60 mG, und die Relaxivität ist 0,4 mM&supmin;¹r&supmin;¹. Bilder A, B, C, D und E: Beispiel 33 2,2,6,6-Tetra(dimethylhexylsilyloxy(²H&sub2;-methyl))benzo[1,2-d:4,5-d']bis(bis(1,3)dithiol
Die Reaktion wurde unter einer Argonatmosphäre ausgeführt. 2,2,6,6-Tetra(hydoxy(²H&sub2;- methyl))benzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)dithiol (29,1 g, 81 mmol) wurde in DMF (176 ml) gelöst. Imidazol (44,3 g, 650 mmol) wurde zugesetzt, und die Lösung wurde auf 0ºC gekühlt. Dimethylhexylsilylchlorid (87,2 g, 96 mmol) wurde tropfenweise zugegeben. Die Lösung wurde 48 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Heptan (4 · 200 ml) extrahiert und die vereinigten Heptan-Phasen wurden dann eingedampft. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan-Heptan (1 : 9) als Elutionsmittel gereinigt.
Ausbeute: 37,6 g (55%).
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 300 MHz)_: 6,84 (s, 2H, ArH), 1,62 (Septett, 4H, J 6,8 Hz, CH), 0,88 (d, 24 H, J 6,8 Hz, CH&sub3;), 0,84 (s, 24H, CH&sub3;), 0,08 (s, 24H, Si(CH&sub3;)&sub2;). Beispiel 34 Bis(2,2,6,6-tetra(dimethylhexylsilyloxy(²H&sub2;-methyl)benzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)dithiol-4-yl)- mono(2,2,6,6-tetramethylbenzo[1,2-d:4,5-d']-bis(1,3)dioxol-4-yl))methanol
Die Reaktion wurde unter einer Argonatmosphäre ausgeführt. 2,2,6,6-Tetra(dimethylhexylsilyloxy(²H&sub2;-methyl))benzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)dithiol (80,9 g, 88 mmol) wurde in trockenem THF (300 ml) gelöst. Die Lösung wurde auf -70ºC gekühlt. n-Butyllithium (70 ml, 2,5 M in Hexan) wurde zugesetzt, und man gestattete, daß die Temperatur Raumtemperatur erreicht, und es wurde 1 Stunde lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum bei Raumtemperatur verdampft und Diethylether (200 ml) wurde zugesetzt. 4-Ethoxycarbonyl-2,2,6,6- tetramethylbenzo[1,2-d:4,5-d']-bis(1,3)dioxol (11,7 g, 42 mmol) wurde dann in einer einzelnen Portion zugegeben, und die Reaktionsmischung wurde 16 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde in eine Mischung aus einer gesättigten wäßrigen NaH&sub2;PO&sub4;- Lösung (200 ml) und Wasser (200 ml) gegossen, die Phasen wurden abgetrennt und die wäßrige Phase wurde mit Diethylether (2 · 200 ml) extrahiert. Die organischen Phasen wurden getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und eingedampft. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC gereinigt.
Ausbeute: 51,5 g (56%).
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 300 MHz)_: 6,80 (s, 2H, ArH), 6,33 (s, 1H, ArH), 4,95 (s, 1H, OH), 1,5 (br m, 20H, CH&sub3; + CH), 0,9 (d, 48H, CH&sub3;), 0,7(s, 48H, CH&sub3;), 0,2 (2 s, 48H, Si(CH&sub3;)&sub2;). Beispiel 35 Bis(8-ethoxycarbonyl-2,2,6,6-tetra(hydroxy(²H&sub2;-methyl))benzo[1,2-d:4.5-d']bis(1,3)dithiol-4- yl)-mono(8-ethoxycarbonyl-2,2,6,6-tetramethylbenzo[1,2-d:4,5-d']-bis(1.3)dioxol-4-yl)methanol
Bis(2,2,6,6-tetra(dimethylhexylsilyloxy(²H&sub2;-methyl))benzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)dithiol- 4-yl)-mono(2,2,6,6-tetramethylbenzo(1,2-d:4,5-d']-bis(1,3)dioxol-4-yl)methanol (54 g, 26 mmol) wurde in Heptan (216 ml) und trockenem Benzol (178 ml) zusammen mit TMEDA (54 ml) unter einer Argonatmosphäre gelöst. Die Lösung wurde auf -22ºC gekühlt und t-BuLi (54 ml, 2,5 M in Pentan) wurde zugegeben. Nach 1 Stunde langem Rühren bei -22ºC wurde die Reaktionsmischung in eine Lösung von Diethylpyrocarbonat (216 ml, 1,47 mol) in Heptan (640 ml) überführt, welche bei -40ºC gehalten wurde. Man gestattete dann, daß die Reaktionsmischung Umgebungstemperatur erreichte. Nach Rühren während einer weiteren Stunde wurde eine gesättigte wäßrige Lösung von NaH&sub2;PO&sub4; (40 ml) zugesetzt. Die Mischung wurde eine Stunde lang gerührt, die organische Phase wurde abgetrennt, mit Wasser (2 * 100 ml) und Acetonitril (2 * 100 ml) gewaschen. Die Heptan/Benzol-Phase wurde eingedampft und dann in THF (380 ml) gelöst. Eine Lösung von Bu&sub4;NF in THF (300 ml, 300 mmol) wurde zugesetzt, und die Mischung wurde über Nacht gerührt. Nach Eindampfen des Lösungsmittels wurde der Rückstand mittels präparativer HPLC gereinigt, wodurch man 11,4 mg (39%) reines Produkt erhielt.
¹H-NMR (CDCl&sub3;), 300 MHZ) δ: 5,77-5,92 (m, 6H), 5,11-5,51 (m, 8H), 2,98-3,24 (m, 12H), 2,90 (t, 6H, J 7,0 Hz), 2,84 (t, 3H, J 6,9 Hz). Beispiel 36 Bis(8-ethoxycarbonyl-2,2,6,6-tetra(hydroxy(²H&sub2;-methyl))benzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)dithiol-4- yl)-mono(8-ethoxycarbonyl-2,2,6,6-tetramethylbenzo[1,2-d:4,5-d']-bis(1,3)dioxol-4-yl)methyl
Bis(8-ethoxycarbonyl-2,2,6,6-tetra(hydroxy(²H&sub2;-methyl))benzo[1,2-d: 4,5-d']bis(1,3)dithiol-4-yl)-mono(8-ethoxycarbonyl-2,2,6,6-tetramethylbenzo[1,2-d:4,5-d']-bis(1,3)dioxol-4- yl)methanol (5,07 g, 4,30 mmol) wurde in Acetonitril (650 ml) unter einer Atmosphäre aus Argon gelöst. Nach Kühlen auf 0ºC wurde Trifluormethansulfonsäure (2,2 ml) zugegeben. Nach 3 Minuten langem Rühren wurde Zinn(II)-chlorid (447 mg, 2,36 mmol), gelöst in Acetonitril (90 ml), zugesetzt. Nach 1 Minute wurde eine gesättigte wäßrige Lösung von NaH&sub2;PO&sub4; (200 ml) zugegeben. Die wäßrige Phase wurde mit Acetonitril (2 · 50 ml) gewaschen, die vereinigten organischen Phasen wurden getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und eingedampft. Eine Reinigung mittels präparativer HPLC ergab 2,66 mg (53%) des reinen Produktes.
ESR (H&sub2;O, 200 G): Singulett, Linienbreite 268 mG. Beispiel 37 Bis(8-carboxy-2,2,6,6-tetra(hydroxy(²H&sub2;-methyl)benzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)dithiol-4-yl)- mono(8-carboxy-2,2,6,6-tetramethylbenzo[1,2-d:4,5-d']-bis(1,3)dioxol-4-yl)methyl-Natriumsalz
Bis(8-ethoxycarbonyl-2,2,6,6-tetra(hydroxy(²H&sub2;-methyl))benzo[1,2-d: 4,5-d']bis(1,3)dithiol-4-yl)-mono(8-ethoxycarbonyl-2,2,6,6-tetramethylbenzo[1,2-d:4,5-d']-bis(1,3)dioxol-4-yl)- methyl (7,48 g, 6,4 mmol) wurde gelöst in einer Mischung aus wäßrigem 1 M NaOH (80 ml) und Ethanol (80 ml). Die Lösung wurde bei Umgebungstemperatur 15 Minuten lang gerührt, der Ethanol wurde durch Verdampfen entfernt, und der Rückstand wurde 1 weitere Stunde lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Nach Verdampfen fast bis zur Trockenheit wurde die reine Säure mittels präparativer HPLC, gefolgt von Lyophilisieren, isoliert. Die Säure wurde in das entsprechende Natriumsalz umgewandelt durch die Zugabe von Wasser (50 ml), gefolgt von Einstellen des pH-Wertes auf 7 mit wäßrigem 1 M NaOH und Lyophilisierung. Ausbeute: 3,96 g (55%).
ESR (1 mM in H&sub2;O, 200 G): Singulett, Linienbreite 60 mG.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der Sauerstoffkonzentration in einer Probe, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: Einbringen in die Probe einer wirksamen Menge eines physiologisch tolerierbaren freien Radikals mit einem ESR-Übergang mit einer Linienbreite von bis zu 50 uT (500 mG); Bestrahlen der Probe mit Strahlung einer Amplitude und Frequenz, die so gewählt sind, um einen Elektronenspinresonanz-Übergang des Radikals zu stimulieren; Detektieren elektronenspinresonanz-verstärkter magnetischer. Resonanzsignale aus der Probe unter mindestens ersten, zweiten und dritten Bedingungen, wobei unter den ersten und zweiten Bedingungen die Strahlung eine erste Frequenz aufweist, unter den dritten Bedingungen die Strahlung eine von der ersten Frequenz verschiedene, zweite Frequenz aufweist, unter den ersten, zweiten und dritten Bedingungen die Strahlung eine erste, zweite und dritte Amplitude aufweist, wobei die erste und zweite Amplitude zumindest voneinander verschieden sind; und Manipulieren der detektierten Signale, um hierdurch die Sauerstoffkonzentration in der Probe zu bestimmen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Manipulierens der detektierten Signale das Erzeugen eines Bilddatensatzes umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, umfassend

(a) Erzeugen eines ersten OMRI-Bildes der Probe bei einer VHF-Leistung PA, Bestrahlungszeit TVHF1 und An-Resonanz (ΔH = 0),

(b) Erzeugen eines zweiten OMRI-Bildes der Probe bei einer zweiten VHF-Leistung PB, Bestrahlungszeit TVHF1 und An-Resonanz (ΔH = 0),

(c) Erzeugen eines dritten OMRI-Bildes der Probe bei einer VHF-Leistung PC, Bestrahlungszeit TVHF1 und Aus-Resonanz (ΔH ≠ 0),

(d) Manipulieren der in den Schritten (a) bis (c) erhaltenen Bilder und Kalibrieren unter Verwendung von ex vivo bestimmten Parametern, um ein Sauerstoffbild der Probe vorzusehen.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei zusätzlich ein viertes Bild bei VHF-Leistung PA und Bestrahlungszeit TVHF2 erzeugt wird und ein fünftes MR-Bild ohne VHF-Bestrahlung erzeugt wird.

5. Verfahren nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, umfassend den zusätzlichen Schritt der Erzeugung eines nativen MR-Bildes der Probe.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Manipulierens der detektierten Signale das Anpassen des gemessenen Sättigungsgrades des ESR-Übergangs an eine Voigtian-Funktion umfaßt.

7. Verfahren nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, wobei das physiologisch tolerierbare freie Radikal ein Radikal ist, das sich im extrazellulären Fluid verteilt.

8. Verfahren nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, wobei das physiologisch tolerierbare freie Radikal einen ESR-Übergang mit einer Linienbreite von weniger als 15 uT (150 mG) aufweist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Radikal einen ESR-Übergang mit einer Linienbreite von weniger als 6 uT (60 mG) aufweist.

10. Verfahren nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, wobei das physiologisch tolerierbare freie Radikal ein Trityl ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Trityl der Formel entspricht:

(worin:

n 0, 1, 2 oder 3 ist;

R&sub1; eine Carboxylgruppe oder ein Derivat hiervon ist;

R&sub2; Wasserstoff oder eine wahlweise hydroxylierte oder alkoxylierte C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylgruppe ist, wobei die Alkoxygruppe selbst hydroxyliert sein kann)

oder deuterierte Analog oder die Salze hiervon.

12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Trityl der Formel entspricht: