JP2009521405A - 分子コンジュゲート - Google Patents
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Abstract
Description
ヒドラジドチオール・リンカーを含む分子コンジュゲートが開示される。1つの態様では、抗体のFc部分に共有結合されたヒドラジドチオール・リンカーを含む抗体−検出可能な標識コンジュゲートが提供される。この態様のFc特異的コンジュゲートは改良された検出感度を提供し、それによって、標的分子の免疫組織化学的検出を、自動化および大量迅速処理用途に一層適合させる。
図1は、開示されたFc特異的抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートおよびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを用いる扁桃組織におけるKappaの検出のための染色パターンを示す一連の画像である。
図2は、開示されたFc特異的抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートおよびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを用いる扁桃組織におけるLambdaの検出のための染色パターンを示す一連の画像である。
図3は、開示されたFc特異的抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートおよびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを用いる肺組織におけるCMVの検出のための染色パターンを示す一連の画像である。
図4は、開示されたFc特異的抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートおよびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを用いる脾臓組織におけるEBERの検出のための染色パターンを示す一連の画像である。
図5は、開示されたFc特異的抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートおよびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを用いるCaSki異種移植組織におけるHPVの検出のための染色パターンを示す一連の画像である。
図6は、開示されたFc特異的抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートおよびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを用いるHeLa異種移植組織におけるHPVの検出のための染色パターンを示す一連の画像である。
図7は、開示されたFc特異的抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートおよびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを用いるSiHa異種移植組織におけるHPVの検出のための染色パターンを示す一連の画像である。
図8は、開示されたFc特異的抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートおよびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを用いる細胞学的サンプルにおけるHPVの検出のための染色パターンを示す一連の画像である。
図9は、開示されたFc特異的抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートおよびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを用いる筋肉組織におけるアクチンの検出のための染色パターンを示す一連の画像である。
図10は、開示された抗体−酵素コンジュゲートの感度の相互の比較、および開示された抗体−酵素コンジュゲートの感度と他の方法によって作成された抗体−体(body)酵素コンジュゲートの感度との比較を示す一連の画像である。
本発明のさらなる態様は、次の限定されるものではない記述および実施例によって具体的に説明され、これらは以下の略語および用語に関して進行する。
Ab − 抗体
(Ab−AP) − 抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲート
AP − アルカリホスファターゼ
BSA − ウシ血清アルブミン
CMV − サイトメガロウイルス
EBER − Epstein−Barrウイルス初期RNA
DL − 検出可能な標識
Fc − 結晶化可能なフラグメント
HRP − セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ
IHC − 免疫組織化学
ISH − インサイチュー・ハイブリダイゼーション
MAL − マレイミド
MBCH − メルカプト酪酸カルボヒドラジド
MBH − メルカプト酪酸ヒドラジド
NHS − N−ヒドロキシ−スクシンイミド
PEG − ポリエチレングリコール
SBM − 特異的結合分子
用語「a」、「an」および「the」は、文章が明白に他に指示しない限り、単数および複数の両指示語を含む。
当業者は、開示された方法が、ヒドラジドチオール・リンカーと反応することができる官能基を有する分子のすべての組み合わせ物を結合するために使用できることを認識できる。次に示す限定されるものではない記述は、抗体コンジュゲート、より具体的には抗体−酵素コンジュゲートに焦点を合わせるが、本発明の範囲を限定するものと考えるべきではない。具体的に開示されるコンジュゲートは抗体−酵素コンジュゲートであるけれども、他の生物分子(例えば核酸配列)と他の検出可能な標識(例えば、ハプテン、蛍光標識、蛍光ナノ粒子および蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質)との間のコンジュゲートも意図されており、そして本発明の範囲内に入る。
A.ヒドラジドチオール・リンカーの作成
いかなるヒドラジドチオール・リンカーも、コンジュゲートを作成する開示された方法において使用されてもよいが、1つの実施態様では、ヒドラジドチオール・リンカーは、下記スキーム1にしたがって、チオールラクトンと、ヒドラジン、カルボヒドラジドまたはジヒドラジドとを反応させることによって提供されてもよい。式中、n=1、2または3、R1は、H、−CONHNH2または−CO−A−CONHNH2であり、ここで、Aは、1〜100個の炭素原子を有する二価の基であり、これは、1個以上のヘテロ原子(例えば、O,NまたはS)によって中断されていてもよく、そして例えば、1個以上のアルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、アシル、カルボキシ、ハロゲン、スルホネート、オキソ、ホスホネートおよび/またはアミン基により置換されていてもよい。より特定の実施態様では、Aは、1〜10個のメチレン基(−CH2−)および/または1〜24個のエチレンオキシド(−CH−CH2−O−)基からなる二価の基である。なおより特定の実施態様では、Aは、1〜6個のメチレン基または4〜12個のエチレンオキシド基からなる二価の基である。
1つの実施態様では、ヒドラジドチオール・リンカーを含むコンジュゲートは、抗体および検出可能な標識のコンジュゲートを含む。特定の実施態様では、コンジュゲートは、抗体および検出可能な標識のFc特異的コンジュゲートを含む。より特定の実施態様では、コンジュゲートは、抗体および酵素、例えばアルカリホスファターゼのFc特異的コンジュゲートを含む。スキーム6は、Fc特異的様式においてヒドラジドチオール・リンカーを抗体に付加する方法を具体的に説明している。
作業実施態様の次の限定されるものではない例は、本発明のある種の態様をさらに具体的に説明するために提供される。
特定の作業実施態様では、ヒドラジドチオール・リンカーは、スキーム8にしたがってγ−ブチロチオラクトンから製造された。
その他の特定の作業実施態様では、カルボヒドラジドチオール・リンカーは、スキーム9にしたがってγ−ブチロチオラクトンから製造された。
なおその他の特定の作業実施態様では、PEGに基づくヒドラジドチオール・リンカーは、スキーム10にしたがって製造されて、メルカプト−dPEGヒドラジドを提供した。
Fc特異的チオール化免疫グロブリンをスキーム11にしたがって製造した。
この実施例では、例4の操作にしたがってMBHを用いて製造されたAb−APコンジュゲートの性能を、その検出感度についてインサイチューハイブリダイゼーション(ISH)アッセイにおいて評価した。利用される操作は、BenchMarkTM自動スライド染色装置(Ventana Medical Systems,Inc.,Tucson,AZ)において利用できる標準ISHプロトコールから適合された。自動染色プロトコールは次のとおりであった。
例5において記述された自動染色方法(使用されたフルオレセイン標識核酸プローブは、Lambda;INFORMTMLambda,Ventana Medical Systems,Inc.,Tucson,AZ、に特異的であり;そしてISH Protease 1は4分間インキュベートされたことを除いて)を、扁桃組織におけるLambdaの検出についてAb−APコンジュゲートの性能を評価するために使用した。Ab−APコンジュゲートを2次抗体増幅段階なしに使用し、そして例4に記述されたようにMBHを使用して作成した。比較のためには、参照スライドを例4に記述されたSA−APコンジュゲート検出スキームを使用して作成した。
例5において記述された自動染色方法(使用されたフルオレセイン標識核酸プローブは、CMV;INFORMTMCMV,Ventana Medical Systems,Inc.,Tucson,AZ、に特異的であり;そしてISH Protease 1は4分間インキュベートされたことを除いて)を、肺組織におけるCMVの検出についてAb−APコンジュゲートの性能を評価するために使用した。Ab−APコンジュゲートを2次抗体増幅段階なしに使用し、そして例4に記述されたようにMBHを使用して作成した。比較のためには、参照スライドを例4に記述されたSA−APコンジュゲート検出スキームを使用して作成した。
例5において記述された自動染色方法(使用されたフルオレセイン標識核酸プローブは、EBER;INFORMTMEBER,Ventana Medical Systems,Inc.,Tucson,AZ、に特異的であり;そしてISH Protease 1は4分間インキュベートされたことを除いて)を、脾臓組織におけるEBERの検出についてAb−APコンジュゲートの性能を評価するために使用した。Ab−APコンジュゲートを2次抗体増幅段階なしに使用し、そして例4に記述されたようにMBHを使用して作成した。比較のためには、参照スライドを例4に記述されたSA−APコンジュゲート検出スキームを使用して作成した。
この実施例では、例4の操作にしたがってMBHを用いて製造されたAb−APコンジュゲートの性能を、それが、ISHによるHPV配列の検出のために必要な段階の数において、さらなる減少を可能にするような十分な感度を提供するか否かを決定するために、一部評価した。結果は、検出のために必要な段階の数における減少を達成することが可能であり、それによって、段階の数における減少が、処理時間と同時にアッセイコストにおける有意な減少をもたらす自動工程のために、開示されたAb−APコンジュゲートを非常に有用なものにさせることを示す。
液体に基づくprepHPVアッセイのためのスライドを、ThinPrepTM2000 Systemスライド作成システム(Cytyc Corporation,Marlborough,MA)を使用して作成した。膣擦過により得られた細胞をメタノールに基づく緩衝化保存溶液(ThinPrepTMPreservCyt Solution,Cytyc Corporation,Marlborough,MA)内に入れ、次いで、この機器によってガラススライド上に塗布した。
この実施例では、MBHリンカーを用いて例4における記述のように作成されたAb−APコンジュゲートを使用するタンパク質標的(アクチン)の免疫組織化学的検出が、SA−APコンジュゲートの性能と比較された。
この実施例では、コンジュゲート組成物および染色特性に及ぼすリンカーの長さおよび型の影響が決定された。例4の方法にしたがったが、種々のヒドラジドチオール・リンカーを使用して数種のコンジュゲートを作成した、具体的には、チオ−PEG4−ヒドラジドリンカー、メルカプト酪酸ヒドラジド(MBH)リンカーおよびメルカプト酪酸カルボヒドラジド(MBCH)リンカーを使用してコンジュゲートを作成した。これらのコンジュゲートは、互いに比較され、そして免疫グロブリンジスルフィドの還元によるチオールの生成をとおして作成されたコンジュゲート、具体的には、DTT還元によるチオールの生成と、それに続くPEGに基づくマレイミド−NHS二官能性リンカーを用いる複合を伴う、同時係属米国暫定特許出願第60/675759号に記述された方法によって作成されたAb−APコンジュゲートと比較された。また、比較のためには、市販されるアセトアミドメルカプト酪酸ヒドラジド(AMBH,Invitrogen,Eugene,OR)リンカーを例4の方法において使用して、Ab−APコンジュゲートを生成した。さらに、マレイミド−ヒドラジド(EMCH;N[ −マレイミド酪酸]ヒドラジド、Pierce Biotechnology,Rockford,IL)により製造者の指示を使用して作成したAb−APコンジュゲートを作成し、比較のための染色プロトコールにおいて使用した。さらにまた、シスタミンを用いる米国特許第5,191,066号に記述されたFc特異的複合方法を使用して、比較のためのFc特異的Ab−APコンジュゲートを提供した。
EMCH<Cystamine<AMBH<MBCH<PEG4=DTT<MBH
画像は、開示された方法および種々の開示されたリンカーおよび市販のヒドラジドチオール・リンカーを用いて、酵素のFc特異的複合によって得ることができる優れた感度を具体的に説明している。また開示された方法は、シスタミンFc特異的方法およびEMCHとのカップリングより優れているコンジュゲートを生成する。DTT媒介の複合方法のみが、類似の特異性および感度を与えるコンジュゲートを提供する。
この実施例では、過剰量のヒドラジドチオール・リンカーに対するコンジュゲート組成物および染色特性の依存性が決定された。AP−IgGコンジュゲートのMBHリンカーによる合成を、例4の操作にしたがって実施したが、MBHリンカーのモル過剰量を、5000倍過剰量から50倍過剰量まで変化させた。Eiiman’sアッセイからの結果は、次に示す数のチオール/Abを示した:5000x − 9〜15;1000x − 7〜10;500x − 3〜5;100x − 2〜4;50x − 1〜3。マレイミド誘導化Abとの反応後のコンジュゲート(5000x,1000x,500x,100x,および50x)の分析を、サイズ排除クロマトグラフィーによって実施し、そして、より多い過剰量のリンカーを使用して合成したコンジュゲートが、より高い総収量を有することを示した。しかしながら、これらのコンジュゲートの各々についての組織染色(抗マウス−筋肉、筋肉アクチン;抗ウサギ−皮膚、S100)は、500xが、最低のバックグラウンド量をもつ最高の強い染色を有することを示した。
この実施例では、アルカリホスファターゼにチオール反応性基を付加するために使用されるリンカーの長さと型に対するコンジュゲート組成物および染色特性の依存性が決定された。MBHリンカーによるAP−IgGコンジュゲートの合成は、例4の方法にしたがって実施されたが、次のリンカーが、チオール化抗体との反応のためにアルカリホスファターゼを活性化するために使用された:LC−SMCC(Pierce,Rockford,IL),MAL−dPEG8−NHSエステル(Quanta Biodesign,Powell,OH)、MAL−dPEG4−NHSエステル(Quanta Biodesign,Powell,OH)およびMAL−dPEG12−NHSエステル(Quanta Biodesign,Powell,OH)。これらのリンカーの各々を、バッファー系(0.1Mリン酸ナトリウム、0.1MNaCl、1mMMgCl2、0.1mMZnCl2、pH=7.5)中で1時間、100倍過剰量におけるAPと反応させた。LC−SMCCをジメチルホルムアミド(DMF)に溶解し、そしてAPに添加する必要があったが、バッファ中DMFの10%総容量を超えてはならない。Ellman’sアッセイは、PEG12およびLC−SMCCリンカーでは20/AP、PEG8リンカーでは27/AP、そしてPEG4リンカーでは30/APのマレイミド組み入れを示した。Fcチオール化抗体(MBHにより作成された)へのカップリング後、サイズ排除クロマトグラムを精製により得た。PEG12リンカーが最高のコンジュゲート収量を提供し、続いてPEG8、LC−SMCCおよびPEG4リンカーであった。組織染色(抗マウス−筋肉、筋肉アクチン;抗ウサギ−皮膚、S100)は、最高の強い染色を与えるPEG12コンジュゲートによるコンジュゲート収量を反映させた。
この実施例では、アルカリホスファターゼへのチオール反応性基の付加のために使用される過剰量のNHS−PEG12−MALリンカーに対するコンジュゲート組成物および染色特性の依存性が決定された。例4の方法にしたがうAP−IgGコンジュゲートの合成を実施したが、この場合、MAL−dPEG12−NHSエステル・リンカーのモル過剰量を、500倍過剰量から25倍過剰量まで変化させた。
この実施例では、最終反応におけるマレイミド誘導化AP(NHS−PEG12−MALリンカー)に対するチオール化抗体(MBH−リンカーによって作成された)の比率におけるコンジュゲート組成物および染色特性の依存性が決定された。次の比率(抗体/AP)を使用した:2:1、1:1、1:2および1:3。サイズ排除クロマトグラフィーのプロフィルは、最高収量がモル比2AP:1Abである場合に得られることを示した。しかしながら、コンジュゲートの組織染色(抗マウス−筋肉、筋肉アクチン;抗ウサギ−皮膚、S100)は、最良のシグナル対ノイズ比が1:1コンジュゲートにより見られることを例証した。
アルカリホスファターゼは二量体タンパク質であり、そしてその安定性は、二量体の解離を防ぐのを助けるよう酵素を架橋することによって増大することができる。アルカリホスファターゼは次の操作を用いて架橋された。アルカリホスファターゼ(Biozyme,SanDiego,CA;17.5mg,0.125μmol)は、それが受領されたバッファーと異なるバッファー(0.1Mリン酸ナトリウム、0.1M塩化ナトリウム、1.0mM塩化マグネシウム、0.1mM塩化亜鉛、pH=7.5)に交換し、そしてシアノホウ水素化ナトリウム(1.6mg,25μmol)の存在下で、再構成され予め酸化されたアルデヒド活性化デキストラン(平均分子量40,000;Pierce,Rockford,IL;5mg,0.125μmol)に添加した。次いで、反応混合液を室温で1時間撹拌した。過剰量のアルデヒドをエタノールアミン(151μl,2.5mmol)によって不活性化し、続いてさらなるシアノホウ水素化ナトリウム(157.1mg,2.5mmol)を添加した。反応混合液をさらに1時間撹拌した。架橋されたAPを、Superdex 200GL 10/300カラム(GE Biosciences,Uppsala,Sweden)を備えたAKTA Purufier LC(GE Biosciences,Uppsala,Sweden)を使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって単離した。流速は1ml/minであり、そして水性移動相は0.1Mリン酸ナトリウム、0.1M塩化ナトリウム、1.0mM塩化マグネシウム、0.1mM塩化亜鉛、pH=7.5であった。反応後に残っているアミン数を、フルオルアルデヒド・アッセイ(Protein Assay Technical Handbook,Pierce Biotechnology,Rockford,IL)を使用して定量し、そして平均8〜12アミンが架橋後に残っていた。架橋APをMAL−dPEG12−NHSエステル(残留アミンと反応した)に結合させ、そして例4に記述されたようにFcチオール化抗体に複合して、架橋AP酵素を含むコンジュゲートを生成した。安定性研究では、架橋が、アビジン含有希釈液(Ventana Medical Systems,Inc.,Tucson,AZ;P/N95130)においてコンジュゲートの安定性を改善したことを示した。具体的には、45℃で、架橋APを有するコンジュゲートについての3日目における染色強度の総損失は50%であったが、これに対して、同じ希釈液中、その温度では、無架橋のAPにより作成されたコンジュゲートは1日目にその染色強度の95%を失った。
この実施例では、例4の複合方法のFc特異性が、変性条件下でポリアクリルアミドゲル電気泳動によって例証される。コンジュゲートの6種の異なる調製物、抗マウスIgG抗体を用いて作成された3種および抗ウサギIgG抗体を用いて作成された3種が分析された。簡単に言えば、各コンジュゲートの100〜200ng/μl溶液の5〜20μlを、4X LDSゲル装填バッファー(Invitrogen,Carlsbad,CA)と混合し、そして2−メルカプトエタノールを1mMの最終濃度まで添加した。サンプル混合液を48〜50℃において5分間適度に加熱した。この温度は、酵素と抗体間の共有結合の解離を最小化するように選ばれたが、2−メルカプトエタノールによるコンジュゲートの抗体部分の軽鎖と重鎖を解離することはなお可能であった。次いで、各サンプルを冷却し、そしてポリアクリルアミドゲル(Invitrogen,Carlsbad,CA製、1.0mmの厚さの、予め形成されたNuPAGETM4〜20%ポリアクリルアミドBis Trisゲル、またはNuPAGETM3〜8%ポリアクリルアミドTrisアセテートゲルのいずれか)の異なるウェルに添加した。使用した分子量標準品は、予備染色されたMulimarkTMおよびMark12 wide rangeTM標準品であり、両方ともInvitrogen(Carlsbad,CA)から購入した。電気泳動を、Novex XCell IIカセットシステム(Invitrogen,Carsbad,CA)を使用して室温で60〜90分間70mAにおいて実施した。展開バッファーは、それぞれ3〜8%および4〜20%ゲルについてMES−SDSまたはTrisアセテート−SDSバッファーであった。ゲルをカセットから取り出し、そしてSDSおよびバッファーを除去するために脱イオン水中で5分間、2回洗浄した。次いで、SDS−PAGEゲルをエタノール/水/酢酸[40:50:10(v:v:v)]中で1時間室温で固定し、そしてメタノール/水/酢酸[50:40:10(v:v:v),Sigma−Aldrich,St.Louis,MO]中に溶解したCoomassie Blue R−250により染色した。ゲルを最小2時間〜最大一夜、室温で弱く振盪して染色した。脱染色を染色と同じ様式で実施した。脱染色溶液は染色溶液マイナス染料と同一であった。ゲルをInvitrogenゲル乾燥キット(Invitrogen,Carsbad,CA)を使用して乾燥した。ゲルの分析により、コンジュゲートの各々について抗体の軽鎖に対応する分子量におけるバンドの存在が示された。また、各コンジュゲートでは、重鎖およびアルカリホスファターゼの分子量に対応するバンドは実質的に不在であった。その代わりに、より高い分子量における一連のバンドは、アルカリホスファターゼが各コンジュゲートのIgGの重鎖に選択的に結合していたことを示した。免疫グロブリンの重鎖はFc部を含むので、この結果は複合のFc部位特異的性質を示した。
この実施例では、PEGに基づくヒドラジドチオール・リンカーを含むFc特異的抗体コンジュゲートの作成が記述される。チオール反応性マレイミド基を次のようにセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼに付加した。4mlアンバーバイアルに、MAL−dPEG4 TMNHSエステル(Quanta Biodesign,Powell,OH)の7.8mg(15.2μmol,100eq.)と、続いてセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ(HRP;Pierce Biotechnology,Rockford,IL;0.25ml,0.1MNa3PO4,0.15MNaCl,pH=7.5中25mg/ml)とを添加した。バイアルを周囲温度で1時間暗所で撹拌し、その後、バッファー水溶液(0.1MNa3PO4,0.15MNaCl,pH=7.5)を用いてSuperdex 200カラム(GE Biosciences,Uppsala,Sweden)を備えたAkta Purufierを使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。HRP含有フラクションを貯えてHRP−PEG4−マレイミドの溶液を得た。HRP濃度を、溶液のA280(ε280=0.652mlcm−1mg−1)から決定し、そしてマレイミド数を改変Ellman’sアッセイにより定量して、酵素当たり6〜8マレイミドであった。
若干の実施態様では、開示された方法において使用できる多官能性ヒドラジドチオール・リンカーは、前記スキーム4a,4b,4cおよび4dにしたがってアミノ酸およびアミノ酸類似体から作成される。この実施例では、特定のリンカーへの合成経路が次に示すスキームにおいて概説される。特定のスキーム17a,17b,17cおよび17dの各々では、アミノ酸またはアミノ酸類似体(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)を、最初に、トリエチルアミン(TEA)の存在下でN−スクシンイミジルS−アセチルチオアセテート(SATA;Pierce Biotechnology,Rockford,IL)と反応させる。スキーム17aでは、この最初の反応の生成物をヒドラジンと反応させて、1個のヒドラジド基と2個のチオール基を有する多官能性ヒドラジドチオール・リンカーを得る。スキーム17bでは、DCCとのカルボジイミド媒介カップリングを使用して、第1の反応の生成物のカルボン酸官能基をもつNHSエステルを形成させ、続いてヒドラジンと反応させて、1個のヒドラジド基と2個のチオール基を有するその他の多官能性ヒドラジドチオール・リンカーを得る。17bにおけると同様に、17cでは、第1の反応の生成物を使用してNHSエステルを形成させ、続いてヒドラジンと反応させて、2個のヒドラジド基と1個のチオール基を有する多官能性ヒドラジドチオール・リンカーを得る。スキーム17dでは、ヒドラジンとの反応によって、1個のヒドラジド基、1個のチオール基および1個のヒドロキシル基を有するその他の多官能性ヒドラジドチオール・リンカーを得る。
若干の実施態様では、開示された方法において使用できる多官能性のPEGに基づくヒドラジドチオール・リンカーが、前記スキーム5a,5bおよび5cにしたがって作成される。この実施例では、特定のリンカーへの合成経路が次のスキーム18a,18bおよび18cにおいて概説される。また、反応についての特定のプロトコールが提示される。別に記述されない限り、試薬および溶媒は慣用のものであり、例えば、Sigma−Aldrich(St.Louis,MO)から得ることができる。
この実施例では、重合多価ヒドラジドチオール・リンカーが提供され、このリンカーは下記スキーム19にしたがって作成することができる。
Claims (30)
- ヒドラジドチオール・リンカーをヒドラジド反応性基を有する第1の分子と反応させて、チオール化された第1の分子を形成する工程であって、かつ、ヒドラジドチオール・リンカーと第1の分子との反応、ヒドラジドチオール・リンカーのチオール基が、実質的に、その中性酸形態において存在する条件下で反応させることを含む、工程;および
チオール化された第1の分子を第2の分子、チオール反応性基を有する第2の分子と反応させて、コンジュゲートを形成する工程:
を含んでなる、2種以上の分子のコンジュゲートを形成する方法。 - 第1の分子が特異的結合分子を含み、そして第2の分子が検出可能な標識を含む、請求項1の方法。
- ヒドラジドチオール・リンカー化合物のチオール基が、実質的に、その中性酸形態において存在する条件下での反応が、約7未満のpHにおける反応を含む、請求項1の方法。
- ヒドラジドチオール・リンカー化合物のチオール基が、実質的に、その中性酸形態において存在する条件下での反応が、約pH=3〜約pH=7における反応を含む、請求項1の方法。
- ヒドラジドチオール・リンカー化合物のチオール基が、実質的に、その中性酸形態において存在する条件下での反応が、約pH=4〜約pH=6における反応を含む、請求項1の方法。
- 第1の分子のヒドラジド反応性基がアルデヒド基を含む、請求項1の方法。
- 第1の分子がグリコシル化された分子を含み、そしてアルデヒド基が、第1の分子のグリコシル化部分の酸化によって第1の分子に導入される、請求項6の方法。
- グリコシル化された分子が抗体を含み、そしてアルデヒド基が抗体のFc部に導入される、請求項7の方法。
- 第2の分子のチオール反応性基が第2の分子に導入されたマレイミド基を含む、請求項1の方法。
- 第2の分子に導入されたマレイミド基が、NHS−PEG−マレイミド・リンカーを使用して導入される、請求項9の方法。
- 第2の分子が検出可能な標識を含む、請求項9の方法。
- ヒドラジドチオール・リンカー化合物が、1種以上のMBH、MBCH、MAMBH、THMBH、BTAL、BTHL、TAGD、THGD、PEGに基づくヒドラジドチオール・リンカー、多官能性ヒドラジドチオール・リンカー、PEGに基づく多官能性ヒドラジドチオール・リンカーおよびポリアクリルアミドヒドラジド・リンカーである、請求項1の方法。
- ヒドラジドチオール・リンカー化合物が、1種以上のMBH、MBCHまたはメルカプト−dPEG−ヒドラジド・リンカーである、請求項12の方法。
- 請求項1の方法にしたがって製造されるコンジュゲート。
- ヒドラジドチオール・リンカーが、1種以上のMBH、MBCH、MAMBH、THMBH、BTAL、BTHL、TAGD、THGD、PEGに基づくヒドラジドチオール・リンカー、多官能性ヒドラジドチオール・リンカー、PEGに基づく多官能性ヒドラジドチオール・リンカーおよびポリアクリルアミドヒドラジド・リンカーであり、リンカーのヒドラジド基が抗体のFc部に共有結合される、ヒドラジドチオール・リンカーを介して検出可能な標識に共有結合された抗体を含んでなるコンジュゲート。
- ヒドラジドチオール・リンカーが、PEGに基づくヒドラジドチオール・リンカーを含む、請求項17のコンジュゲート。
- PEGに基づくヒドラジドチオール・リンカーが、メルカプト−dPEG−ヒドラジド・リンカーを含む、請求項18のコンジュゲート。
- ヒドラジドチオール・リンカーが、MBHまたはMBCHを含む、請求項17のコンジュゲート。
- 検出可能な標識が、酵素、蛍光分子、ハプテンまたは蛍光ナノ粒子を含む、請求項17のコンジュゲート。
- 検出可能な標識が酵素を含む、請求項21のコンジュゲート。
- 検出可能な標識が、アルカリホスファターゼおよびセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼからなる群から選ばれる酵素を含む、請求項22のコンジュゲート。
- 検出可能な標識がアルカリホスファターゼを含む、請求項23のコンジュゲート。
- アルカリホスファターゼが、架橋されたアルカリホスファターゼを含む、請求項24のコンジュゲート。
- 抗体が抗ハプテン抗体を含む、請求項17のコンジュゲート。
- 抗体が抗抗体抗体を含む、請求項17のコンジュゲート。
- 式:
H2N−NH−CO−(CH2−CH2−O)t−CH2−CH2−SH
[式中、t=2〜50]
を有するヒドラジドチオール・リンカー;および
請求項1の方法を実施するための説明書;
を含んでなるキット。
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