CN106132435B - 筛选通过促进rip3表达增强抗癌药物的敏感性的抗癌辅剂的方法和试剂盒 - Google Patents

筛选通过促进rip3表达增强抗癌药物的敏感性的抗癌辅剂的方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗癌辅剂药物组合物，其含有受体相互作用蛋白激酶‑3(RIP3)蛋白表达促进剂或激活剂作为活性成分。本发明还提供用于增强癌细胞死亡的方法，所述方法包括向癌细胞施用联合的RIP3蛋白表达促进剂或激活剂与抗癌药物。此外，本发明涉及：用于筛选通过促进RIP3表达增强抗癌药物敏感性的抗癌辅剂的方法；和通过RIP3是否表达监测抗癌药物敏感性的方法。因此，预期在缺乏RIP3表达的患者中用去甲基化剂预处理诱导RIP3表达然后使用常规化疗剂可以是有效的治疗策略。此外，预期在癌症治疗中监测抗癌药物敏感性和筛选增强抗癌药物敏感性的抗癌辅剂可以是有效的策略。

Description

筛选通过促进RIP3表达增强抗癌药物的敏感性的抗癌辅剂的 方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及含有RIP3表达诱导剂作为活性成分的用于抗癌辅剂的组合物和与抗癌药物联合施用所述组合物的方法。此外，本发明涉及筛选通过促进RIP3表达增强抗癌药物敏感性的抗癌辅剂的方法和基于RIP3表达监测对抗癌药物的敏感性的方法。此外，本发明提供用于诊断抗癌药物敏感性的生物标志物组合物，其含有RIP3基因或从所述基因表达的蛋白，并且提供用于提供诊断抗癌药物敏感性的预后所需的信息的方法。
背景技术
受体相互作用蛋白激酶-3(RIP3或RIPK3)是细胞死亡中重要的蛋白，并且在死亡受体诱导的细胞死亡或其他细胞应激诱导的细胞死亡中发挥其作用。已知这些细胞死亡信号通过与具有磷酸化-或脱乙酰化-依赖性 RIP1和混合的谱系激酶(lineage kinase)结构域样蛋白(MLKL)的复合体结合来诱导，并且存在于线粒体中的任何蛋白参与该信号。该信号传导系统的调节机制由细胞死亡调节蛋白诱导以调节淋巴细胞、角质形成细胞和小肠上皮细胞的发育、以及细胞死亡和免疫应答。此外，调节的坏死在退化、免疫和很多病因学过程如传染病和缺血损伤中发挥其作用。
公开内容
技术问题
本发明的一个目的是提供含有受体相互作用蛋白激酶-3(RIP3)蛋白表达诱导剂或激活剂作为活性成分的用于抗癌辅剂的药物组合物，和增强癌细胞死亡的方法，所述方法包括与抗癌药物联合施用用于抗癌辅剂的药物组合物。
本发明的另一个目的是提供筛选通过促进RIP3(受体相互作用蛋白激酶-3)表达增强对抗癌药物敏感性的抗癌辅剂的方法，和基于RIP3表达监测抗癌药物敏感性的方法。
本发明的另一个目的是提供用于诊断抗癌药物敏感性的生物标志物组合物，其含有RIP3基因或从所述基因表达的蛋白。
本发明的另一个目的是提供用于诊断抗癌药物敏感性的试剂盒，其包含用于扩增RIP3基因的引物或特异结合从所述基因表达的蛋白的抗体或适体，以及能够预测和诊断组织中的癌症的试剂盒。
本发明的另一个目的是提供用于提供诊断抗癌药物敏感性和抗癌药物反应的预后所需的信息的方法。所述方法包括测量来自癌症患者样品的 RIP3的表达水平。
技术方案
为了完成上述目的，本发明提供含有受体相互作用蛋白激酶-3(RIP3) 蛋白表达诱导剂或激活剂作为活性成分的用于抗癌辅剂的药物组合物.
本发明还提供用于增强癌细胞死亡的方法，其包括将受体相互作用蛋白激酶-3(RIP3)蛋白表达诱导剂或激活剂与抗癌药物联合施用于癌细胞。
本发明还提供筛选抗癌辅剂的方法，其包括：使测试物质与癌细胞接触；测量与测试物质接触的癌细胞中RIP3(受体相互作用蛋白激酶-3)蛋白的表达或活性水平；并且选择与对照样品相比显示RIP3蛋白的表达或活性水平增加的测试物质。
本发明还提供监测抗癌药物敏感性的方法，其包括：测量癌细胞中 RIP3蛋白的表达或活性水平；测量正常组织细胞中RIP3蛋白的表达或活性水平；和如果测量的癌细胞中RIP3蛋白的表达或活性水平低于测量的正常组织细胞中RIP3蛋白的表达或活性水平，确定所述癌细胞具有抗癌药物耐药性。
本发明还提供增强抗癌药物敏感性的方法，其包括：用RIP3蛋白表达诱导剂或激活剂处理癌细胞；测量处理的癌细胞中RIP3蛋白的表达或活性水平；并且，如果处理后RIP3蛋白的表达或活性水平比处理前的对照样品高50-100％，确定抗癌药物敏感性增强。
本发明还提供用于诊断抗癌药物敏感性的生物标志物组合物，其包含RIP3基因或从所述基因表达的蛋白。生物标志物组合物还可以用于预测和诊断组织中的癌症。
本发明还提供用于诊断抗癌药物敏感性的试剂盒，其包含用于扩增 RIP3基因的引物或特异结合从所述基因表达的蛋白的抗体或适体。试剂盒的用途可以提供预测和诊断组织中的癌症所需的信息。
本发明还提供用于提供诊断抗癌药物敏感性的预后所需的信息的方法，其包括：测量癌症患者样品中RIP3的表达水平；测量正常对照样品中RIP3 的表达水平；并且，如果测量的癌症患者样品中的RIP3蛋白表达水平低于测量的正常对照样品中的RIP3蛋白表达水平，确定癌症患者样品具有抗癌药物耐药性。
有益效果
本发明涉及含有RIP3表达诱导剂作为活性成分的用于抗癌辅剂的组合物和与抗癌药物联合施用所述组合物的方法。目前，在90％的在癌症治疗中有问题的三阴性(ER，PR，Her2阴性)患者中，发现低RIP3表达。与同一患者的正常组织相比，癌组织中RIP3表达的显著减少提示，在肿瘤的发育和生长期间，RIP3选择性减少。因此，在缺乏RIP3表达的患者的情形中，预期在用去甲基化剂预处理诱导RIP3表达后使用常规化疗剂可以是有效的治疗策略。此外，本发明涉及用于筛选通过促进RIP3表达增强抗癌药物敏感性的抗癌辅剂的方法和基于RIP3表达监测抗癌药物敏感性的方法。目前，在90％的在癌症治疗中有问题的三阴性(ER，PR，Her2 阴性)患者中，发现低RIP3表达，并且观察到，RIP3表达的调节影响抗癌细胞的抗癌药物耐药性。尤其是发现，当抑制RIP3表达时，癌细胞对抗癌药物具有耐药性，并因此抑制抗癌药物的活性，而当表达RIP3时，癌细胞的死亡依赖于抗癌药物的浓度增加。预期RIP3的表达或活性水平的分析可以是监测抗癌治疗中对抗癌药物敏感性和筛选增强抗癌药物敏感性的抗癌辅剂的有效策略。
附图描述
图1显示分析正常乳腺和乳腺癌细胞系中RIP3表达的结果。
图2显示去甲基化剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-AD)诱导的RIP3表达。
图3显示去甲基化剂5-氮杂胞苷(5-AZA)诱导的RIP3表达。
图4显示通过用去甲基化剂(5-AD)和抗癌药物联合治疗使癌细胞系对细胞死亡敏感。
图5显示通过用去甲基化剂(5-AD和5-AZA)和抗癌药物联合治疗使癌细胞系对细胞死亡敏感。
图6显示通过抑制RIP3表达抑制去甲基化剂(5-AD)-诱导的癌细胞系对细胞死亡的致敏作用。
图7显示典型正常乳腺组织和乳腺癌组织中RIP3的免疫染色图像。
图8和9显示典型正常乳腺组织和乳腺癌组织中RIP3免疫染色的H- 得分。
图10显示根据各种浓度的抗癌药物的RIP3-沉默的HT-29细胞的生存力。
图11显示根据各种浓度的抗癌药物的RIP3-沉默的T47D细胞的生存力。
图12是显示分析1,166名乳腺癌症患者的10年无转移性复发存活的结果的图表。
最佳方式
本发明人发现RIP3-依赖性细胞死亡可以影响化疗剂的细胞毒性。可能发现，很多癌细胞系中RIP3表达被抑制，并且该RIP3表达抑制不仅导致对死亡受体-诱导的细胞死亡的抗性，而且导致对化疗剂的耐药性，特别是对各种标准抗癌治疗剂如DNA损伤药物或紫杉烷的耐药性。可能发现， RIP3表达由本发明中使用的去甲基化剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-AD)恢复，并且对化疗剂的敏感性由去甲基化剂增加。从该结果，可以发现，在缺乏 RIP3表达的患者的情形中，在用去甲基化剂预处理诱导RIP3表达后使用常规化疗剂可以是有效的治疗策略。基于该研究结果，完成本发明。
此外，本发明人发现，RIP3表达的调节影响癌细胞系对抗癌药物的耐药性，并且特别是发现，当抑制RIP3表达时，癌细胞具有对抗癌药物的耐药性，并且因此抑制抗癌药物的活性，而当表达RIP3时，癌细胞死亡依赖于抗癌药物浓度增加，从而完成本发明。
本发明提供含有受体相互作用蛋白激酶-3(RIP3)蛋白表达诱导剂或激活剂作为活性成分的用于抗癌辅剂的药物组合物。
特别是，RIP3蛋白表达诱导剂或激活剂可以选自化合物、肽、肽模拟物、适体、抗体和天然物质，其特异结合RIP3基因的表达调节区域。特别是，所述组合物可以诱导RIP3蛋白的去甲基化。
优选地，所述癌症可以是乳腺癌症、宫颈癌、肝癌或结直肠癌，但不限于此。
优选地，RIP3蛋白可以是来自所有具有RIP3的真核生物的蛋白，所述真核生物包括哺乳动物，如人、牛、山羊、绵羊、猪、小鼠、兔等。例如，其可以是人RIP3(NCBI登记号NP_006862.2)。
如本文使用的，术语″肽模拟物″是指抑制RIP3蛋白的结合结构域诱导 RIP3活性的肽或非肽。
如本文使用的，术语″适体″是指具有稳定的3维结构并且可以以高亲和力和特异性结合靶标的单链核酸(DNA、RNA或修饰的核酸)。因为适体针对靶分子具有独特的高亲和力(一般是pM水平)和特异性，其与单克隆抗体相当，并且特别是，其用作替代性抗体的可能性高，以致适体常称为“化学抗体”。
用于本发明的″抗体″可以是通过RIP3注射产生的抗体或可商购的抗体。此外，抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体和能够结合表位的片段。多克隆抗体可以如下产生。将RIP3注射入动物；从所述动物采集血液样品；并且随后从血液分离含有抗体的血清。该多克隆抗体可以通过本领域技术人员已知的任意方法纯化，并且可以从任何动物宿主产生，包括山羊、兔、绵羊、猴、马、猪、牛、狗等。单克隆抗体可以使用任何通过连续培养细胞系提供抗体分子的生产的技术产生。该技术包括但不限于杂交瘤技术、人B-细胞系杂交瘤技术和EBV-杂交瘤技术。
作为活性成分，本发明的药物组合物可以含有化学物质、核苷酸、反义、siRNA、寡核苷酸和天然提取物。除了活性成分之外，本发明的药物组合物或联合制剂可以使用药学适用的和生理学可接受的辅剂制备。辅剂可以包括赋形剂、崩解剂、甜味剂、粘合剂、包衣剂、膨胀剂(expander)、润滑剂、助流剂、香味剂、增溶剂等。为了给药，除活性成分之外，本发明的药物组合物可以优选地使用至少一种药用载体配制。当组合物配制为液体溶液时，其可以含有至少一种选自以下各项的药用载体：盐水溶液、无菌水、林格溶液、缓冲盐水、可注射白蛋白溶液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇和其混合物。如果需要，可以加入其他常规添加剂，包括抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂等。此外，可以进一步加入稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂以制备可注射制剂(如水溶液、悬浮液或乳状液等)、丸剂、胶囊、颗粒剂或片剂。
本发明的药物组合物可以以活性化合物的颗粒、粉末、包衣片剂、片剂、胶囊、栓剂、糖浆、果汁、混悬剂、乳剂、滴剂、可注射液体或缓释制剂的形式配制。本发明的药物组合物可以根据常规方法通过静脉内、动脉内、腹内、肌肉内、胸骨内、经皮、鼻内、吸入、局部、直肠、口服、眼内或皮内途径施用。根据本发明的药物组合物的活性成分有效量意为预防或治疗疾病所需的量。因此，有效量可以根据各种因素确定，包括疾病的类型、疾病的严重度、活性成分和组合物中含有的其他成分的类型和含量、制剂的类型、患者的年龄、重量、一般健康状况、性别和膳食、施用时间、施用途径、组合物的分泌率、治疗期和同时使用的药物。对于成人，组合物可以每天施用一次或数次。当每天施用一次或数次时，施用剂量可以是对于化合物0.1ng/kg-10g/kg，对于多肽、蛋白或抗体0.1ng/kg-10g/kg，和对于反义核苷酸、siRNA、shRNAi或miRNA 0.01ng/kg-10g/kg，但本发明的范围不限于此。
本发明还提供增强癌细胞死亡的方法，其包括将受体相互作用蛋白激酶-3(RIP3)蛋白表达诱导剂或激活剂与抗癌药物联合施用于癌细胞。
特别是，所述方法可以包括：用受体相互作用蛋白激酶-3(RIP3)蛋白表达诱导剂或激活剂处理癌细胞；和将抗癌药物施用于经处理的癌细胞。
优选地，癌细胞可以是乳腺癌细胞、宫颈癌细胞、肝癌细胞或结直肠癌细胞，并且抗癌药物可以是多柔比星(doxorubicin)或依托泊苷 (etoposide)，但本发明的范围不限于此。
本发明还提供用于筛选抗癌辅剂的方法，其包括：使测试物质与癌细胞接触；测量与测试物质接触的癌细胞中RIP3(受体相互作用蛋白激酶-3) 蛋白的表达或活性水平；和选择与对照样品相比显示RIP3蛋白的表达或活性水平增加的测试物质。
优选地，RIP3蛋白的表达或活性水平可以通过选自由以下各项组成的组的任一项测量：反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)，酶联免疫吸附测定 (ELISA)，免疫组织化学，蛋白质印迹和流式细胞术(FACS)，但本发明的范围不限于此。
特别是，抗癌辅剂可以增强对抗癌药物的敏感性。更特别是，抗癌药物可以优选是多柔比星、依托泊苷或紫杉醇，但本发明的范围不限于此。
关于本文中的筛选方法使用的术语“测试物质”意为用于筛选以检测其是否影响基因的表达水平或其是否影响蛋白的表达或活性的未知候选物质。样品可以包括化学物质、核苷酸、反义-RNA、siRNA(小干扰RNA) 或天然提取物，但不限于此。
本发明还提供用于监测抗癌药物敏感性的方法，其包括：测量癌细胞中RIP3蛋白的表达或活性水平；测量的正常组织细胞中RIP3蛋白的表达或活性水平；和如果测量的癌细胞中RIP3蛋白的表达或活性水平低于测量的正常组织细胞中RIP3蛋白的表达或活性水平，则确定所述癌细胞具有抗癌药物耐药性。
优选地，癌细胞可以是乳腺癌细胞、宫颈癌细胞、肝癌细胞或结直肠癌细胞，并且所述抗癌药物可以是多柔比星、依托泊苷或紫杉醇，但本发明的范围不限于此。
本发明还提供用于增强抗癌药物敏感性的方法，其包括：用RIP3蛋白表达诱导剂或激活剂处理癌细胞；测量处理的癌细胞中RIP3蛋白的表达或活性水平；并且如果处理后RIP3蛋白的表达或活性水平比处理前的对照样品高50-100％，则确定抗癌药物敏感性增强。
本发明还提供用于诊断抗癌药物敏感性的生物标志物组合物，其包含 RIP3基因或从该基因表达的蛋白。
如本文使用的，术语“诊断”包括确定受试者对某种疾病或病症的易感性；确定受试者是否患有某种疾病或病症；确定患有某种疾病或病症的受试者的预后；或rametrics(例如，监测受试者的状况以提供关于治疗效力的信息)。
本发明还提供用于诊断抗癌药物敏感性的试剂盒，其包含用于扩增 RIP3基因的引物或特异结合从所述基因表达的蛋白的抗体或适体。
如本文使用的，术语″引物″是指具有短的游离3′-末端羟基的核酸序列，其是短的核酸序列，可以与互补模板形成碱基对并用作模板链复制的起始点。在合适的缓冲液在合适的温度在存在用于聚合的试剂(例如，DNA聚合酶或反转录酶)和四种三磷酸核苷的情况下，引物可以起始DNA合成。 PCR条件和有义和反义引物的长度可以根据本领域中已知技术适当选择。
本发明的试剂盒可以包含特异结合标志物成分的抗体、具有通过与底物反应显色的标记的第二抗体缀合物、要与标记反应的底物溶液、洗涤缓冲液和酶反应终止缓冲液等。此外，试剂盒可以由包括使用的试剂成分的多个包装或隔室制成。
第二抗体缀合物的标记可以优选地是显色的常规显色材料。其可以选自荧光素如HRP(辣根过氧化物酶)、碱性磷酸酶、胶体金、FITC(聚L- 赖氨酸-荧光素异硫氰酸酯)，RITC(罗丹明-B-异硫氰酸酯)等、和染料。
本发明还提供为诊断抗癌药物敏感性的预后提供所需的信息的方法，其包括：测量癌症患者样品中RIP3的表达水平；测量正常对照样品中RIP3 的表达水平；并且如果测量的癌症患者样品中RIP3蛋白的表达水平低于测量的正常对照样品中RIP3蛋白的表达水平，则确定所述癌症患者样品具有抗癌药物耐药性。
特别是，RIP3的表达水平可以通过抗原-抗体反应测量。更特别是，抗原-抗体反应可以根据本领域已知的定量或定性免疫测定方案进行。免疫测定形式可以包括，但不限于，酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、夹心测定、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫组织化学染色、流式细胞术、荧光辅助的细胞分选(FACS)、酶底物显色测定和抗原-抗体聚集。
如本文使用的，术语“患者样品”可以意为样品，包括显示与正常对照中的相比RIP3(其是用于诊断抗癌药物敏感性的生物标志物)表达水平的差异的组织、细胞、全血、血清、血浆、唾液、痰、脑脊液和尿，但本发明的范围不限于此。
发明的模式
下文中，将参考实施例详细描述本发明。然而，要理解，这些实施例仅用于说明的目的而不意在限制本发明的范围。提供本发明的实施例，从而本公开将彻底和完全，并且将本发明的范围完全传达给本领域技术人员。
实验实施例
以下实验实施例提供通常用于本发明的实施例的实验实施例。
1.试剂
RIP3抗体购自Abcam。肌动蛋白抗体、多柔比星、依托泊苷、5-AD 和5-AZA购自Sigma-Aldrich。
2.细胞培养
各种癌细胞系在ATCC建议的培养基中培养。DLD1、HeLa和MCF7 在补充有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100ug/mL 链霉素的DMEM培养基中培养。HCC1937、BT-549、MDA-MB231、 MDA-MB468、SK-BR3、ZR75-1和T47D在补充有10％胎牛血清、2mM 谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100ug/mL链霉素的RPMI中培养。
3.正常人细胞
乳腺上皮细胞(HMEs)获自Clonetics Corp.(San Diego，CA)。正常乳腺上皮细胞的HMLE用hTERT永生化，并且还用具有SV40大和小T抗原的反转录病毒感染。
4.人乳腺癌组织的制备
人乳腺癌症和对照正常样品获自Yonsei大学医学院(首尔，韩国)。在所有情况中，从所有参与者获得书面知情同意书，并且该研究在Yonsei 大学的工业评述委员会(Institutional Review Board，IRB)的批准下进行。
5.慢病毒shRNA实验
靶向hRIP3 mRNA(NM_006871)的编码区域或3′UTR的MISSION短发夹RNA(shRNA)质粒或非靶标对照序列(NM-027088)获自Sigma-Aldrich。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，11668019)将慢病毒质粒转染入293T 细胞(System Biosciences，LV900A-1)。在转染慢病毒质粒后2天收集假病毒颗粒并在聚凝胺(10μg/mL)的存在下感染入各种癌细胞。在感染后2 天，用嘌呤霉素选择感染的细胞，并通过免疫印迹确认RIP3敲低。之后将没有内源性RIP3的细胞用5-AD处理4天并通过免疫印迹分析。
6.蛋白质印迹(免疫印迹)
将细胞在M2缓冲液中裂解。通过SDS-PAGE和免疫印迹分析等量的细胞提取物，并且印迹通过增强的化学发光(ECL，Amersham)显现。
7.细胞毒性测定
使用四唑鎓染料比色试验(MTT测定)在570nm确定细胞存活力。
8.免疫组织化学测定
使用UltraVision LP Detection System TL-060-HD(Thermo Scientific，Bioanalytica)根据制造商的使用说明进行免疫组织化学。薄的石蜡切片 (4.5μm)在二甲苯中脱蜡并在分级系列的乙醇-水溶液中再水合。抗原修复 (antigen retrieval)通过在微波炉中在10mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中加热切片15min进行。内源性过氧化物酶活性通过在TBS中的3％过氧化氢中温育10min阻断，并且然后将切片在4℃在1∶300稀释的抗-RIP3抗体中温育过夜。用3，3′-二氨基联苯(TL-015-HD，Thermo Scientific，Bioanalytica，Greece)溶液使色原体显色5min并且用Meyer′s苏木精复染。基于染色的细胞的比例和免疫染色强度评价免疫组织化学染色。将染色的细胞的比例(％)乘以分级为0(阴性)、1(弱)、2(中等)、或3(强)的染色强度获得H-得分。H-得分范围从0至300。对于每个样品对肿瘤和正常组织进行染色相同的时间。由对临床数据不知情的有经验的病理学家解释染色。
9.统计分析
数据由平均值±S.D表示。统计学分析使用ANOVA和未配对 Student′s t-检验进行。0.01或以下的P-值被认为是统计学显著的。统计计算使用用于Windows版本12.0的SPSS软件(SPSS，Chicago，IL，USA) 进行。
实施例1：乳腺癌细朐系中RIP3表达的分析
裂解癌细胞系以分离蛋白，其随后使用SDS-PAGE进行蛋白质印迹。分析乳腺癌细胞系中的RIP3表达样式，并且结果表明，在60％以上的细胞系中不表达RIP3。发现RIP3在癌细胞系中由特定机制导致沉默(图1)。
实施例2：分析通过去甲基化剂的RIP3表达
在将癌细胞系接种至10-20％汇合，并且然后用5-AD处理两次达4天后，通过蛋白质印迹技术分析细胞系中RIP3表达模式。表明，当将不表达RIP3的三种癌细胞系(HeLa、MDA-MB231、BT549)用去甲基化剂 (5-AD，2uM)处理时，5-AD诱导RIP3表达。该结果提示，癌细胞系中的RIP3表达被甲基化抑制(图2)。
此外，在将癌细胞系接种至10-20％汇合，并随后用5-AZA处理两次达4天时，通过蛋白质印迹技术分析细胞系中的RIP3表达模式。表明，当将不表达RIP3的DLD-1结直肠癌细胞系用各种浓度的5-AZA(类似于 5AD的物质)处理时，诱导RIP3表达。该结果表明，癌细胞系中的RIP3 表达被甲基化抑制(图3)。
实施例3：通过去甲基化剂和抗癌药物联合治疗致敏癌细胞死亡
将癌细胞系接种至10-20％汇合，并随后用5-AD或5-AZA处理两次达4天以诱导RIP3表达。接种相同数量的5-AD处理的HeLa和未处理的HeLa细胞系，并随后用相同浓度的抗癌药物的处理。分析去甲基化剂对细胞死亡致敏的影响。
结果表明，在由5-AD诱导RIP3表达后进行利用抗癌药物的处理时，使得用5-AD处理的表达RIP3的癌细胞系对抗癌药物敏感。这提示，RIP3 参与抗癌药物导致的癌细胞系死亡(图4)。
此外，除了5-AD的情况，表明，在由5-AZA诱导RIP3表达后进行抗癌药物处理时，获得使癌细胞系对细胞死亡敏感的效应(图5)。
实施例4：在抑制RIP3表达的条件下去甲基化剂对使癌细胞系对细胞死亡敏感的 效应
使用慢病毒系统，制备了在宫颈癌细胞系(HeLa细胞系)中连续抑制 RIP3表达的稳定细胞。不像非靶标细胞系，在shRIP3细胞系的情形中，尽管细胞系用5-AD处理，但是细胞系中的RIP3表达被shRNA抑制。因此，可以证实RIP3对用抗癌药物和去甲基化剂联合治疗导致细胞系致敏的效应。最初将非靶标细胞系和shRIP3细胞系中的每种接种至10-20％汇合，并随后用5-AD处理两次达4天，并且检查RIP3是否表达。此外，在接种相同数量的细胞后，使用细胞存活力测定(MTT测定)分析用抗癌药物联合治疗导致的致敏作用(图6)。
因为去甲基化剂(5-AD或5-AZA)不是特异性针对某种蛋白的药物，其可以引起除RIP3之外的多种蛋白的表达。因此，为了确定通过用抗癌药物和去甲基化剂联合治疗导致的对细胞死亡的致敏作用是否是由除 RIP3之外的蛋白诱导的效应，使用特异抑制RIP3表达的shRIP3细胞系进行实验。在非靶标细胞系中，当癌细胞系用5-AD处理时，用抗癌药物联合治疗显示由RIP3表达导致的使癌细胞死亡致敏的效应，但在其中 RIP3表达被特异抑制的shRIP3细胞系中，即使细胞系用5-AD处理， shRNA体系也不表达RIP3。当基于该结果进行细胞存活力测定时，能够观察到，在不表达RIP3的shRIP3细胞系的情况下，致敏作用被抑制，提示RIP3是用去甲基化剂和抗癌药物联合治疗诱导的癌细胞死亡的致敏中的重要分子。此外，其提示，促进RIP3表达是新的抗癌策略，其可以增加癌细胞的死亡。
实施例5：正常乳腺组织和乳腺癌组织的免疫染色测定
肿瘤组织和非肿瘤组织分离自132名乳腺癌症患者，并制备石蜡块。将制备的石蜡块切片至4.5μm的厚度，并且然后置于载玻片上。将切片在二甲苯中脱蜡并在分级系列的乙醇-水溶液中再水合，并且随后用过氧化氢处理以消除非特异性酶反应，接着用柠檬酸溶剂处理以解离潜在的抗原。然后，将其与稀释的正常血清温育20分钟以阻断非特异反应，并且随后与RIP3(1∶300)反应24小时。在用水洗涤后，将温育的物质与生物素缀合的第二抗体温育30分钟，接着用水洗涤。在将其与亲和素-生物素复合体温育30分钟，并随后用水洗涤后，将其用DAB显色溶液处理5分钟。接着，用苏木精染核，用水洗涤，并且随后进行封固过程。
DAB的显色强度分级为0(无显色)、1(弱显色)、2(中等)、或3(强显色)，并且通过将染色的细胞的比例(％)乘以染色强度获得H-得分。染色由有经验的病理学家解释。
在实验结果中，将典型正常乳腺组织和乳腺癌组织中的RIP3成像，并且结果显示为H-得分(图7、8和9)。可以看出，RIP3的表达水平在癌组织中显著低于正常乳腺组织中。
实施例6：用各种浓度的抗癌药物处理的RIP3-沉默的HT-29细胞的存活力测定
将HT-29细胞(美国组织培养物收集中心(American Tissue CultureCollection))在37℃培养箱中使用补充有青霉素-链霉素(10IU/ml)和10％ FBS的DMEM培养基培养。本发明中使用的shRNAi双链由Sigma-Aldrich 商业合成。设计本发明中使用的shRNA从而靶向人RIPK3 mRNA序列 (NCBI参考序列NM_006871)的编码区。
首先，将培养的HT-29细胞以2×105个细胞的密度分配到3S-mm培养皿中。在次日，根据方案说明将细胞用shRNA颗粒连同聚凝胺(10ug/ml) 感染。作为对照，使用不靶向特定蛋白的shRNA(NCBI参考序列 NM_027088)。
为了测量感染的细胞中产生的RIP3蛋白的量，在将感染的HT-29细胞用PBS清洗，并随后用裂解缓冲液裂解以收集上清后，使用蛋白质印迹试剂盒(BIO-RARD)分离蛋白。将分离的蛋白与合适的抗体(抗-β-肌动蛋白 (1∶5,000，Sigma)、抗-RIP3(1∶1,000，Abcam)和第二HRP-缀合抗体(Jackson) 温育，并随后使用Immunobilon Western化学发光HRP底物试剂盒(Thermo) 检测HRP。
结果，如图10所示，在RIP3 shRNA感染的HT-29细胞中基本上检测不到RIP3蛋白。这提示，感染的RIP3 shRNA有效敲低RIP3基因。
在本发明中，为了检查RIP3基因是否与抗癌药物敏感性相关，将RIP3 shRNA感染的HT-29细胞用不同浓度的多柔比星和依托泊苷处理，并随后测量癌细胞的细胞存活力。特别是，将RIP3 shRNA感染的HT-29细胞用 2.5uM和5uM的多柔比星以及50uM和100uM的依托泊苷处理，并随后温育48小时。在将培养基更换为含有0.1mg的MTT(3-([4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑鎓溴化物)的新鲜培养基，再将细胞温育2小时。在通过将四唑鎓盐(活细胞溶解于其中)还原成紫色甲
Figure BDA0001119615880000131
(formazan)晶体获得的沉淀上进行比色分析。接着，去除培养基，并且将产生的甲
Figure BDA0001119615880000132
晶体溶解在500ul DMSO中，并且使用ELISA读数器在570nm测量吸光度。细胞存活力表示为相对于视为100％存活力的对照的百分数。
结果，如图10(右侧)所示，在对照组中，细胞存活力依赖于多柔比星和依托泊苷的浓度降低，而在RIP3用shRNA敲低的测试组中，与对照组相比，细胞存活力增加。
实施例7：用各种浓度的抗癌药物处理导致的RIP3-沉默的T47D细朐的存活力测定
为了检查RIP3是否还对乳腺癌细胞具有效应，使用表达RIP3的T47D 细胞。首先，以与实施例6中所述相同的方式用RIP3感染细胞。
蛋白质印迹的结果表明，在RIP3 shRNA感染的T47D细胞中基本上检测不到RIP3，并且RIP3基因被有效敲低(图11)。为了检查RIP3是否增加T47D乳腺癌细胞中的抗癌药物敏感性，进行MTT测定。将对照组和 RIP3-敲低测试组与图11(右侧)所示浓度的多柔比星、依托泊苷和紫杉醇温育48小时。MTT测定的结果表明，对照组的细胞依赖于抗癌药物的浓度被杀伤，而与对照组相比，RIP3细胞系，特别是依托泊苷-处理的测试组的抗癌药物耐药性显著增加。
从上述结果，可以发现，RIP3表达的调节影响癌细胞系的抗癌药物耐药性。特别是，能够发现，当RIP3表达被抑制时，癌细胞对抗癌药物具有耐药性，并且因此抗癌药物的活性被抑制，而当RIP3表达时，癌细胞的死亡依赖于抗癌药物的浓度增加。
实施例8：乳腺癌症患者的10-年无转移性复发存活的分析
图12是显示1,166名乳腺癌症患者的10-年无转移性复发存活的图表。 RIP3基因的表达水平分为两部分(高于和低于50％)，并且分析患者的存活率。结果，具有高于50％RIP3表达的患者显示统计学显著的差异 (p＜0.0085)，这提示RIP3的表达水平影响患者的存活率。结果使用Jezequel 等人设计的乳腺癌症基因-表达Miner v3.0软件(BreastCancer Research and Treatment 2012；131：765-75)进行分析。
尽管已经参考具体特征详细描述了本发明，对于本领域技术人员显而易见的是，该描述仅是其优选的实施方案，并且不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求和其等效形式限定。

Claims (5)

1.用于筛选抗癌辅剂的方法，所述方法包括：
使测试物质与癌细胞接触；
测量与所述测试物质接触的癌细胞中受体相互作用蛋白激酶-3蛋白的表达或活性水平；和
选择与对照样品相比显示RIP3蛋白的表达或活性水平的增加的测试物质，
其中所述抗癌辅剂增强癌细胞中药物敏感性，并且其中所述癌细胞相比于非癌细胞具有较低的RIP3蛋白的表达水平。
2.权利要求1所述的方法，其中所述RIP3蛋白的表达或活性水平通过选自由以下各项组成的组中的任一项测量：反转录-聚合酶链式反应、酶联免疫吸附测定、免疫组织化学、蛋白质印迹和流式细胞术。
3.权利要求1所述的方法，其中所述癌细胞是乳腺癌细胞、宫颈癌细胞、肝癌细胞或结直肠癌细胞。
4.权利要求1所述的方法，其中所述抗癌药物是多柔比星、依托泊苷或紫杉醇。
5.生物标志物RIP3基因或从所述基因表达的蛋白质在制备诊断抗癌药物敏感性试剂或试剂盒中的用途，其中所述敏感性是癌细胞死亡的致敏作用。
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