ES2534646T3 - Anticuerpos anti-hepsina y métodos de uso de los mismos - Google Patents

Anticuerpos anti-hepsina y métodos de uso de los mismos Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo anti-hepsina aislado, en el que una forma monovalente del anticuerpo se une a hepsina humana con una afinidad inferior o igual a 10 nM o mejor, en el que una forma monovalente del anticuerpo se une a hepsina de ratón con una afinidad inferior o igual a 330 nM, y en el que el anticuerpo se une a hepsina presente en un complejo que comprende hepsina y un inhibidor de serina proteasa que se une al subsitio S1 de hepsina humana, y en el que el anticuerpo comprende: (a) HVR-H1 que comprende la secuencia ; GFNFSYSYMH (SEQ ID NQ:4); (b) HVR-H2 que comprende la secuencia ; ASIYSYYGSTYYADSVKG(SEQ:IDNO:5); (c) HVR-H3 que comprende la secuencia; ARSDSWSYKSGYTQKIYSKGLDY (SEQ ID NQ:6) (d) HVR-L1 que comprende la secuencia ; RASQSVSSAVA (SEQ ID NO:1); (e) HVR-L2 que comprende la secuencia ; SASSLYS (SEQ ID NO:2): y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia ; QQYYSSYYLLT (SEQ ID NO:3).

Description

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La ruta de hepsina participa en múltiples funciones biológicas y fisiológicas, que incluyen, por ejemplo, activación de la ruta de HGF/c-met, activación de la ruta de MSP/Ron, rotura/degradación de la membrana basal, degradación de matrices, etc. Estas funciones están a su vez frecuentemente desreguladas en trastornos tales como cáncer. Así, en otro aspecto, la invención proporciona un método para inhibir la rotura/degradación de la membrana basal y/o degradación de matrices, comprendiendo dicho método poner en contacto una célula o tejido con un antagonista de la invención, por lo que se inhibe la rotura/degradación de la membrana basal y/o degradación de matrices. En otro aspecto más, la invención proporciona un método para inhibir la rotura/degradación de la membrana basal y/o degradación de matrices, comprendiendo dicho método administrar a una célula, tejido y/o sujeto con una afección asociada a rotura/degradación anormal de la membrana basal y/o degradación de matrices un antagonista de la invención, por lo que se inhibe la rotura/degradación de la membrana basal y/o degradación de matrices.
En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar o prevenir un trastorno asociado a elevada actividad de hepsina, comprendiendo dicho método administrar a un sujeto en necesidad de tal tratamiento una cantidad eficaz de un antagonista de la invención, tratándose o previniéndose así eficazmente dicho trastorno. En una realización, dicho trastorno es cáncer.
En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un anticuerpo anti-hepsina de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de un trastorno, tal como un cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo de células. En algunas realizaciones, el cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo de células es cáncer de próstata. En algunas realizaciones, el cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo de células es cáncer de ovario o renal.
En un aspecto, la invención proporciona el uso de un ácido nucleico de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de un trastorno, tal como un cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo de células. En algunas realizaciones, el cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo de células es cáncer de próstata. En algunas realizaciones, el cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo de células es cáncer de ovario o renal.
En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un vector de expresión de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de un trastorno, tal como un cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo de células. En algunas realizaciones, el cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo de células es cáncer de próstata. En algunas realizaciones, el cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo de células es cáncer de ovario o renal.
En otro aspecto más, la invención proporciona el uso de una célula huésped de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de un trastorno, tal como un cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo de células. En algunas realizaciones, el cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo de células es cáncer de próstata. En algunas realizaciones, el cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo de células es cáncer de ovario o renal.
En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un artículo de fabricación de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de un trastorno, tal como un cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo de células. En algunas realizaciones, el cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo de células es cáncer de próstata. En algunas realizaciones, el cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo de células es cáncer de ovario o renal.
En un aspecto, la invención también proporciona el uso de un kit de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de un trastorno, tal como un cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo de células. En algunas realizaciones, el cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo de células es cáncer de próstata. En algunas realizaciones, el cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo de células es cáncer de ovario o renal.
La invención proporciona métodos y composiciones útiles para modular trastornos asociados a la expresión y/o señalización de hepsina, tal como elevada expresión y/o señalización o expresión y/o señalización no deseada.
Pueden usarse métodos de la invención para afectar cualquier estado patológico adecuado. Trastornos a modo de ejemplo se describen en el presente documento, e incluyen un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de ovario, cáncer de tiroides, cáncer testicular, cáncer endometrial, cáncer de cabeza y cuello (por ejemplo, carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello), cáncer cerebral (por ejemplo, neuroblastoma o meningioma), cáncer de piel (por ejemplo, melanoma, carcinoma de células basales o carcinoma de células escamosas), cáncer de vejiga (por ejemplo, carcinoma de células transitorias), carcinoma de mama, cáncer gástrico, cáncer colorrectal (CRC), carcinoma hepatocelular, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón, cáncer pancreático, cáncer de próstata y cáncer renal, y cáncer endometrial.
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proteináceos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificará (1) a más del 95 % en peso del anticuerpo como se ha determinado por el método de Lowry, y lo más preferentemente más del 99 % en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos del extremo N o interna usando un secuenciador de taza giratoria, o (3) a homogeneidad por SDS-PAGE (electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida) bajo condiciones reductoras o no reductoras usando tinción con azul de Coomassie o, preferentemente, con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo, generalmente, el anticuerpo aislado se preparará por al menos una etapa de purificación.
Una molécula de ácido nucleico “aislada” es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que está generalmente asociada en la fuente natural del ácido nucleico. Una molécula de ácido nucleico aislada es distinta en la forma o entorno en el cual se encuentra en la naturaleza. Por tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas se diferencian de la molécula de ácido nucleico que existe en células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que generalmente expresan el ácido nucleico (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica anticuerpo) en el que, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una localización cromosómica diferente de la de células naturales.
El término “numeración de residuos del dominio variable como en Kabat” o “numeración de la posición de aminoácidos como en Kabat” y variaciones de los mismos se refiere al sistema de numeración usado para dominios variables de la cadena pesada o dominios variables de la cadena ligera de la compilación de anticuerpos en Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Usando esta numeración, la presente secuencia de aminoácidos lineal puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales correspondientes a un acortamiento de, o inserción en, una FR o CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de la cadena pesada puede incluir un inserto de un único aminoácido (residuo 52a según Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (por ejemplo, residuos 82a, 82b y 82c, etc. según Kabat) después del residuo de FR de la cadena pesada 82. La numeración de residuos de Kabat puede determinarse para un anticuerpo dado por alineamiento en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat “convencional”.
La expresión “sustancialmente similar” o “sustancialmente los mismos”, como se usa en el presente documento, denota un grado suficientemente alto de similitud entre dos valores numéricos (generalmente uno asociado a un anticuerpo de la invención y el otro asociado a un anticuerpo de referencia/comparador), de forma que un experto en la materia consideraría que la diferencia entre los dos valores es de poca o ninguna significancia biológica y/o estadística dentro del contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores de Kd). La diferencia entre dichos dos valores es preferentemente inferior a aproximadamente el 50 %, preferentemente inferior a aproximadamente el 40 %, preferentemente inferior a aproximadamente el 30 %, preferentemente inferior a aproximadamente el 20 %, preferentemente inferior a aproximadamente el 10 % en función del valor para el anticuerpo de referencia/comparador.
“Afinidad de unión” generalmente se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su componente de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique lo contrario, como se usa en el presente documento, “afinidad de unión” se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su componente Y puede representarse generalmente por la constante de disociación (Kd). Deseablemente, Kd es 1 x 10-7, 1 x 10-8, 5 x 10-8, 1 x 10-9, 3 x 109, 5 x 10-9, o incluso 1 x 10-10 o más fuerte. La afinidad puede medirse por métodos comunes conocidos en la técnica, que incluyen aquellos descritos en el presente documento. Los anticuerpos de baja afinidad se unen generalmente al antígeno lentamente y tienden a disociarse fácilmente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad generalmente se unen al antígeno más rápidamente y tienden a permanecer unidos durante más tiempo. En la técnica se conoce una variedad de métodos de medición de la afinidad de unión, cualquiera de los cuales puede usarse para los fines de la presente invención. A continuación se describen realizaciones ilustrativas específicas.
En una realización, “Kd” o “valor de Kd” según la presente invención se mide por un ensayo de unión al antígeno radiomarcado (RIA) realizado en la versión de Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno como se describe por el siguiente ensayo que mide la afinidad de unión en disolución de Fab por antígeno se mide equilibrando el Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (125I) en presencia de una serie de valoración de antígeno sin marcar, luego capturando el antígeno unido con una placa recubierta de anticuerpo anti-Fab (Chen, y col., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881). Para establecer condiciones para el ensayo, placas de microtitulación (Dynex) se recubren durante la noche con 5 µg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato sódico 50 mM (pH 9,6), y posteriormente se bloquean con 2 % (peso/volumen) de albúmina de suero bovino en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 ºC). En una placa no adsorbente (Nunc n.º 269620), [125I]-antígeno 100 pM o 26 pM se mezcla con diluciones sucesivas de un Fab de interés (por ejemplo, de acuerdo con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta y col., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). Entonces, el Fab de interés se incuba durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un periodo
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prolongado (por ejemplo, aproximadamente 65 horas) para garantizar que se alcance el equilibrio. Después, las mezclas se transfieren a la placa de captura para incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). Entonces, la disolución se elimina y la placa se lava ocho veces con 0,1 % de Tween-20 en PBS. Cuando las placas se han secado se añaden 150 µl/pocillo de centelleante (MicroScint-20; Packard) y las placas se cuentan en un contador gamma Topcount (Packard) durante diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que dan menos de
o igual al 20 % de unión máxima se eligen para su uso en ensayos de unión competitivos. Según otra realización, Kd
o el valor de Kd se mide usando ensayos de resonancia de plasmones superficiales usando un BIAcoreTM-2000 o un BIAcoreTM-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 ºC con chips CM5 de antígeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (UR). Brevemente, pastillas de biosensor de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore® Inc.) se activan con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) según las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato sódico 10 mM, pH 4,8, a 5 µg/ml (~0,2 µM) antes de la inyección a una velocidad de flujo de 5 µl/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Tras la inyección de antígeno se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para medidas cinéticas, diluciones sucesivas dobles de Fab (0,78 nM a 500 nM) se inyectan en PBS con 0,05 % de Tween 20 (PBST) a 25 ºC a una velocidad de flujo de aproximadamente 25 µl/min. En algunas realizaciones, se usan las siguientes modificaciones para el método de ensayo de resonancia de plasmones superficiales: se inmoviliza anticuerpo en chips biosensores CM5 para lograr aproximadamente 400 UR, y para mediciones cinéticas, se inyectan diluciones sucesivas dobles de proteína diana (por ejemplo, hepsina-IIIb o -IIIc) (a partir de 67 nM) en tampón PBST a 25 ºC con una velocidad de flujo de aproximadamente 30 ul/minuto. Las constantes de asociación (kas) y las constantes de disociación (kdis) se calculan usando un modelo de unión de Langmuir uno a uno simple (software de evaluación BIAcore® versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calcula como la relación kdis/kas. Véase, por ejemplo, Chen, Y., y col., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881. Si la constante de asociación supera 106 M-1 s-1 por el ensayo de resonancia de plasmones superficiales anterior, entonces la constante de asociación puede determinarse usando una técnica de extinción fluorescente que mide el aumento o la disminución en la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, 16 nm de paso banda) a 25 ºC de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma de Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno como se mide en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con flujo de parada (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-Aminco serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta con agitación.
Una “constante de asociación” o “kas” según la presente invención también puede determinarse con la misma técnica de resonancia de plasmones superficiales descrita anteriormente usando BIAcore™-2000 o a BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 ºC con chips CM5 de antígeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (UR). Brevemente, pastillas de biosensor de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore® Inc.) se activan con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) según las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato sódico 10 mM, pH 4,8, a 5 µg/ml (~0,2 µM) antes de la inyección a una velocidad de flujo de 5 µl/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Tras la inyección de antígeno se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para medidas cinéticas, diluciones sucesivas dobles de Fab (0,78 nM a 500 nM) se inyectan en PBS con 0,05 % de Tween 20 (PBST) a 25 ºC a una velocidad de flujo de aproximadamente 25 µl/min. En algunas realizaciones, se usan las siguientes modificaciones para el método de ensayo de resonancia de plasmones superficiales: se inmoviliza anticuerpo en chips biosensores CM5 para lograr aproximadamente 400 UR, y para mediciones cinéticas, se inyectan diluciones sucesivas dobles de proteína diana (por ejemplo, hepsina-IIIb o -IIIc) (a partir de 67 nM) en tampón PBST a 25 ºC con una velocidad de flujo de aproximadamente 30 ul/minuto. Las constantes de asociación (kas) y las constantes de disociación (kdis) se calculan usando un modelo de unión de Langmuir uno a uno simple (software de evaluación BIAcore® versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calcula como la relación kdis/kas. Véase, por ejemplo, Chen, Y., y col., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881. Si la constante de asociación supera 106 M-1 s-1 por el ensayo de resonancia de plasmones superficiales anterior, entonces la constante de asociación puede determinarse usando una técnica de extinción fluorescente que mide el aumento o la disminución en la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, 16 nm de paso banda) a 25 ºC de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma de Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno como se mide en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con flujo de parada (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-Aminco serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta con agitación.
El término “vector”, como se usa en el presente documento, pretende referirse a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico con el que se ha unido. Un tipo de vector es un “plásmido”, que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que se han ligado segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector de fago. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que segmentos de ADN adicionales pueden ligarse en el genoma vírico. Ciertos vectores pueden replicarse autónomamente en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores de mamífero episómicos). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episómicos) pueden integrarse en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped, y así se replican junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores pueden dirigir la expresión de genes a los que están operativamente ligados. Tales vectores se denominan en el presente documento “vectores de expresión recombinantes” (o simplemente “vectores
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directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero presentan diversas funciones efectoras tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpo.
La digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de unión al antígeno idénticos llamados fragmentos “Fab”, cada uno con un único sitio de unión al antígeno, y un fragmento “Fc” residual cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina da un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación con antígeno y que todavía puede reticular el antígeno.
“Fv” es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento y unión al antígeno completo. En una especie de Fv bicatenaria, esta región consiste en un dímero de un dominio variable de las cadenas pesadas y ligeras en estrecha asociación no covalente. En una especie de Fv monocatenaria, un dominio variable de las cadenas pesadas y ligeras puede estar covalentemente ligado por un conector de péptido flexible de forma que las cadenas ligeras y pesadas puedan asociarse en un análogo de estructura “dimérica” con el de en una especie de Fv bicatenaria. En esta configuración, las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión al antígeno sobre la superficie del dímero de VH-VL. En conjunto, las seis CDR confieren especificidad de unión del antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que sólo comprende tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad para reconocer y unirse a antígeno, aunque a una menor afinidad que el sitio de unión entero.
El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' se diferencian de los fragmentos Fab por la adición de algunos residuos en el extremo carboxi del dominio de las cadenas pesadas CH1 que incluyen una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en el presente documento para Fab' en el que el (los) residuo(s) de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre. Los fragmentos F(ab')2 de anticuerpos se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tenían cisteínas de bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.
Las “cadenas ligeras” de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno de los dos tipos claramente distintos llamados kappa () y lambda () basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.
Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de éstas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman , , ,  y µ, respectivamente. Las estructuras de subunidad y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son muy conocidas. “Fragmentos de anticuerpos” comprenden sólo una parte de un anticuerpo intacto, en el que la porción retiene preferentemente al menos una, preferentemente la mayoría o todas, de las funciones normalmente asociadas a esa porción cuando está presente en un anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenario; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. En una realización, un fragmento de anticuerpo comprende un sitio de unión al antígeno del anticuerpo intacto y, por tanto, retiene la capacidad para unirse al antígeno. En otra realización, un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, uno que comprende la región Fc, retiene al menos una de las funciones biológicas normalmente asociadas a la región Fc cuando está presente en un anticuerpo intacto, tal como la unión a FcRn, modulación de la semivida del anticuerpo, función de ADCC y unión al complemento. En una realización, un fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monovalente que tiene una semivida in vivo sustancialmente similar a un anticuerpo intacto. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo tal puede comprender sobre el antígeno el brazo de unión ligado a una secuencia de Fc que puede conferir estabilidad in vivo al fragmento.
El término “región hipervariable”, “HVR” o “HV”, cuando se usa en el presente documento, se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos. Generalmente, los anticuerpos comprenden seis regiones hipervariables; tres en VH (H1, H2, H3) y tres en VL (L1, L2, L3). Varias delineaciones de la región hipervariable están en uso y están englobadas en el presente documento. Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de Kabat se basan en la variabilidad de secuencias y son las más comúnmente usadas (Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia se refiere por el contrario a la localización de los bucles estructurales (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Las regiones hipervariables de AbM representan un compromiso entre CDR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia, y son usadas por el software de modelado de anticuerpos Oxford Molecular's AbM. Las regiones hipervariables de “contacto” se basan en un análisis de las complejas estructuras cristalinas disponibles. Los residuos de cada una de estas regiones hipervariables se anotan a continuación.
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anticuerpos humanos como se ha desvelado en el presente documento. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión al antígeno no humanos.
Un anticuerpo “madurado por afinidad” es uno con una o más alteraciones en una o más CDR del mismo que producen una mejora en la afinidad del anticuerpo por antígeno, en comparación con un anticuerpo parental que no posee aquella(s) alteración (alteraciones). Los anticuerpos madurados por afinidad preferidos tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares para el antígeno diana. Los anticuerpos madurados por afinidad se producen mediante procedimientos conocidos en la técnica. Marks y col. Bio/Technology 10:779-783 (1992) describe la maduración por afinidad por barajado de dominios VH y VL. La mutagénesis al azar de residuos de CDR y/o de regiones estructurales se describe por: Barbas y col. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier y col. Gene 169:147-155 (1995); Yelton y col. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson y col., J. Immunol. 154(7):33109 (1995); y Hawkins y col., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).
Las “funciones efectoras” de los anticuerpos se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fc (una región Fc de la secuencia nativa o región Fc de variante de secuencias de aminoácidos) de un anticuerpo, y varían con el isotipo del anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpos incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento; unión al receptor de Fc; citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B); y activación de linfocitos B.
“Citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo” o “ADCC” se refiere a una forma de citotoxicidad en la que Ig secretada unida sobre receptores de Fc (FcR) presentes en ciertas células citotóxicas (por ejemplo, linfocitos citolíticos espontáneos (NK), neutrófilos y macrófagos) permiten que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula diana que lleva antígeno y posteriormente destruyan la célula diana con citotoxinas. Los anticuerpos “arman” a las células citotóxicas y se requieren absolutamente para tal destrucción. Las células primarias para mediar en ADCC, linfocitos NK, expresan FcRIII solo, mientras que los monocitos expresan FcRI, FcRII y FcRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés puede realizarse un ensayo de ADCC in vitro, tal como el descrito en la patente de EE. UU. n.º 5.500.362 o
5.821.337 o la patente de EE. UU. de Presta n.º 6.737.056. Células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (CMSP) y linfocitos citolíticos espontáneos (NK). Alternativamente, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el desvelado en Clynes y col. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).
“Células efectoras humanas” son leucocitos que expresan una o más FcR y realizan funciones efectoras. Preferentemente, las células expresan al menos FcRIII y realizan función efectora de ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que median en ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (CMSP), linfocitos citolíticos espontáneos (NK), monocitos, linfocitos T citotóxicos y neutrófilos; prefiriéndose las células CMSP y NK. Las células efectoras pueden aislarse de una fuente nativa, por ejemplo, de sangre.
“Receptor de Fc” o “FcR” describe un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia nativa. Además, un FcR preferido es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcRI, FcRII y FcRIII, que incluyen variantes alélicas y formas alternativamente cortadas y empalmadas de estos receptores. Los receptores FcRII incluyen FcRIIA (un “receptor activante”) y FcRIIB (un “receptor inhibidor”) que tienen secuencias de aminoácidos similares que se diferencian principalmente en los dominios citoplásmicos del mismo. El receptor activante FcRIIA contiene un motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptora (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor inhibidor FcRIIB contiene un motivo de inhibición basado en tirosina inmunorreceptora (ITIM) en su dominio citoplásmico (véase la revisión M. en Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Los FcR son revisados en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel y col., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas y col., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Otras FcR, que incluyen aquellos que van a identificarse en el futuro, están englobados por el término “FcR” en el presente documento. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer y col., J. Immunol. 117:587 (1976); y Kim y col., J. Immunol.
24:249 (1994)) y regula la homeostasis de inmunoglobulinas. El documento WO00/42072 (Presta) describe variantes de anticuerpos con unión mejorada o disminuida a FcR. Véase, por tanto, Shields y col. J. Biol. Chem. 9(2): 65916604 (2001).
Se conocen métodos de medición de la unión a FcRn (véase, por ejemplo, Ghetie 1997, Hinton 2004). La unión a FcRn humano in vivo y la semivida en suero de polipéptidos de unión con alta afinidad a FcRn humano pueden ensayarse, por ejemplo, en ratones transgénicos o líneas celulares humanas transfectadas que expresan FcRn humano, o en primates administrados con los polipéptidos de variante de Fc.
“Citotoxicidad dependiente del complemento” o “CDC” se refiere a la lisis de una célula diana en presencia de complemento. La activación de la ruta del complemento clásica se inicia por la unión del primer componente del
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