MX2012004647A - Anticuerpos antihepsina y metodos para su uso. - Google Patents

Abstract

La invención provee anticuerpos de hepsina y composiciones que los comprenden, y métodos de uso de estos anticuerpos.

Description

ANTICUERPOS ANTIHEPSINA Y MÉTODOS PARA SU USO CAMPO DE LA INVENCIÓN .

La presente invención se refiere, generalmente, al campo de la biología molecular. Más específicamente, la invención se refiere a anticuerpos antihepsina, y a sus usos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN.

La hepsina es una serina proteasa de transmembrana de tipo II (TTSP, según su sigla en inglés) expresada sobre la superficie de células epiteliales. La proteína de 417 aminoácidos está compuesta por un dominio citoplásmico N-terminal corto, un dominio de transmembrana y un solo dominio rico en cisteína de receptor depurador que se aprisiona estrechamente contra el dominio de proteasa C-terminal (Somoza et al. (2003) Structure 11 (9), 1123-1131). La función fisiológica de la hepsina no es clara. A pesar de su expresión en las etapas muy tempranas de la embriogénesis (Vu et al (1997), J. Biol. Chem. , 272 (50), 31315-31320), los ratones deficientes en hepsina fueron viables y se desarrollaron con normalidad (Yu et al (2000) Thromb Haemost 84 (5), 865-870; Wu et al (1998) J. Clin. Invest. 101 (2), 321-326) . Se halló que la hepsina no era esencial para la regeneración hepática y para las funciones fisiológicas relacionadas con la coagulación (Id.) . Un estudio reciente demostró que los ratones knockout de hepsina tienen daños en la audición. Guipponi et al. (2007), Am. J. Pathol., 171: 608-616. Sin embargo, la hepsina se ha involucrado en el cáncer de ovario [ (Tanimoto et al (1997) Cáncer Res., 57 (14), 2884-2887); WO 2001/62271] y próstata. Varios estudios de expresión genética identificaron la hepsina como uno de los genes más altamente inducidos en el cáncer de próstata (Dhanasekaran et al (2001) Nature, 412, 822-826; Luo et al (2001) Cáncer Res., 61 (12), 4683-4688; Magee et al (2001) Cáncer Res. 61 (15), 5692-5696; Stamey et al (2001) J. Urol. 166 (6), 2171-2177; Stephan et al (2004) J. Urol. 171 (1), 187-191; Welsh et al (20010) Cáncer Res. 61 (16), 5974-5978) . Se halló que las concentraciones de ARN de hepsina eran bajas en la próstata normal y en hiperplasia benigna, si bien incrementaron fuertemente en el carcinoma de próstata, en particular, en las etapas avanzadas ( (Dhanasekaran et al (2001) Nature, 412, 822-826; Luo et al (2001) Cáncer Res 61(12), 4683-4688; Magee et al (2001) Cáncer Res 61(15), 5692-5696; Stamey et al (2001) J Urol 166(6), 2171-2177; Stephan et al (2004) J Urol 171(1), 187-191/ Welsh et al (20010) Cáncer Res 61(16), 5974-5978) . La tinción de proteina de hepsina con un anticuerpo antihepsina monoclonal mostró que la expresión de hepsina fue más alta en sitios de metástasis ósea, y en tumores primarios de etapa tardía (Xuan et al (2006) Cáncer Res 66(7), 3611-3619), lo que es consecuente con el hallazgo de que las mayores concentraciones de ARN de hepsina se correlacionan con grados más altos de Gleason y el avance tumoral ( (Luo et al (2001) Cáncer Res 61(12), 4683-4688; Magee et al (2001) Cáncer Res 61(15), 5692-5696; Stamey et al (2001) J Urol 166(6), 2171-2177; Stephan et al (2004) J Urol 171(1), 187-191; Chen et al (2003) J Urol 169(4), 1316-1319) .

La evidencia experimental sobre el rol de hepsina en el cáncer de próstata provino de un estudio de Klezovitch et al. (Klezovitch et al (2004) Cáncer Cell 6 (2), 185-195), que demostró que en un modelo de ratón de cáncer de próstata sin metástasis, la sobreexpresión de hepsina condujo al avance de tumor primario y a la metástasis. Intrigantemente, la sobreexpresión de hepsina se asoció con la interrupción de la membrana basal (Id.), para apuntar hacia la posibilidad de que la actividad de hepsina está ligada en cierta manera con la degradación de los componentes de la membrana basal. In vitro, la hepsina es capaz de convertir el factor de crecimiento latente, factor de crecimiento prohepatocito (pro-HGF) , en su forma activa de dos cadenas (HGF) , que indujo la señalización del receptor Met (Herter et al (2005) Biochem. J. 390 (Pt 1), 125-136; Kirchhofer et al (2005) FEBS Lett. 579 (9), 1945-1950; WO2006/014928) . La hepsina también es capaz de convertir pro-uPA en su forma activa (Moran et al (2006) J. Biol. Chem. 281 (41): 30439-46), y de disociar lamina in vitro (Tripathi et al. (2008), J. Biol. Chem. 283: 30576). Debido a que la via HGF/Met ha sido comprometida en el crecimiento tumoral invasivo y la metástasis, es posible que la sobreexpresion de hepsina active el eje HGF/Met en el cáncer de próstata (Herter et al (2005) Biochem. J. 390 (Pt 1), 125-136; Kirchhofer et al (2005) FEBS Lett. 579 (9), 1945-1950; WO 2006/014928) . La hepsina además demostró disociar otros sustratos in vitro, principalmente, las proteínas relacionadas con la coagulación (Herter et al, id; Kazama et al (1995) J. Biol. Chem. 270 (1), 66-72). Sin embargo, su rol en la oncogénesis es desconocido.

Es claro que continúa habiendo una necesidad de agentes que tengan atributos clínicos óptimos para el desarrollo como agentes terapéuticos. La invención descripta en la presente cumple con ésta necesidad, y proporciona otros beneficios .

Todas las referencias citadas en esta solicitud, que incluyen las publicaciones y solicitudes de patente, se incorporan a modo de referencia en su totalidad.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN.

La invención se basa, en parte, en la identificación de una diversidad de agentes de unión de hepsina (tales como anticuerpos y sus fragmentos) . La hepsina presenta un importante y conveniente blanco terapéutico, y la invención proporciona composiciones y métodos sobre la base de la unión de los agentes a la hepsina. Los agentes de unión a hepsina de la invención, como se describe en esta solicitud, proporcionan importantes agentes terapéuticos y de diagnóstico para el uso- en la dirección de condiciones patológicas asociadas con la expresión y/o actividad de las vias de señalización de hepsina. En consecuencia, la invención proporciona métodos, composiciones, equipos y artículos de fabricación relacionados con la unión de hepsina .

El sitio activo de las proteasas de serina tipo tripsina, tal como la hepsina, se forma mediante diversos bucles móviles intrinsicamente (el ominio de activación' ) (Huber and Bode, 1978) . En particular, el bucle 200 forma parte del bolsillo SI y pude adaptar varios estados conformacionales en algunas proteasas de serina (Johnson et al., 2005; Shia et al., 2005; Spraggon et al., 2009; Wilken et al., 2004). Sin embargo, las estructuras de co-cristal de proteasas de serina con un inhibidor de sitio activo mostraron sitios activos formados apropiadamente, más que nada debido a las fuerzas estabilizadoras aplicadas al inhibidor (Arni et al., 1994; Shia et al., 2005; Spraggon et al., 2009). Se razonó que la ocupación del bolsillo SI por un inhibidor de serina proteasa puede aplicar fuerzas estabilizadoras sobre la flexibilidad del bucle de sitio activo de serina proteasa, facilitando el reconocimiento del anticuerpo del sitio activo de serina proteasa. Asi, para identificar anticuerpos anti-hepsina que bloquean la actividad ensimática de hepsina, se obtuvieron anticuerpos que se unieron a la hepsina encomplejo con un inhibidor de serina proteasa que ocupa el bolsillo SI, 3,4-dicloro-isocoumarina (DCI) .

La presente invención proporciona anticuerpos que se unen a hepsina. En un aspecto, la invención presenta un anticuerpo aislado que se une a hepsina.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo antihepsina aislado, donde una forma monovalente (tal como una forma Fab) del anticuerpo se une específicamente a hepsina humana con una afinidad de unión de aproximadamente 2 nM o mayor. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une específicamente a hepsina humana con una afinidad de unión de alrededor de 4 nM o mayor. Como está bien establecido en el arte, la afinidad de unión de un ligando a su receptor puede determinarse usando cualquiera de una diversidad de ensayos, y puede expresarse en términos de una diversidad de valores cuantitativos. Por lo tanto, en una realización, la afinidad de unión es expresada como valores Kd y refleja la afinidad de unión intrínseca (por ejemplo, con efectos minimizados de avidez) . En general, y preferentemente, la afinidad de unión se mide in vitro, o bien en un contexto libre de células, o asociado a células. Cualquiera de una cantidad de ensayos conocidos en el arte, que incluyen aquellos descriptos en esta solicitud, puede emplearse para obtener mediciones de afinidad de unión, entre ellos, por ejemplo, Biacore, radioinmunoensayo (RIA) y ELISA.

En otro aspecto, la invención proporciona anticuerpos antihepsina que se unen a una región de unión de dominio Kunitz de hepsina. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo antihepsina aislado que compite con un dominio Kunitz por la unión a hepsina. En una realización, dicha secuencia de dominio Kunitz es el dominio Kunitz 1 (KD1) de HAI-1 o HAI-1B. En una realización, un antagonista de la invención comprende una secuencia de variante KD1 que tiene por lo menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con respecto al tipo salvaje de KD1 de HAI-1 humano, donde dicha secuencia variante tiene una capacidad por lo menos comparable al tipo salvaje de KD1, para la inhibición de la actividad de hepsina. En una realización, una variante del dominio de Kunitz 70% y 99%, alrededor de 75% y 98%, alrededor de 80% y 97%, 85% y 95% de identidad de secuencia con KD1 de tipo salvaje de HAI-1, donde dicha secuencia tiene al menos la capacidad comparable como el KD1 de tipo salvaje en la inhibición de la actividad de hepsina. En una realización, una secuencia de dominio Kunitz HAI-2 variante es una o ambas de los dominios de Kunitz de HAI-2. En una realización, una secuencia de dominio de Kunitz de HAI-2 variante tiene al menos una identidad de secuencia del 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, ' 98%, 99% con respecto a los correspondientes dominios de Kunitz de HAI-2 humano de tipo salvaje, donde dicha secuencia tiene una capacidad por lo menos comparable a HAI-2 de tipo salvaje, para la inhibición de la actividad de hepsina. En una realización, una secuencia de dominio de Kunitz de HAI-2 variante tiene al menos una identidad de secuencia del 70% y 99%, alrededor de 75% y 98%, alrededor de 80% y 97%, 85% y 95% de identidad de secuencia con respecto a los correspondientes dominios de Kunitz de HAI-2 humano de tipo salvaje, donde dicha secuencia tiene una capacidad por lo menos comparable a HAI-2 de tipo salvaje, para la inhibición de la actividad de hepsina.

En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos antihepsina que se unen al sitio catalítico de hepsina.

En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos anti-hepsina que enlazan a la hepsina fuera del subsitio si. En algunas modalidades, los anticuerpos enlazan la hepsina s2 y/o el subsitio s3.

En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos anti-hepsina que enlazan a la hepsina inactivada catalíticamente .

En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos anti-hepsina que son resistentes a la proteólisis de hepsina. En algunas modalidades, los anticuerpos son expuestos a la hepsina durante 24 horas bajo condiciones que permite el desdoblamiento de la hepsina del substrato de hepsina.

En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos antihepsina que se unen a hepsina presente en un complejo que comprende hepsina y un inhibidor de serina proteasa que se une al subsitio de hepsina SI. En algunas realizaciones, la hepsina presente en el complejo es inactivada. En algunas realizaciones, el inhibidor de serina proteasa es 3,4-dicloro-isocumarina (DCI). En algunas realizaciones, el inhibidor de serina proteasa se une a los residuos de aminoácidos catalíticos de hepsina Serl95 y His 57, con lo cual la hepsina es inactivada.

En un aspecto, la invención provee anticuerpos antihepsina que se unen específicamente a hepsina humana y que inhiben sustancialmente in vivo o in vitro la actividad enzimática de hepsina. En una realización, la actividad enzimática comprende la disociación de sustrato de polipéptido de hepsina. En una realización, el sustrato de polipéptido de hepsina es uno o más de la proteína estimulante promacrófago (pro-MSP, según su sigla en inglés) , pro-uPA, Factor VII y pro-HGF. La activación de hepsina de pro-MSP se describe en la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos de América copendiente, de propiedad común, Nro. (espacio en blanco), presentada el 22 de octubre de 2009. En una realización, la actividad enzimática comprende la disociación de un sustrato sintético de hepsina. En algunas realizaciones, el sustrato sintético de hepsina es un sustrato expuesto en la Tabla 1.

En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos antihepsina, donde los anticuerpos inhiben sustancialmente la actividad catalítica de hepsina humana y de ratón. En algunas realizaciones, una forma monovalente de un anticuerpo antihepsina inhibe la actividad catalítica de hepsina humana con un valor Ki de aproximadamente 4 nM. En algunas realizaciones, una forma monovalente de un anticuerpo antihepsina inhibe la actividad catalítica de hepsina de ratón con un valor Ki de aproximadamente 330 nM.

En un aspecto, la invención provee anticuerpos antihepsina, donde los anticuerpos inhiben sustancialmente la disociación de hepsina de pro-uPA. En algunas realizaciones, los anticuerpos antihepsina inhiben la disociación de hepsina de pro-uPA con un valor IC50 de aproximadamente 3 nM o superior .

En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos antihepsina, donde los anticuerpos inhiben sustancialmente la migración celular dependiente de laminina.

En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos antihepsina, donde los anticuerpos fueron generados por un método que comprende la selección de anticuerpos que se unen a un complejo que comprende (a) hepsina y (b) un inhibidor de serina proteasa que se une al subsitio de hepsina SI. En algunas realizaciones, la hepsina presente en el complejo es inactivada. En algunas realizaciones, el inhibidor de serina proteasa es 3, 4-dicloro-isocumarina (DCI) . En algunas realizaciones, el inhibidor de serina proteasa se une a los residuos de aminoácidos catalíticos de hepsina Serl95 y His 57, con lo cual la hepsina es inactivada. En algunas realizaciones, antes de la selección del anticuerpo, el anticuerpo es incubado con hepsina y el inhibidor de serina proteasa. En algunas realizaciones, el método además comprende la etapa de selección de anticuerpos que compiten por la unión a hepsina con un dominio de Kunitz. En algunas realizaciones, el dominio de Kunitz es KD1.

En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos antihepsina, donde los anticuerpos fueron generados por un método que comprende la selección (identificación) de anticuerpos que compiten con un dominio Kunitz por la unión a hepsina. En algunas realizaciones, el dominio de Kunitz es KD1.

En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos antihepsina que no son sustancialmente disociados por hepsina. En algunas realizaciones, los anticuerpos antihepsina son sustancialmente resistentes a la disociación de hepsina.

En general, los anticuerpos antihepsina de la presente invención son anticuerpos antagonistas.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo antihepsina que comprende: por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco y/o seis secuencias de región hipervariable (HVR, según su sigla en inglés) seleccionadas del grupo que consiste en: (a) HVR-L1 que comprende la secuencia RASQSVSSAVA (SEQ ID N0:1) ; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia SASSLYS (SEQ ID NO : 2 ) ; (c) HVR-L3 que comprende la secuencia QQYYSSYYLLT (SEQ ID NO: 3) ; (d) HVR-Hl que comprende la secuencia GFNFSYSYMH (SEQ ID NO : 4 ) ; (e) HVR-H2 que comprende la secuencia ASIYSYYGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 5) ; y (f) HVR-H3 que comprende la secuencia ARSDSWSYKSGYTQKIYSKGLDY (SEQ ID NO: 6) .

En un aspecto, la invención provee un anticuerpo antihepsina que comprende (a) una cadena ligera que comprende (i) HVR-L1 que comprende la secuencia RASQSVSSAVA (SEQ ID N0:1); (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia SASSLYS (SEQ ID N0:2); y (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia QQYYSSYYLLT (SEQ ID NO: 3); y/o (b) una cadena pesada que comprende (i) HVR-Hl que comprende la secuencia GFNFSYSYMH (SEQ ID NO: 4); (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia ASIYSYYGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 5); y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia ARSDSWSYKSGYTQKIYSKGLDY (SEQ ID NO: 6) .

En un aspecto, la invención provee un anticuerpo antihepsina que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:l. En un aspecto, la invención provee un anticuerpo antihepsina que comprende una HVR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2. En un aspecto, la invención provee un anticuerpo antihepsina que comprende una HVR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 3. En un aspecto, la invención provee un anticuerpo antihepsina que comprende una región HVR-Hl que comprende la secuencia de SEQ ID NO: . En un aspecto, la invención provee un anticuerpo antihepsina que comprende una región HVR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5. En un aspecto, la invención provee un anticuerpo antihepsina que comprende una región HVR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 6.

En un aspecto, un anticuerpo antihepsina comprende una región variable de cadena ligera que comprende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, donde, cada una, en orden, comprende la secuencia RASQDVN/STAVA (SEQ ID NO:7), SEQ ID N0:2, 3, y/o una región variable de cadena pesada que comprende HVR-Hl, HVR-H2 y HVR-H3, donde cada una, en orden, contiene SEQ ID NO: 4, 5, 6.

En un aspecto, un anticuerpo antihepsina comprende¦ una región variable de cadena ligera que comprende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, donde cada una, en orden, comprende la secuencia RASQDVN/STAVA (SEQ ID N0:7), SEQ ID NO: 1, secuencia SASFLYS (SEQ ID NO: 8), SEQ ID NO: 3, y/o una región variable de cadena pesada que comprende HVR-Hl, HVR-H2 y HVR-H3, donde cada una, en orden, contiene SEQ ID NO: 4, 5, 6.

En un aspecto, un anticuerpo antihepsina comprende una región variable de cadena ligera que comprende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, donde cada una, en orden, comprende SEQ ID NO: 7, 8, 3, y/o una región variable de cadena pesada que comprende HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, donde cada una, en orden, contiene SEQ ID NO: 4, 5, 6.

Las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-6 se numeran con respecto a HVR individuales (es decir, Hl, H2 o H3), como se indica en la Figura 1, donde la numeración es consecuente con el sistema de numeración Kabat como se describe a continuación.

Los anticuerpos de la invención pueden comprender cualquier secuencia de dominio variable de marco adecuada, siempre que la actividad de unión a hepsina sea retenida de manera sustancial. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención comprenden una secuencia de consenso de marco de cadena pesada del subgrupo III humano. En una realización de estos anticuerpos, la secuencia de consenso de marco comprende una sustitución en la posición 71, 73, y/o 78. En algunas realizaciones de estos anticuerpos, la posición 71 es A, 73 es T, y/o 78 es A. En una realización, estos anticuerpos comprenden secuencias de marco de dominio variable de cadena pesada de huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) (también referida en las Patentes de los Estados Unidos de América Nros . 6.407.213 y 5.821.337, y en la referencia de Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340 (5) : 1073-1093) . En una realización, estos anticuerpos además comprenden una secuencia de consenso de marco de cadena ligera humana kl. En algunas realizaciones, la secuencia de consenso de marco comprende una sustitución en la posición 66. En algunas realizaciones, la posición 66 es G. En una realización particular, estos anticuerpos comprenden secuencias HVR de cadena ligera de huMAb4D5-8 como se describe en las Patentes de los Estados Unidos de América Nros. 6.407.213 y 5.821.337) . En una realización, estos anticuerpos comprenden secuencias de dominio variable de cadena ligera de huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) (también referidas en las Patentes de los Estados Unidos de América Nros. 6.407.213 y 5.821.337, y en la referencia de Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340 (5) : 1073-1093) .

En una realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de cadena pesada, donde la secuencia de marco comprende la secuencia de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 y/o 29, y las secuencias HVR Hl, H2 y H3 son SEQ ID NO: , 5, y/o 6, respectivamente.

En una realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de cadena pesada, donde la secuencia de marco comprende la secuencia de SEQ ID NO: 38, 39, 40 y/o 41, y las secuencias HVR Hl, H2, y H3 son SEQ ID NO: , 5, y/o 6, respectivamente. En otra realización, la secuencia de marco comprende la secuencia de SEQ ID NO: 38, 39, 43 y/o 41, y las secuencias HVR Hl, H2 y H3 son SEQ ID NO: 4, 5, y/o 6, respectivamente.

En una realización particular, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de cadena ligera, donde la secuencia de marco comprende la secuencia de SEQ ID NO: 30, 31, 32 y/o 33, y las secuencias HVR Ll, L2 y L3 son SEQ ID N0:1, 2, y/o 3, respectivamente. En otra realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de cadena ligera, donde la secuencia de marco comprende la secuencia de SEQ ID NO: 34, 35, 36 y/o 37 y las secuencias HVR Ll, L2 y L3 son SEQ ID NO:l, 2, y/o 3, respectivamente. En otra realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de cadena ligera, donde la secuencia de marco comprende la secuencia de SEQ ID NO: 34, 35, 42 y/o 37, y las secuencias HVR Ll, L2 y L3 son SEQ ID NO:l, 2, y/o 3, respectivamente .

En una realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de cadena pesada, donde la secuencia de marco comprende la secuencia de SEQ ID NO: 38, 39, 43, y/o 41, y las secuencias HVR Hl, H2, y H3 son SEQ ID NO: 4, 5, y/o 6, respectivamente, y un dominio variable de cadena ligera, donde la secuencia de marco comprende la secuencia de SEQ ID NO: 34, 35, 36 y/o 37, y las secuencias de HVR Ll, L2 y L3 son SEQ ID N0:1, 2, y/o 3, respectivamente.

En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 10 y/o un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 9.

En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 10, y un dominio variable de cadena ligera .

En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 9 y un dominio variable de cadena pesada .

Algunas realizaciones de anticuerpos de la invención comprenden un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo humanizado 4D5 (huMAb4D5-8) (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) (también referido en la Patente de los Estados Unidos de América Nro. 6.407.213 y en la referencia de Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340 (5) : 1073-93) como se representa en SEQ ID NO: 11 a continuación. 1 Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 107 (SEQ ID NO: 44) (los residuos HVR están subrayados ) .

En una realización, la secuencia de dominio variable de cadena ligera huMAb4D5-8 está modificada en una o más posiciones 30, 66 y 91 (Asn, Arg y His como se indica, en negritas/cursiva anteriores, respectivamente) . En ¡una realización, la secuencia modificada de huMAb4D5-8 comprende Ser en la posición 30, Gly en la posición 66 y/o Ser en la posición 91. En consecuencia, en una realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variablé de cadena ligera que comprende la secuencia representada en SEQ ID NO: 45 a continuación: 1 Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr •Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 107 (SEQ ID NO: 45) (los residuos HVR están subrayados) .

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo ihepsina que compite con cualquiera de los anticuerpos i anteriormente mencionados por la unión a hepsina. Enj un I aspecto, la invención proporciona un anticuerpo antihepsina que se une al mismo epitopo o similar en hepsina, que cualquiera de los anticuerpos mencionados con anterioridad Como se conoce en el arte y como se describe en mayor detalle a continuación, la posición de aminoácido/limite que delinea una región hipervariable de un anticuerpo puede variar de acuerdo con el contexto y las diversas definiciones conocidas en el arte (como se describe a continuación) .

Algunas posiciones dentro de un dominio variable pueden observarse como posiciones hipervariables híbridas, en términos de que estas posiciones pueden ser consideradas dentro de una región hipervariable conforme a un grupo . de criterios, mientras que se consideran fuera de una región hipervariable conforme a un grupo diferente de criterios. Una o más de estas posiciones también pueden hallarse en regiones I hipervariables extendidas (como se define adicionalmentie a continuación) . ¡ En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal . En otras realizaciones, el anticuerpo es¡ un anticuerpo policlonal. En algunas realizaciones, j el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo quimérico, un anticuerpo madurado por afinidad!, un anticuerpo humanizado, y un anticuerpo humano. En ciertas realizaciones, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un fragmento Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, o scFv.

En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, por ejemplo, un anticuerpo que comprende secuencias de unión de antigeno de un donante no humano invención tiene regiones murinas V y una región C humanal En una realización, la región V de cadena ligera fusiona con una cadena ligera kappa humana. realización, la región V de cadena pesada murina con una región C humana de IgGl. i Los anticuerpos ' humanizados de la invención incluyen aquellos que tienen sustituciones de aminoácidos en la región de marco (FR, según su sigla en inglés) y variantesj de maduración para afinidad con cambios en las CDR injertadas.

Los aminoácidos sustituidos en la CDR o FR no se limitan a función CDC y/o ADCC y muerte de células B. Otros anticuerpos i de la invención incluyen aquellos que tienen cambios i I específicos que mejoran la estabilidad. En ojtras í realizaciones, los anticuerpos de la invención comprenden cambios en residuos de aminoácidos en la región Fe ¡ que I I conducen a la menor función efectora, por ejemplo, menor I función CDC y/o ADCC o menor muerte de células B. En algunas I realizaciones, los anticuerpos de la invención j se ¡ caracterizan por la menor unión (tal como la ausencia de i unión) al factor de complemento humano Clq o al receptor humano Fe en linfocitos citolíticos naturales (NK, según su sigla en inglés). En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención se caracterizan por la menor unión (tal como I la ausencia de unión) a FcgRI, FcgRIIA, y/o FcgRIIIA humanos. i En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención! son i de la clase IgG (por ejemplo, IgGl o IgG4) y comprenden' por unión de hepsina que comprenden cualquiera de las secuenbias de unión de antígeno proporcionadas en esta solicitud, dónde los polipéptidos de unión de hepsina se unen específicamente a una hepsina, por ejemplo, una hepsina humana y/o de mapaco i y/o de ratón.

Los anticuerpos de la invención se unen (por ejemplo!, se i unen específicamente) a hepsina, y en algunas realizaciones, pueden modular (por ejemplo, inhibir) uno o más aspectos de I la actividad de hepsina (tal como la actividad enzimática de I ¡ hepsina) y/o la interrupción de cualquier vía biológica de sustrato de polipéptido de hepsina y/o de hepsina i biológicamente pertinente, y/o el tratamiento y/o ¡ la prevención de un tumor, un trastorno proliferativo celular o un tipo de cáncer; y/o el tratamiento o la prevención dé un trastorno asociado con la expresión o actividad de hepsina (tal como la mayor expresión o actividad de hepsina) . En algunas realizaciones, el anticuerpo para hepsina se une específicamente a un polipéptido que consiste o que consiste esencialmente en una hepsina (por ejemplo, una hepsina humana o de ratón) . En una realización, la actividad enzimática de hepsina comprende la disociación de sustrato de polipéptido de hepsina. En una realización, el sustrato de polipéptido de hepsina es uno o más de una proteína estimulante promacrófagos (pro-MSP) , pro-uPA, Factor VII y pro-HGF.

En una realización, un anticuerpo de la invención nó es un anticuerpo antihepsina descripto en Cáncer Research, Volume 66, pp. 3611-3619, publicado en 2006 (por ejemplo, anticuerpo 1A12, 85B11, 94A7, A6, A174, A21 y/o. A24 como se ejemplifica en la Figura 4), o un anticuerpo de hepsina i aislado descripto en la Publicación PCT WO 2004/033630 (por En una realización, un anticuerpo de la invención no compite por la unión a hepsina humana con un anticuerpo tihepsina descripto en Cáncer Research, Volume pp. 3611-3619 publicado en 2006 (por ejemplo, anticuerpo 1A12, 85B11, 94A7, A6, A174, A21 y/o A24 como se ejemplifica en la Figura 4), o un anticuerpo de hepsina aislado descripto Publicación PCT WO 2004/033630 (por ejemplo, anticuerpo 14C7, 46D12, 38E2, 37G10, 31C1, 11C1 y/o 72H6 referido página 93 y en las Figuras 15A-D) o un anticuerpo de hep ina aislado descripto en la referencia de Xuan et al (2006) Cáncer Res 66 (7), 3611', o un anticuerpo de hepsina descripto en WO 2007/149932.

En una realización, un anticuerpo de la invención no se une al mismo epitopo en hepsina humana que un anticuerpo j antihepsina descripto en Cáncer Research, Volume 66, pp. 3611-3619 publicado en 2006 (por ejemplo, anticuerpo 85B11, 94A7, A6, A174, A21 y/o A24 como se ejemplifica Figura 4), o un anticuerpo de hepsina aislado revelado Publicación PCT WO 2004/033630 (por ejemplo, anticuerpo 14C7, 46D12, 38E2, 37G10, 31C1, 11C1 y/o 72H6 referido ei la página 93 y en las Figuras 15A-D) o un anticuerpo de hepsina aislado descripto en la referencia de Xuan et al ( 2|? 06 ) Cáncer Res 66(7), 3611, o un anticuerpo de hepsina revelado ! en WO 2007/149932. j I En un aspecto, la invención provee composiciones ¡ que comprenden uno o más anticuerpos de la invención y un portador. En una realización, el portador ; es farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la invención provee ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo de hepsina de la invención.

Aun en otro aspecto, la invención provee vectores | que comprenden un ácido nucleico de la invención.

En un aspecto adicional, la invención i composiciones que comprenden uno o más ácidos nucleicos dé la I invención y un portador. En una realización, el portador es farmacéuticamente aceptable. ¡ En un aspecto, la invención provee células huésped que comprenden un ácido nucleico o un vector de la invención l Un vector puede ser de cualquier tipo, por ejemplo, un vector recombiante, tal como un vector de expresión. Puede usarse i expresado. En algunas realizaciones, el método ad'emás comprende la recuperación del anticuerpo del cultivo! de célula huésped. En algunas realizaciones, el anticuerpo se recupera del medio de cultivo de célula huésped. En algjunas realizaciones, el método además anticuerpo recuperado con farmacéuticamente aceptable, preparación de una formulación anticuerpo humanizado. En algunas realizaciones, la invención provee métodos para la preparación de un anticuerpo antihepsina, donde dicho método comprende la de anticuerpos que se unen a un complejo que (a) hepsina y (b) un inhibidor de serina proteasa al subsitio de hepsina SI. En algunas realizaciones, la hep'sina presente en el complejo es inactivada. En algiunas realizaciones, el inhibidor de serina proteasa es 3,4-dicloro-isocumarina (DCI). En algunas realizaciones, el inhibidor de serina proteasa se une a los residuos| de aminoácidos catalíticos de hepsina Serl95 y His 57, con lo cual la hepsina es inactivada. En algunas realizaciones, antes de la selección del anticuerpo, el anticuerpo; incubado con hepsina y el inhibidor de serina proteasa: En algunas realizaciones, el método además comprende la etapa de ¡ la selección de anticuerpos que compiten por la unión a hepsina con un dominio de Kunitz. En algunas realizaciopes, el dominio de Kunitz es KD1. ! En un aspecto, la invención provee un artículoj de fabricación que comprende un recipiente; y una composi'ción contenida dentro del recipiente, donde la compósipión comprende uno o más anticuerpos de hepsina de la invencjión.

En una realización, la composición comprende un ápido nucleico de la . invención. En otra realización, una composición que comprende un anticuerpo además comprende un portador, que en algunas realizaciones es farmacéuticamente aceptable. En una realización, un articulo de fabricació de la invención además comprende instrucciones para la administración de la composición (por ejemplo, el anticuerpo) a un individuo (por ejemplo, instrucciones para cualquiera de los métodos descrxptos en esta solicitud) .

En otro aspecto, la invención provee un equipo que En una realización, una composición que comprende un I anticuerpo además comprende un portador, que en algunas i realizaciones, es farmacéuticamente aceptable. En btra realización, un equipo además comprende instrucciones par^ la administración de la composición (por ejemplo, el anticuerpo) a un individuo. i La vía de hepsina participa en múltiples funciones biológicas y fisiológicas, que incluyen, por ejemplo, la activación de la vía HGF/c-met, la activación de la vía MSP/Ron, la interrupción/degradación de la membrana basal[ la degradación de. matriz, etc. Estas funciones, a su vez, a menudo son desreguladas en trastornos tales como el cáncer.

En consecuencia, en otro aspecto, la invención provee un método de inhibición de la interrupción/degradación dej la membrana basal y/o la degradación de matriz, donde dicho método comprende el contacto de una célula o un tejido coi un antagonista de la invención, con lo cual la interrupción/degradación de la membrana basal o la degradación de matriz es inhibida. En aun otro aspecto, la invención provee un método de inhibición de la interrupción/degradación de la membrana basal o la degradación de matriz, donde dicho método comprende! la I administración a una célula, un tejido o un sujeto con una condición asociada con la anormal interrupción/degradacióh de la membrana basal o la degradación de matriz, de un antagonista de la invención, con lo cual ¡ la interrupción/degradación de la membrana basal o la degradación de matriz es inhibida.

En un aspecto, la invención provee un método para tratamiento o la prevención de un trastorno asociado con mayor actividad de hepsina, donde dicho método comprende administración a un sujeto que necesita dicho tratamiento, una cantidad eficaz de un antagonista de la invención, con cual se trata o previene dicho trastorno de manera eficaz una realización, dicho trastorno es cáncer.

En un aspecto adicional, la invención provee el uso de un anticuerpo' antihepsina de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o profiláctico de un trastorno, tal como un tipo de cáncer, un tumor, o un trastorno proliferativo celular. En algunas realizaciones, el cáncer, tumor, y/o trastorno proliferafivo celular es cáncer de próstata. En algunas cáncer, tumor, y/o trastorno proliferativo de ovario o renal.

En un aspecto, la invención provee el uso de un á^ido I i nucleico de la invención en la preparación de un medicamento í I para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de¡ un i trastorno, tal como un proliferativo celular.

En un aspecto adicional, la invención provee el uso de un articulo de fabricación de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de un trastorno, tal como un tipo de cáncer, un tumor, y/o un trastorno proliferativo celular. En algunas realizaciones, el tipo de cáncer, tumor, y/o trastorno proliferativo celular es cáncer de próstata. En algunas realizaciones, el cáncer, tumor, y/o trastorno proliferajtivo celular es cáncer de ovario o renal.

En un aspecto, la invención además provee el uso de un equipo de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de un trastorno, tal como un tipo de cáncer, un tumor o un trastorno proliferativo celular. En algunas realiz tipo de cáncer, tumor, y/o trastorno proliferativo cáncer de próstata. En algunas realizaciones, tumor, y/o trastorno proliferativo celular es cáncer' de ovario o renal La invención proporciona métodos y composiciones útiles para la modulación de trastornos asociados con la exprejsión y/o la señalización de hepsina, por ejemplo, la mayor expresión y/o señalización, o la expresión y/o señalización indeseada .

Los métodos de la invención pueden usarse para afectar cualquier estado patológico adecuado. En esta solicitud, se describen trastornos ejemplares, que incluyen un tipo de cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de ovario, cáncer tiroideo, cáncer testicular, cáncer endometrial, cáncer de cabeza y cuello (por ejemplo, carcinoma de célula escamosa de cabeza y cuello), cáncer cerebral (por ejemplo, neuroblastoma o meningioma) , cáncer de piel (por ejemplo, melanoma, carcinoma de célula basal, o carcinoma de célula escamosa) , cáncer de vejiga (por ejemplo, carcinoma de célula transicional ) , carcinoma de mama, cáncer gástrico, cáncer colorrectal (CCR) , carcinoma hepatocelular, cáncer cervical, cáncer de pulmón, cáncer pancreático, cáncer de próstata y cáncer renal, y cáncer endometrial.

En una realización, una célula apuntada en un método de la invención es una célula cancerosa. Por ejemplo, una célula cancerosa puede ser aquella seleccionada del grupo que consiste en una célula de cáncer de mama, una célula de cáncer colorrectal, una célula de cáncer de pulmón (por ejemplo, una célula de cáncer de pulmón de células no pequeñas) , una célula de cáncer tiroideo, una célula de mieloma múltiple, una célula de cáncer testicular, una célula de carcinoma papilar, una célula de cáncer de colon, una célula de cáncer pancreático, una célula de cáncer de ovario, una célula de cáncer cervical, una célula de cáncer del sistema nervioso central, una célula de sarcoma osteógeno, una célula de carcinoma renal, una célula de .carcinoma hepatocelular , una célula de cáncer de vejiga (por ejemplo, una célula de carcinoma de célula transicional ) , una célula de carcinoma gástrico, una célula de carcinoma escamoso de cabeza y cuello, una célula de melanoma, una célula de leucemia, una célula de cáncer endometrial, y una célula de adenoma de colon. En una realización, una célula que es apuntada en un método de la invención es una célula hiperproliferativa y/o hiperplásica. En otra realización, una célula apuntada en un método de la invención es una célula displásica. Aun en otra realización, una célula que es apuntada en un método de la invención es una célula metastásica.

Los métodos de la invención además pueden comprender etapas de tratamiento adicionales. Por ejemplo, en una realización, un método además comprende una etapa donde una célula o tejido dirigido (por ejemplo, una célula cancerosa) se expone a tratamiento de radiación o a un agente quimioterapéutico .

En un aspecto, la invención provee métodos que comprenden la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo antihepsina en combinación con una cantidad eficaz de otro agente terapéutico (tal como un agente antiangiogénico, otro anticuerpo, un agente quimioterapéutico, un agente citotóxico, un agente inmunosupresor, un profármaco, una citoquina, radioterapia citotóxica, un corticoesteroide, un antiemético, una vacuna contra el cáncer, un analgésico, o un agente inhibidor del crecimiento) . Por ejemplo, los anticuerpos antihepsina se usan en combinaciones con un agente anticancerigeno o un agente antiangiogénico, a fin de tratar diversas condiciones neoplásicas o no neoplásicas.

De acuerdo con la indicación de cáncer especifica por tratar, la terapia de combinación de la invención puede ser combinada con agentes terapéuticos adicionales, como agentes quimioterapéuticos, o terapias adicionales como radioterapia o cirugía. Muchos agentes quimioterapéuticos conocidos pueden ser usados en la terapia de combinación de la invención. Preferentemente, se usarán dichos agentes quimioterapéuticos que son convencionales para el tratamiento de las indicaciones específicas. La dosificación o la frecuencia de cada agente terapéutico por utilizar en la combinación es, preferentemente, la misma que la dosificación o frecuencia del correspondiente agente utilizado sin los otros agentes; o inferior .

En otro aspecto, la invención provee cualquiera de los anticuerpos antihepsina descriptos en esta solicitud, donde el anticuerpo antihepsina comprende una marca detectable.

En otro aspecto, la invención provee un complejo de cualquiera de los anticuerpos antihepsina descriptos en la presente y hepsina. En algunas realizaciones, el complejo es in vivo o in vitro. En algunas realizaciones, el complejo comprende una célula cancerosa. En algunas realizaciones, el anticuerpo antihepsina está detectablemente mercado.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS.

FIGURAS 1: Secuencias de bucle HVR de cadena pesada y de cadena ligera de anticuerpo antihepsina. La figura muestra las secuencias de HVR de cadena pesada, Hl, H2 y H3, y las secuencias de- HVR de cadena ligera, Ll, L2, y L3. La numeración de secuencia es la siguiente: Clon 25 (HVR-H1 es SEQ ID NO: 4; HVR-H2 es SEQ ID NO : 5 ; HVR-H3 es SEQ ID NO: 6; HVR-L1 es SEQ ID NO:l; HVR-L2 es SEQ ID NO:2; HVR-L3 es SEQ ID NO:3); Las posiciones de aminoácidos se numeran de acuerdo con el sistema . de numeración Kabat como se describe a continuación.

FIGURAS 2A, 2B y FIGURA 3: representan secuencias de marco de consenso humanas aceptoras ejemplares para el uso en la práctica de la presente invención, con identificadores de secuencia de la siguiente manera: Marcos de consenso de variable pesada (VH) (FIG. 2A, 2B) . marco de consenso subgrupo I VH humano menos CDR de Kabat (SEQ ID nos: 21-23 & 16, respectivamente); marco de consenso subgrupo I VH humano menos regiones hipervariables extendidas (SEQ ID NOS: 24-25, 23&16; 24-26&16 y 24-25, 27&16, respectivamente) ; marco de consenso subgrupo II VH humano menos CDR de Kabat (SEQ ID NO:28-30&16, respectivamente); marco de consenso subgrupo II VH humano menos regiones hipervariables extendidas (SEQ ID NOS 31-32, 30 & 16; 31-33 & 16; y 31-32, 34 & 16, respectivamente) ; marco de consenso subgrupo II VH humano menos extendidas ; marco de consenso subgrupo III VH humano menos CDR de Kabat (SEQ ID NO:35-37&16, respectivamente); marco de consenso subgrupo III VH humano menos regiones hipervariables extendidas (SEQ ID NOS 14-15, 37 & 16; 14-15, 38 & 16; y 14-15, 43 & 16, respectivamente) ; marco aceptor VH humano menos CDR de Kabat (SEQ ID NOS 36, 40 & 16, respectivamente) ; marco aceptor VH humano menos regiones hipervariables extendidas (SEQ ID 14-15, 40 & 16; y 14-15, 41 & 16, respectivamente) ; marco 2 aceptor VH humano menos CDR de Kabat (SEQ ID NOS 39, 36, 42 & 16, respectivamente) ; marco 2 aceptor VH humano menos regiones hipervariables extendidas (SEQ ID NOS 14-15, 42 & 16; 14-15, 44 & 16; y 14-15, 48 & 16, respectivamente) .

Marcos de consenso de variable ligera (VL) (FIG. 3) . marco de consenso subgrupo I VL kappa humano (SEQ ID NO: 17-20, respectivamente); marco de consenso subgrupo II VL kappa humano (SEQ ID NO:49-51&20, respectivamente); marco de consenso subgrupo III VL kappa humano (SEQ ID NO:52-54&20, respectivamente; marco de consenso subgrupo IV VL kappa humano (SEQ ID NO:55-57&20, respectivamente).

FIGURA : representa secuencias de región de marco de las cadenas de huMAb4D5-8 ligera (SEQ ID NO: 17-18, 58&20, respectivamente, en orden de aparición) y pesada (SEQ ID NOS 14-15, 48&16, respectivamente, en orden de aparición) . Los números en superindice/negritas indican posiciones de aminoácidos de acuerdo con Kabat .

FIGURA 5: representa secuencias de región de marco modificadas/variantes de cadenas de huMAb4D5-8 ligera (SEQ ID NO: 17-20, respectivamente en orden de aparición) y pesada (SEQ ID NO: 14-15, 43&16, respectivamente en orden de aparición) . Los números en superindice /negritas indican posiciones de aminoácidos de acuerdo con Kabat.

FIGURA 6: representa la región variable de cadena pesada 25 de anticuerpo mab antihepsina (SEQ ID NO: 10) y región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 9).

FIGURA 7: Una realización una secuencia de aminoácidos de hepsina humana nativa.

FIGURAS 8A Y 8B: Otra realización de una secuencia de aminoácidos de hepsina humana nativa.

FIGURA 9A-B: Inactivación de hepsina por 3,4-dicloro-isocumarina (DCI) . Figura 9A. Concentración hacia el sustrato S2765 luego de una incubación de 40 min de concentración de hepsina con concentraciones crecientes de DCI. Figura 9B. Estructura química de DCI y sus aductos potenciales cón hepsina de acuerdo con (Powers et al., 1989).

FIGURA 10: KD1 compite con un Fab-fago antihepsina por la unión a hepsina. La unión de Fab25-fago a hepsina en presencia de concentraciones crecientes de KD1.

FIGURA 11: Inhibición de la actividad enzimática de hepsina humana y murina por Fab25. Se incubaron hepsina humana (hu) y murina (mu) con Fab25 o un Fab de control (ctrl Fab) durante 40 min, antes de la adición de sustrato S2765. Las velocidades lineales iniciales se midiéron en un lector de microplaca cinético, y la actividad enzimática se expresó como actividad fraccional (Vi/v0) .

FIGURA 12: Especificidad de Fab25. Fab25 (1 µ?) se incubó con hepsina y 9 serina proteasas del tipo tripsina durante 40 min, antes de la adición de sustratos sintéticos de paranitroanilida (pNA) . Las velocidades lineales iniciales se midieron en un lector de microplaca cinético, y la actividad enzimática se expresó como actividad fraccional (Vi/Vo) .

FIGURA 13A-D: Inhibición por Fab25 de procesamiento de sustrato macromolecular por hepsina. Figura 13A. Inhibición de la activación de pro-uPA por Fab25. El efecto de Fab25 sobre el procesamiento mediado por hepsina de pro-uPA se determinó en un ensayo enzimático de dos etapas. Las velocidades lineales iniciales se midieron en un lector de placa cinético, y la actividad enzimática se expresó como actividad fraccional (vi/vo) . Mediante el uso de una curva estándar de uPA, se determinó que el índice no inhibido de formación de uPA por hepsina fue de 0,81 ± 0,22 µ? uPA/min (n = 3) . La inhibición del proceso de substrato de hepsina por Fab25 se realizó para 3 substratos conocidos: Figura 13B. factor VII (FVII) ; Figura 13C. pro-HGF; y Figura 13D. pro- MSP. Se llevó a cabo el desdoblamiento del Factor VII por hepsina durante 0.5 horas y 2.0 horas en la presencia o ausencia de Fab25 y un Fab de control (ctrl Fab) , mientras que los experimentos de desdoblamiento de pro-HGF y pro-MSP se llevaron a cabo durante 30 minutos. Los alícuotas de la reacción fueron analizados por SDS-PAGE (condiciones reductoras) y geles tintados.

FIGURA 14: Efectos de la integridad de Fab25 luego de la exposición prolongada a hepsina. El bucle CDR-H3 en Fab25 contiene tres residuos lisina y un residuo arginina que podrían ser potencialmente disociados por hepsina, si bien no se observó procesamiento proteolítico de Fab25 por hepsina cuando se incubó durante 24 h o bien a pH 6,0 o pH 8,0. La ¦ proteólisis se controló por movilidad de gel-cambio en un gel de gradiente de poliacrilamida al 4-20% (p/v) y con tinción de azul brillante de Coomassie.

FIGURA 15A-B: Inhibición por Fab25 de la migración dependiente de laminina, de células DU145. Figura 15A. Se agregaron células DU145 (2 x 104) en medio de Eagle modificado de Dulbecco libre de suero, a cámaras superiores pretratadas de inserciones Fluoroblok, y se dejaron migrar durante 5 h a 37 °C. Luego de la incubación, las células no migratorias y los medios se lavaron, y aquellas células que migraron hacia la base de los filtros se fijaron, se tiñeron con el YO-PRO-I, y se tomaron imágenes usando un microscopio invertido. Se tomaron imágenes representativas de filtros pretratados (laminina, laminina coincubada con hepsina, laminina coincubada con complejo de hepsina : Fab25 o control de PBS) con células fijadas. Figura 15B. Media de unidades de fluorescencia relativa (R. F. U., según su sigla en inglés) de células teñidas con los sustratos YO-PRO que tienen sustracción de referencia para pocilios de PBS. Las células DU145 tratadas con laminina procesada con hepsina tuvieron marcado incremento en la migración en comparación con las células que fueron tratadas con laminina sola. La falta de procesamiento de laminina por hepsina en presencia de Fab25 torna DU145 menos migratoria.

FIGURA 16A-B: Figura 16A. Activación de pro-MSP por hepsina expresada en superficie celular en células LnCap-34. Las células LnCap-34 que sobreexpresan en forma estable hepsina fueron privadas de suero y tratadas con 1251-pro-MSP solo o en combinación con diferentes inhibidores durante 3 h. Se usó hepsina recombinante (10 nM) como un control positivo. Se observó un incremento significativo en el procesamiento de pro-MSP luego de 3 h, en comparación con el inicio del experimento. Los inhibidores KQLR (SEQ ID NO: 12), KD1 y anticuerpo antihepsina Fab25 bloquearon en forma eficaz la activación de pro-MSP. Figura 16B. Activación de pro-HGF por superficie celular expresada por hepsina en células LnCap-34. Las células LnCap-34 fueron tratadas con 1251-pro-HGF en presencia de concentración de fab25 variada (20nM-0.15nM) e incubadas durante 3 horas. La hepsina recombinante (????) se usó como un control positivo. Se observó un incremento significativo en el proceso de pro-HGF después de 3 horas en comparación con el inicio del experimento. El anticuerpo Fab25 antihepsina bloqueó efectivamente la activación de pro-HGF de una manera dependiente de la concentración.

FIGURA 17A-B: Figura 17A. Se usó la resonancia plasmón superficial para medir la afinidad de enlace de Ab25 con, una hepsina humana activa. Se inyectaron diulciones en serie de hepsina (0.39nM a 200nM) a un chip biosensor CM5 con Ab25 capturado durante 3 minutos y la disociación se monitoreó por 15 minutos. El ajuste de los datos experimentales dieron el índice de disociación de equilibrio (KD) de 10.6nM. Figura 17B. Mientras en enlace de Ab25 a la pro-hepsina mostró cinéticas rápidas, la afinidad de enlace se midió mediante mediciones de afinidad de estado quieto. Se inyectaron diluciones en serie de pro-hepsina (195nM a 80nM) a un chip biosensor CM5 con Ab25 capturado durente 2 minutos. El índice de disociación de equilibrio (KD=5.52mN) se determinó mediante el análisis de estado quito de una parcela de Req contra la concentración de pro-hepsina.

FIGURA 18: Experimento calorimétrico de titulación isotermal de enlace Fab25 a la hepsina activa. La reacción de asociación es exotérmica y la estoiquimetría de enlace es 1:1 como se esperaba. La constante de disociación (KD) de ITC es 6.1nM que se correlaciona excelentemente con los datos previos de BIAcore. La etalpía (DH) y entropía (TDS) de enlace son -27.5 kcal/mol y -16.3 kcal/mol mostrando que el enlace se conduce entálpicamente con entropía desfavorable.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN.

La invención de esta solicitud proporciona anticuerpos antihepsina que son útiles para, por ejemplo, el tratamiento o la prevención de enfermedades asociadas con la expresión y/o actividad de la hepsina, tal como, la mayor expresión y/o actividad, o la expresión y/o actividad indeseada. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención se usan para el tratamiento de un tumor, un tipo de cáncer y/o un trastorno proliferativo celular En otro aspecto, los anticuerpos antihepsina de invención encuentran utilidad como reactivos para detección y/o el aislamiento de hepsina, tal como detección de hepsina en diversos tejidos y tipos celulares La invención además provee métodos para la preparación el uso de anticuerpos antihepsina, y polinucleótidos qu codifican los anticuerpos antihepsina.

Técnicas generales .

Las técnicas y los procedimientos descriptos o referenciados en la presente son generalmente bien entendidos y empleados comúnmente usando metodología convencional por los expertos en el arte, por ejemplo, las metodologías ampliamente utilizadas descriptas en las referencias de Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds . , (2003)); la serie METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): "PCR 2: A PRACTICAL APPROACH" (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, y ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)).

Definiciones .

Un anticuerpo "aislado" es aquel que ha sido identificado y separado, y/o recuperado, de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interfieren con los usos diagnóstico o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos . En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificará (1) a más del 95% en peso de anticuerpo, según lo determinado por el método de Lowry, y con mayor preferencia, a más del 99% en peso; (2) a un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N-terminales o internos mediante el uso de un secuenciador de taza giratoria; o (3) a homogeneidad por SDS-PAGE (electroforesis de gel de poliacrilamida de dodecilsulfato sódico) , en condiciones reductoras o no reductoras, usando azul de Coomasie o, preferentemente, tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes, ya que no se presentará por lo menos un componente del entorno natural del anticuerpo. Sin embarqo, comúnmente, el anticuerpo aislado se preparará por medio de al menos una etapa de purificación.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y está separada de por lo menos otra molécula de ácido nucleico contaminante con la cual está asociada normalmente en la fuente natural del ácido nucleico. Una molécula de ácido nucleico aislada se presenta en una forma o en un contexto diferente de aquel hallado en la naturaleza. Las moléculas de ácido nucleico aisladas, por lo tanto, se distinquen de la molécula de ácido nucleico tal como se presenta en células naturales. Sin embarqo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que comúnmente expresan el ácido nucleico (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica anticuerpo) donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico se encuentra en una ubicación cromosómica diferente de aquella de las células naturales.

Las expresiones "numeración de residuos de dominio variable como en Kabat" o "numeración de posición de aminoácido como en Kabat" y sus variaciones se refieren al sistema de numeración utilizado para los dominios variables de cadena pesada o dominios variables de cadena ligera de la compilación de anticuerpos en la referencia de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). Usando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos, o aminoácidos adicionales, correspondientes a un acortamiento o una inserción en una FR o CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir una inserción de aminoácido simple (residuo 52a de acuerdo con Kabat) luego del residuo 52 de H2, y residuos insertados (por ejemplo, los residuos 82a, 82b y 82c, etc., de acuerdo con Kabat) luego del residuo 82 de FR de cadena pesada. La numeración de Kabat de los residuos puede ser establecida para un anticuerpo determinado por medio de la alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo, con una secuencia numerada por Kabat "estándar".

La expresión "sustancialmente similar" o "sustancialmente igual", de acuerdo con la presente, denota un grado suficientemente alto de similitud entre dos valores numéricos (en general, uno asociado con un anticuerpo de la invención y el otro asociado con un anticuerpo de referencia/comparador) , de modo que el experto en el arte considerará de poca o nula significación biológica o estadística la diferencia entre los dos valores, dentro del contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores Kd) . La diferencia entre dichos dos valores es, preferentemente, inferior a alrededor del 50%, preferentemente, inferior a aproximadamente 40%, preferentemente, inferior a alrededor del 30%, preferentemente, inferior a alrededor del 20%, preferentemente, inferior a aproximadamente el 10%, como una función del valor para el anticuerpo de referencia/comparador .

La "afinidad de unión" se refiere, en general, a la intensidad de la suma total de interacciones no covalentes entre un solo sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno) . A menos que se indique lo contrario, de acuerdo con la presente, la "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción de 1:1 entre los miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno) . La afinidad de una molécula X para su compañero Y puede ser generalmente representada por la constante de disociación (Kd) . Convenientemente, el valor Kd es 1 x 10-7, 1 x 10-8, 5 x 10-8, 1 x 10-9, 3 x 10-9, 5 x 10-9, o aun 1 x 10-10 o superior. La afinidad puede ser medida por métodos comunes conocidos en el arte, que incluyen aquellos descriptos en la presente. Los anticuerpos de baja afinidad en general se unen a antigeno lentamente, y tienden a disociarse en forma gradual con rapidez, mientras que los anticuerpos de alta afinidad en general se unen a antígeno en forma más rápida, y tienden a permanecer ligados por más tiempo. Se conocen en el arte una diversidad de métodos de medición de la afinidad de unión, cualquiera de los cuales puede ser utilizado para los propósitos de la presente invención. A continuación, se describen realizaciones ilustrativas específicas.

En una realización, el "Kd" o "valor Kd" de acuerdo con esta invención sé mide por medio de un ensayo de unión de antígeno radiomarcado (RIA, por sus siglas en inglés) efectuado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antigeno, como se describe en el siguiente ensayo, que mide la afinidad de unión de solución de Fab para antigeno, mediante el equilibrio de Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (1251) en presencia de una serie de valoración de antígeno no marcado, y luego, se captura el antígeno ligado con una placa revestida con anticuerpo anti-Fab (Chen et al. (1999) : J. Mol. Biol., 293: 865-881) . A fin de establecer las condiciones para el ensayo, se revisten placas de microvaloración (Dynex) durante la noche con 5 mg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio, 50 mM (pH 9,6), y posteriormente, se bloquean con albúmina de suero bovino al 2% (p/v) en PBS durante dos a cinco horas, a temperatura ambiente (aproximadamente 23°C) . En una placa no adsorbente (Nunc #269620), se mezclan 100 pM o 26 pM de [ 1251 ] -antígeno con diluciones seriales de un Fab de interés (por ejemplo, consecuente con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en la referencia de Presta et al. (1997) : Cáncer Res., 57: 4593-4599) . El Fab de interés luego se incuba durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un período mayor (por ejemplo, 65 horas) , a fin de garantizar el logro de equilibrio. A continuación, las mezclas se transfieren a la placa de captura para la incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora) . Luego se remueve la solución, y la placa se lava ocho veces con Tween-20 al 0,1% en PBS. Una vez secadas las placas, se agregan 150 ml/pocillo de centellante (MicroScint-20 ; Packard) , y las placas se someten a recuento en un contador gamma Topcount (Packard) durante diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que proporcionan menos del 20%, o igual al 20%, de unión máxima se seleccionan para el uso en ensayos de unión competitiva. De acuerdo con otra realización, se mide el Kd o valor Kd usando ensayos de resonancia de plasmón de superficie, empleando un BIAcoreTM-2000, o un BIAcoreTM-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) , a 25°C, con chips C 5 de antigeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (UR) . Brevemente, se activan chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) con N-etil-N' - ( 3-dimetilaminopropil ) -carbodiimida clorhidrato (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) , de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se diluye antigeno con acetato de sodio, 10 mM, pH 4,8, a 5 mg/ml (~0,2 µ?) , antes de la inyección con un caudal de 5 ml/minuto, a fin de lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteina acoplada. Luego de la inyección de antigeno, se inyecta etanolamina, 1 M, de manera de bloquear los grupos no reaccionados. Para las mediciones de cinética, se inyectan diluciones sucesivas dobles de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con 0,05% de Tween-20 (PBST (sigla en inglés de "solución salina regulada con fosfato con Tween 20") a 25°C, con un caudal de aproximadamente 25 ml/min. En algunas realizaciones, se usan las siguientes modificaciones para el método de ensayo de resonancia de plasmón de superficie: se inmoviliza anticuerpo en chips biosensores CM5 a fin de lograr aproximadamente 400 UR, y para las mediciones de cinética, se inyectan diluciones sucesivas dobles de proteina blanco (por ejemplo, hepsina-IIIb o -Ule) (iniciando a partir de 67 nM) en tampón de PBST a 25°C con un caudal de aproximadamente 30 ul/minuto. Se calculan los índices de asociación (kon) y los índices de disociación (koff) usando un simple modelo de unión Langmuir de uno a uno (BIACORE® Evaluation Software versión 3.2), mediante la adaptación simultánea de los sensogramas de asociación y de disociación. Se calcula la constante de disociación de equilibrio (Kd) como la relación Koff/kon. Ver, por ejemplo, la referencia de Chen, Y. et al. (1999) : J. Mol. Biol . , 293: 865-881. Si el índice de asociación excede 106 M-l S-l por el ensayo de resonancia de plasmón de superficie anterior, entonces puede determinarse el índice de asociación usando una técnica de apagado fluorescente que mide el incremento o la disminución de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm; pase de banda de 16 nm) a 25°C, de un anticuerpo antiantigeno, 20 nM (forma Fab) , en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antigeno, medido en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con flujo de detención (Aviv Instruments) , o un espectrofotómetro 8000-series SLM-Aminco (ThermoSpectronic) con una probeta roja de agitación.

Un "índice asociado", "índice de asociación" o "kon" de acuerdo con la invención también puede determinarse con la misma técnica de resonancia de plasmón de superficie que se describe anteriormente usando un BIAcoreT -2000 o BIAcoreTM-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C con chips CM5 de antigeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (UR) . Brevemente, se activan chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) con clorhidrato de N-etil-N' - ( 3-dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se diluye antígeno con acetato de sodio, 10 mM, pH 4,8, en 5 µ?/p?? (~0,2 uM) antes de la inyección con un caudal de 5 µ?/minuto, a fin de lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteina acoplada. Luego de la inyección de antigeno, se inyecta etanolamina, 1 M, a fin de bloquear los grupos no reaccionados. Para las mediciones de cinética, se inyectan diluciones sucesivas dobles de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con 0,05% de Tween 20 (PBST) a 25°C con un caudal de flujo de aproximadamente 25 µ?/min. En algunas realizaciones, se usan" las siguientes modificaciones para el método de ensayo de resonancia de plasmón de superficie: se inmoviliza anticuerpo en chips biosensores CM5 a fin de lograr aproximadamente 400 UR, y para las mediciones de cinética, se inyectan diluciones sucesivas dobles de proteina blanco (por ejemplo, hepsina-IIIb o -lile) (iniciando a partir de 67 nM) en tampón de PBST a 25 °C, con un caudal de aproximadamente 30 ul/minuto. Se calculan los Indices de asociación (kon) y los índices de disociación (koff) usando un simple modelo de unión Langmuir de uno a uno (BIACORE® Evaluation Software versión 3.2), mediante la adaptación simultánea de los sensogramas de asociación y de disociación. Se calcula la constante de disociación de equilibrio (Kd) como la relación Koff/kon. Ver, por ejemplo, la referencia de Chen, Y. et al. (1999): J. Mol. Biol., 293: 865-881. Sin embargo, , si el índice de asociación excede 106 M-l S-l por el ensayo de resonancia de plasmón de superficie anterior, entonces puede determinarse preferentemente el índice de asociación usando una técnica de apagado fluorescente que mide el incremento o la disminución de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm; pase de banda de 16 nm) a 25°C, de un anticuerpo antiantígeno, 20 nM (forma Fab) , en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno, medido en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con flujo de detención (Aviv Instruments) , o un espectrofotómetro 8000-series SL -Aminco (ThermoSpectronic) con una probeta roja de agitación.

El término "vector", de acuerdo con la presente solicitud, tiene el propósito de hacer referencia a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha unido. Un tipo de vector es. un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN de doble filamento circular en la cual pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector de fagos. Otro tipo de vector es un vector viral, donde pueden ligarse segmentos de ADN en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la cual son introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores mamíferos episomales) . Otros vectores (por ejemplo, vectores mamíferos no episomales) pueden ser integrados en el genoma de la célula huésped con la introducción en la célula huésped, y de ese modo, son replicados junto con el genoma del huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales están funcionalmente unidos. Dichos vectores se denominan, en esta solicitud, "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente, "vectores recombinantes") . En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante a menudo se presentan en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, los términos "plásmido" y "vector" pueden usarse de modo indistinto, ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente utilizada.

Los términos "polinucleótido" o "ácido nucleico", utilizados de manera indistinta en esta solicitud, se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud, e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos , ribonucleótidos , bases o nucleótidos modificados, o sus análogos, o cualquier sustrato que pueda ser incorporado en un polímero por ADN o ARN polimerasa, o por una reacción de síntesis. Un polinucleótido puede comprender .nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Si se presenta, la modificación de la estructura de nucleótidos puede impartirse antes o después del montaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede ser interrumpida por componentes no nucleótidos. Un polinucleótido puede ser adicionalmente modificado luego de la síntesis, tal como, por conjugación con una marca. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "casquetes"; sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales con un análogo; modificaciones de internucleótidos , tales como aquellas con conexiones no cargadas (por ejemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con conexiones cargadas (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.); aquellas que contienen restos pendientes, tales como por ejemplo proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, ply-L-lisina, etc.); aquellas con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.); aquellas que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidantes, etc.); aquellas que contienea alquilantes; aquellas con conexiones modificadas (por ejemplo, ácidos nucleicos anoméricos alfa, etc.); al igual que formas no modificadas de los polinucleótidos . Asimismo, cualquiera de los grupos hidroxilo comúnmente presentes en los azúcares puede ser reemplazado, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegido por grupos protectores convencionales, o activado para la preparación de conexiones adicionales a nucleótidos adicionales; o puede ser conjugado con soportes sólidos o semisólidos. El terminal OH 5' y 3' puede ser fosforilado o sustituido con aminas o restos de grupos de casquete orgánicos, de 1 a 20 átomos de carbono. Además, pueden derivarse otros hidroxilos para . grupos protectores convencionales. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares de ribosa o desoxirribosa generalmente conocidas en el arte, por ejemplo, 2' -0-metilo-, 2'-0-alilo-, 2' -flúor- o 2' -azido-ribosa, análogos de azúcares carbociclicos, azúcares a-anoméricos , azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas, análogos aciclicos y análogos nucleósidos básicos tales como metil ribosida. Una o más conexiones de fosfodiéster pueden ser reemplazadas por grupos conectores alternativos. Estos grupos conectores alternativos incluyen, sin limitación, realizaciones donde fosfato es reemplazado por P(0)S ("tioato") , P(S)S ("ditioato") , (0)NR2 ("amidato") , P(0)R, P(0)OR', CO, o CH2 ("formacetal") , donde cada R o R' es independientemente H o alquilo (Cl-20 ) sustituido o no sustituido que opcionalmente contiene una conexión éter (-0-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No todas las conexiones en un polinucleótido deben ser necesariamente idénticas. La descripción precedente se aplica a todos los polinucleótidos a los que se hace referencia en la presente solicitud, entre ellos, ARN y ADN.

"Oligonucleótido", de acuerdo con la presente, se refiere, en general, a polinucleótidos cortos, generalmente de filamento simple, generalmente sintéticos, que, en general, si bien no necesariamente, tienen menos de alrededor de 200 nucleótidos de longitud. Los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" no son exclusivos entre si. La descripción anterior para polinucleótidos es igual y completamente aplicable a los oligonucleótidos .

"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos", con respecto a una secuencia de polipéptido o péptido, se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia de polipéptido o péptido específica, luego de la alineación de las secuencias y de la introducción de espacios, si fueran necesarios, a fin de lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación, para los propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos, puede lograrse de diversas maneras, que se encuentran dentro de la experiencia del arte, por ejemplo, usando programas informáticos de libre disponibilidad tales como los programas BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en el arte pueden determinar los parámetros apropiados para la alineación de secuencias, que incluyen cualquier algoritmo necesario para lograr la máxima alineación sobre la longitud total de las secuencias comparadas. Sin embargo, para los propósitos de la presente, los valores de porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos son generados usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2, donde el código de fuente completo para el programa ALIGN-2 se proporciona en la Tabla A a continuación. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 fue diseñado por Genentech, Inc., y se ha presentado el código de fuente con documentación del usuario en la Oficina de Derechos de Autor de los Estados Unidos, Washington D. C, 20559, donde se encuentra registrado bajo el Registro U. S. Copyright Nro. TXU510087. El programa ALIGN-2 es de libre acceso al público en Genentech, Inc., South San Francisco, California, o puede ser compilado del código de fuente, proporcionado, por ejemplo, en el documento WO 2007/001851. El programa ALIGN-2 debe ser compilado para el uso en un sistema operativo UNIX, preferentemente, UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias son establecidos por el programa ALIGN-2 y no varían.

En situaciones donde se emplea ALIGN-2 para comparaciones de secuencias de aminoácidos, el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos determinada A, con respecto a una secuencia de aminoácidos determinada B (lo que, alternativamente, puede ser parafraseado como una secuencia de aminoácidos determinada A que tiene o comprende un cierto porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a una secuencia de aminoácidos determinada B) se calcula de la siguiente manera: 100 veces la fracción X/Y donde X es la cantidad de residuos de aminoácidos clasificados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en la alineación de dicho programa de A y B, y donde Y es la cantidad total de residuos de aminoácidos en B. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no será igual al porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A.

En algunas realizaciones, dos o más secuencias de aminoácidos son por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, o 90% idénticas. En algunas realizaciones, dos o más secuencias de aminoácidos son por lo menos 95%, 97%, 98%, 99%, o aun 100% idénticas. A menos que se establezca específicamente lo contrario, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos utilizados en la presente se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa informático ALIGN-2.

El término "hepsina", de acuerdo con la presente, se refiere, a menos que sea especifica o contextualmente indicado de otro modo, a cualquier polipéptido de hepsina nativo o variante. El término "secuencia nativa" abarca en forma especifica formas truncadas naturales (por ejemplo, una secuencia de dominio extracelular o una secuencia de subunidad de transmembrana) , formas variantes naturales (por ejemplo, formas alternativamente empalmadas) y variantes alélicas naturales. El término "hepsina de tipo salvaje" se refiere, en general, a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de una proteina de hepsina natural. El término "secuencia de hepsina de tipo salvaje" se refiere, en general, a una secuencia de aminoácidos hallada en una hepsina natural. En una realización, un polipéptido de hepsina de secuencia nativa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:46 (ver Figura 7). En una realización, un polipéptido de hepsina de secuencia nativa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 (ver Figura 8 ) .

"Variante de polipéptido de hepsina", o sus variaciones, significa un polipéptido de hepsina, en general, un polipéptido de hepsina activo, como se define en esta solicitud, que tiene por lo menos alrededor de 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a cualquiera de las secuencias de polipéptidos de hepsina de secuencia nativa como se describe en la presente. Dichas variantes de polipéptidos de hepsina incluyen, por ejemplo, polipéptidos de hepsina donde se agregan o deletean uno o más residuos de aminoácidos, en el término N o C de una secuencia de aminoácidos nativa. Comúnmente, una variante de polipéptido de hepsina tendrá por lo menos alrededor de 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente, por lo menos alrededor de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos, con respecto a una secuencia de polipéptido de hepsina de secuencia nativa como se revela en la presente. Comúnmente, los polipéptidos variantes de hepsina tienen por lo menos alrededor de 10 aminoácidos de longitud, alternativamente, por lo menos alrededor de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600 aminoácidos de longitud o más. En forma opcional, los polipéptidos variantes de hepsina tendrán no más de una sustitución de aminoácido conservadora en comparación con una secuencia de polipéptido de hepsina nativa, alternativamente, no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 sustituciones de aminoácidos conservadoras, en comparación con la secuencia de polipéptido de hepsina nativa.

Un "inhibidor de tirosina quinasa" es una molécula que inhibe hasta cierto alcance la actividad de tirosina quinasa de una tirosina quinasa tal como un receptor de hepsina.

El término "inhibir" significa disminuir o reducir una actividad, función, o cantidad, en comparación con una referencia .

La "expresión" de proteina se refiere a la conversión de a información codificada en un gen, en ARN mensajero (ARNm) luego, a la proteina.

En la presente, una muestra o célula que "expresa" una roteina de interés (tal como hepsina) es aquella en la cual e determina que el ARNm que codifica la proteina, o la proteína, incluso sus fragmentos, está presente en la muestra o célula.

Un "inmunoconj ugado" (denominado, en forma indistinta, "conjugado de anticuerpo-fármaco" o "ADC", según su sigla en inglés) significa un anticuerpo conjugado con uno o más agentes citotóxicos, tales como un agente quimioterapéutico, un fármaco, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina de proteína, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, de planta, o animal, o sus fragmentos), o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconj ugado) .

Un anticuerpo "de bloqueo" o un anticuerpo "antagonista" es aquel que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno al que se une. Los anticuerpos bloqueantes o anticuerpos antagonistas preferidos inhiben por completo la actividad biológica del antígeno.

Un "anticuerpo desnudo" es un anticuerpo que no está conjugado con una. molécula heteróloga, tal como una porción citotóxica o radiomarca.

Un anticuerpo que tiene una "característica biológica" de un anticuerpo designado es aquel que posee una o más de las características biológicas de dicho anticuerpo, que lo distinguen de otros anticuerpos que se unen al mismo antígeno.

A fin de identificar sistemáticamente los anticuerpos que se unen a un epítopo en un antígeno ligado por un anticuerpo de interés, puede efectuarse un ensayo de bloqueo cruzado de rutina, tal como aquel descripto en la referencia titulada Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lañe (1988) .

A fin de incrementar la semivida de los anticuerpos o polipéptidos que contienen las secuencias de aminoácidos de esta invención, puede adjuntarse un epítopo de unión de receptor de rescate, al anticuerpo (especialmente, un fragmento de anticuerpo) , como se describe, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos de América Nro. 5.739.277. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica el epítopo de unión de receptor de rescate, puede ligarse en marco a un ácido nucleico que codifica una secuencia de polipéptido de esta invención, de modo que la proteína de fusión expresada por la molécula de ácido nucleico diseñada comprenda el epitopo de unión de receptor de rescate y una secuencia de polipéptido de esta invención. De acuerdo con la presente, el término "epitopo de unión de receptor de rescate" se refiere a un epitopo de la región Fe de una molécula de IgG (por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, o IgG4) que es responsable del aumento de la semivida sérica in vivo de la molécula de IgG (por ejemplo, Ghetie et al., Ann. Rev. Immunol . 18:739-766 (2000), Tabla 1) . Los anticuerpos con sustituciones en una de sus regiones Fe y mayores semividas séricas se describen también en los documentos O 00/42072, WO 02/060919; Shields et al., J. Biol. Chem. , 276: 6591-6604 (2001); Hinton, J. Biol. Chem. 279: 6213-6216 (2004)) . En otra realización, la semivida sérica puede ser también aumentada, por ejemplo, mediante la unión de otras secuencias de polipéptido. Por ejemplo, los anticuerpos u otros polipéptidos útiles en los métodos de la invención pueden unirse a albúmina sérica o a una porción de albúmina sérica que se une al receptor FcRn o un péptido de unión de albúmina sérica, de modo que la albúmina sérica se une al anticuerpo o polipéptido, por ejemplo, secuencias de polipéptido descriptas en WO01/45746. En una realización preferida, el péptido de albúmina sérica por ser unido comprende una secuencia de aminoácidos de DICLPRWGCL (SEQ ID NO: (espacio en blanco) ) . En otra realización, la semivida de un Fab se incrementa por estos métodos. Ver, además, la referencia de Dennis et al. J. Biol. Chem.' 277: 35035-35043 (2002), para secuencias de péptidos de unión de albúmina sérica.

El término "fragmento" significa una porción de un polipéptido o molécula de ácido nucleico que contiene, preferentemente, por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o más de la longitud entera del polipéptido o la molécula de ácido nucleico de referencia. Un fragmento puede contener 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ó 100, 200, 300, 400, 500, 600, o más nucleótidos, o 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 190, 200 aminoácidos o más.

Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se usan de modo indistinto en el más amplio sentido, e incluyen anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos monoclonales de longitud completa o intactos), anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes , anticuerpos multiespecificos (por ejemplo, anticuerpos biespecificos , siempre que exhiban la actividad biológica deseada) y también pueden incluir ciertos fragmentos de anticuerpos (como se describe en mayor detalle en esta solicitud) . Un anticuerpo puede ser humano, humanizado, o de afinidad madurada.

El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensamente en su secuencia entre los anticuerpos, y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antigeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye en forma pareja a través de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones de determinación de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) , o regiones hipervariables , tanto en los dominios variables de cadena ligera como de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan las regiones de marco (FR, por sus siglas en inglés) . Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden independientemente cuatro regiones FR, que adoptan, en gran parte, una configuración de lámina ß, conectadas por tres regiones CDR, que forman bucles que conectan la estructura de lámina ß, y en algunos casos, forman parte de ella. Las CDR en cada cadena se sostienen juntas en estrecha proximidad por medio de las regiones FR, y con las regiones CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión de antigeno de los anticuerpos (ver la referencia de Kabat et al.: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Los dominios constantes no están directamente involucrados en la unión de un anticuerpo a un antigeno, sino que exhiben diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpo.

La digestión de papaina de los anticuerpos produce dos fragmentos de unión de antigeno idénticos, denominados fragmentos "Fab", cada uno, con un sitio de unión de antigeno simple, y un fragmento "Fe" residual, cuya denominación refleja su capacidad para cristalizarse fácilmente. El tratamiento de pepsina logra un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación de antigeno y es capaz aún de entrecruzar antigeno.

"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de unión y reconocimiento de antígeno completo. En una especie Fv de dos cadenas, esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en asociación estrecha, no covalente. En una especie Fv de cadena simple, un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera pueden estar covalentemente unidos por un conector péptido flexible, de modo que las cadenas pesada y ligera puedan asociarse en una estructura "dimera" análoga a aquella en una especie Fv de dos cadenas. En esta configuración, las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión de antigeno sobre la superficie del dimero VH-VL. Colectivamente, las seis CDR confieren especificidad de unión de antigeno al anticuerpo. Sin embargo, aun un dominio variable simple (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDR especificas para un antigeno) tiene la capacidad de reconocer y unir antigeno, si bien con una menor afinidad que el sitio de unión entero.

El fragmento Fab además contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de algunos " residuos en el término carboxi del dominio CH1 de cadena pesada, que incluyen una o más cisteinas de la región de bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente para Fab' donde el residuo o los residuos cisteina de los dominios constantes portan por lo menos un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpos F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab ' que tenían cisteínas de bisagra entre ellos. Se conocen además otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.

Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado pueden ser asignadas a uno de dos tipos claramente distintivos, denominados kappa (k) y lambda (1), sobre la base de las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

De acuerdo con las secuencias de aminoácidos de los dominios constantes de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden ser asignadas a diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, d, e, g y m, respectivamente. Las estructuras de subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden solo una porción de un anticuerpo intacto, donde, preferentemente, la porción retiene por lo menos una, con mayor preferencia, la mayoría o todas de las funciones normalmente asociadas con dicha porción cuando se presenta en un anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab1, F(ab')2, y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos de cadena simple; y anticuerpos multiespecífieos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. En una realización, un fragmento de anticuerpo comprende un sitio de unión de antígeno del anticuerpo intacto y, en consecuencia, retiene la capacidad de unión de antígeno. En otra realización, un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, aquel que comprende la región Fe, retiene por lo menos una de las funciones biológicas normalmente asociadas con la región Fe cuando se presenta en un anticuerpo intacto, tal como la unión de FcRn, la modulación de la semivida del anticuerpo, la función ADCC y la unión de complemento. En una realización, un fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monovalente que tiene una semivida in vivo sustancialmente similar a un anticuerpo intacto. A modo de ejemplo, dicho fragmento de anticuerpo puede comprender un brazo de unión de antígeno ligado a una secuencia Fe capaz de conferir la estabilidad in vivo al fragmento.

Los términos "región hipervariable", "HVR" o "HV", utilizados en la presente solicitud, se refieren a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en su secuencia, y/o forman bucles estructuralmente definidos. En general, los anticuerpos comprenden seis regiones hipervariables; tres en el VH (Hl, H2, H3) y tres en el VL (Ll, L2, L3) . Se utilizan una cantidad de delineaciones de región hipervariable, y se contemplan en esta solicitud. Las regiones de determinación de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) de Kabat se sustentan en la variabilidad de secuencia, y son las más comúnmente utilizadas (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) . Chothia se refiere, en cambio, a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia y Lesk, J. Mol. Bio'l. 196: 901-917 (1987)) . Las regiones hipervariables de AbM representan un término medio entre las CDR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia, y son utilizadas por el programa informático de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Las regiones hipervariables de "contacto" se sustentan en un análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles. Los residuos de cada una de estas regiones hipervariables se observan a continuación.

Bucle Kabat AbM Chothia Contacto Ll L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 Hl H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (Numeración Kabat) Hl H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Numeración Chothia) H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101 Las regiones hipervariables pueden comprender "regiones hipervariables extendidas" de la siguiente manera: 24-36 ó 24-34 (Ll), 46-56 ó 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el VL, y 26-35 (Hl), 50-65 ó 49-65 (H2) y 93-102, 94-102 ó 95-102 (H3) en el VH. Los residuos de dominio variable se numeran de acuerdo con Kabat et al., supra, para cada una de estas definiciones.

Los residuos de "marco" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable diferentes de los residuos de región hipervariable como se define en esta solicitud.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ¦ ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) donde residuos de una región hipervariable del receptor están reemplazados por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) , tal como ratón, rata, conejo o primate no humano, que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de región de marco (FR) de la inmunoglobulina humana están reemplazados por residuos correspondientes no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones son efectuadas a fin de refinar adicionalmente el comportamiento del anticuerpo. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de por lo menos uno, y habitualmente, dos, dominios variables, donde la totalidad, o sustancialmente la totalidad de los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado además comprenderá, opcionalmente, por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), habitualmente, aquella de una inmunoglobulina humana. Para mayores detalles, ver, por ejemplo, las referencias de Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al.: Nature, 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992) . Ver, además, por ejemplo, las siguientes referencias y artículos de reseña allí citados: Vaswani y Hamilton: Ann. Allergy, Asthma & Immunol . , 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions, 23: 1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech., 5: 428-433 (1994) .

Los anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) tienen una porción de la cadena pesada y/o ligera idéntica u homologa a las correspondientes secuencias en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de las cadenas son idénticas u homologas a las correspondientes secuencias en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, al igual que fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (Patente de los Estados Unidos de América Nro. 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)) . El anticuerpo humanizado, como se usa en esta solicitud, es un subgrupo de anticuerpos quiméricos.

Los fragmentos de anticuerpos "Fv de cadena simple" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL de anticuerpo, donde estos dominios se presentan en una sola cadena de polipéptido . En general, el polipéptido de scFv además comprende un conector de polipéptido entre los dominios VH y VL, lo que permite que el ScFv forme la estructura deseada para la unión de antigeno. Para una reseña de scFv, ver, por ejemplo, la referencia de Pluckthün, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds . , Springer-Verlag, New York, pp. 269-315, (1994) .

Un "antigeno" es un antigeno predeterminado al cual puede unirse selectivamente un anticuerpo. El antigeno blanco puede ser polipéptido, carbohidrato, ácido nucleico, lipido, hapteno u otro compuesto natural o sintético. Preferentemente, el antigeno blanco es un polipéptido.

El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpos pequeños con dos sitios de unión de antigeno, donde dichos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptido (VH-VL) . Mediante el uso de un conector demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios están obligados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena, y crean dos sitios de unión de antígeno. Los diacuerpos se describen en mayor detalle, por ejemplo, en los documentos EP 404.097; WO 93/11161;' y Hollinger et al. PNAS USA, 90: 6444-6448 (1993) .

Un "anticuerpo humano" es aquel que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a aquella de un anticuerpo producido por un humano, o que ha sido producido usando cualquiera de las técnicas para la preparación de anticuerpos humanos reveladas en la presente. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión de antígeno no humanos .

Un anticuerpo "de afinidad madurada" es aquel con una o más alteraciones en una o más de sus CDR, que logran una mejoría en la afinidad del anticuerpo para el antígeno, en comparación con un anticuerpo progenitor que no posee dichas alteraciones. Los anticuerpos de afinidad madurada preferidos tendrán afinidades nanomolares o aun picomolares para el antígeno blanco. Los anticuerpos de afinidad madurada pueden producirse usando ciertos procedimientos conocidos en el arte. Por ejemplo, Marks et al.: Bio/Technology, 10: 779-783 (1992), describen la maduración para afinidad por medio de la mezcla de dominios VH y VL. La mutagénesis de azar de residuos de marco y/o CDR es descripta, por ejemplo, por Barbas et al.: Proc Nat . Acad. Sci. USA, 91: 3809-3813 (1994); Schier et al., Gene, 169: 147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154 (7) : 3310-9 (1995); y Hawkins et al, J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992) .

Las "funciones efectoras" de anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fe (una región Fe de secuencia nativa o una región Fe variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo, y varían con el isotipo de anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: la citotoxicidad dependiente de complemento y unión Clq; la unión de receptor Fe; la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC, según sus siglas en inglés); la fagocitosis; la regulación descendente de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de célula B) ; y la activación de células B.

La "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la cual Ig secretada unida a receptores Fe (FcR) presentes en ciertas células citotóxicas (por ejemplo, linfocitos citoliticos naturales (NK) , neutrófilos y macrofagos) permite que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula blanco que porta antígeno, y a continuación, maten la célula blanco con citotoxinas. Los anticuerpos "arman" las células citotóxicas y son absolutamente necesarias para dicha muerte. Las células primarias para la mediación de ADCC, linfocitos citoliticos naturales, expresan solo FcgRIII, mientras que los monocitos expresan FcgRI, FcgRII y FcgRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3, página 464, de la referencia de Ravetch y Kinet: Annu. Rev. Immunol . , 9: 457-92 (1991). A fin de evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés, puede efectuarse un ensayo de ADCC in vitro, tal como aquel descripto en las Patentes de los Estados Unidos Nro. 5.500.362/ 5.821.337/ ó la Patentes de los Estados Unidos de Presta 6.737.056. Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC, según su sigla en inglés) y linfocitos citoliticos naturales (NK) . Alternativa o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés puede ensayarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como aquel revelado en la referencia de Clynes et al. PNAS (USA) , 95: 652-656 (1998) .

Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcR y realizan funciones efectoras. Preferentemente, las células expresan por lo menos FcgRIII y realizan funciones efectoras ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que median ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) , linfocitos citoliticos naturales (NK) , monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos, preferentemente, PBMC y NK. Las células efectoras pueden ser aisladas de una fuente natural, por ejemplo, de sangre.

El "receptor Fe" o "FcR" describe un receptor que se une a la región Fe de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia nativa. Además, un FcR preferido es aquel que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) , e incluye receptores de las subclases FcgRI, FcgRII y FcgRIII, que incluyen variantes alélicas y, alternativamente, formas empalmadas de dichos receptores. Los receptores FcgRII incluyen FcgRI IA (un "receptor activador") y FcgRI IB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en sus dominios citoplásmicos . El receptor activador FcgRIIA contiene un motivo de activación a base de tirosina de inmunorreceptor (ITAM, por sus siglas en inglés) en su dominio citoplásmico . El receptor inhibidor FcgRIIB contiene un motivo de inhibición a base de tirosina de inmunorreceptor (ITIM, por sus siglas en inglés) en su dominio citoplásmico (ver, por ejemplo, la referencia de Daéron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)) . Los FcR son reseñados en las referencias de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4: 25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. , 126: 330-41 (1995) . Otros FcR, incluidos aquellos por ser identificados en el futuro, están contemplados por el término "FcR" de la presente solicitud. El término además incluye el receptor neonato, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol., 117: 587 (1976), y Kim et al., J. Immunol., 24: 249 (1994)) y la regulación de la homeostasis de inmunoglobulinas . WO 00/42072 (Presta) describe variantes de anticuerpos con mayor o menor unión a FcRs . El contenido de dicha publicación de patente se incorpora específicamente en la presente a modo de referencia. Ver, además, la referencia de Shields et al., J. Biol . Chem. 9 (2) : 6591-6604 (2001) .

Los métodos para la medición de la unión a FcRn son conocidos (ver, por ejemplo, las referencias de Ghetie, 1997; Hinton, 2004). La unión a FcRn humano in vivo y la semivida sérica de polipéptidos de unión de alta afinidad a FcRn humano pueden ensayarse, por ejemplo, en ratones transgénicos o estirpes celulares humanas transfectadas que expresan FcRn humano, o en primates a los que se les administró polipéptidos Fe variantes.

La "citotoxicidad dependiente de complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula blanco en presencia de complemento. La activación de la vía de complemento clásica se inicia mediante la unión del primer componente del sistema de complemento (Clq) a anticuerpos (de la subclase apropiada), que están unidos a su antigeno cognado. A fin de evaluar la activación de complemento, puede efectuarse un ensayo de CDC, por ejemplo, como se describe en la referencia de Gazzano-Santoro et al., J. Immunol . Methods, 202: 163 (1996) .

Las variantes de polipéptido con secuencias alteradas de aminoácidos de región Fe y mayor o menor capacidad de unión Clq se describen en la Patente de los Estados Unidos Nro. 6.194.551 Bl y en el documento WO 1999/51642. Los contenidos de dichas publicaciones de patente se incorporan de manera especifica en la presente a modo de referencia. Ver, además, la referencia de Idusogie et al. J. Immunol., 164: 4178-4184 (2000) .

El término "polipéptido que comprende región Fe" se refiere a un polipéptido, tal como un anticuerpo o una inmunoadhesina, que comprende una región Fe. La lisina C-terminal (residuo 447 de acuerdo con el sistema de numeración EU) de la región Fe puede removerse, por ejemplo, durante la purificación del polipéptido, o por medio del diseño recombinante del ácido nucleico que codifica el polipéptido. En consecuencia, una composición que comprende un polipéptido que tiene una región Fe de acuerdo con esta invención puede comprender polipéptidos con K447, con todos los residuos K447 removidos, o una mezcla de polipéptidos con residuos K447 y sin residuos K447.

Un "marco humano aceptor" para los propósitos de esta invención es un marco que comprende la secuencia de aminoácidos de un marco VL o VH derivado de un marco de inmunoglobulina humana, o de un marco de consenso humano. Un marco humano aceptor "derivado de" un marco de inmunoglobulina humana o un marco de consenso humano puede comprender la misma secuencia de aminoácidos, o puede contener cambios de secuencias de aminoácidos preexistentes. Cuando se presentan cambios de aminoácidos preexistentes, preferentemente, se presentan no más de 5 y, preferentemente, 4 o menos o 3 o menos cambios de aminoácidos preexistentes. Cuando se presentan cambios de aminoácidos preexistentes en una VH, preferentemente, dichos cambios se presentan solo en tres, dos o una de las posiciones 71H, 73H y 78H; por ejemplo, los residuos de aminoácidos en dichas posiciones pueden ser 71A, 73T y/o 78A. En una realización, el marco humano aceptor VL es idéntico, en su secuencia, a la secuencia de marco de inmunoglobulina humana VL o a la secuencia de marco de consenso humano.

Un "marco de consenso humano" es un marco que representa el residuo de aminoácido de mayor aparición en una selección de secuencias de marco de inmunoglobulina humana VL o VH. En general, la selección de secuencias VL o VH de inmunoglobulina humana es de un subgrupo de secuencias de dominio variable. En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en la referencia de Kabat et al. En una realización, para el VL, el subgrupo es el subgrupo kappa I como en la referencia de Kabat et al. En una realización, para el VH, el subgrupo es el subgrupo III como en la referencia de Kabat et al.

Un "marco de consenso del subgrupo III de VH" comprende la secuencia de consenso obtenida de las secuencias de aminoácidos en el subgrupo III de variable pesada de Kabat et al. En una realización, la secuencia de aminoácidos de marco de consenso del subgrupo III de VH comprende por lo menos una porción o la totalidad de cada una de las siguientes secuencias: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID N0:42)-H1-WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: ) -H2-RFTISRDNSKNTLYLQ NSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO:44)-H3- GQGTLVTVSS (SEQ ID NO:).

Un "marco de consenso de subgrupo I de VL" comprende la secuencia de consenso obtenida de las secuencias · de aminoácidos en el subgrupo kappa de variable ligera de Kabat et al. En una realización, la secuencia de aminoácidos de marco de consenso de subgrupo I de VH comprende por lo menos una porción o la totalidad de cada una de las siguientes secuencias : DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: ) -Ll-WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: ) -L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: ) -L3-FGQGTKVEIK (SEQ ID NO:).

De acuerdo con la presente, "mutante de anticuerpo" o "variante de anticuerpo" se refiere a una variante de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo, donde uno o más de los residuos de aminoácidos del anticuerpo dependiente de especie han sido modificados. Dichas mutantes tienen, necesariamente, menos de 100% de identidad o similitud de secuencia con respecto al anticuerpo dependiente de especie. En una realización, la mutante de anticuerpo tendrá una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 75% de identidad o similitud de secuencia de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de ya sea el dominio variable de cadena pesada o ligera del anticuerpo dependiente de la especie, más preferentemente, por lo menos 80%, más preferentemente, por lo menos 85%, más preferentemente, por lo menos 90%, y con mayor preferencia, por lo menos 95%. La identidad o similitud con respecto a esta secuencia se define en la presente como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos (es decir, el mismo residuo) o similares (es decir, residuo de aminoácido del mismo grupo, sobre la base de propiedades de cadenas laterales comunes, ver a continuación) con respecto a los residuos de anticuerpo dependiente de la especie, luego de la alineación de las secuencias y de la introducción de espacios, si son necesarios, a fin de lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia. Se interpretará que ninguna de las extensiones, deleciones o inserciones N-terminales, C-terminales o internas en la secuencia de anticuerpo fuera del dominio variable afecta la identidad o similitud de secuencia.

Un "trastorno" o una "enfermedad" es cualquier condición que se beneficia con el tratamiento con una sustancia/molécula o un método de la invención. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas, que abarcan aquellas¦ condiciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Ejemplos no limitativos de trastornos por tratar con esta invención abarcan tumores malignos y benignos, carcinoma, blastoma y sarcoma.

"Tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como profiláctico o a medidas preventivas.

Aquellos que necesitan tratamiento abarcan aquellos que tienen un tumor . benigno, precanceroso o no metastásico, igual que aquellos donde debe prevenirse la aparición recurrencia del cáncer.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un agente terapéutico para tratar o prevenir una enfermedad o un trastorno en un mamífero. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del agente terapéutico puede reducir la cantidad de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor primario; inhibir (es decir, enlentecer hasta cierto alcance, y preferentemente, detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibir (es decir, enlentecer hasta cierto alcance, y preferentemente, detener) la metástasis tumoral; inhibir, hasta cierto alcance, el crecimiento tumoral; y aliviar hasta cierto alcance uno o más de los síntomas asociados con el trastorno. Al alcance que el fármaco pueda prevenir el crecimiento de células cancerosas existentes, o matarlas, puede ser citostático o citotóxico. Para la terapia contra el cáncer, la eficacia in vivo, por ejemplo, puede medirse mediante la evaluación de la duración de la sobrevida, el tiempo al avance de la enfermedad (TTP, según su sigla en inglés) , los índices de respuesta (RR, según su sigla en inglés), la duración de la respuesta, y/o la calidad de vida.

Los términos "cáncer" y "canceroso" describen o se refieren a la condición fisiológica en mamíferos, que se caracteriza típicamente por el crecimiento celular desregulado. Se incluyen en esta definición los tipos de cáncer benigno y maligno. El "cáncer de etapa temprana" o "tumor de etapa temprana" significa un tipo de cáncer que no es invasivo ni metastásico, o que se clasifica como un cáncer de Etapa 0, I, o II. Ejemplos de tipos de cáncer incluyen, sin limitación, carcinoma, linfoma, blastoma (que incluye meduloblastoma y retinoblastoma) , sarcoma (que incluye liposarcoma y sarcoma de célula sinovial) , tumores neuroendocrinos (que incluyen tumores carcinoides, gastrinoma, e insulinoma) , mesotelioma, schwanoma (que incluye neuroma acústico) , meningioma, adenócarcinoma, melanoma, y leucemia o enfermedades malignas linfoides. Ejemplos más particulares de dichos tipos de cáncer incluyen cáncer de célula escamosa (por ejemplo, cáncer de célula escamosa epitelial) , cáncer de pulmón, que incluye cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC, según su sigla en inglés), cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC, según su sigla en inglés) , adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o estomacal, que incluye cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama (que incluye cáncer de mama metastásico) , cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de las glándulas salivales, cáncer de riñon o renal, cáncer de próstata, cáncer de la vulva, cáncer tiroideo, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma peniano, cáncer testicular, cáncer esofágico, tumores del tracto biliar, al igual que cáncer de cabeza y cuello y mieloma múltiple.

El término "precanceroso" se refiere a una condición o al crecimiento que típicamente precede al cáncer, o que se desarrolla hasta un tipo de cáncer. Un crecimiento "precanceroso" tendrá células que se caracterizan por la regulación, proliferación o diferenciación del ciclo celular anormal, que pueden determinarse por medio de marcadores de la regulación del ciclo celular, proliferación celular o diferenciación .

La "displasia" significa cualquier crecimiento o desarrollo de tejido, órgano o células anormal. Preferentemente, la displasia es de alto grado o precancerosa .

La "metástasis" significa la diseminación de cáncer desde su sitio primario hasta otros sitios del organismo. Las células cancerosas pueden desprenderse de un tumor primario, penetrar en los vasos linfáticos y sanguíneos, circular a través del torrente sanguíneo, y crecer en un foco distante (metástasis) en tejidos normales en otro lugar del organismo. La metástasis puede ser local o distante. La metástasis es un proceso secuencial, dependiente de las células tumorales que se desprenden del tumor primario, viajan a través del torrente sanguíneo y se detienen en un sitio distante. En el nuevo sitio, las células establecen un suministro de sangre, y pueden desarrollarse para formar una masa potencialmente mortal .

Este comportamiento es regulado tanto por vías moleculares estimulantes como inhibitorias dentro de la célula tumoral, y las interacciones entre la célula tumoral y las células huésped en el sitio distante son también significativas .

El término "no metastásico" significa un tipo de cáncer benigno o que permanece en el sitio primario y no ha penetrado en el sistema de vasos linfáticos o sanguíneos o en tejidos diferentes del sitio primario. En general, un tipo de cáncer no metastásico es cualquier tipo de cáncer de Etapa 0, I, o II, y ocasionalmente, un tipo de cáncer de Etapa III.

Un "tumor primario" o "cáncer primario" significa el cáncer original y no una lesión metastásica ubicada en otro tejido, órgano, o en otra región en el organismo del sujeto.

Un "tumor benigno" o "cáncer benigno" significa un tumor que permanece localizado en el sitio de origen y que no tiene la capacidad de infiltrar, invadir, o hacer metástasis en un sitio distante.

La "carga tumoral" significa la cantidad de células cancerosas, el tamaño de un tumor, o la cantidad de cáncer en el organismo. La carga tumoral también se denomina carga de tumor .

La "cantidad de tumores" significa la cantidad de tumores .

El término "sujeto" significa un mamífero, que incluye, sin limitación, un mamífero humano o no humano, tal como una vaca, un caballo, perro, oveja o gato. Preferentemente, el sujeto es un ser humano.

El término "terapia anticancerígena" se refiere a una terapia útil en el tratamiento del cáncer. Ejemplos de agentes terapéuticos anticancerígenos incluyen, sin limitación, agentes quimioterapéuticos, agentes inhibidores del crecimiento, agentes citotóxicos, agentes utilizados en la terapia de radiación, agentes antiangiogénicos, agentes apoptóticos, agentes contra la tubulina y otros agentes para el tratamiento del cáncer, anticuerpos anti-CD20, inhibidores de factores de crecimiento derivados de plaquetas (por ejemplo, GleevecT (Imatinib mesilato) ) , un inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib) , interferones, citoquinas, antagonistas (por ejemplo, anticuerpos neutralizantes) que se unen a uno o más de los siguientes blancos: ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-beta, BlyS, APRIL, BCMA o receptores de VEGF, TRAIL/Apo2, y otros agentes bioactivos y químicos orgánicos, etc. Se contemplan también en esta invención las combinaciones de los anteriores.

El término "agente citotóxico" de acuerdo con la presente se refiere a un agente que inhibe o evita la función de células, y/o que causa la destrucción de células. El término tiene la intención de incluir isótopos radiactivos (por ejemplo, 1131, 1125, Y90 y Rel86) , agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, de planta o animal, o sus 'fragmentos.

Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y CYTOXAN® ciclofosfamida ; sulfonatos de alquilo tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas, que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilomelamina; acetogeninas (en especial, bulatacina y bulatacinona) ; una camptotecina (que incluye el análogo sintético topotecano) ; briostatina; calistatina; CC-1065 (que incluye sus análogos sintéticos de adozelesina, carzelesina y bizelesina) ; criptoficinas (en particular, criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina ; duocarmicina (que incluye los análogos sintéticos K -2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictiina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucil, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos tales como los antibióticos enediina (por ejemplo, caliqueamicina, en especial, caliqueamicina gammall y caliqueamicina omegall (ver, por ejemplo, la referencia de Ange , Chem. Intl. Ed. Engl . , 33: 183-186 (1994)); dinemicina, que incluye dinemicina A; bifosfonatos, tales como clodronato; una esperamicina; al igual que el cromóforo neocarzinostatina y cromóforos antibióticos de cromaproteina enediina relacionados; aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas , dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina ADRIAMYCIN® (que incluye morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina y desoxidoxorrubicina) , epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina ; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluoruracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina , trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; agentes antiadrenérgicos tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; abastecedores de ácido fólico tales como ácido frolinico; aceglatona; aldofosfamida glicósido; ácido aminolevulinico; eniluracilo ; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglucid; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas ; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona ; ácido podofilinico; 2-etilhidrazida ; procarbazina; complejo polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2' ,2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (en especial, toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina) ; uretano; vindesina; dacarbazina; raanomustina; mitobronitol ; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N. J.), ABRAXANEÓ libre de cromóforo, formulación de nanoparticulas diseñada con albúmina, de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) y docetaxel TAXOTERE® (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France) ; cloranbucil; GEMZARÓ gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etoposida (VP-16) ; ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; NAVELBINEÓ vinorrelbina; novantrona; teniposida; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecano (Camptostar , CPT-11) (que incluye el régimen de tratamiento de irinotecano con 5—FU y leucovirina) ; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluormetilornitina (DMFO) ; retinoides tales como ácido retinoico; capecitabina; combrestatina ; VELCADE bortezomib; REVLIMID lenalidomida; leucovirina (LV) ; oxaliplatino, que incluye el régimen de tratamiento de oxaliplatino (FOLFOX); inhibidores de PKC-alfa, Raf, H-Ras, EGFR (por ejemplo, erlotinib (TarcevaTM) ) y VEGF-A, que reducen la proliferación celular; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

Se incluyen además en esta definición los agentes antihormonales que actúan de manera de regular o inhibir la acción de las hormonas sobre tumores, tales como antiestrógenos y moduladores selectivos del receptor de estrógeno (SER , según su sigla en inglés) , que incluyen, por ejemplo, tamoxifeno (que incluye NOLVADEX® tamoxifeno) , raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y FARESTON -toremifeno; inhibidores de la aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógeno en las glándulas suprarrenales, por ejemplo, (5) -imidazoles, aminoglutetimida, MEGASE® megestrol acetato, AROMASIN® exemestano, formestanio, fadrozol, RIVISOR® vorozol, FEMARA® letrozol y ARIMIDEX® anastrozol; y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserrelina; al igual que troxacitabina (un análogo de 1,3-dioxolano nucleósido citosina) ; oligonucleótidos antisentido, en particular, aquellos que inhiben la expresión de genes en vías de señalización que participan en la proliferación celular anormal, por ejemplo, PKC-alfa, Raf y H-Ras; ribozimas tales como un inhibidor de la expresión de VEGF (sigla en inglés de "factor de crecimiento endotelial vascular") (por ejemplo, ribozima ANGIOZYME®) y un inhibidor de la expresión de HER2; vacunas, tales como vacunas de terapia génica, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN® y vacuna VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; LURTOTECAN® inhibidor de la topoisomerasa 1; ABARELIX® rmRH; Vinorelbine y esperamicinas (ver Patente de los Estados Unidos de América Nro. 4.675.187), y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

El término "profármaco", de acuerdo con la presente solicitud, se refiere a un precursor o una forma derivada de un agente farmacéuticamente activo, que es menos citotóxico para las células tumorales, en comparación con el fármaco original, y que es capaz de ser enzimáticamente activado o convertido en la forma original más activa. Ver, por ejemplo, las referencias de Wilman, "Prodrugs in Cáncer Chemotherapy", Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986); y Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985) . Los profármacos de esta invención incluyen, sin limitación, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos modificados con D-aminoácidos , profármacos glicosilados , profármacos que contienen ß-lactámicos, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida; profármacos de 5-fluorcitosina y otros profármacos de 5-fluoruridina que pueden ser convertidos en el fármaco libre citotóxico más activo. Ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden derivarse hasta una forma de profármaco para el uso en esta invención incluyen, sin limitación, aquellos agentes quimioterapéuticos que se describen con anterioridad.

El término "terapia de radiación" significa el uso de rayos beta o rayos gamma dirigidos para inducir suficiente daño a una célula, de modo de limitar su capacidad para funcionar normalmente o para destruir la célula. Se apreciará que habrá muchas formas conocidas en el arte para determinar la dosificación y duración del tratamiento. Los tratamientos típicos se suministran como una administración de una sola vez, y las dosificaciones típicas varían de 10 a 200 unidades (Gray) por día.

Una "muestra biológica" (indistintamente denominada "muestra", o "muestra de tejido o célula") abarca una diversidad de tipos de muestras obtenidas de un individuo, y que pueden usarse en un ensayo de diagnóstico o de control. La definición contempla muestras de sangre y otros líquidos de origen biológico, muestras de tejido sólido, tales como una muestra de biopsia o cultivos de tejido o células de allí derivadas, y su descendencia. La definición además incluye muestras que han sido manipuladas de cualquier manera luego de su obtención, por ejemplo, mediante el tratamiento con reactivos, solubilización, o enriquecimiento de ciertos componentes, como proteínas o polinucleótidos, o fijadas en una matriz sólida o semisólida con propósitos de seccionamiento . El término "muestra biológica" abarca una muestra clínica, y además incluye células en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma, líquido biológico, y muestras de tejido. La fuente de la muestra biológica puede ser tejido sólido, por ejemplo, de una muestra de tejido u órgano fresco, congelado o preservado, biopsia o aspiración; sangre o cualquier constituyente sanguíneo; líquidos corporales, tales como líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, líquido peritoneal, o líquido intersticial; células de cualquier momento de la gestación o del desarrollo del individuo. En algunas realizaciones, la muestra biológica se obtiene de un tumor primario o metastásico. La muestra biológica puede contener compuestos que no están naturalmente mezclados con el tejido en la naturaleza, por ejemplo, conservantes, anticoagulantes, tampones, fijadores, nutrientes, antibióticos, o similares.

Para los propósitos de esta solicitud, una "sección" de una muestra de tejido significa una sola parte o un trozo de una muestra de tejido, por ejemplo, una rebanada delgada de tejido o célula cortada de una muestra de tejido. Se entiende que pueden tomarse múltiples secciones de muestras de tejido y someterse al análisis de acuerdo con la presente invención. En algunas realizaciones, se analiza la misma sección de muestra de tejido tanto en el nivel morfológico como molecular, o se analiza tanto con respecto a proteina como a ácido nucleico.

El término "marca", utilizado en esta solicitud, se refiere a un compuesto o una composición que se conjuga o se fusiona directa o indirectamente con un reactivo, tal como una sonda de ácido nucleico o un anticuerpo, y facilita la detección del reactivo al cual está conjugado o fusionado. La marca puede ser en sí misma detectable (por ejemplo, marcas de radioisótopos o marcas fluorescentes) o, en el caso de una marca enzimática, puede catalizar la alteración química de una composición o un compuesto de sustrato que es detectable.

Composiciones de la invención y métodos para su preparación y uso.

Esta invención abarca composiciones, que incluyen composiciones farmacéuticas, que comprenden un anticuerpo antihepsina; y polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican un anticuerpo antihepsina. De acuerdo con la presente, las composiciones comprenden uno o más anticuerpos que se unen a hepsina, y uno o más polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican uno o más anticuerpos que se unen a hepsina. Estas composiciones además pueden comprender portadores adecuados, tales como excipientes farmacéuticamente aceptables que incluyen tampones, que son bien conocidos en el arte.

La invención contempla además realizaciones de polinucleótidos y anticuerpos aislados. La invención contempla asimismo realizaciones de anticuerpos y polinucleótidos sustancialmente puros.

Además, la invención abarca un método de tratamiento de un trastorno, por ejemplo, cáncer de próstata, usando un anticuerpo antihepsina (como se describe en la presente o se conoce en el arte) .

Composiciones .

Los anticuerpos antihepsina de la invención, eferentemente, son monoclonales . Además se contemplan ntro del alcance de la invención los fragmentos Fab, Fab 1 , Fab'-SH y F(ab')2 de los anticuerpos antihepsina proporcionados en esta solicitud. Estos fragmentos de anticuerpos pueden ser creados mediante medios tradicionales, como la digestión enzimática, o pueden ser generados por medio de técnicas recombinantes . Dichos fragmentos de anticuerpos pueden ser guiméricos o humanizados. Estos fragmentos son útiles para los propósitos de diagnóstico y terapéuticos expuestos a continuación.

Los anticuerpos monoclonales se obtienen de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales gue comprenden la población son idénticos, excepto posibles mutaciones naturales que pueden presentarse en cantidades menores. En consecuencia, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo, que no es una mezcla de anticuerpos separados .

Los anticuerpos monoclonales antihepsina de la invención pueden prepararse usando el método de hibridoma descripto por primera vez por Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), o pueden prepararse mediante métodos de ADN recominantes (Patente de los Estados Unidos de América Nro. 4.816.567).

En el método de hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster, es inmunizado a fin de producir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína utilizada para la inmunización. Los anticuerpos para hepsina pueden ser producidos en animales por múltiples inyecciones subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) de hepsina y un coadyuvante. La hepsina puede prepararse usando métodos bien conocidos en el arte, algunos de los cuales se describen adicionalmente' en esta solicitud. Por ejemplo, la producción recombinante de hepsina humana y de ratón se describe a continuación. En una realización, los animales son inmunizados con una hepsina fusionada a la porción Fe de una cadena pesada de inmunoglobulina . En una realización preferida, los animales son inmunizados con una proteína de fusión de hepsina-IgGl . Los animales comúnmente son inmunizados contra conjugados inmunogénicos o derivados de hepsina con monofosforil lípido A ( PL) /trehalosa dicrinomicolato (TDM) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, T) , y la solución es inyectada por vía intradérmica en múltiples sitios. Dos semanas más tarde, se aplica un refuerzo a los animales. Siete a catorce días más tarde, se toman muestras de sangre de los animales, y el suero es ensayado a fin de establecer la valoración de antihepsina. Se refuerza a los animales hasta que la valoración se estabiliza.

Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Los linfocitos entonces son fusionados con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, a fin de formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, páginas 59-103 (Academic Press, 1986) ) .

Las células de hibridoma preparadas de esta manera se siembran y se desarrollan en un medio de cultivo adecuado, que preferentemente, contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma progenitoras, no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma progenitoras carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT, según su sigla en inglés) , el medio de cultivo para los hibridomas habitualmente comprenderá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT) , donde estas sustancias previenen el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

Las células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan eficazmente, que sostienen la producción de alto nivel estable de anticuerpo por las células productoras de anticuerpo seleccionadas, y que son sensibles a un medio tal como medio HAT. Entre estas, las estirpes celulares de mieloma preferidas son las estirpes de mieloma murinas, tales como aquellas derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11, que pueden obtenerse en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California U. S. A, y células SP-2 o X63-Ag8-653, que pueden obtenerse en la Colección de Cultivos Tipificados Norteamericanos, Rockville, aryland, U. S. A. Las estirpes de células de heteromieloma de ratón-humano y de mieloma humano también se han descripto para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur y col., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)) .

El medio de cultivo en el cual crecen las células de hibridoma es ensayado a fin de evaluar la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra hepsina. Preferentemente, se determina la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma mediante la inmunoprecipitacion, o por medio de un ensayo de unión in vitro, tal como el radioinmunoensayo (RIA) o el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) .

La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede ser determinada, por ejemplo, por el análisis Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem. , 107: 220 (1980).

Después de identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad o actividad deseada, los clones pueden ser subclonados mediante la limitación de los procedimientos de dilución, y cultivados por medio de métodos convencionales (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986) ) . Los medios de cultivo adecuados para este propósito abarcan, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo, como tumores de asciticos en un animal.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones son adecuadamente separados del medio de cultivo, liquido ascitico o suero, mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales, tales como proteína A-Sefarosa, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis de gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

Los anticuerpos anti epsina de la invención pueden prepararse usando bibliotecas de combinación a fin de identificar sistemáticamente los clones de anticuerpos sintéticos con la actividad o las actividades deseadas. En principio, se seleccionan clones de anticuerpos sintéticos mediante el sometimiento a la detección sistemática de bibliotecas de fagos qué contienen fagos que exhiben diversos fragmentos de región variable de anticuerpo (Fv) fusionados a proteína de cobertura de fago. Dichas bibliotecas de fagos son lavadas por medio de la cromatografía de afinidad contra el antígeno deseado. Los clones que expresan fragmentos Fv capaces de unión al antígeno deseado son adsorbidos por el antígeno y, en consecuencia, separados de los clones sin unión en la biblioteca. Los clones de unión entonces son eluidos del antígeno, y pueden ser adicionalmente enriquecidos por ciclos adicionales de adsorción/elución de antígeno. Cualquiera de los anticuerpos antihepsina de la invención puede obtenerse mediante el diseño de un procedimiento de detección sistemática de antígeno adecuado a fin de seleccionar el clon de fago de interés, seguido de la construcción de un clon de anticuerpo antihepsina de longitud completa usando las secuencias Fv del clon de fagos de interés y las secuencias de región constante adecuadas (Fe) descriptas en la referencia de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda D (1991), vols. 1-3. Un método ejemplar para la generación de anticuerpos antihepsina se revela en los Ejemplos.

El dominio de unión de antigeno de un anticuerpo está formado por dos regiones variables (V) de aproximadamente 110 aminoácidos, una de la cadena ligera (VL) y una de la cadena pesada (VH) , donde ambas presentan tres bucles hipervariables o regiones de determinación de complementariedad (CDR) . Los dominios variables pueden ser exhibidos funcionalmente en fagos, ya sea como fragmentos de cadena simple Fv (scFv) , donde VH y VL se ligan covalentemente a través de un péptido corto, flexible, o como fragmentos Fab, donde se fusionan independientemente a un dominio constante e interactúan de manera no covalente, como se describe en la referencia de Winter et al., Ann. Rev. Immunol . , 12: 433-455 (1994). De acuerdo con la presente solicitud, los clones de fagos codificadores ScFv y los clones de fagos codificadores Fab se denominan en forma colectiva "clones de fagos Fv" o "clones Fv".

Los repertorios de genes VH y VL pueden clonarse en forma separada por medio de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) , y pueden recombinarse al azar en bibliotecas de fagos, las que luego pueden someterse a la búsqueda a fin de establecer clones de unión de antigeno como se describe en la referencia de inter et al.: Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Las bibliotecas de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad para el inmunógeno, sin la necesidad de la construcción de hibridomas. Alternativamente, el repertorio natural puede clonarse, a fin de proporcionar una sola fuente de anticuerpos humanos para un amplio rango de autoantigenos y no autoantigenos, sin ninguna inmunización, como lo describen Griffiths et al., EMBO J., 12: 725-734 (1993). Finalmente, las bibliotecas naturales también pueden prepararse en forma sintética, mediante la clonación de segmentos de genes V no redispuestos a partir de células madre, y el uso de cebadores de PCR que contienen secuencia aleatoria, de modo de codificar las regiones CD3 altamente variables y efectuar la redisposición in vitro,' como lo describen Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992).

Se usa fago filamentoso a fin de exhibir fragmentos de anticuerpos por fusión a la proteina de cobertura menor pIII. Los fragmentos de anticuerpos pueden ser exhibidos como fragmentos Fv de cadena simple, donde los dominios VH y VL están conectados en la misma cadena de polipéptido por medio de un espaciador de polipéptido flexible, por ejemplo, como lo describen Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), o como fragmentos Fab, donde una cadena está fusionada a pIII y la otra es secretada en el periplasma de la célula huésped bacteriana, donde el montaje de una estructura de Fab-proteina de cobertura se exhibe sobre la superficie del fago mediante el desplazamiento de algunas de las proteínas de cobertura de tipo salvaje, por ejemplo, como se describe en la referencia de Hoogenboom et al., Nucí. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991).

En general, los ácidos nucleicos que codifican fragmentos de genes de anticuerpos se obtienen a partir de células inmunitarias cosechadas de humanos o animales. Si se desea una biblioteca inclinada a favor de clones antihepsina, el sujeto es inmunizado con hepsina, de manera de generar una respuesta de anticuerpo, y las células del bazo o las células B circulantes diferentes de los linfocitos de sangre periférica (PBL, por sus siglas en inglés) son recuperadas para la construcción de la biblioteca. En una realización preferida, se obtiene una biblioteca de fragmentos de genes de anticuerpos humanos inclinada a favor de clones antihepsina, mediante la generación de una respuesta de anticuerpo antihepsina en ratones transgénicos que portan una serie de genes de inmunoglobulina humana funcionales (y que carecen de un sistema de producción de anticuerpos endógenos funcionales) , de modo que la inmunización de hepsina da origen a células B que producen anticuerpos humanos contra hepsina. A continuación, se describe la generación de ratones transgénicos productores de anticuerpos humanos.

El enriquecimiento adicional de poblaciones de células reactivas antihepsina puede obtenerse usando un procedimiento de detección sistemática adecuado, a fin de aislar células B que expresan anticuerpo ligado a membrana especifico de hepsina, por ejemplo, por medio de la separación de células usando la cromatografía de afinidad de hepsina o la adsorción de células en hepsina marcada con fluorcromo, seguida de la clasificación de células activadas por flujo (FACS, por sus siglas en inglés) .

Alternativamente, el uso de células del bazo o células B u otros PBL de un donante no inmunizado proporciona una mejor representación del posible repertorio de anticuerpos, y además, permite la construcción de una biblioteca de anticuerpos usando cualquier especie de animal (humano o no humano) en la cual hepsina no sea antigénica. Para bibliotecas que incorporan la construcción de genes de anticuerpos in vitro, las células madre son cosechadas del individuo, de modo de proporcionar ácidos nucleicos que codifican segmentos de genes de anticuerpos no redispuestos . Las células inmunitarias de interés pueden obtenerse de una variedad de especies de animales, tales como las especies humana, de ratón, rata, lagomorfa, luprina, canina, felina, porcina, bovina, equina y aviar, etc.

Se recuperan segmentos de genes variables de anticuerpos codificadores de ácido nucleico (que incluyen segmentos VH y VL) de las células de interés, y se amplifican. En el caso de bibliotecas de genes VH y VL redispuestas, el ADN deseado puede obtenerse mediante el aislamiento de ARNm o ADN genómico de linfocitos, seguido de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) con cebadores que coinciden con los extremos 5' y 3' de los genes VH y VL redispuestos , como se describe en la referencia de Orlandi et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 86: 3833-3837 (1989), a fin de obtener diversos repertorios de genes V para la expresión. Los genes V pueden amplificarse a partir de ADN genómico y ADNc, con los cebadores traseros en el extremo 5' del exón que codifica el dominio V maduro y cebadores delanteros con base dentro del segmento J, como se describe en la referencia de Orlandi et al. (1989) y de Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989) . Sin embargo, para la amplificación a partir de ADNc, los cebadores traseros también pueden tener base en el exón líder, como se describe en la referencia de Jones et al., Biotechnol., 9: 88-89 (1991), y los cebadores delanteros, dentro de la región constante, como lo describen Sastry et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) , 86: 5728-5732 (1989) . A fin de maximizar la complementariedad, puede incorporarse degeneración en los cebadores, como se describe en la referencia de Orlandi. et al. (1989) o de Sastry et al. (1989) . Preferentemente, la diversidad de la biblioteca se maximiza usando cebadores de PCR dirigidos a cada familia de genes V, a fin de amplificar todas las disposiciones VH y VL disponibles presentes en la muestra de ácido nucleico de célula inmunitaria, por ejemplo, como se describe en el método de Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), o como se describe en el método de Orum et al., Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993) . Para la clonación del ADN amplificado en vectores de expresión, pueden introducirse sitios de restricción excepcionales dentro del cebador de PCR como una marca en un extremo, como se describe en la referencia de Orlandi et al. (1989), o por medio de la amplificación de PCR adicional, con un cebador marcado, como se describe en la referencia de Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) .

Los repertorios de genes V sintéticamente redispuestos pueden derivarse in vitro a partir de segmentos de genes V. La mayoría de los segmentos de genes VH humanos han sido clonados y secuenciados (informado en la referencia de Tomlinson et al., J. Mol. Biol., 227: 776-798 (1992)), y cartografiados (informado en la referencia de Matsuda et al., Nature Genet., 3: 88-94 (1993); estos segmentos clonados (que incluyen todas las conformaciones principales de las bucles Hl y H2) pueden usarse a fin de generar diversos repertorios de genes VH con cebadores de PCR que codifican bucles H3 de secuencia y longitud diversas, como se describe en la referencia de Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992) . Los repertorios VH también pueden producirse con toda la diversidad de secuencia focalizada en un bucle H3 larga de una sola longitud, como se describe en la referencia de Barbas et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992) . Los segmentos VK y VA humanos han sido clonados y secuenciados (informado en la referencia de Williams y Winter, Eur. J. Immunol . , 23: 1456-1461 (1993)), y pueden usarse para la producción de repertorios de cadena ligera sintéticos. Los repertorios de genes V sintéticos, sobre la base de un rango de pliegues VH y VL, y longitudes L3 y H3, codificarán anticuerpos de considerable diversidad estructural. Luego de la amplificación de ADN codificadores de genes V, los segmentos de genes V de linea germinal pueden redisponerse in vitro, de acuerdo con los métodos de Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992) .

Los repertorios de fragmentos de anticuerpos pueden construirse mediante la combinación de repertorios de genes VH y VL juntos, de varias maneras. Cada repertorio puede crearse en diferentes vectores, y los vectores pueden recombinarse in vitro, por ejemplo, como se describe en la referencia de Hogrefe et al., Gene, 128: 119-126 (1993), o in vivo, mediante la infección de combinación, por ejemplo, el sistema loxP descripto en la referencia de Waterhouse et al., Nucí. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993). El enfoque de recombinación in vivo explota la naturaleza de dos cadenas de los fragmentos Fab, a fin de superar el limite sobre el tamaño de la biblioteca impuesto por la eficiencia de la transformación de E. coli. Los repertorios VH y VL naive se clonan en forma separada, uno en un fagémido, y el otro, en un vector de fago. Las dos bibliotecas luego se combinan por medio de la infección de fago de bacterias que contienen fagémidos, de manera que cada célula contiene una combinación diferente, y el tamaño de la biblioteca es limitado solo por la cantidad de células presentes (alrededor de 1012 clones) . Ambos vectores contienen señales de recombinación in vivo, de manera que los genes VH y VL se recombinan en un solo replicón y son reempaquetados en viriones de fagos. Estas enormes bibliotecas proporcionan grandes cantidades de anticuerpos diversos de buena afinidad (Kd-1 de alrededor de 10-8 M) .

Alternativamente, los repertorios pueden clonarse en forma sucesiva en el mismo vector, por ejemplo, como se describe en la referencia de Barbas et al., Proc. Nati.

Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991), o pueden montarse mediante la PCR, y luego, clonarse, por ejemplo, como se describe en la referencia de Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) . El montaje de PCR también puede usarse para unir ADN de VH y VL con ADN codificador de un espaciador peptídico flexible, a fin de formar repertorios Fv de cadena simple (scFv) . Aun en otra técnica, se usa el "montaje de PCR en célula", a fin de combinar genes de VH y VL dentro de linfocitos por PCR, y luego, clonar los repertorios de genes ligados como se describe en la referencia de Embleton et al., Nucí. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992) .

Los anticuerpos producidos por bibliotecas naive (de origen natural o sintético) pueden ser de afinidad moderada (Kd-1 de aproximadamente 106 a 107 M-l) , si bien la maduración para afinidad también puede ser imitada in vitro, mediante la construcción y reselección de bibliotecas secundarias como se describe en la referencia de Winter et al. (1994), supra. Por ejemplo, pueden introducirse mutaciones al azar, in vitro, mediante el uso de la polimerasa propensa a error (informada en la referencia de Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989)) en el método de Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992) o en el método de Gram et al., Proc. Nati. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992) . Además, puede efectuarse la maduración para afinidad por medio de la mutación aleatoria de una o más CDR, por ejemplo, usando PCR con cebadores que portan secuencia aleatoria que abarca la CDR de interés, en clones Fv individuales seleccionados, y la detección sistemática para la determinación de clones de afinidad superior. El documento WO 9607754 (publicado el 14 de marzo de 1996) describe un método para la inducción de la mutagénesis en una región de determinación de complementariedad de una cadena ligera de inmunoglobulina, a fin de crear una biblioteca de genes de cadena ligera. Otro enfoque eficaz consiste en la recombinación de los dominios VH o VL seleccionados por la exhibición de fagos con repertorios de variantes de dominio V-naturales obtenidos de donantes no inmunizados, y la detección sistemática a fin de establecer la afinidad superior en varias rondas de remezcla de cadenas, como se describe en la referencia de Marks et al., Biotechnol., .10: 779-783 (1992) . Esta técnica permite la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos con afinidades de alrededor de 10-9 M.

Las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de hepsina son conocidas en el arte. La secuencia de ácido nucleico que codifica la hepsina puede ser diseñada usando la secuencia de aminoácidos de la región deseada de hepsina. Como es bien sabido en el arte, hay dos isoformas de empalme principales de hepsina: hepsina Illb y hepsina lile. Las secuencias de hepsina son bien conocidas en el arte, y pueden incluir las secuencias expuestas en las Figuras 7 y 8.

Los ácidos nucleicos que codifican hepsina pueden prepararse mediante una diversidad de métodos conocidos en el arte. Estos métodos incluyen, sin limitación, la síntesis química por cualquiera de los métodos descriptos en la referencia de Engels et al., Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 28: 716-734 (1989), tales como los métodos de triéster, fosfito, fosforami.dita y H-fosfonato. En una realización, los codones preferidos por la célula huésped de expresión se usan en el diseño del ADN codificador de hepsina. Alternativamente, el ADN codificador de hepsina puede ser aislado de una biblioteca de ADNc o genómico.

Luego de la construcción de la molécula de ADN que codifica la hepsina, la molécula de ADN es funcionalmente ligada a una secuencia de control de expresión en un vector de expresión, tal como un plásmido, donde la secuencia de control es reconocida por una célula huésped transformada con el vector. En general, los vectores plásmidos contienen secuencias de replicación y control gue derivan de especies compatibles con la célula huésped. El vector comúnmente porta un sitio de replicación, al igual que secuencias que codifican proteínas que son capaces de proporcionar la selección fenotípica en células transformadas. Los vectores adecuados para la expresión en células huésped procariotas y eucariotas son conocidos en el arte, y algunos se describen adicionalmente en esta solicitud. Pueden usarse organismos eucariotos, tales como levaduras, o células derivadas de organismos multicelulares, tales como mamíferos.

Opcionalmente, el ADN que codifica la hepsina está funcionalmente ligado a una secuencia líder de secreción, a fin de lograr la secreción del producto de expresión por la célula huésped en el medio de cultivo. Ejemplos de secuencias líder de secreción incluyen stll, ecotina, lamB, herpes GD, lpp, fosfatasa alcalina, invertasa, y factor alfa. Es también adecuada para el uso en esta invención la secuencia líder de 36 aminoácidos de proteina A (Abrahmsen et al., EMBO J. , 4: 3901 (1985)).

Las células huésped son transíectadas y, preferentemente, transformadas con los vectores de expresión o clonación descriptos anteriormente de esta invención, y se cultivan en medio nutriente convencional modificado según lo apropiado para la inducción de promotores, la selección de transformantes, o la amplificación de los genes que codifican las secuencias deseadas.

La transfección se refiere a la toma de un vector de expresión por una célula huésped, ya sea si se expresa, de hecho, cualquier secuencia codificadora, o si no se expresa. Los expertos en el arte conocen numerosos métodos de transfección, por ejemplo, la precipitación de CaP04 y electroporacion. La transfección exitosa es generalmente reconocida cuando cualquier indicación de la operación de este vector se produce dentro de la célula huésped. Los métodos de transfección son bien conocidos en el arte, y algunos se describen adicionalmente en esta solicitud.

La transformación significa la introducción de ADN en un organismo de manera que el ADN sea replicable, ya sea como un elemento extracromosómico, ya sea como integrante cromosómico. De acuerdo con la célula huésped utilizada, la transformación se realiza usando técnicas convencionales apropiadas para dichas células. Los métodos para la transformación son conocidos en el arte, y algunos se describen adicionalmente en esta solicitud.

Las células huésped procariotas utilizadas para producir la hepsina pueden cultivarse como se describe generalmente en la referencia de Sambrook et al., supra.

Las células huésped mamiferas utilizadas para la producción de la hepsina pueden cultivarse en una diversidad de medios bien conocidos en el arte, y algunos de los cuales se describen en esta solicitud.

Las células huésped referidas en esta invención abarcan células en cultivo in vitro al igual que células que se encuentran dentro de un animal huésped.

La purificación de hepsina puede lograrse usando métodos reconocidos en el arte, algunos de los cuales se describen en esta solicitud.

La hepsina purificada puede unirse a una matriz adecuada, por ejemplo, cuentas de agarosa, cuentas de acrilamida, cuentas de vidrio, celulosa, diversos copolimeros acrílicos, geles de hidroxil metacrilato, copolimeros poliacrilicos y polimetacrílieos , nailon, portadores neutros e iónicos y similares, para el uso en la separación cromatografía de afinidad de clones de exhibición de fagos. La unión de la proteína hepsina a la matriz puede efectuarse por los métodos descriptos en Methods in Enzymology, vol. 44 (1976) . Una técnica comúnmente empleada para la unión de ligandos de proteínas a matrices de polisacáridos, por ejemplo, agarosa, dextrano o celulosa, supone la activación del portador con haluros de cianógeno, y el posterior acoplamiento de las aminas aromáticas o alifáticas primarias del ligando péptido a la matriz activada.

Alternativamente, la hepsina puede usarse para revestir los receptáculos de placas de adsorción, puede expresarse en células huésped fijadas a las placas de adsorción, o utilizarse en la clasificación celular, conjugarse con biotina para la captura con cuentas revestidas con estreptavidina, o usarse en cualquier otro método conocido en el arte para el lavado de bibliotecas de exhibición de fagos.

Las muestras de bibliotecas de fagos se ponen en contacto con hepsina inmovilizada en condiciones adecuadas para la unión de por lo menos una porción de las partículas de fago con el adsorbente. Normalmente, las condiciones, que incluyen el pH, la concentración iónica, la temperatura y similares, se seleccionan de manera de imitar las condiciones fisiológicas. Los fagos ligados a la fase sólida se lavan y luego se eluyen con ácido, como se describe, por ejemplo, en la referencia de Barbas et al.,. Proc. Nati. Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991), o con álcali, por ejemplo, como se describe en la referencia de Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991); o con competición de antígeno de hepsina, por ejemplo, en un procedimiento similar al método de competición de antígeno de Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) . Los fagos pueden ser enriquecidos 20-1.000 veces en una sola ronda de selección. Además, los fagos enriquecidos pueden cultivarse en cultivo bacteriano y someterse a rondas adicionales de selección.

La eficiencia de la selección depende de muchos factores, entre ellos, la cinética de la disociación durante el lavado, y si pueden unirse simultáneamente múltiples fragmentos de anticuerpos en un solo fago, con antigeno. Los anticuerpos con rápida cinética de disociación (y débiles afinidades de unión) pueden ser retenidos mediante el uso de lavados cortos, exhibición de fagos multivalentes y alta densidad de revestimiento de antigeno en fase sólida. La alta densidad no solo estabiliza el fago a través de interacciones multivalentes, sino que favorece la nueva unión de fagos que han sido disociados. La selección de anticuerpos con lenta cinética de disociación (y buenas afinidades de unión) puede ser favorecida mediante el uso de largos lavados y exhibición de fagos monovalentes, como se describe en la referencia de Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990) y en el documento WO 92/09690, y una baja densidad de revestimiento de antigeno, como se describe en la referencia de Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992).

Es posible la selección entre anticuerpos de fagos de diferentes afinidades, aun con afinidades · que difieren levemente, para hepsina. Sin embargo, la mutación aleatoria de un anticuerpo seleccionado (por ejemplo, como se realiza en algunas técnicas de maduración para afinidad) probablemente proporcione muchas mutantes, la mayoría, de unión de antígeno, y algunas, con afinidad superior. Con limitación de hepsina, el fago de alta afinidad excepcional podría ser descalificado. A fin de retener todas las mutantes de afinidad superior, los fagos pueden incubarse con exceso de hepsina biotinilada, si bien con la hepsina biotinilada en una concentración de menor molaridad que la constante de afinidad molar blanco para hepsina. Los fagos de unión de alta afinidad entonces pueden ser capturados por cuentas paramagnéticas revestidas con estreptavidina . Dicha "captura de equilibrio" permite la selección de los anticuerpos de acuerdo con sus afinidades de unión, con sensibilidad que permite el aislamiento de clones mutantes con una afinidad superior tan baja como del doble, de un gran exceso de fagos con menor afinidad. Las condiciones utilizadas en el lavado de fagos ligados a una fase sólida también pueden manipularse de manera de discriminar sobre la base de la cinética de disociación.

Los clones de hepsina pueden seleccionarse sobre la base de la actividad. Los clones Fv que corresponden a dichos anticuerpos de hepsina pueden seleccionarse por medio de: (1) el aislamiento de clones de hepsina de una biblioteca de fagos, como se describe con anterioridad, y opcionalmente , la amplificación de la población aislada de clones de fagos mediante el cultivo de la población en un huésped bacteriano adecuado; (2) la selección de hepsina y una segunda proteína contra la cual se desea actividad de bloqueo y actividad sin bloqueo, respectivamente; (3) la adsorción de los clones de fagos antihepsina por hepsina inmovilizada; (4) el uso de un exceso de la segunda proteína a fin de eluir cualquier clon ' indeseado que reconoce determinantes de unión de hepsina que se superponen con los determinantes de unión de la segunda proteína, o que son compartidos con ellos; y (5) la elución de los clones que quedan adsorbidos luego de la etapa ( 4 ) .

Opcionalmente, los clones con las propiedades de bloqueo/sin bloqueo deseadas pueden ser adicionalmente enriquecidos repitiendo los procedimientos de selección descriptos en esta solicitud, una o más veces.

El ADN codificador de los anticuerpos monoclonales derivados de hibridoma o clones Fv de exhibición de fagos de la invención es aislado con facilidad y secuenciado usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando cebadores de oligonucleótidos diseñados a fin de amplificar de manera especifica las regiones codificadoras de cadena pesada y ligera de interés de hibridoma o patrón de ADN fago) . Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que luego son transíectados a células huésped, tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés) o células de mieloma que, de otro modo, no producen proteína inmunoglobulina, a fin de obtener la síntesis de los anticuerpos monoclonales deseados en las células huésped recombinantes . Los artículos de reseña sobre la expresión recombinante en bacterias de ADN codificador de anticuerpos incluyen los de: Skerra et al., Curr. Opinión in Immunol. , 5: 256 (1993), y Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992) .

El ADN codificador de clones Fv de la invención puede combinarse con secuencias de ADN conocidas que codifican regiones constantes de cadena pesada y de cadena ligera (por ejemplo, las secuencias de ADN apropiadas pueden obtenerse de la referencia de Kabat et al., supra) , a fin de formar clones que codifican cadenas pesadas y/o ligeras de longitud completa o parcial. Se apreciará que, para este propósito, pueden usarse las regiones constantes de cualquier isotipo, entre ellas, las regiones constantes de IgG, Ig , IgA, IgD e IgE, y que dichas regiones constantes pueden obtenerse de cualquier especie humana o animal. Un clon Fv derivado del ADN de dominio variable de una especie animal (tal como humana) y luego fusionado al ADN de región constante de otra especie animal para formar secuencias codificadoras para la cadena pesada y/o cadena ligera de longitud completa "híbrida" se incluye en la definición de anticuerpo "quimérico" e "híbrido", como se usa en esta solicitud. En una realización preferida, un clon Fv derivado de ADN variable humano es fusionado a ADN de región constante humana a fin de formar secuencias codificadoras para todas las cadenas pesadas y/o ligeras humanas de longitud completa o parcial .

El ADN que codifica anticuerpo antihepsina derivado de un hibridoma de la invención puede además modificarse, por ejemplo, mediante la sustitución de la secuencia codificadora para los dominios constantes de cadena pesada y ligera humanas, en lugar de las secuencias murinas homologas derivadas del clon de hibridoma (por ejemplo, como en el método de Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 81: 6851-6855 (1984)) . El ADN que codifica un anticuerpo derivado de clon Fv o de hibridoma, o fragmento, puede ser adicionalmente modificado mediante la unión covalente a la secuencia codificadora de inmunoglobulina, de la totalidad o parte de la secuencia codificadora para un polipéptido no inmunoglobulina. De esta manera, se preparan anticuerpos "quiméricos" o "híbridos" que tienen la especificidad de unión del clon Fv, o anticuerpos derivados de clones de hibridoma de la invención.

Fragmentos de anticuerpos.

La presente invención contempla fragmentos de anticuerpos. En ciertas circunstancias, existen ventajas en el uso de fragmentos de anticuerpos, en lugar de anticuerpos enteros. El menor tamaño de los fragmentos permite la rápida eliminación, y puede lograr mejor acceso a tumores sólidos.

Se han formulado diversas técnicas para la producción de · fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos eran derivados por medio de la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver, por ejemplo, las referencias de Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24: 107-117 (1992); y Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)) . Sin embargo, estos fragmentos ahora pueden ser producidos directamente por células huésped recombinantes . Los fragmentos de anticuerpos Fab, Fv y ScFv pueden ser expresados todos en E. coli, y secretados desde E. coli, a fin de permitir asi la fácil producción de grandes cantidades de estos fragmentos. Los fragmentos de anticuerpos pueden aislarse de las bibliotecas de fagos de anticuerpos descriptas con anterioridad. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH pueden ser recuperados directamente a partir de E. coli, y pueden acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology, 10: 163-167 (1992)) . De acuerdo con otro enfoque, los fragmentos F(ab')2 pueden ser aislados directamente de cultivo de células huésped recombinantes. Los fragmentos Fab y F(ab')2 con mayor semivida in vivo que comprenden residuos de epítopos de unión de receptor de rescate se describen en la Patente de los Estados Unidos Nro. 5.869.046. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para el experto en el arte. En otras realizaciones, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena simple (scFv) (ver, por ejemplo, el documento WO 93/16185; Patentes de los Estados Unidos de América Nros. 5.571.894; y 5.587.458) . Fv y scFv son las únicas especies con sitios de combinación intactos que están desprovistos de regiones constantes; en consecuencia, son adecuados para la menor unión no especifica durante el uso in vivo. Las proteínas de fusión sFv pueden construirse de manera de obtener la fusión de una proteína efectora, ya sea en el término amino, ya sea en el término carboxi de un sFv. Ver: Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. El fragmento de anticuerpo además puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, como se describe en la Patente de los Estados Unidos de América Nro. 5.641.870. Dichos fragmentos de anticuerpos lineales pueden ser monoespecífieos o biespecífieos .

Anticuerpos humanizados.

La presente invención contempla anticuerpos humanizados.

Se conocen en el arte diversos métodos para la humanización de anticuerpos no humanos. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado puede tener uno o más residuos de aminoácidos introducidos, desde una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos a menudo se denominan residuos "importados", que, habitualmente, se toman de un dominio variable "de importación". La humanización puede efectuarse, esencialmente, siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al. (1986), Nature, 321: 522-525; Riechmann et al. (1988), Nature, 332: 323-327; Verhoeyen et al. (1988), Science, 239: 1534-1536), mediante la sustitución de secuencias de región hipervariable con las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. En consecuencia, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de los Estados Unidos de América Nro. 4.816.567) donde se ha sustituido una cantidad sustancialmente menor que un dominio variable humano intacto, con la correspondiente secuencia de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos de región hipervariable, y posiblemente, algunos residuos FR, están sustituidos con residuos de sitios análogos en anticuerpos roedores.

La elección de dominios variables humanos, tanto livianos como pesados, por ser utilizados en la preparación de anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el asi denominado método de "mejor adaptación", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo roedor es sometida a la detección sistemática contra la biblioteca entera de secuencias de dominio variable humano conocidas. La secuencia humana más cercana a aquella del roedor es entonces aceptada como el marco humano para el anticuerpo humanizado. Ver, por ejemplo, las referencias de Sims et al. (1993) : J. Immunol. 151: 2296; Chothia et al. (1987) : J. Mol. Biol. 196: 901. Otro método utiliza un marco particular derivado de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. El mismo marco puede usarse para varios anticuerpos humanizados diferentes. Ver, por ejemplo, las referencias de Cárter et al. (1992) : ' Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 4285; Presta et al. (1993) : J. Immunol., 151: 2623.

Además, es importante que los anticuerpos sean humanizados con retención de alta afinidad para el antigeno y otras propiedades biológicas favorables. A fin de lograr esta meta, de acuerdo con un método, se preparan anticuerpos humanizados por un proceso de análisis de las secuencias progenitoras y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias progenitoras y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales pueden obtenerse comúnmente, y son conocidos para aquellos expertos en el arte. Pueden obtenerse programas informáticos que ilustran y exhiben estructuras de conformación tridimensional probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas exhibiciones permite el análisis de la probable función de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que afectan la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antigeno. De este modo, pueden seleccionarse y combinarse residuos FR de las secuencias de importación y del receptor, de manera de lograr la característica de anticuerpo deseada, tal como una mayor afinidad para los antígenos blanco. En general, los residuos de región hipervariable están directa y más sustancialmente involucrados en la influencia de la unión de antígeno.

Anticuerpos humanos.

Los anticuerpos antihepsina humanos de la invención pueden construirse mediante la combinación de secuencias de dominio variable de clon Fv seleccionadas de bibliotecas de exhibición de fagos derivadas de humanos, con secuencias de dominio constante humanas conocidas como se describe con anterioridad. Alternativamente, los anticuerpos antihepsina monoclonales humanos de la invención pueden prepararse por el método de hibridoma. Las estirpes celulares de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos han sido descriptas, por ejemplo, por Kozbor: J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); y Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991) .

Ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, con la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descripto que la deleción homocigota del gen de la región de unión de cadena pesada de anticuerpo (JH) en ratones mutantes de linea germinal y quiméricos logra la inhibición completa de la producción de anticuerpo endógeno. La transferencia de la disposición de genes de inmunoglobulina de linea germinal humana en dichos ratones mutantes de linea germinal logrará la producción de anticuerpos humanos, con la estimulación de antigenos. Ver, por ejemplo, las referencias de Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol. , 7: 33 (1993) .

Puede usarse además el barajado de genes a fin de derivar anticuerpos humanos de anticuerpos no humanos, por ejemplo, de roedores, donde el anticuerpo humano tiene afinidades y especificidades similares al anticuerpo no humano inicial. De acuerdo con este método, que se denomina también "impresión de epitopo", o bien la región variable de cadena pesada o ligera de un fragmento de anticuerpo no humano obtenido por técnicas de exhibición de fagos, como se describe en esta solicitud, es reemplazada por un repertorio de genes de dominio V humano, para crear una población de quimeras de scFv o Fab de cadena no humana/cadena humana. La selección con antigeno logra el aislamiento de un scFv o Fab quimérico de cadena no humana/cadena humana donde la cadena humana restaura el sitio de unión de antigeno destruido con la eliminación de la correspondiente cadena no humana en el clon de exhibición de fagos primario; es decir, el epitopo gobierna (imprime) la elección del compañero de cadena humana. Cuando el proceso se repite a fin de reemplazar la cadena no humana restante, se obtiene un anticuerpo humano (ver PCT WO 93/06213 publicada el 1° de abril de 1993) . A diferencia de la humanización de anticuerpos no humanos tradicional por medio del injerto de CDR, esta técnica provee anticuerpos humanos por completo, que no tienen residuos FR o CDR de origen no humano.

Anticuerpos biespecificos .

Los anticuerpos biespecificos son anticuerpos monoclonales , preferentemente, humanos o humanizados, que tienen especificidades de unión . para al menos dos antigenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de unión es para hepsina, y la otra es para cualquier otro antigeno. Ejemplos de anticuerpos biespecificos pueden unirse a dos epitopos diferentes de la hepsina. Los anticuerpos biespecificos además pueden ser utilizados para localizar agentes citotóxicos en células que expresan hepsina. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a hepsina y un brazo que se une al agente citotóxico, tal como saporina, antiinterferón-a, alcaloides de las vincas, cadena de ricina A, metotrexato o hapteno de isótopo radiactivo. Los anticuerpos biespecificos pueden prepararse como anticuerpos de longitud completa o como fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespecificos F(ab')2).

Los métodos para la preparación de anticuerpos biespecificos son conocidos en el arte. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecificos se sustenta en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein and Cuello, Nature, 305: 537 (1983)). Debido a la asignación aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpos diferentes, de las cuales solo una tiene la correcta estructura biespecifica . La purificación de la molécula correcta, que habitualmente se realiza mediante etapas de cromatografía de afinidad, es algo dificultosa, y los rendimientos de producto son bajos. Se revelan procedimientos similares en el documento WO 93/08829, publicado el 13 de mayo de 1993, y en la referencia de Traunecker et al., E BO J. , 10: 3655 (1991).

De acuerdo con un enfoque diferente y más preferido, se fusionan dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) , con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión, preferentemente, es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende por lo menos parte de la bisagra, regiones CH2 y CH3. Se prefiere que la primera región constante de cadena pesada (CH1), que contiene el sitio necesario para la unión de cadena ligera, se presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, son insertados en vectores de expresión separados, y son cotransfectados en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido, en realizaciones donde las relaciones desiguales de las tres cadenas de polipéptido utilizadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificadoras para dos o para las tres cadenas de polipéptido en un vector de expresión, cuando la expresión de por lo menos dos cadenas de polipéptido en relaciones iguales logra altos rendimientos, o cuando las relaciones no tienen significación particular .

En una realización de este enfoque, los anticuerpos biespecificos están compuestos por una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbridas (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se halló que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado, de combinaciones de cadenas de inmunoglobulina indeseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina solo en una mitad de la molécula biespecífica proporciona una manera fácil de separación. Este enfoque se revela en el documento WO 94/04690. Para más detalles de la generación de anticuerpos biespecificos, ver, por ejemplo, la referencia de Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).

De acuerdo con otro enfoque, puede diseñarse la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpos, a fin de maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células recombinantes . La interfaz preferida comprende por lo menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeños de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo son reemplazadas por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano) . Se crean "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a las cadenas laterales grandes, en la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo, mediante el reemplazo de cadenas laterales de aminoácidos grandes con unas de menor tamaño (por ejemplo, alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodimero en comparación con otros productos finales indeseados, tales como homodimeros .

Los anticuerpos biespecificos incluyen anticuerpos entrecruzados o "heteroconj ugados" . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconj ugado puede acoplarse a avidina, y el otro, a biotina. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmune a células indeseadas (Patente de los Estados Unidos Nro. 4.676.980), y para el tratamiento de la infección de HIV ( O 91/00360, WO 92/00373 y EP 03089) . Los anticuerpos heteroconj ugados pueden prepararse usando cualquier método de entrecruzamiento conveniente. Los agentes de entrecruzamiento adecuados son bien conocidos en el arte, y se revelan en la Patente de los Estados Unidos de América Nro. 4.676.980, junto con una cantidad de técnicas de entrecruzamiento.

Las técnicas para la generación de anticuerpos biespecificos a partir de fragmentos de anticuerpos también se han descripto en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos biespecificos pueden prepararse usando la unión química. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) describen un procedimiento donde se disocian en forma proteolítica anticuerpos intactos, a fin de generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente formador de complejos de ditiol arsenito sódico, de modo de estabilizar ditioles vecinos y evitar la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados entonces son convertidos en derivados de tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados Fab'-TNB es luego reconvertido en el Fab'-tiol mediante la reducción con mercaptoetilamina, y es mezclado con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecifico . Los anticuerpos biespecificos producidos pueden usarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

Los avances recientes han facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH a partir de E. coli, que pueden acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecificos . Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula de anticuerpo biespecifico completamente humanizado F(ab')2 . Cada fragmento Fab1 fue secretado en forma separada a partir de E. coli, y fue sometido al acoplamiento químico dirigido in vitro, a fin de formar el anticuerpo biespecifico. El anticuerpo biespecifico formado de este modo fue capaz de unirse a células que sobreexpresaban el receptor HER2 y a células T humanas normales, al igual que fue capaz de disparar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra blancos de tumores de mama humanos .

Se han descripto además diversas técnicas para la preparación y el aislamiento de fragmentos de anticuerpos biespecí fieos directamente del cultivo celular recombinante . Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecificos usando cierres de leucina, Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5) : 1547-1553 (1992). Los péptidos de cierres de leucina de las proteínas Fos y Jun se ligaron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes, mediante la fusión de genes. Los homodímeros de anticuerpos se redujeron en la región de bisagra, para formar monómeros, y luego se reoxidaron a fin de formar los heterodímeros de anticuerpos. Este método puede utilizarse también para la producción de homodímeros de anticuerpos. La tecnología de "diacuerpos" descripta por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993), ha proporcionado un mecanismo alternativo para la producción de fragmentos de anticuerpos biespecí fieos . Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) por medio de un conector, que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por lo tanto, los dominios VH y VL de un fragmento se ven obligados a emparejarse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, para formar asi dos sitios de unión de antígeno. Se ha informado también otra estrategia para la preparación de fragmentos de anticuerpos biespecí fieos mediante el uso de dímeros Fv de cadena simple (sFv) . Ver la referencia de Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994) .

Se contemplan los anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecífieos . Tutt et al., J. Immunol., 147: 60 (1991) .

Anticuerpos multivalentes .

Un anticuerpo multivalente puede ser internalizado (y/o catabolizado) más rápido que un anticuerpo bivalente por una célula que expresa un antígeno al cual se unen los anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos multivalentes (que no son de la clase IgM) con tres o más sitios de unión de antigeno (por ejemplo, anticuerpos tetravalentes) , que pueden producirse sin dificultad mediante la expresión recombinante de ácido nucleico que codifica las cadenas de polipéptido del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio >de dimerización y tres o más sitios de unión de antigeno. El dominio de dimerización preferido comprende (o consiste en) una región Fe o una región bisagra. En este escenario, el anticuerpo comprenderá una región Fe y tres o más sitios de unión de antigeno amino-terminales con respecto a la región Fe. El anticuerpo multivalente preferido de esta invención comprende (o consiste en) tres a alrededor de ocho sitios de unión de antigeno, preferentemente, cuatro.. El anticuerpo multivalente comprende por lo menos una cadena de polipéptido (y preferentemente, dos cadenas de polipéptido) , donde las cadenas de polipéptido comprenden dos o más dominios variables. Por ejemplo, las cadenas de polipéptido pueden comprender VDl-(Xl)n -VD2-(X2)n -Fe, donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fe es una cadena de polipéptido de una región Fe, XI y X2 representan un aminoácido o polipéptido, y n es 0 ó 1. A modo de ejemplo, las cadenas de polipéptido pueden comprender: VH-CHl-conector flexible-VH-CHl-cadena de región Fe; o VH-CH1-VH-CHl-cadena de región Fe. El anticuerpo multivalente de la presente invención comprende además por lo menos dos (y preferentemente, cuatro) polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. El anticuerpo multivalente de la presente invención puede comprender, por ejemplo, de alrededor de dos a alrededor de ocho polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. Los polipéptidos de dominio variable de cadena ligera contemplados aquí comprenden un dominio variable de cadena ligera y, opcionalmente, comprenden además un dominio CL.

Variantes de anticuerpos.

En algunas realizaciones, se contemplan modificaciones de secuencias de aminoácidos de los anticuerpos descriptos en esta solicitud. Por ejemplo, puede ser conveniente mejorar la afinidad de unión y otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo se preparan mediante la introducción de cambios de nucleótidos apropiados en la secuencia de ácido nucleico del anticuerpo, o por medio de la síntesis de péptidos. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones y/o inserciones y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Puede efectuarse cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución, a fin de lograr la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Las alteraciones de aminoácidos pueden introducirse en la secuencia de aminoácidos de anticuerpo objeto en el momento en que se prepara la secuencia.

Un método útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo que son ubicaciones preferidas para la mutagénesis se denomina "mutagénesis de barrido de alanina", como lo describen Cunningham y Wells (1989): Science, 244: 1081-1085. Aquí, se identifican un residuo o grupo de residuos blanco (por ejemplo, residuos cargados tales como.arg, asp, his, lys y glu) y se reemplazan por un aminoácido neutro o negativamente cargado (más preferentemente, alanina o polialanina) a fin de afectar la interacción de los aminoácidos con antígeno. Aquellas ubicaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones entonces son refinadas mediante la introducción de variantes adicionales o distintas, en o para los sitios de sustitución. Por lo tanto, si bien el sitio para la introducción de una variación de secuencia de aminoácidos es predeterminado, no es necesario que la naturaleza de la mutación per se sea predeterminada. Por ejemplo, a fin de analizar el comportamiento de una mutación en un sitio determinado, se lleva a cabo la mutagénesis de azar o de barrido ala en la región o el codón blanco, y las inmunoglobulinas expresadas son sometidas a la detección sistemática a fin de establecer la actividad deseada.

Las inserciones de secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxilo-terminales que varían en su longitud, de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, al igual que inserciones de intrasecuencia de residuos de aminoácidos simples o múltiples. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo metionilo N-terminal, o el anticuerpo fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al término N o C del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT (sigla en inglés de "tratamiento de profármaco de enzima dirigida a anticuerpo") ) o un polipéptido que incrementa la semivida sérica del anticuerpo.

La glicosilación de polipéptidos habitualmente es religada u O-ligada. El término "N-ligado" se refiere a la unión de un resto de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo asparagina. Las secuencias de tripéptidos asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la porción carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. En consecuencia, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación O-ligada se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acilgalactosamina, galactosa o xilosa, a un hidroxiamino ácido, más comúnmente, serina o treonina, si bien pueden usarse también 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glicosilación en el anticuerpo es efectuada, convenientemente, mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos, de modo de contener una o más de las secuencias de tripéptido descriptas con anterioridad (para sitios de glicosilación N-ligados) . La alteración también puede efectuarse mediante la adición o sustitución de uno o más residuos serina o treonina en la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación O-ligados) .

Cuando el anticuerpo comprende una región Fe, el carbohidrato unido a este puede ser alterado. Por ejemplo, los anticuerpos con una estructura de carbohidrato madura que carece de fucosa unida a una región Fe del anticuerpo se describen en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de América Nro. US 2003/0157108 (Presta, L.) . Ver, además, US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd) . Los anticuerpos con una N-acetilglucosamina de bisección (GlcNAc) en el carbohidrato unido a una región Fe del anticuerpo se describen en el documento WO 2003/011878, Jean-Mairet et al. y Patente de los Estados Unidos de América Nro. 6.602.684, Umana et al. Los anticuerpos con por lo menos un residuo galactosa en el oligosacárido unido a una región Fe del anticuerpo se informan en el documento WO 1997/30087, Patel et al. Ver, además, WO 1998/58964 (Raju, S.) y WO 1999/22764 (Raju, S.), que se relacionan con anticuerpos con alteración de carbohidrato unido a su región Fe. Ver, además, US 2005/0123546 (Umana et al. ) , sobre moléculas de unión de antígeno con glicosilación modificada.

La variante de glicosilación preferida en esta invención comprende una región Fe, donde una estructura de carbohidrato unida a la región Fe carece de fucosa. Este tipo de variantes tiene mejor función ADCC. Opcionalmente, la región Fe además comprende una o más sustituciones de aminoácidos que aumentan además la ADCC, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333, y/o 334 de la región Fe (numeración de residuos Eu) . Ejemplos de publicaciones relacionadas con anticuerpos "defucosilados" o "deficientes en fucosa" incluyen: US 2003/0157108; WO 2000/61739; O 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; Okazaki et al. J. Mol. Biol . 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Ejemplos de estirpes celulares que producen anticuerpos defucosilados incluyen células CHO Lecl3 deficientes en fucosilación de proteína (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249: 533-545 (1986); Solicitud de Patente de los Estados Unidos de América Nro. US 2003/0157108 Al, Presta, L; y WO 2004/056312 Al, Adams et al., en especial, en el Ejemplo 11), y estirpes celulares knockdown, tales como las células CHO knockdown del gen de alfa-1,6-fucosiltransferasa, FUT8 (Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004) ) .

Otra variante de anticuerpo es una variante de sustitución de aminoácido. Estas variantes tienen por lo menos un residuo de aminoácido (por lo menos 2, por lo menos 3, por lo menos 4 o más) en la molécula de anticuerpo reemplazado por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las regiones hipervariables , si bien se contemplan además alteraciones FR. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla A, con el encabezamiento "sustituciones preferidas". Si dichas sustituciones producen un cambio en la actividad biológica, entonces pueden introducirse cambios más sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla A, o como se describe adicionalmente a continuación con referencia a las clases de aminoácidos, y los productos pueden ser sometidos a la detección sistemática.

Tabla A Residuo original Sustituciones ej emplares Sustituciones preferidas Ala (A) Val; Leu; lie Val Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln Asp (D) Glu; Asn Glu Cys (C) Ser; Ala Ser Gln (Q) Asn; Glu Asn Glu (E) Asp; Gln Asp Gly (G) Ala Ala His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg lie (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu Leu (L) Norleucina; lie; Val; Met; Ala; Phe -lie Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; lie Leu Phe (F) Trp; Leu; Val; lie; Ala; Tyr Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Val; Ser Ser Trp ( ) Tyr; Phe Tyr Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe Val (V) lie; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina Leu Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se logran mediante la selección de sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación helical o de lámina; (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio blanco; o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos naturales se dividen en grupos sobre la base de las propiedades de cadenas laterales comunes: (1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) neutros hidrófilos: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: his, lys, arg; (5) residuos que afectan la orientación de cadena: gly, pro ; y aromáticos: trp, tyr, phe Las sustituciones no conservadoras ' acarrearán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.

Un tipo de variante de sustitución supone la sustitución de uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo progenitor (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado) . En general, las variantes resultantes seleccionadas para el posterior desarrollo tendrán propiedades biológicas mejoradas, en relación con el anticuerpo progenitor a partir del cual son generados. Una manera conveniente para la generación de dichas variantes de sustitución involucra la maduración para afinidad, usando la expresión de fagos. Brevemente, varios sitios de región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) son mutados a fin de generar todas las sustituciones de aminoácidos posibles en cada sitio. Los anticuerpos generados de esta manera son exhibidos desde partículas de fagos filamentosas como fusiones al producto de gen III de M13 empaquetado dentro de cada partícula. Las variantes exhibidas en fagos luego son sometidas a la detección sistemática a fin de establecer su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) , como se describe en esta solicitud. Con el objetivo de identificar sitios de región hipervariable candidatos para la modificación, puede efectuarse la mutagénesis de barrido de alanina, de modo de identificar residuos de región hipervariable que contribuyen de manera significativa a la unión de antígeno. Alternativa o adicionalmente , puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo de antígeno-anticuerpo, de modo de identificar puntos · de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos para la sustitución de' acuerdo con las técnicas elaboradas en esta solicitud. Una vez generadas dichas variantes, el panel de variantes se somete a la detección sistemática como se describe en esta solicitud, y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos pertinentes pueden seleccionarse para el posterior desarrollo.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo se preparan por medio de una diversidad de métodos conocidos en el arte. Estos métodos abarcan, sin limitación, el aislamiento desde una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoácidos naturales) , o la preparación por medio de la mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida a sitio) , la mutagénesis por PCR y la mutagénesis de cásete de una variante preparada anteriormente o una versión no variante del anticuerpo.

Puede ser conveniente introducir una o más modificaciones de aminoácidos en una región Fe de los polipéptidos de inmunoglobulina de la invención, para generar, de ese modo, una variante de región Fe. La variante de región Fe puede comprender una secuencia de región Fe humana (por ejemplo, una región Fe humana IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4) que comprende una modificación de aminoácido (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos, que incluyen aquella de una cisteina bisagra.

De acuerdo con esta descripción y con las enseñanzas del arte, se contempla que, en algunas realizaciones, un anticuerpo utilizado en los métodos de la invención puede comprender una o más alteraciones, en comparación con el anticuerpo de contraparte de tipo salvaje, por ejemplo, en la región Fe. Sin embargo, estos anticuerpos retendrán sustancialmente las mismas características requeridas para la utilidad terapéutica, en comparación con su contraparte de tipo salvaje. Por ejemplo, se cree que pueden efectuarse ciertas alteraciones en la región Fe que lograrán una alterada (es decir, mejorada o disminuida) unión a Clq o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) , por ejemplo, como se describe en el documento O 99/51642. Ver además la referencia de Duncan & inter, Nature, 322: 738-40 (1988); Patente de los Estados Unidos Nro. 5.648.260; Patente de los Estados Unidos Nro. 5.624.821; y WO 94/29351 en relación con otros ejemplos de variantes de región Fe. Los documentos WO 00/42072 (Presta) y WO 2004/056312 (Lowman) describen variantes de anticuerpos con mejorada o disminuida unión a FcR. El contenido de estas publicaciones de patente se incorpora específicamente en la presente solicitud a modo de referencia. Ver, además, la referencia de Shields et al., J. Biol. Chem., 9 (2) : 6591-6604. (2001) . Los anticuerpos con mayores semividas y mejor unión al receptor Re neonato (FcRn) , que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol . , 117: 587 (1976) y Kim et al., J. Immunol., 24: 249 (1994)) se describen en el documento US 2005/0014934A1 (Hinton et al.) . Estos anticuerpos comprenden una región Fe con una o más sustituciones que mejoran la unión de la región Fe a FcRn. Las variantes de polipéptido con alteradas secuencias de aminoácidos de región Fe y mayor o menor capacidad de unión de Clq se describen en la Patente de los Estados Unidos Nro. 6.194.551B1, y en el documento WO 99/51642. Los contenidos de dichas publicaciones de patente se incorporan específicamente en la presente solicitud a modo de referencia. Ver, además, la referencia de Idusogie et al.: J. Immunol., 164: 4178-4184 (2000) .

Derivados de anticuerpos.

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser adicionalmente modificados de manera de contener restos no proteináceos adicionales conocidos en el arte y de fácil disponibilidad. Preferentemente, los restos adecuados para la derivación del anticuerpo son polímeros solubles en agua. Ejemplos no limitativos de los polímeros solubles en agua incluyen, sin limitación, polietilenglicol (PEG) , copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1, 3, 6-trioxano, copolímero de etileno/anhidrido maleico, poliaminoácidos (o bien homopolímeros o copolímeros de azar) y dextrano o poli(n-vinil pirrolidona ) polietilenglicol , homopolímeros de propilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) , alcohol polivinílico, y sus mezclas. El polietilenglicol propionaldehído puede tener ventajas en la elaboración, debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular, y puede ser ramificado o no ramificado. La cantidad de polímeros unidos al anticuerpo puede variar, y si se unen más de un polímero, estos pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, la cantidad y/o el tipo de polímeros utilizados para la derivación pueden determinarse sobre la base de consideraciones que incluyen, sin limitación, las propiedades particulares o las funciones del anticuerpo por mejorar, el uso del derivado de anticuerpo en una terapia en condiciones definidas, etc.

Detección sistemática de anticuerpos con propiedades deseadas .

Los anticuerpos de la presente invención pueden caracterizarse por sus propiedades fisicas/quimicas y funciones biológicas por diversos ensayos conocidos en el arte (algunos de los cuales se describen en esta solicitud) . En algunas realizaciones, los anticuerpos se caracterizan por cualesquiera una o más de la reducción o el bloqueo de la unión de hepsina, reducción o bloqueo de la actividad de hepsina, reducción o bloqueo de hepsina y/o señalización molecular aguas abajo del sustrato de hepsina (por ejemplo, pro-MSP, pro-uPA, Factor VII, pro-HGF) , y/o tratamiento y/o prevención de un tumor, trastorno proliferativo celular o tipo de cáncer; y/o el tratamiento o la prevención de un trastorno asociado con la expresión y/o actividad de hepsina (tal como la mayor expresión y/o actividad de hepsina) . En algunas realizaciones, la actividad de hepsina es la actividad enzimática de hepsina. En una realización, la actividad enzimática comprende la disociación de sustrato de polipéptido de hepsina. En una realización, el sustrato de polipéptido de hepsina es uno o más de la proteina de estimulación promacrófagos (pro-MSP) , pro-uPA, Factor VII y pro-HGF. La activación de hepsina de pro-MSP se describe en la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos de América copendiente de propiedad común Nro. (espacio en blanco), presentada el 22 de octubre de 2009. En una realización, la actividad enzimática comprende la disociación de un sustrato sintético de hepsina. En algunas realizaciones, el sustrato sintético de hepsina es un sustrato expuesto en la Tabla 1.

Los anticuerpos purificados pueden ser adicionalmente caracterizados por una serie de ensayos que incluyen, sin limitación, el secuenciamiento N-terminal, el análisis de aminoácidos, la cromatografía líquida de alta presión (HPLC, según su sigla en inglés) de exclusión por tamaño no desnaturalizante, la espectrometría de masa, la cromatografía de intercambio iónico y la digestión de papaina.

En ciertas realizaciones de la invención, los anticuerpos producidos en esta invención se analizan a fin de establecer su actividad biológica. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención se ensayan de modo de establecer su actividad de unión de antígeno. Los ensayos de unión de antígeno son conocidos en el arte y pueden usarse en esta solicitud, e incluyen, sin limitación, cualquier ensayo de unión directa o competitiva usando técnicas tales como western blots, radioinmunoensayos , ELISA (ensayo inmunosorbente ligado a enzima) , inraunoensayos tipo "sándwich", ensayos de inmunoprecipitación, inmunoensayos fluorescentes e inmunoensayos de proteina A. La unión de antigeno ilustrativa y otros ensayos se proveen a continuación en la sección de Ejemplos.

Si se desea un anticuerpo antihepsina que inhibe el crecimiento celular, el anticuerpo candidato puede ensayarse en ensayos in vitro o in vivo que miden la inhibición del crecimiento celular. Los métodos para el análisis del crecimiento o la proliferación de una célula cancerosa son bien conocidos en el arte. Los métodos ejemplares para la determinación del crecimiento y/o la proliferación y/o la apoptosis celular incluyen, por ejemplo, el ensayo de incorporación de BrdU, MTT, la incorporación de [ 3H] -timidina (por ejemplo, el ensayo TopCount (PerkinElmer) ) , ensayos de viabilidad celular (por ejemplo, CellTiter-Glo (Promega) ) , y similares .

En una realización, la presente invención contempla un anticuerpo que posee funciones efectoras. En ciertas realizaciones, se miden las actividades Fe del anticuerpo. Pueden conducirse ensayos de citotoxicidad in vitro o in vivo a fin de confirmar la reducción o el agotamiento de las actividades CDC o ADCC. Por ejemplo, pueden llevarse a cabo ensayos de unión de receptor Fe (FcR) a fin de garantizar que el anticuerpo carece de unión de FcgR (y en consecuencia, probablemente carezca de actividad ADCC) , si bien retiene la capacidad de unión de FcRn. Las células primarias para la mediación de ADCC, los linfocitos citoliticos naturales, expresan solo FcgRIII, mientras que los monocitos expresan FcgRI, FcgRII y FcgRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3, página 464, de la referencia de Ravetch y Kinet: Annu. Rev. Immunol . , 9: 457-92 (1991) . Un ejemplo de un ensayo in vitro para la evaluación de la actividad de ADCC de una molécula de interés se describe en la Patente de los Estados Unidos de América Nro. 5.500.362 ó 5.821.337. Un ensayo para la detección de la actividad de ADCC también se ejemplifica en esta solicitud. Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y linfocitos citoliticos naturales (NK) . Alternativa o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como aquel revelado en la referencia de Clynes et al. PNAS, 95: 652-656 (1998) . Los ensayos de unión de Clq también pueden llevarse a cabo de manera de confirmar que el anticuerpo es incapaz de unión a Clq, y en consecuencia, carece de actividad CDC. A fin de evaluar la activación de complemento, puede efectuarse un ensayo CDC, por ejemplo, como se describe en la referencia de Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202: 163 (1996). Las determinaciones de unión de FcRn y aclaramiento/semivida in vivo pueden efectuarse también usando métodos conocidos en el arte.

Vectores, células huésped y métodos biotecnológicos .

Para la producción biotecnológica de un anticuerpo de la invención, se aisla el ácido nucleico que codifica el anticuerpo, y se inserta en un vector replicable para la clonación adicional (amplificación del ADN) o para la expresión. El ADN que codifica el anticuerpo puede ser aislado sin dificultad y secuenciado usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo). Varios vectores están disponibles. La elección del vector depende, en parte, de la célula huésped por ser utilizada. En general, las células huésped preferidas son de origen procarioto o eucarioto (generalmente, mamífero) . Se apreciará que pueden usarse regiones constantes de cualquier isotipo para este propósito, por ejemplo, regiones constantes de IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, y que dichas regiones constantes pueden obtenerse de cualquier especie humana o animal. a. Generación de anticuerpos usando células huésped procariotas. i. Construcción de vector.

Las secuencias de polinucleótidos que codifican componentes polipéptidos del anticuerpo de la invención pueden obtenerse usando técnicas recombinantes convencionales. Las secuencias de polinucleótidos deseadas pueden ser aisladas y secuenciadas desde células productoras de anticuerpo, tales como células de hibridoma. Alternativamente, los polinucleótidos pueden sintetizarse empleando técnicas de PCR o sintetizador de nucleótidos. Una vez obtenidas, las secuencias que codifican los polipéptido son insertadas en un vector recombinante capaz de replicacion y expresión de polinucleótidos heterólogos en células procariotas. Para el propósito de esta invención, pueden usarse muchos vectores que pueden ser obtenidos y que son conocidos en el arte. La selección de un vector apropiado dependerá, principalmente, del tamaño de los ácidos nucleicos por ser insertados en el vector, y de la célula huésped particular por ser transformada con el vector. Cada vector contiene diversos componentes, de acuerdo con su función (amplificación o expresión de polinucleótido heterólogo, o ambas) y su compatibilidad con la célula huésped particular donde reside. Los componentes del vector generalmente incluyen, sin limitación: un origen de replicación, un gen marcador de selección, un promotor, un sitio de unión de ribosoma (RBS, según su sigla en inglés) , una secuencia de señal, la inserción de ácido nucleico heteróloga y una secuencia de terminación de transcripción.

En general, se usan vectores plásmidos que contienen secuencias de replicón y de control que derivan de especies compatibles con la célula huésped, en relación con estos huéspedes. El vector comúnmente porta un sitio de replicación, al igual que secuencias marcadoras que son capaces de proporcionar selección fenotipica en células transformadas. Por ejemplo, E. coli típicamente se transforma usando pBR322, un plásmido derivado de una especie de E. coli. pBR322 contiene genes que codifican para la resistencia a ampicilina (Amp) y tetraciclina (Tet) , y en consecuencia, proporciona un fácil medio para la identificación de células transformadas. pBR322, sus derivados, u otros plásmidos microbianos o bacteriófagos también pueden contener, o ser modificados de manera de contener promotores que pueden ser usados por el organismo microbiano para la expresión de proteínas endógenas. Ejemplos de derivados de pBR322 utilizados para la expresión de anticuerpos particulares se describen en detalle en la referencia de Cárter et al., Patente de los Estados Unidos de América Nro. 5.648.237.

Además, pueden usarse como vectores de transformación vectores de fagos que contienen secuencias de replicón y de control que son compatibles con el microorganismo huésped, en relación con estos huéspedes. A modo de ejemplo, puede utilizarse bacteriófago tal como 1GEM.TM.-11 en la preparación de un vector recombinante que puede usarse para la transformación de células huésped sensibles tales como E. coli LE392.

El vector de expresión de la invención puede comprender dos o más pares de promotor-cistrón, que codifican cada uno de los componentes de polipéptido. Un promotor es una secuencia reguladora no traducida ubicada aguas arriba (5') con respecto a un cistrón que modula su expresión. Los promotores procariotos típicamente se dividen en dos clases, inducibles y constitutivos. El promotor inducible es un promotor que inicia mayores niveles de transcripción del cistrón bajo su control en respuesta a cambios en la condición del cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura.

Se conocen una gran cantidad de promotores reconocidos por una diversidad de potenciales células huésped. El promotor seleccionado puede ser funcionalmente ligado a ADN de cistrón que codifica la cadena ligera o pesada, mediante la remoción del promotor del ADN fuente, por medio de la digestión enzimática de restricción y la inserción de la secuencia de promotor aislada en el vector de la invención. Tanto la secuencia de promotor nativa como muchos promotores heterologos pueden usarse a fin de dirigir la amplificación y/o expresión de los genes blanco. En algunas realizaciones, se utilizan promotores heterologos, ya que estos generalmente permiten una mayor transcripción y mayores rendimientos de gen blanco expresado en comparación con el promotor de polipéptido blanco nativo.

Los promotores adecuados para el uso con huéspedes procariotos incluyen el promotor phoA, los sistemas de promotores de b-lactamasa y lactosa, un sistema promotor de triptófano (trp) , y promotores híbridos tales como el promotor tac o trc. Sin embargo, son también adecuados otros promotores funcionales en bacterias (tales como otros promotores de fagos o bacterianos conocidos) . Se han publicado sus secuencias de nucleótidos, a fin de permitir al experto su ligación a cistrones que codifican las cadenas pesada y ligera objetivo (Siebenlist et al., (1980) Cell 20: 269) usando conectores o adaptadores a fin de suministrar los sitios de restricción necesarios.

En un aspecto de la invención, cada cistrón dentro del vector recombinante comprende un componente de secuencia de señal de secreción que dirige la translocación de los polipéptidos expresados a través de una membrana. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN de polipéptido blanco que se inserta en el vector. La secuencia de señal seleccionada para el propósito de esta invención debe ser aquella reconocida y procesada (es decir, disociada por una peptidasa de señal) por la célula huésped. Para células huésped procariotas que no reconocen ni procesan las secuencias de señal nativas para los polipéptidos heterólogos, la secuencia de señal es sustituida por una secuencia de señal procariota, seleccionada, por ejemplo, del grupo que consiste en la fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp? líderes de enterotoxina II estables con respecto al calor (STII, según su sigla en inglés) , LamB, PhoE, PelB, OmpA y MBP. En una realización de la invención, las secuencias de señal utilizadas en ambos cistrones del sistema de expresión son secuencias de señal STII o sus variantes.

En otro aspecto, la producción de las inmunoglobulinas de acuerdo con la invención puede producirse en el citoplasma de la célula huésped, y por lo tanto, no requiere la presencia de secuencias de señal de secreción dentro de cada cistrón. En este sentido, las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina son expresadas, plegadas y montadas · para formar inmunoglobulinas funcionales dentro del citoplasma. Ciertas cepas huésped (por ejemplo, las cepas de E. coli trxB) proporcionan condiciones del citoplasma que son favorables para la formación de enlaces de disulfuro, a fin de permitir el apropiado plegado y montaje de subunidades de proteína expresadas. Proba and Pluckthun, Gene, 159: 203 (1995) .

Las células huésped procariotas adecuadas para la expresión de anticuerpos de la invención incluyen arqueobacterias y eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos . Ejemplos de bacterias útiles incluyen Escherichia (por ejemplo, E. coli) , Bacilli (por ejemplo, B. subtilis) , enterobacterias, especies de Pseudomonas (por ejemplo, P. aeruginosa) , Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla, o Paracoccus. En una realización, se usan células gram-negativas . En una realización, se usan células de E. coli como huéspedes para la invención. Ejemplos de cepas de E. coli incluyen la cepa W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), páginas 1190-1219; Nro. de depósito ATCC 27.325) y sus derivados, que incluyen la cepa 33D3 que tiene el genotipo W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 lac Iq lacL8 AompTA (nmpc-fepE) degP41 kanR (Patente de los Estados Unidos de América Nro. 5.639.635) . Son también adecuadas otras cepas y sus derivados, tales como E. coli 294 (ATCC 31.446), E. coli B, E . colil 1776 (ATCC 31.537) y E. coli RV308 (ATCC 31.608). Estos ejemplos son ilustrativos, y no limitativos. Los métodos para la construcción de derivados de cualquiera de las bacterias mencionadas con anterioridad con genotipos definidos son conocidos en el arte, y se describen, por ejemplo, en la referencia de Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990). Generalmente, es necesario seleccionar las bacterias apropiadas teniendo en cuenta la replicabilidad del replicón en las células de una bacteria. Por ejemplo, pueden usarse adecuadamente especies de E. coli, Serratia o Salmonella como el huésped, cuando se usan plásmidos bien conocidos, tales como pBR322, pBR325, pACYC177, o pKN410 a fin de suministrar el replicón. Típicamente, la célula huésped debe secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas, y convenientemente, pueden incorporarse inhibidores de proteasa adicionales en el cultivo de células. ii. Producción de anticuerpo.

Las células huésped son transformadas con los vectores de expresión descriptos con anterioridad, y cultivadas en medios nutrientes convencionales modificados según lo apropiado para la inducción de promotores, selección de transformantes, o amplificación de los genes codificadores de las secuencias deseadas.

La transformación significa la introducción de ADN en el huésped procarioto, de modo que el ADN sea replicable, o bien como un elemento extracromosómico, o como un integrante cromosómico. De acuerdo con la célula huésped utilizada, la transformación se realiza usando técnicas convencionales apropiadas para dichas células. El tratamiento de calcio que emplea cloruro de calcio es utilizado generalmente para células bacterianas que contienen barredores de la pared celular sustanciales. Otro método para la transformación emplea polietilenglicol/DMSO . Aun otra técnica utilizada es la electroporación .

Las células procariotas utilizadas para la producción de los polipéptidos de la invención se cultivan en medios conocidos en el arte, y adecuados ' para el cultivo de' las células huésped seleccionadas. Ejemplos de medios adecuados incluyen caldo de cultivo Luria (LB) más suplementos nutrientes necesarios. En algunas realizaciones, los medios además contienen un agente de selección, seleccionado sobre la base de la construcción del vector de expresión, a fin de permitir selectivamente el crecimiento de células procariotas que contienen el vector de expresión. Por ejemplo, se agrega ampicilina al medio, para el crecimiento de células que expresan el gen de resistencia a ampicilina.

Cualquier suplemento necesario, además de fuentes de carbono, nitrógeno y fosfato inorgánico, puede ser también incluido en concentraciones apropiadas, e introducido solo o como una mezcla con otro suplemento o medio, tal como una fuente de nitrógeno compleja. Opcionalmente, el medio de cultivo puede contener uno o más agentes reductores seleccionados del grupo que consiste en glutationa, cisteina, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol y ditiotreitol .

Las células huésped procariotas se cultivan a temperaturas adecuadas. Para el cultivo de E. coli, por ejemplo, la temperatura preferida varia de aproximadamente 20°C a aproximadamente 39°C, más preferentemente, de alrededor de 25°C a alrededor de 37°C, aun más preferentemente, a alrededor de 30°C. El pH del medio puede ser cualquier pH que varíe de alrededor de 5 a alrededor de 9, conforme, principalmente, al organismo huésped. Para E. coli, el pH es, preferentemente, de alrededor de 6,8 a alrededor de 7,4, y más preferentemente, alrededor de 7.0.

Si se usa un promotor inducible en el vector de expresión de la invención, la expresión de proteina es inducida en condiciones adecuadas para la activación del promotor. En un aspecto de la invención, se usan promotores PhoA para el control de la transcripción de los polipéptidos . En consecuencia, las células huésped transformadas se cultivan en un medio de limitación de fosfato, para ' la inducción. Preferentemente, el medio de limitación de fosfato es el medio C.R.A.P (ver, por ejemplo, la referencia de Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263: 133-147). Pueden usarse una diversidad de otros inductores de acuerdo con la construcción de vector empleada, como se conoce en el arte .

En una realización, los polipéptidos expresados de la presente invención son secretados en el periplasma de las células huésped, y de allí, recuperados. La recuperación de proteina típicamente supone la interrupción del microorganismo, en general, por medios tales como el choque osmótico, la sonicación o lisis. Una vez que las células son interrumpidas, pueden removerse los restos celulares o las células enteras mediante la centrifugación o filtración. Las proteínas pueden ser adicionalmente purificadas, por ejemplo, mediante la cromatografía de resina de afinidad. Alternativamente, las proteínas pueden ser transportadas al medio de cultivo, y allí, aisladas. Las células pueden removerse del cultivo, y el sobrenadante de cultivo puede ser filtrado y concentrado para la purificación adicional de las proteínas producidas. Los polipéptidos expresados pueden aislarse adicionalmente e identificarse usando métodos comúnmente conocidos tales como la electroforesis de gel de poliacrilamida (PAGE) y el ensayo de Western blot.

En un aspecto de la invención, la producción de anticuerpo se lleva a cabo en grandes cantidades, mediante un proceso de fermentación. Pueden obtenerse diversos procedimientos de fermentación de alimentación de lotes de gran escala, para la producción de proteínas recombinantes . Las fermentaciones de gran escala tienen por lo menos 1.000 litros de capacidad, preferentemente, alrededor de 1.000 a 100.000 litros de capacidad. Estos termentadores utilizan impulsores agitadores a fin de distribuir oxígeno y nutrientes, en especial, glucosa (la fuente de carbono/energía preferida) . La fermentación de pequeña escala se refiere, en general, a la fermentación en un termentador que no tiene más de aproximadamente 100 litros de capacidad volumétrica, y que puede variar de aproximadamente 1 litro a aproximadamente 100 litros.

En un proceso de fermentación, la inducción de la expresión de proteina se inicia típicamente luego de que las células se han cultivado en condiciones adecuadas hasta una densidad deseada, por ejemplo, una OD 550 de aproximadamente 180-220; en dicha etapa, las células se encuentran en la fase estacionaria temprana. Pueden usarse una diversidad de inductores, de acuerdo con la construcción de vector empleada, como se conoce en el arte y se describe anteriormente. Las células pueden cultivarse durante períodos más cortos antes de la inducción. Habitualmente, las células son inducidas durante alrededor de 12-50 horas, si bien puede usarse un tiempo de inducción más largo o más corto.

A fin de mejorar el rendimiento de producción y la calidad de los polipéptidos de la invención, diversas condiciones de fermentación pueden ser modificadas. Por ejemplo, a fin de mejorar el apropiado montaje y plegado de los polipéptidos de anticuerpos secretados, pueden usarse vectores adicionales que sobreexpresan proteínas chaperonas tales como proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD, y/o DsbG) o FkpA (una peptidilprolil cis , trans-isomerasa con actividad chaperona) a fin de cotransformar las células procariotas huéspedes. Las proteínas chaperonas han demostrado facilitar el apropiado plegado y la solubilidad de proteínas heterólogas producidas en células huésped bacterianas. Chen et al., (1999), J. Biol . Chem. , 274: 19601-19605; Georgiou et al., Patente de los Estados Unidos de América Nro. 6.083.715; Georgiou et al . , Patente de los Estados Unidos de América Nro. 6.027.888; Bothmann and Pluckthun (2000), J. Biol. Chem., 275: 17100-17105; Ramm and Pluckthun, (2000), J. Biol. Chem. 275: 17106-17113; Arie et al., (2001), Mol. Microbiol., 39: 199-210.

A fin de minimizar la proteólisis de proteínas heterólogas expresadas (en especial, aquellas que son. proteolíticamente sensibles), pueden usarse para la presente invención ciertas cepas huéspedes deficientes en enzimas proteolíticas . Por ejemplo, las cepas de células huésped pueden modificarse de modo de efectuar mutaciones genéticas en los genes que codifican proteasas bacterianas conocidas tales como Proteasa III, OmpT, DegP, Tsp, Proteasa I, Proteasa Mi, Proteasa V, Proteasa VI y sus combinaciones. Pueden obtenerse algunas cepas deficientes en proteasa de E. coli y se describen, por ejemplo, en la referencia de Joly et al., (1998), supra; Georgiou et al., Patente' de los Estados Unidos de América Nro. 5.264.365; Georgiou et al., Patente de los Estados Unidos de América Nro. 5.508.192; Hará et al., Microbial Drug Resistance, 2: 63-72 (1996).

En una realización, se usan cepas de E. coli deficientes en enzimas proteoliticas y transformadas con plásmidos que sobreexpresan una o más proteínas chaperonas, como células huésped en el sistema de expresión de la invención. iii. Purificación de anticuerpo.

Pueden emplearse métodos de purificación de proteina convencionales conocidos en el arte. Los siguientes procedimientos son ejemplares de procedimientos de purificación adecuados: fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o columnas de intercambio iónico, precipitación de etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice o una resina de intercambio catiónico tal como DEAE, cromatofocalización, SDS-PAGE, precipitación de sulfato de amonio y filtración de gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75.

En un aspecto, se usa Proteina A inmovilizada en una fase sólida, para la purificación de inmunoafinidad de los productos de anticuerpo de longitud entera de la invención. La Proteina A es una proteina de pared celular de 41 kD de Staphylococcus áureas que se une con alta afinidad a la región Fe de los anticuerpos. Lindmark et al. (1983), J. Immunol . Meth. , 62: 1-13. La fase sólida sobre la cual la Proteina A es inmovilizada es, preferentemente, una columna que comprende una superficie de vidrio o sílice, más preferentemente, una columna de vidrio de poro controlado o una columna de ácido silícico. En algunas aplicaciones, la columna ha sido revestida con un reactivo, tal como glicerol, en un intento por prevenir la adherencia no específica de contaminantes .

Como la primera etapa de purificación, se aplica la preparación derivada del cultivo de células, como se describe con anterioridad, a la fase sólida inmovilizada de Proteína A a fin de permitir la unión específica de un anticuerpo de interés a la Proteina A. La fase sólida luego se lava de modo de eliminar los contaminantes ligados en forma no especifica a la fase sólida. Finalmente, el anticuerpo de interés es recuperado de la fase sólida mediante la elución. b. Generación de anticuerpos usando células huésped eucariotas.

Los componentes del vector generalmente incluyen, sin limitación, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento mej orador, un promotor, y una secuencia de terminación de transcripción. (i) Componente de secuencia de señal.

Un vector para el uso en una célula huésped eucariota puede contener además una secuencia de señal u otro polipéptido que tiene un sitio de disociación especifico en el término N de la proteina madura o polipéptido de interés. La secuencia de señal heteróloga seleccionada, preferentemente, es aquella que es reconocida y procesada (es decir, disociada por una peptidasa de señal) por la célula huésped. En la expresión de células mamiferas, hay disponibles secuencias de señal mamíferas al igual que líderes secretores virales, por ejemplo, la señal gD de herpes simple.

El ADN para dicha región de precursor está ligado en marco de lectura al ADN codificador del anticuerpo. (ii) Origen de replicación.

En general, no es necesario un componente de origen de replicación ara vectores de expresión mamíferos. Por ejemplo, puede usarse típicamente el origen SV40 solo porque contiene el promotor anterior. (iii) Componente de gen de selección.

Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también denominado un marcador de selección. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, cuando es pertinente, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles en el medio de complejo.

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que son exitosamente transformadas con un gen heterólogo producen una proteina que confiere resistencia a fármacos, y en consecuencia, sobreviven al régimen de selección. Ejemplos de dicha selección dominante emplean los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Otro ejemplo de marcadores de selección adecuados para células mamiferas son aquellos que permiten la identificación de células competentes para tomar ácido nucleico de anticuerpo, tal como DHFR, timidina quinasa, metalotioneina-I y -II, preferentemente, genes de metalotioneina de primates, adenosina deaminasa, ornitina decarboxilasa, etc.

Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección de DHFR se identifican primero mediante el cultivo de todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx) , un antagonista competitivo de DHFR. Una célula huésped apropiada cuando se emplea DHFR de tipo salvaje es la estirpe celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad de DHFR (por ejemplo, ATCC CRL-9096) .

Alternativamente, las células huésped (en particular, los huéspedes de tipo salvaje que contienen DHFR endógeno) transformadas o cotransformadas con secuencias de ADN que codifican un anticuerpo, la proteina de DHFR de tipo salvaje, y otro marcador de selección tal como aminoglicósido 3'-fosfotransferasa (APH) pueden seleccionarse mediante el crecimiento celular en un medio que contiene un agente de selección para el marcador de selección, tal como un antibiótico aminoglicósido, por ejemplo, kanamicina, neomicina, o G418. Ver Patente de los Estados Unidos de América Nro. 4.965.199. (iv) Componente de promotor.

Los vectores de expresión y clonación generalmente contienen un promotor que es reconocido por el organismo huésped y que está funcionalmente ligado al ácido nucleico de polipéptido del anticuerpo. Se conocen las secuencias de promotor para eucariotos. Prácticamente todos los genes eucariotos tienen una región rica en AT ubicada aproximadamente 25 a 30 bases aguas arriba desde el sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia hallada 70 a 80 bases aguas arriba desde el inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT, donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucariotos se encuentra una secuencia AATAAA, que puede ser la señal para la adición de la cola poli A al extremo 3' de la secuencia codificadora. Todas estas secuencias están adecuadamente insertadas en vectores de expresión eucariotos.

La transcripción de polipéptido de anticuerpo desde vectores en células huésped mamíferas es controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus tales como el virus de polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus (tal como Adenovirus 2) , virus de papiloma bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B, virus simio 40 (SV40) ; de promotores mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, de promotores de choque de calor, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped.

Los promotores anterior y posterior del virus SV40 se obtienen de modo conveniente como un fragmento de restricción de SV40 que además contiene el origen de replicación viral de SV40. El promotor anterior inmediato del citomegalovirus humano se obtiene, de modo conveniente, como un fragmento de restricción HindIII E. Un sistema para la expresión de ADN en huéspedes mamíferos usando el virus de papiloma bovino como un vector se revela en la Patente de los Estados Unidos de América Nro. 4.419.446. Se describe una modificación de este sistema en la Patente de los Estados Unidos de América Nro. 4.601.978. Alternativamente, puede usarse como promotor la repetición terminal larga del virus de sarcoma Rous. (v) Componente de elemento mej orador.

La transcripción de un ADN que codifica polipéptido de anticuerpo de esta invención por eucariotos mayores a menudo se incrementa mediante la inserción de una secuencia de mejorador en el vector. Actualmente, se conocen muchas secuencias de mejorador de genes mamíferos (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína e insulina) . Sin embargo, habitualmente, se utilizará un mejorador de un virus de célula eucariota. Ejemplos abarcan el mejorador de SV40 en el lateral posterior del origen de replicación (p. b. 100-270), el mejorador de promotor anterior de citomegalovirus, el mejorador de polioma en el lateral posterior del origen de replicación, y mejoradores de adenovirus. Ver, además, la referencia de Yaniv, Nature, 297: 17-18 (1982), sobre elementos mejoradores para la activación de promotores eucariotos. El mej orador puede ser empalmado en el vector en una posición 5' ó 3' con respecto a la secuencia codificadora de polipéptido de anticuerpo, si bien, preferentemente, se ubica en un sitio 5' desde el promotor. (vi) Componente de terminación de transcripción.

Los vectores de expresión utilizados en células huésped eucariotas además contendrán habitualmente secuencias necesarias para la terminación de la transcripción, y para la estabilización del ARNm. Dichas secuencias pueden obtenerse comúnmente de las regiones no traducidas 5', y, ocasionalmente, 3', de ADNc o ADN virales o eucariotos. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcriptos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica el anticuerpo. Un componente de terminación de transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. Ver el documento WO 94/11026 y el vector de expresión allí revelado. (vii) Selección y transformación de células huésped.

Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión del ADN en los vectores de la presente solicitud incluyen células eucariotas superiores que se describen en esta solicitud, que incluyen células huésped de vertebrados. La propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejido) se ha tornado un procedimiento de rutina. Ejemplos de estirpes celulares huéspedes de mamíferos útiles son la línea CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñon embrionario humano (células 293 ó 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen. Virol., 36: 59 (1977)); células de riñon de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10) ; células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 77:4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. , 23: 243-251 (1980); células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2) ; células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata de Búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2) .

Las células huésped se transforman con los vectores de expresión o clonación descriptos anteriormente para la producción de anticuerpos, y se cultivan en un medio nutriente convencional modificado según lo apropiado para la inducción de promotores, la selección de transformantes, o la amplificación de los genes que codifican las secuencias deseadas. (viii) Cultivo de las células huésped.

Las células huésped utilizadas para la producción de un anticuerpo de esta invención pueden cultivarse en una diversidad de medios. Los medios disponibles comercialmente, tales como medio de Ham FIO (Sigma) , medio esencial mínimo ( (MEM) , Sigma), RP I-1640 (Sigma) y medio de Eagle modificado de Dulbecco ( (DMEM) , Sigma), son adecuados para el cultivo de las células huésped. Además, cualquiera de los medios descriptos en las referencias de Ham et al., Meth. Enz. , 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. , 102: 255 (1980), Patentes de los Estados Unidos de América Nros. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655 ó 5.122.469; los documentos WO 90/03430; WO 87/00195; o Ref de Patente de los Estados Unidos de América 30.985 puede usarse como medio de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede suplementarse según lo necesario con hormonas u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico) , sales (como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato) , tampones (tales como HEPES), nucleótidos (como adenosina y timidina) , antibióticos (tales como el fármaco GENTAMYCIN™) , oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos habitualmente presentes en concentraciones finales en el rango micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. Puede incluirse además cualquier otro suplemento necesario en concentraciones apropiadas conocidas por los expertos en el arte. Las condiciones de cultivo, como la temperatura, el pH y similares, son aquellas utilizadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes para los expertos en el arte. (ix) Purificación de anticuerpo.

Cuando se emplean técnicas recombinantes , el anticuerpo puede producirse en forma intracelular, o puede ¦ ser directamente secretado en el medio. Si el anticuerpo se produce en forma intracelular, como una primera etapa, se remueven los restos de partículas, ya sea células huésped, ya sea fragmentos lisados, por ejemplo, mediante la centrifugación o la ultrafiltración. Cuando el anticuerpo se secreta en' el medio, en general, se concentran primero los sobrenadantes de dichos sistemas de . expresión usando un filtro de concentración de proteina disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Puede incluirse un inhibidor de proteasa tal como P SF en cualquiera de las etapas anteriores a fin de inhibir la proteólisis, y pueden incluirse antibióticos de manera de evitar el desarrollo de contaminantes nocivos.

La composición de anticuerpo preparada a partir de las células puede purificarse usando, por ejemplo, la cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis de gel, diálisis y la cromatografía de afinidad, donde la cromatografía de afinidad es la técnica de purificación preferida. La conveniencia de la proteína A como un ligando de afinidad depende de la especie y el isotipo de cualquier dominio Fe de inmunoglobulina presente en el anticuerpo. La proteína A puede usarse a fin de purificar anticuerpos a base de cadenas pesadas humanas gl, g2, o g4 (Lindmark et al., J. Immunol . Meth., 62: 1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para g3 humano (Guss et al., EMBO J. , 5: 15671575 (1986)) . La matriz a la cual se une el ligando de afinidad con mayor frecuencia es agarosa, si bien pueden obtenerse otras matrices. Las matrices mecánicamente estables, como vidrio de poro controlado o poli (estirenodivinil) enceno, permiten caudales más rápidos y tiempos de procesamiento más cortos que lo que puede lograrse con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX™resin (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación. Pueden obtenerse además otras técnicas para la purificación de proteina, tales como la fraccionación en una columna de intercambio iónico, la precipitación de etanol, la HPLC de fase inversa, la cromatografía en sílice, la cromatografía en heparina SEPHAROSE™, la cromatografía en una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico) , la cromatofocalización, SDS-PAGE y la precipitación de sulfato de amonio, de acuerdo con el anticuerpo por ser recuperado.

Luego de cualquier etapa de purificación preliminar, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y contaminantes puede someterse a la cromatografía de interacción hidrófoba de bajo pH usando un tampón de elución a un pH entre aproximadamente 2,5 y 4,5, preferentemente, efectuada en bajas concentraciones salinas (por ejemplo, de aproximadamente 0-0,25 M de sal).

Inraunoconj ugados .

La invención además provee inmunoconjugados (término utilizado de modo indistinto con "conjugados de anticuerpo-fármaco" o "ADC", por sus siglas en inglés) que comprenden cualquiera de los anticuerpos antihepsina descriptos en esta solicitud, conjugado con un agente citotóxico, tal como un agente quimioterapéutico, un fármaco, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, de planta, o animal, o sus fragmentos) , o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado) .

El uso de conjugados de anticuerpo-fármaco para el suministro local de agentes citotóxicos o citostáticos , es decir, fármacos que matan células tumorales o las inhiben, en el tratamiento del cáncer (Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research, 19: 605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997), Adv. Drg. Del. Rev., 26: 151-172; Patente de los Estados Unidos de América Nro. 4.975.278) permite el suministro dirigido del resto de fármaco a los tumores, y la acumulación intracelular dentro de los tumores, donde la administración sistémica de estos agentes de fármacos no conjugados puede provocar niveles inaceptables de toxicidad en células normales, al igual que en las células tumorales que se busca eliminar (Baldwin et al., Lancet (Mar. 15, 1986) páginas 603-05; Thorpe (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (A. Pinchera et al., eds) páginas 475-506). Se busca asi la máxima eficacia, con mínima toxicidad. Se ha informado que tanto los anticuerpos policlonales como los anticuerpos monoclonales son útiles en estas estrategias (Rowland et al., (1986) Cáncer Immunol . Immunother., 21: 183-87). Los fármacos utilizados en estos métodos incluyen daunomicina, doxorrubicina, metotrexato y vindesina (Rowland et al., (1986) supra) . Las toxinas utilizadas en conjugados de anticuerpo-toxina abarcan toxinas bacterianas tales como toxina de difteria, toxinas de plantas tales como ricina, toxinas de molécula pequeña tales como geldanamicina (Mandler et al. (2000), Jour. Nat. Cáncer Inst., 92 (19): 1573-1581; Mandler et al. (2000), Bioorganic & Med. Chem. Letters, 10: 1025-1028; andler et. al. (2002), Bioconjugate Chem. , 13: 786-791), maitansinoides (EP 1391213; Liu et al. (1996), Proc Nati Acad Sci USA, 93: 8618-8623) y caliqueamicina (Lode et al. (1998), Cáncer Res., 58: 2928; Hinman et al. (1993), Cáncer Res., 53: 3336-3342) . Las toxinas pueden ejercer sus efectos citotóxicos y citostáticos por mecanismos que incluyen la unión de tubulina, la unión de ADN, o la inhibición de la topoisomerasa . Algunos fármacos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando se conjugan con grandes anticuerpos o ligandos de receptor de proteina.

ZEVALINO ( ibritumomab tiuxetano, Biogen/Idec) es un conjugado de anticuerpo-radioisótopo compuesto por un anticuerpo monoclonal murino IgGl kappa dirigido contra el antigeno CD20, hallado en la superficie de linfocitos B normales y malignos, y radioisótopo lllln o 90Y ligado por un conector-quelante de tiourea (Wiseman et al. (2000), Eur. Jour. Nucí. Med. 27 (7) : 766-77; Wiseman et al. (2002), Blood, 99 (12) : 4336-42; Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol., 20 (10) : 2453-63; Witzig et al. (2002), J. Clin. Oncol., 20 (15) : 3262-69) . Si bien ZEVALIN tiene actividad contra el linfoma no de Hodgkin (NHL, según su sigla en inglés) de células B, la administración produce citopenias graves y prolongadas en la mayoría de los pacientes. MYLOTARGÓ (gemtuzumab ozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals) , un conjugado de anticuerpo-fármaco compuesto por un anticuerpo huCD33 ligado a caliqueamicina, fue aprobado en 2000 para el tratamiento de leucemia mieloide aguda mediante la inyección (Drugs of the Future, (2000), 25 (7) : 686; Patentes de los Estados Unidos, de América Nro. 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001) . Cantuzumab mertansina (Immunogen, Inc.), un conjugado de anticuerpo- fármaco compuesto por el anticuerpo huC242 ligado por medio del conector de disulfuro SPP al resto de fármaco maitansinoide, DM1, se encuentra en avance a ensayos de Fase II para el tratamiento de tipos de cáncer que expresan CanAg, tales como cáncer de colon, pancreático, gástrico y otros tipos de cáncer. MLN-2704 (Millennium Pharm. , BZL Biologics, Immunogen Inc.), un conjugado de anticuerpo-fármaco compuesto por el anticuerpo monoclonal de antígeno de membrana específico antiprostásico (PSMA, por sus siglas en inglés) ¦ ligado al resto de fármaco maitansinoide, DM1, se encuentra en desarrollo para el tratamiento potencial de tumores de próstata. Los péptidos de auristatina, auristatina E (AE) y monometilauristatina (MMAE) , análogos sintéticos de dolastatina, se conjugaron con anticuerpos monoclonales quiméricos cBR96 (especifico para Lewis Y en carcinomas) y cAClO (especifico para CD30 en enfermedades malignas hematológicas ) (Doronina et al. (2003), Nature Biotechnol., 21 (7): 778-784), y se encuentran en desarrollo terapéutico.

Los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de inmunoconj ugados se describen en la presente (por ejemplo, anteriormente) . Las toxinas enzimáticamente activas y sus fragmentos que pueden usarse incluyen cadena de difteria A, fragmentos activos no ligantes de toxina de difteria, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos . Ver, por ejemplo, el documento WO 93/21232, publicado el 28 de octubre de 1993. Pueden obtenerse una diversidad de radionúclidos para la producción de anticuerpos radioconj ugados . Ejemplos incluyen 212BÍ, 1311, 1311?, 90Y y 186Re. Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se preparan empleando una diversidad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales , tales como N-succinimidil-3- (2-piridilditiol) propionato (SPDP, según su sigla en inglés), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCl) , ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato) , aldehidos (tales como glutaraldheído) , compuestos de bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil ) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil ) -etilenodiamina ) , diisocianatos (tales como tolueno 2 , 6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1 , 5-difluoro-2 , 4-dinitrobenceno ) . Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina de ricina como se describe en la referencia de Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987) . El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietileno triaminapentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación de radionucleótido al anticuerpo. Ver el documento WO 94/11026.

Se contemplan asimismo en la presente los conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña, tales como una caliqueamicina, maitansinoides , dolastatinas , aurostatinas , un tricoteceno y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina. i. Maitansina y maitansinoides.

En algunas realizaciones,' el inmunoconjugado comprende un anticuerpo (de longitud completa o fragmentos) de la invención conjugado con una o más moléculas maitansinoides.

Los maitansinoides son inhibidores mitóticos que actúan mediante la inhibición de la polimerización de tubulina. La maitansina fue aislada por primera vez del arbusto del este de África Maytenus serrata (Patente de los Estados Unidos de América Nro. 3.896.111). Posteriormente, se descubrió que ciertos microbios también producen maitansinoides, tales como maitansinol y C-3 maitansinol ésteres (Patente de los Estados Unidos de América Nro. 4.151.042). El maitansinol sintético y sus derivados y análogos se revelan, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos de América Nro. 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; y 4.371.533.

Los restos de fármacos maitansinoides son atractivos restos de fármacos en conjugados de fármacos de anticuerpos, debido a que: (i) su preparación es relativamente accesible mediante la fermentación o la modificación química, y la derivación de los productos de fermentación, (ii) son tratables por la derivación con grupos funcionales adecuados para la conjugación, a través de conectores no disulfúricos , a anticuerpos, (iii) son estables en plasma, y (iv) son eficaces contra una diversidad de estirpes celulares tumorales.

Los inmunoconj ugados que contienen maitansinoides , los métodos para su preparación y su efecto terapéutico se revelan, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos de América Nro. 5.208.020, 5.416.064 y en la Patente Europea EP 0 425 235 Bl, cuyas revelaciones se incorporan expresamente en la presente solicitud a modo de referencia. Liu et al., Proc Nati Acad Sci USA, 93: 8618-8623 (1996), describieron inmunoconj ugados que comprendían un maitansinoide designado DM1, ligado al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra el cáncer colorrectal humano. Se halló que el conjugado era altamente citotóxico para células de cáncer de colon cultivadas, y mostraba actividad antitumoral en un ensayo de crecimiento tumoral in vivo. Chari et al., Cáncer Research, 52: 127-131 (1992), describen inmunoconj ugados en los cuales se conjugó un maitansinoide por medio de un conector de disulfuro al anticuerpo murino A7 de unión a un antigeno en estirpes celulares de cáncer de colon humanas, o a otro anticuerpo monoclonal murino TA.l, que se une al oncogén HER-2/neu. La citotoxicidad del conjugado de TA.1-maitansinoide se ensayó in vitro en la estirpe celular de cáncer' de mama humano SK-BR-3, que expresa 3 x 105 antigenos de superficie HER-2 por célula. El conjugado de fármaco logró un grado de citotoxicidad similar al fármaco maitansinoide libre, que pudo incrementarse mediante el aumento de la cantidad de moléculas de maitansinoide por molécula de anticuerpo. El conjugado de A7-maitansinoide mostró baja citotoxicidad sistémica en ratones.

Los conjugados de anticuerpo-maitansinoide se preparan mediante la unión química de un anticuerpo a una molécula de maitansinoide, sin disminuir de manera significativa la actividad biológica del anticuerpo o de la molécula de maitansinoide. Ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Nro. 5.208.020 (cuya revelación se incorpora expresamente a modo de referencia) . Un promedio de 3-4 moléculas de maitansinoide conjugadas por molécula de anticuerpo ha mostrado eficacia en el aumento de la citotoxicidad de células blanco, sin afectar de manera negativa la función o solubilidad del anticuerpo, si bien se esperaría que aun una molécula de toxina/anticuerpo aumente la citotoxicidad en comparación con el uso de anticuerpo desnudo. Los maitansinoides son bien conocidos en el arte, y pueden sintetizarse mediante técnicas conocidas, o aislarse de fuentes naturales. Los maitansinoides adecuados se revelan, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos de América Nro. 5.208.020, y en las otras patentes y publicaciones no referidas a patentes mencionadas con anterioridad. Los maitansinoides preferidos son maitansinol y análogos de maitansinol modificados en el anillo aromático o en otras posiciones de la molécula de maitansinol, tales como diversos ésteres de maitansinol.

Existen muchos grupos conectores conocidos en el arte para la preparación de conjugados de anticuerpo-maitansinoide, por ejemplo, aquellos revelados en la Patente de los Estados Unidos de América Nro. 5.208.020, o en la Patente EP 0 425 235 Bl, Chari et al., Cáncer Research, 52: 127-131 (1992), y en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de América Nro. 10/960.602, presentada el 8 de octubre de 2004, cuyas revelaciones se incorporan expresamente a modo de referencia. Los conjugados de anticuerpo-maitansinoide que comprenden el componente conector SMCC pueden prepararse como se revela en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de América Nro. 10/960.602, presentada el 8 de octubre de 2004. Los grupos conectores incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles al ácido, grupos fotolábiles, grupos lábiles a la peptidasa, o grupos lábiles a la esterasa, como se revela en las patentes identificadas con anterioridad; se prefieren los grupos disulfuro y tioéter. Otros grupos conectores adicionales se describen y se ejemplifican en esta solicitud.

Los conjugados del anticuerpo y maitansinoide pueden prepararse usando una cantidad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales, por ejemplo, N-succinimidil-3- (2-piridilditio)' propionato (SPDP) , succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) , iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HC1) , ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato) , aldehidos (tales como glutaráldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil ) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil ) -etilénodiamina) , diisocianatos (tales como tolueno 2, 6-diisocianato) , y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1 , 5-difluoro-2 , 4-dinitrobenceno) . Los agentes de acoplamiento particularmente preferidos incluyen N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. , 173: 723-737 (1978)) y N-succinimidil-4- ( 2-piridiltio) pentanoato (SPP) , a fin de proporcionar una unión de disülfuro.

El conector puede estar unido a la molécula de maitansinoide en diversas posiciones, de acuerdo con el tipo de unión. Por ejemplo, una unión de éster puede formarse mediante la reacción con un grupo hidroxilo usando técnicas de acoplamiento convencionales. La reacción puede producirse en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo, y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En una realización preferida, la unión se forma en la posición C-3 de maitansinol o un análogo de maitansinol. ii. Auristatinas y dolastatinas .

En algunas realizaciones, el inmunoconj ugado comprende un anticuerpo de la invención conjugado con dolastatinas o derivados y análogos peptidicos de dolostatina, las auristatinas (Patentes de los Estados Unidos de América Nros. 5635483; 5780588) . Las dolastatinas y auristatinas han demostrado interferir con la dinámica de microtúbulo, la hidrólisis de GTP y la división nuclear y celular (Woyke et al. (2001), Antimicrob. Agents and Chemother. , 45 (12) : 3580-3584), y tienen actividad anticancerigena (Patente de los Estados Unidos de América Nro. 5.663.149) y antifúngica (Pettit et al (1998), Antimicrob. Agents Chemother., 42: 2961-2965) . El resto de fármaco de dolastatina o auristatina puede unirse al anticuerpo a través del término N (amino) o el término C (carboxilo) del resto de fármaco peptidico (WO 02/088172) .

Las realizaciones ejemplares de auristatina incluyen los restos de fármaco de monometilauristatina ligados al término N DE y DF, revelados en "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", Acta de los Estados Unidos Nro. 10/983.340, presentada el 5 de noviembre de 2004, cuya revelación se incorpora expresamente a modo de referencia en su totalidad.

Habitualmente, los restos de fármaco a base de péptidos pueden prepararse mediante la formación de un enlace peptidico entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos de péptidos. Dichos enlaces peptídicos pueden prepararse, por ejemplo, de acuerdo con el método de síntesis de fase líquida (ver la referencia de E. Schróder y K. Lübke, "The Peptides", volumen 1, páginas 76-136, 1965, Academic Press), bien conocido en el campo de la química de péptidos. Los restos de fármaco de auristatina/dolastatina pueden prepararse de acuerdo con los métodos de la Patente de los Estados Unidos de América Nro. 5.635.483; y Patente de los Estados Unidos de América Nro. 5.780.588; las referencias de Pettit et al. (1989), J. Am. Chem. Soc, 111: 5463-5465; Pettit et al. (1998), Anti-Cancer Drug Design, 13: 243-277; Pettit, G. R. , et al., Synthesis, 1996, 719-725; y Pettit et al. (1996), J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1 5: 859-863. Ver, además, Doronina (2003) Nat. Biotechnol., 21 (7) : 778-784; "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", Acta de los Estados Unidos de América Nro. 10/983,340, presentada el 5 de noviembre de 2004, incorporada en la presente solicitud a modo de referencia en su totalidad (que revela, por ejemplo, conectores y métodos para la preparación de compuestos de monometilvalina tales como MMAE y MMAF conjugados a conectores) . iii. Caliqueamicina .

En otras realizaciones, el inmunoconj ugado comprende un anticuerpo de la invención conjugado con una o más moléculas de caliqueamicina . La familia de antibióticos de las caliqueamicinas es capaz de producir roturas de ADN de doble hebra en concentraciones subpicomolares . Para la preparación de conjugados de la familia de las caliqueamicinas, ver las Patentes de los Estados Unidos Nro. 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, y 5.877.296 (todas, concedidas a American Cyanamid Company) . Los análogos estructurales de caliqueamicina que pueden usarse incluyen, sin limitación, ???, a2?, a3?, N—acetil-??? , PSAG y T?1 (Hinman et al., Cáncer Research, 53: 3336-3342 (1993); Lode et al., Cáncer Research, 58: 2925-2928 (1998); y las patentes de los Estados Unidos mencionadas con anterioridad concedidas a American Cyanamid) . Otro fármaco antitumoral con el cual puede conjugarse en anticuerpo es QFA, que es un antifolato. Tanto la caliqueamicina como QFA tienen sitios intracelulares de acción, y no cruzan fácilmente la membrana plasmática. Por lo tanto, la absorción celular de estos agentes a través de la internalización mediada por anticuerpo aumenta en gran medida sus efectos citotóxicos . iv. Otros agentes citotóxicos.

Otros agentes antitumorales que pueden conjugarse con los- anticuerpos de la invención incluyen BCNU, estreptozoicina, vincristina y 5-fluoruracilo, la familia de agentes conocidos en forma conjunta como el complejo LL-E33288, descripto en las Patentes de los Estados Unidos de América Nro. 5.053.394 y 5.770.710, al igual que esperamicinas (Patente de los Estados Unidos Nro. 5.877.296).

Las toxinas enzimáticamente activas y sus fragmentos que pueden usarse comprenden cadena de difteria A, fragmentos activos no ligantes de toxina de difteria, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos . Ver, por ejemplo, el documento WO 93/21232, publicado el 28 de octubre de 1993.

La presente invención contempla, asimismo, un inmunoconj ugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolitica (por ejemplo, una ribonucleasa o una endonucleasa de ADN, tal como una desoxirribonucleasa; DNasa) .

Para la destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radiactivo. Pueden obtenerse una diversidad de isótopos radiactivos para la producción de anticuerpos radioconjugados . Ejemplos incluyen At211, 1131, 1125, Y90, Rel86, Rel88, Sml53, BÍ212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu. Cuando el conjugado se usa para la detección, puede comprender un átomo radiactivo para estudios centellográficos, por ejemplo, tc99m o 1123, o una marca de espin para la imagen de resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como imagen de resonancia magnética,- IRM) , tal como yodo-123 nuevamente, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxigeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.

Las radiomareas u otras marcas pueden incorporarse en el conjugado de maneras conocidas. Por ejemplo, el péptido puede ser biosintetizado, o puede ser sintetizado por medio de la síntesis química de aminoácidos, usando precursores de aminoácidos adecuados que comprenden, por ejemplo, flúor-19 en lugar de hidrógeno. Las marcas tales como tc99m o 1123, Rel86, Rel88 e Inlll pueden unirse por medio de un residuo cisteína en el péptido. Itrio-90 puede unirse por medio de un residuo lisina. El método IODOGEN (Fraker et al. (1978), Biochem. Biophys . Res. Commun. 80: 49-57) puede emplearse para incorporar yodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) describe otros métodos en detalle.

Los conjugados del anticuerpo y agente citotóxico pueden prepararse usando una diversidad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) , succinimidil-4- (N-maleimidometil ) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HC1), ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil ) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilenodiamina ) , diisocianatos (tales como tolueno 2 , 6-diisocianato) , y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1 , 5-difluoro-2 , 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse como se describe en la referencia de Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987) . El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietileno triaminapentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono-14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación de radionucleótido al anticuerpo. Ver el documento WO 94/11026. El conector puede ser un "conector disociable" que facilita la liberación del fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, pueden usarse un conector lábil al ácido, un conector sensible a peptidasa, un conector fotolábil, conector de dimetilo o conector que contiene disulfuro (Chari et al., Cáncer Research, 52: 127-131 (1992); Patente de los Estados Unidos de América Nro. 5.208.020) .

Los compuestos de la invención contemplan expresamente, sin limitación, ADC preparado con reactivos entrecruzadores : BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-S CC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS , sulfo-KMUS, sulfo-MBS , sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB y SVSB (succinimidil- ( 4-vinilsulfona) benzoato) , que pueden obtenerse en el mercado (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U. S. A) . Ver las páginas 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog. v. Preparación de conjugados de anticuerpo y fármaco.

En los conjugados de anticuerpo y fármaco (ADC, por sus siglas en inglés) de la invención, se conjuga un anticuerpo (Ab) con uno o más restos de fármaco (D) , por ejemplo, aproximadamente 1 a aproximadamente 20 restos de fármaco por anticuerpo, a través de un conector (L) . El ADC de Fórmula I puede prepararse por medio de varias vías que emplean reacciones de la química orgánica, condiciones y reactivos conocidos por los expertos en el arte, que incluyen: (1) la reacción de un grupo nucleófilo de un anticuerpo con un reactivo conector bivalente, para formar Ab-L, por medio de un enlace covalente, seguida de la reacción con un resto de fármaco D; y (2) la reacción de un grupo nucleófilo de un resto de fármaco con un reactivo conector bivalente, para formar D-L, por medio de un enlace covalente, seguida de la reacción con el grupo nucleófilo de un anticuerpo. Otros métodos para la preparación de ADC se describen en la presente .

Ab-(L-D)p I El conector puede estar compuesto por uno o más componentes de conector. Ejemplos de componentes de conector abarcan 6-maleimidocaproilo ("MC") , maleimidopropanoílo ("MP"), valina-citrulina ("val-cit"), alanina-fenilalanina ("ala-phe"), p-aminobenciloxicarbonilo ("PAB") , N-succinimidil 4- ( 2-piridiltio) pentanoato ("SPP"), N-succinimidil 4- (N-maleimidometil ) ciclohexano-1 carboxilato ("S CC") y N-succinimidil ( 4-yodo-acetil ) aminobenzoato ("SIAB"). Otros componentes conectores son conocidos en el arte, y algunos se describen en la presente. Ver, además, "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", Acta de los Estados Unidos Nro. 10/983.340, presentada el 5 de noviembre de 2004, cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia en su totalidad.

En algunas realizaciones, el conector puede comprender residuos de aminoácidos. Ejemplos de componentes conectores aminoácidos incluyen un dipéptido, un tripéptido, un tetrapéptido o un pentapéptido. Ejemplos de dipéptidos comprenden: valina-citrulina (ve o val-cit) , alanina-fenilalanina (af o ala-phe) . Ejemplos de tripéptidos incluyen: glicina-valina-citrulina (gly-val-cit ) y glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly) . Los residuos de aminoácidos que comprenden un componente conector de aminoácidos incluyen aquellos de origen natural, al igual que aminoácidos menores y análogos de aminoácidos de origen no natural, tales como citrulina. Los componentes conectores de aminoácidos pueden diseñarse y optimizarse en términos de su selectividad para la disociación enzimática por una enzima particular, por ejemplo, una proteasa asociada con tumor, catepsina B, C y D, o una proteasa de plasmina.

Los grupos nucleófilos en anticuerpos incluyen, sin limitación: (i) grupos amina N-terminales , (ii) grupos amina de cadena lateral, por ejemplo, lisina, (iii) grupos tiol de cadena lateral, por ejemplo, cisteina, y (iv) grupos amino o hidroxilo de azúcares, donde el anticuerpo es glicosilado. Los grupos amina, tiol e hidroxilo son nucleófilos, y capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupo electrófilos en restos de conector y reactivos de conector que incluyen: (i) ásteres activos tales como ésteres de NHS, ésteres de HOBt, haloformiatos y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo tales como haloacetamidas ; (iii) grupos aldehido, cetona, carboxilo y maleimida. Ciertos anticuerpos tienen disulfuros de intercadena reducibles, es decir, puentes de cisteína. Los anticuerpos pueden prepararse de modo de ser reactivos para la conjugación con reactivos de conectores mediante el tratamiento con un agente reductor tal como DTT (ditiotreitol ) . En consecuencia, cada puente de cisteína formará, teóricamente, dos nucleófilos tiol reactivos. Pueden introducirse grupos nucleófilos adicionales en los anticuerpos, a través de la reacción de Usinas con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) , a fin de lograr la conversión de una amina en un tiol. Los grupos tiol reactivos pueden introducirse en el anticuerpo mediante la introducción de uno, dos, tres, cuatro o más residuos cisterna (por ejemplo, mediante la preparación de anticuerpos mutantes que comprenden uno o más residuos aminoácidos cisteína no nativos) .

Los conjugados de anticuerpo y fármaco de la invención además pueden producirse mediante la modificación del anticuerpo de manera de introducir restos electrófilos, que pueden reaccionar con sustituyentes nucleófilos en el fármaco o reactivo de conector. Los azúcares de anticuerpos glicosilados pueden oxidarse, por ejemplo, con reactivos de oxidación de periodato, a fin de formar grupos aldehido o cetona que pueden reaccionar con el grupo amina de reactivos de conectores o restos de fármaco. Los grupos de base Schiff de imina resultantes pueden formar una unión estable, o pueden ser reducidos, por ejemplo, por reactivos de borohidruro a fin de formar uniones de amina estables. En una realización, la reacción de la porción carbohidrato de un anticuerpo glicosilado con galactosa oxidasa o meta-periodato sódico puede lograr grupos carbonilo (aldehido y cetona) en la proteina, que pueden reaccionar con grupos apropiados en el fármaco (Hermanson, Bioconjugate Techniques) . En otra realización, las proteínas que contienen residuos serina o treonina N-terminales pueden reaccionar con meta-periodato sódico, a fin de lograr la producción de un aldehido en lugar del primer aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992): Bioconjugate Chem., 3: 138-146; Patente de los Estados Unidos de América Nro. 5.362.852). Dicho aldehido puede hacerse reaccionar con un resto de fármaco o un nucleófilo de conector .

Asimismo, los grupos nucleófilos en un resto de fármaco incluyen, sin limitación: grupos amina, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, hidrazina carboxilato y arilhidrazida, capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos en restos de conector y reactivos de conector, que incluyen: (i) ásteres activos tales como ésteres de NHS, ésteres de HOBt, haloformiatos y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo tales como haloacetamidas ; (iii) grupos aldehido, cetona, carboxilo y maleimida.

Alternativamente, una proteina de fusión que comprende el anticuerpo y agente citotóxico puede prepararse, por ejemplo, mediante técnicas recombinantes o mediante la síntesis de péptidos. La longitud de ADN puede comprender regiones respectivas que codifican las dos porciones del conjugado, ya sea adyacentes entre sí, o separadas por una región que codifica un péptido de conector que no destruye las propiedades deseadas del conjugado.

Aun en otra realización, el anticuerpo puede ser conjugado con un "receptor" (tal como estreptavidina ) para la utilización en la dirección previa al tumor, donde el conjugado de anticuerpo-receptor se administra al individuo, luego se elimina de la circulación el conjugado no ligado usando un agente de aclaramiento, y a continuación, se administra un "ligando" (por ejemplo, avidina) , que es conjugado con un agente citotoxico (por ejemplo, un radionucleótido) .

Métodos de uso de anticuerpos antihepsina.

La presente invención caracteriza el uso de un anticuerpo de hepsina como parte de un régimen de tratamiento especifico que tiene el fin de proporcionar un efecto beneficioso a partir de la actividad de este agente terapéutico. La presente invención es particularmente útil en el tratamiento de cáncer de diversos tipos, en diversas etapas .

El término "cáncer" abarca un grupo de trastornos proliferativos , que incluyen, sin limitación, crecimiento precanceroso, tumores benignos y tumores malignos. Los tumores benignos permanecen localizados en el sitio de origen, y no tienen la capacidad de infiltrarse, invadir o hacer metástasis en sitios distantes. Los tumores malignos invadirán otros tejidos circundantes, y los dañarán. Además, pueden obtener la capacidad de desprenderse del sitio original y diseminarse hacia otras partes del organismo (metástasis) , habitualmente, a través del torrente sanguíneo o a través del sistema linfático, donde se ubican los ganglios linfáticos. Los tumores primarios se clasifican por el tipo de tejido a partir del cual surgen; los tumores metastásicos se clasifican por el tipo de tejido a partir del cual derivan las células cancerosas. Con el transcurso del tiempo, las células de un tumor maligno se tornan más anormales, y no tienen la apariencia de células normales. Este cambio en la apariencia de las células cancerosas se denomina grado de tumor, y las células cancerosas se describen como bien diferenciadas (bajo grado) , moderadamente diferenciadas, escasamente diferenciadas, o no diferenciadas (alto grado) . Las células bien diferenciadas tienen una apariencia bastante normal, y se asemejan a las células normales a partir de las cuales se originaron. Las células no diferenciadas son células que se han tornado tan anormales que ya no es posible determinar el origen de las células.

Los sistemas de etapas del cáncer describen cuanto se ha diseminado el cáncer anatómicamente, e intentan colocar pacientes con pronóstico y tratamiento similares en el mismo grupo de etapa. Pueden llevarse a cabo diversos ensayos a fin de ayudar a clasificar la etapa del cáncer, entre ellos, la biopsia y ciertos ensayos de imágenes, tales como la radiografía de tórax, mamografía, gammagrafía ósea, tomografía axial computarizada y la imagen de resonancia magnética. Se usan además pruebas sanguíneas y una evaluación clínica a fin de evaluar el estado de salud general del paciente y detectar si el cáncer se ha diseminado hacia ciertos órganos.

A fin de clasificar el cáncer en etapas, la Comisión Conjunta Americana para el Cáncer primero coloca el cáncer, en particular, los tumores sólidos, en una categoría de letra utilizando el sistema de clasificación TNM. El cáncer se designa con las letras T (tamaño del tumor) , N (nodulos palpables) , y M (metástasis) . TI, T2, T3 y T4 describen el tamaño creciente de la lesión primaria; NO, NI, N2, N3 indica el avance progresivo de compromiso nodular; y MO y MI reflejan la ausencia o presencia de metástasis distantes.

En el segundo método de clasificación de etapas, también conocido como el Agrupamiento General por Etapas o Clasificación de Etapas de Numeración Romana, el cáncer se divide en las etapas 0 a IV, incorporando el tamaño de las lesiones primarias al igual que la presencia de diseminación de nodulos y de metástasis distantes. En este sistema, los casos se agrupan en cuatro etapas, denotadas por los números romanos I a IV, o se clasifican como "recurrentes". Para ciertos tipos de cáncer, la etapa 0 se denomina "in situ" o "Tis", tal como el' carcinoma canalicular in situ o carcinoma lobulillar in situ, para cáncer de mama. Los adenomas de alto grado también pueden clasificarse como de etapa 0. En general, el cáncer tipo I es cáncer localizado, de tamaño reducido, que habitualmente es curable, mientras que el cáncer de la etapa IV habitualmente representa cáncer inoperable o metastásico. El cáncer de las etapas II y III habitualmente está localmente avanzado, o exhibe compromiso de nodos linfáticos locales. En general, los números de etapas superiores indican enfermedad más extensa, que incluye mayor tamaño de tumor y/o diseminación del cáncer a ganglios linfáticos circundantes y/u órganos adyacentes al tumor primario. Estas etapas se definen de manera precisa, si bien la definición es diferente para cada clase de cáncer, y es conocida por el experto en el arte.

Muchos registros de cáncer, como el Programa de Observación, Epidemiología y Resultados Finales (SEER, según siglas en inglés) del Instituto Nacional del Cáncer, utilizan la clasificación de etapas de síntesis. Este sistema se usa para todos los tipos de cáncer. Agrupa los casos de cáncer en cinco categorías principales: In situ es cáncer temprano, que se presenta solo en el estrato de células en el cual comenzó.

Localizado es el cáncer que se limita al órgano en el cual comenzó, sin evidencia de diseminación.

Regional es el cáncer que se ha diseminado más allá del sitio original (primario) , hacia ganglios linfáticos u órganos y tejidos circundantes.

Distante es el cáncer que se ha diseminado desde el sitio primario hacia órganos distantes o ganglios linfáticos distantes .

Desconocido se usa para describir casos en los cuales no hay suficiente información a fin de indicar una etapa.

Además, es común que el cáncer retorne meses o años luego de haber eliminado el tumor primario. El cáncer que retorna después de que todo el tumor visible se ha erradicado se denomina enfermedad recurrente. La enfermedad recurrente en el área del tumor primario es localmente recurrente, y la enfermedad recurrente como metástasis se denomina recurrencia distante .

El tumor puede ser un tumor sólido o un tumor no sólido, o de tejido blando. Ejemplos de tumores de tejido blando incluyen leucemia (por ejemplo, leucemia mielógena crónica, leucemia mielógena aguda, leucemia linfoblástica aguda del adulto, leucemia mielógena aguda, leucemia linfoblástica aguda de células B maduras, leucemia linfocitica crónica, leucemia polinfocitica o leucemia de células pilosas) o linfoma (por ejemplo, linfoma no de Hodgkin, linfoma de células T cutáneas o enfermedad de Hodgkin) . Un tumor sólido comprende cualquier cáncer de tejidos corporales diferentes de la sangre, la médula ósea o el sistema linfático. Los tumores sólidos además pueden ' dividirse en aquellos de origen celular epitelial y aquellos de origen celular no epitelial. Ejemplos de tumores sólidos de células epiteliales incluyen tumores del tracto gastrointestinal, colon, mama, próstata, pulmón, riñon, hígado, páncreas, ovario, cabeza y cuello, cavidad oral, estómago, duodeno, intestino delgado, intestino grueso, ano, vesícula biliar, labio, nasoíaringe , piel, útero, órgano genital masculino, órganos urinarios, vejiga y piel (sic) . Los tumores sólidos de origen no epitelial incluyen sarcomas, tumores cerebrales y tumores óseos. Otros ejemplos de tumores se describen en la sección de Definiciones .

En algunas realizaciones, el paciente de la presente invención es sometido a un ensayo de diagnóstico, por ejemplo, antes del tratamiento y/o durante el tratamiento y/o después del tratamiento. En general, si se efectúa un ensayo de diagnóstico, puede obtenerse una muestra del paciente, que necesita tratamiento. Cuando el sujeto tiene cáncer, la muestra puede ser una muestra del tumor, u otra muestra biológica, tal como un liquido biológico, que incluye, sin limitación, sangre, orina, saliva, liquido ascitico, o derivados tales como suero sanguíneo y plasma samguineo, y similares .

La muestra biológica de la presente solicitud puede ser una muestra fijada, por ejemplo, una muestra fijada en formalina, embutida en parafina (FFPE, según sus siglas en inglés), o una muestra congelada.

Diversos métodos para la determinación de la expresión de ARNm o proteina incluyen, sin limitación, el perfil de expresión génica, la reacción en cadena de polimerasa (PCR), que incluye la PCR en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR) , el análisis de microserie, análisis serial de la expresión génica (SAGE, según sus siglas en inglés) , MassARRAY, el análisis de expresión génica por secuenciamiento de firma masivamente paralela (MPSS, según sus siglas en inglés) , proteómica, inmunohistoquimica (IHC, según sus siglas en inglés), etc. Preferentemente, se cuantifica el ARNm. Dicho análisis de ARNm se efectúa, preferentemente, usando la técnica de la reacción en cadena de polimerasa (PCR), o el análisis de microserie. Cuando se emplea la PCR, una forma preferida de PCR es la PCR en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR) . En una realización, la expresión de uno o más de los genes observados con anterioridad se considera expresión positiva si se encuentra en la mediana o es superior a la mediana, por ejemplo, en comparación con otras muestras del mismo tipo de tumor. La mediana del nivel de expresión puede determinarse esencialmente en forma simultánea con la medición de la expresión génica, o puede haber sido determinada con anterioridad.

Las etapas de un protocolo representativo para el perfil de la expresión génica usando tejidos fijados, incorporados en parafina, como la fuente de ARN, que incluye la aislación de ARNm, la purificación, la extensión de cebador y la amplificación, se proporcionan en diversos artículos de jornales publicados (por ejemplo: Godfrey et al.: J. Molec. Diagnostics, 2: 84-91 (2000); Specht et al.: Am. J. Pathol., 158: 419-29 (2001)) . En .síntesis, un proceso representativo se inicia con el corte de secciones de aproximadamente 10 microgramos de espesor de muestras de tejido tumoral incorporadas en parafina. A continuación, se extrae el ARN, y se remueven la proteína y el ADN. Después del análisis de la concentración de ARN, pueden incluirse las etapas de reparación de ARN o amplificación, si son necesarias, y el ARN es transcripto en forma inversa usando promotores específicos de genes, y luego sigue la PCR. Finalmente,, la información se analiza a fin de identificar las mejores opciones de tratamiento disponibles para el paciente, sobre la base del patrón de expresión génica característico identificado en la muestra de tumor examinada.

La detección de la expresión génica o proteica puede determinarse directa o indirectamente.

Puede determinarse la expresión o amplificación de hepsina en el cáncer (directa o indirectamente) . Pueden obtenerse diversos ensayos de diagnóstico/pronóstico para esta determinación. En una realización, la sobreexpresión de hepsina puede analizarse por IHC. Las secciones de tejido incorporadas en parafina de una biopsia de tumor pueden someterse al ensayo de IHC, y se les puede asignar criterios de intensidad de tinción de proteína hepsina, de la siguiente manera : Puntaje 0: no se observa tinción, o se observa tinción membrana en menos del 10% de las células tumorales.

Puntaje 1+: se detecta una leve/apenas perceptibl tinción de membrana en más del 10% de las células tumorales Las células solo están teñidas en parte de su membrana.

Puntaje 2+: se observa una débil a moderada tinción d membrana completa en más del 10% de las células tumorales.

Puntaje 3+: se observa una moderada a fuerte tinción membrana completa en más del 10% de las células tumorales.

En algunas realizaciones, aquellos tumores con puntajes de 0 ó 1+ para la evaluación de sobreexpresion de hepsina pueden caracterizarse como sin sobreexpresion de hepsina, mientras que aquellos tumores con puntajes de 2+ o 3+ pueden caracterizarse como con sobreexpresion de hepsina.

En forma alternativa o adicional, pueden realizarse ensayos FISH en tejido tumoral fijado en formalina, incorporado en parafina, a fin de determinar la presencia y/o el alcance (si lo hay) de amplificación o translocación de hepsina en el tumor.

La activación de hepsina puede determinarse directamente (por ejemplo, por medio del ensayo de fosfo-ELISA u otro medio para la detección de receptor fosforilado) , o indirectamente (por ejemplo, mediante la detección de componentes de la vía de señalización aguas abajo activados, la detección de dimeros receptores (por ejemplo, homodimeros, heterodimeros ) , la detección de los perfiles de expresión génica y similares.

Los métodos para la detección de mutaciones de ácido nucleico son bien conocidos en el arte. A menudo, si bien no necesariamente, un ácido nucleico blanco en una muestra se amplifca de manera de proporcionar la cantidad deseada de material para la determinación de la presencia de una mutación. Las técnicas de amplificación son bien conocidas en el arte. Por ejemplo, el producto amplificado puede abarcar o no la totalidad de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteina de interés, siempre que el producto amplificado comprenda la posición de secuencia de ácido nucleico/aminoácido particular donde se sospecha que está la mutación .

Una muestra que comprende un ácido nucleico blanco puede obtenerse por métodos conocidos en el arte, y apropiados para el tipo particular y la ubicación del tumor. La biopsia de tejido a menudo se usa para obtener un trozo representativo de tejido tumoral. Alternativamente, . las células tumorales pueden obtenerse de modo indirecto en forma de tejidos/líquidos que se sabe o se cree contienen las células tumorales de interés. Por ejemplo, las muestras de lesiones de cáncer de pulmón pueden obtenerse mediante la resección, broncoscopia, aspiración por aguja fina, cepillado bronquial, o a partir de esputo, líquido pleural o sangre. Los genes mutantes o productos génicos pueden detectarse del tumor o de otras muestras del organismo tales como orina, esputo o suero. Las mismas técnicas que se describen con anterioridad para la detección de productos génicos o genes blanco mutantes en muestras de tumor pueden aplicarse a otras muestras corporales. Las células cancerosas se desprenden de los tumores y aparecen en dichas muestras corporales. Mediante el sometimiento a la detección sistemática de dichas muestras corporales, puede lograrse un diagnóstico temprano simple para enfermedades tales como el cáncer. Además, el avance de la terapia puede controlarse más fácilmente, ensayando dichas muestras corporales a fin de determinar productos génicos o genes blanco mutantes.

Los medios para el enriquecimiento de una preparación de tejido para células tumorales son conocidos en el arte. Por ejemplo, puede aislarse el tejido de secciones de crióstato o parafina. Las células cancerosas también pueden separarse de las células normales por citometría de flujo o microdisección de captura de láser. Estas, al igual que otras técnicas para la separación de células tumorales de células normales, son conocidas en el arte. Si el tejido tumoral está altamente contaminado con células normales, la detección de mutaciones puede ser más difícil, si bien se conocen las técnicas para minimizar la contaminación o los resultados falsos positivos o falsos negativos, algunas de las cuales se describen a continuación. Por ejemplo, una muestra también puede evaluarse para establecer la presencia de un biomarcador (que incluye una mutación) conocido por su asociación con una célula tumoral de interés, aunque no con una célula normal correspondiente, o viceversa.

En algunos casos, el cáncer sobreexpresa o no sobreexpresa hepsina. La sobreexpresión de hepsina puede determinarse en un ensayo de diagnóstico o pronóstico, evaluando los mayores niveles de hepsina presente en una célula (por ejemplo, por medio de un ensayo de inmunohistoquímica; IHC) . De manera alternativa o adicional, pueden medirse los niveles de ácido nucleico codificador de hepsina en la célula, por ejemplo, por medio de la hibridación in situ fluorescente (FISH, según su sigla en inglés; ver el documento WO 98/45479 publicado en octubre de 1998), southern blotting, o técnicas de reacción en cadena de polimerasa (PCR), tales como PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR) . Además de los ensayos anteriores, el experto en el arte podrá obtener diversos ensayos in vivo. Por ejemplo, pueden exponerse las células en el organismo del paciente, a un anticuerpo opcionalmente marcado con una marca detectable, por ejemplo, un isótopo radiactivo, y puede evaluarse la unión del anticuerpo a las células en el paciente, por ejemplo, mediante el análisis externa para la detección de radioactividad, o el análisis de una biopsia tomada del paciente previamente expuesto al anticuerpo.

Agentes quimioterapéuticos .

La terapia de combinación de la invención además puede comprender uno o más agentes quimioterapéuticos. La administración combinada incluye la administración conjunta o la administración concurrente, usando formulaciones separadas o una sola formulación farmacéutica, y la administración consecutiva, en cualquier orden, donde, preferentemente, se presenta un periodo de tiempo mientras ambos agentes activos (o todos) ejercen simultáneamente sus actividades biológicas.

En caso de administrarse, el agente quimioterapéutico habitualmente se administra en sus dosificaciones conocidas, u opcionalmente, en dosificaciones menores, debido a la acción combinada de los fármacos o a los efectos secundarios negativos atribuibles a la administración del agente quimioterapéutico antimetabolito . La preparación y los programas de dosificación para dichos agentes quimioterapéuticos pueden ser aquellos utilizados de acuerdo con las instrucciones del fabricante, o según lo determinado empíricamente por el médico experto.

Pueden combinarse diversos agentes quimioterapéuticos que se revelan en esta solicitud.

Formulaciones, dosificaciones y administraciones.

Los agentes terapéuticos utilizados en la invención serán formulados, dosificados y administrados de manera consecuente con las buenas prácticas médicas. Los factores de consideración en este contexto incluyen el trastorno particular tratado, el sujeto particular tratado, la condición general del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de suministro del agente, el método de administración, el programa de administración, las interacciones de fármaco-fármaco de los agentes por combinar, y otros factores conocidos por los médicos.

Las formulaciones terapéuticas se preparan usando métodos convencionales conocidos en el arte, mediante la mezcla del ingrediente activo que tiene el grado deseado de pureza, con portadores, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences (Ed. 20), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA) . Los portadores aceptables incluyen solución salina, o tampones tales como fosfato, citrato u otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de alrededor de 10 residuos) ; proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona ; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparaginas, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa o dextriñas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcares tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; y/o surfactantes no iónicos tales como TWEENá, PLURONICSá o PEG.

En forma opcional, si bien preferentemente, la formulación contiene una sal farmacéuticamente aceptable, preferentemente, cloruro de sodio, y preferentemente, en concentraciones aproximadamente fisiológicas. En forma opcional, las formulaciones de la invención pueden contener un conservante farmacéuticamente aceptable. . En algunas realizaciones, la concentración de conservante varia de 0,1 a 2,0%, en general, v/v. Los conservantes adecuados comprenden aquellos conocidos en las artes farmacéuticas. Entre los conservantes preferidos se encuentran alcohol bencílico, fenol, m-cresol, metilparabeno y propilparabeno .

Opcionalmente, las formulaciones de la invención pueden incluir un surfactante farmacéuticamente aceptable, en una concentración de 0,005 a 0,02%.

La formulación de la presente solicitud además puede contener más de un compuesto activo, según lo necesario para la indicación particular tratada, preferentemente, compuestos con actividades complementarias que no se afectan de manera adversa entre sí. Dichas moléculas se presentan, adecuadamente, en combinación en cantidades eficaces para el propósito propuesto.

Los ingredientes activos además pueden estar atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por medio de técnicas de coacervación, o mediante la polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina, y microcápsulas de poli- (metilmetacilato) , respectivamente, sistemas de suministro de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nanoparticulas y nanocápsulas ) , o en macroemulsiones . Dichas técnicas se describen en Remington' s Pharmaceutical Sciences, supra.

Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, donde dichas matrices se presentan como artículos con forma, por ejemplo, películas o microcápsulas. Ejemplos .de matrices para liberación sostenida abarcan poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) , o poli (vinil alcohol)), poliláctidos (Patente de los Estados Unidos Nro. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y g-etil-L-glutamato, acetato de etilenvinilo no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico tales como el LUPRON DEPOTTM (microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutirico. Si bien los polímeros tales como acetato de etilenvinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el organismo durante un tiempo largo, pueden desnaturalizarse o agregarse como consecuencia de la exposición a la humedad a 37 °C, para producir una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Pueden diseñarse estrategias racionales para la estabilización, de acuerdo con el mecanismo involucrado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través del intercambio de tio-disulfuro, la estabilización puede lograrse mediante la modificación de residuos sulfhidrilo, la liofilización a partir de soluciones ácidas, el control del contenido de humedad, el uso de aditivos apropiados y el desarrollo de composiciones de matrices poliméricas específicas .

Los agentes terapéuticos de la invención se administran a un paciente humano de acuerdo con métodos conocidos, tales como la administración intravenosa como un bolo o mediante la infusión continua durante un periodo de tiempo; por las vías intramuscular, intraperitoneal , intracerebroespinal , subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o por inhalación. Puede emplearse además una estrategia ex vivo para aplicaciones terapéuticas. Las estrategias ex vivo suponen la transfección o la transducción de células obtenidas del sujeto con un polinucleótido que codifica un antagonista de hepsina. Las células transfectadas o transducidas luego son retornadas al sujeto. Las células pueden ser cualesquiera de un amplio rango de tipos, que incluyen, sin limitación, células hematopoyéticas (por ejemplo, células de la médula ósea, macrófagos, monocitos, células dendriticas, células T o células B) , fibroblastos, células epiteliales, células endoteliales , queratinocitos o células musculares.

Por ejemplo, si el antagonista de hepsina es un anticuerpo, el anticuerpo se administra por cualquier medio adecuado, que incluye la vía parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal, y si se desea, para el tratamiento inmunosupresor local, la administración intralesional . Las infusiones parenterales comprenden la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial , intraperitoneal o subcutánea. Además, el anticuerpo se administra adecuadamente por medio de la infusión por pulsos, en particular, con dosis decrecientes del anticuerpo. Preferentemente, la dosificación se suministra por medio de inyecciones, más preferentemente, por inyección intravenosa o subcutánea, dependiendo, en parte, de la administración breve o crónica.

En otro ejemplo, el compuesto antagonista de hepsina se administra en forma local, por ejemplo, mediante inyecciones directas, cuando el trastorno o la ubicación del tumor lo permiten, y las inyecciones pueden repetirse periódicamente. El antagonista de hepsina también puede suministrarse por vía sistémica al sujeto, o directamente a las células tumorales, por ejemplo, a un tumor o a un lecho tumoral luego de la escisión quirúrgica del tumor, a fin de prevenir o reducir la recurrencia local o la metástasis.

La administración de los agentes terapéuticos en combinación habitualmente se realiza durante un periodo de tiempo definido (en general, minutos, horas días o semanas, de acuerdo con la combinación seleccionada) . La terapia de combinación tiene el propósito de abarcar la administración de estos agentes terapéuticos de manera sucesiva, es decir, donde cada agente terapéutico se administra en un momento diferente, al igual que la administración de estos agentes terapéuticos, o por lo menos dos de los agentes terapéuticos, de manera sustancialmente simultánea.

Los agentes terapéuticos pueden administrarse por la misma via o por vías diferentes. Por ejemplo, el anticuerpo antihepsina en la combinación puede adminis rarse por medio de la inyección intravenosa, mientras que un agente quimioterapéutico en la combinación puede administrarse por via oral. Alternativamente, por ejemplo, ambos agentes terapéuticos pueden administrarse por via oral, o ambos agentes terapéuticos pueden administrarse por inyección intravenosa, de acuerdo con los agentes terapéuticos específicos. La secuencia en la cual se administran los agentes terapéuticos también varía conforme a los agentes específicos.

Según el tipo y la gravedad de la enfermedad, una dosificación candidata inicial para la administración al paciente es alrededor de 1 mg/kg a 100 rag/kg de cada agente terapéutico, o bien en una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Una dosificación diaria típica podría variar de alrededor de 1 mg/kg a alrededor de 100 mg/kg o más, de acuerdo con los factores mencionados con anterioridad. Para las administraciones repetidas durante varios días o períodos más largos, según la condición, el tratamiento se sostiene hasta que se trata el cáncer, según lo medido con los métodos descriptos anteriormente. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación.

La presente solicitud contempla la administración del anticuerpo de hepsina por medio de la terapia génica. Ver, por ejemplo, el documento WO 96/07321, publicado el 14 de marzo de 1996, relacionado con el uso de la terapia génica para la generación de anticuerpos intracelulares .

Artículos de fabricación.

En otro aspecto de la invención, se provee un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, la prevención y el diagnóstico de los trastornos descriptos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y un rótulo o un prospecto sobre el recipiente o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados abarcan, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, etc. Los recipientes pueden formarse a partir de una diversidad de materiales, como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que, en si misma, o combinada con otra composición, es eficaz para el tratamiento, la prevención o el diagnóstico de la condición, y puede tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón punzable por una aguja de inyección hipodérmica) . Por lo menos un ingrediente, activo en la composición es un anticuerpo de la invención. El rótulo o prospecto indica que la composición se usa para el tratamiento de la condición de elección, tal como el cáncer. Además, el articulo de fabricación puede comprender: (a) un primer recipiente con una composición allí contenida, donde la composición comprende un anticuerpo de la invención; y (b) un segundo recipiente con una composición allí contenida, donde la composición comprende un agente citotóxico adicional. El articulo de fabricación, en esta realización de la invención, puede comprender además un prospecto que indica que las primera y segunda composiciones de anticuerpo pueden usarse a fin de tratar una condición particular, por ejemplo, el cáncer. Alternativa o adicionalmente, el artículo de fabricación además puede comprender un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón aceptable para uso farmacéutico, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI, según su sigla en inglés), solución salina regulada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Asimismo, puede incluir otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, por ejemplo, otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

Los que siguen son ejemplos de los métodos y de las composiciones de la invención. Se entiende que pueden ponerse en práctica diversas realizaciones diferentes, dada la descripción general proporcionada anteriormente.

EJEMPLOS Materiales y métodos.

Reactivos y proteínas: Los sustratos sintéticos de paranitroanilida S2765 (= sustrato DiaPharma FXa) , S2266, S2288, S2366 y S2444 fueron de DiaPharma ( estchester , OH); Chromozym TH, de Roche Diagnostics ( Indianapolis, IN-) ; Spectrozyme flXa® (#299) y Spectrozyme® FVIIa, de American Diagnostica (Green ich, CT) . 3, -dicloro-isocumarina, BSA y Tween-20 fueron de Sigma-Aldrich.

Plasmina y factor Xla fueron de Haematologic Technologies Inc. (Essex Junction, VT) ; kalikreina plasmática, de Calbiochem (La Jolla, CA) ; Factor VII y Factor Xlla, de Enzyme Research (South Bend, IN) ; activador de plasminógeno de tipo uroquinasa (uPA) , de American Diagnostica; pro-uPA, de Fitzgerald Industries Int. (Concord, MA) . La laminina de rata fue de illipore (Temecula, CA) . La hepsina (humana) , matriptasa, marapsina, el activador de factor de crecimiento de hepatocitos (HGFA) , factor de crecimiento prohepatocito (pro-HGF) , el inhibidor-1 de dominio de Kunitz (KD1) derivado del inhibidor-1 de HGFA (HAI-1) y HAI-2 fueron expresados de manera recombinante y purificados como se describe previamente (Kirchhofer et al., 2003; Kirchhofer et al., 2005; Li et al., 2009; Moran et al., 2006; Peek et al., 2002; Shia et al., 2005). Como anticuerpos de control se usaron IgG o Fab anti-HGFA (Fab40, Fab58, Fab75, IgG75) generados por medio de la exhibición de fagos de anticuerpo (Ganesan et al., 2009; Wu et al., 2007). ' El fago auxiliar M13-K07 fue de New England Biolabs. Las inmunoplacas Maxisorp fueron de Nalgen NUNC International (Naperville, IL) . La estreptavidina Dynabeads® MyOne fue de Invitrogen (Carlsbad, CA) . El sustrato 3,3', 5, 5' -tetrametil-bencidina/H202 (TMB) peroxidasa fue de Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc. NeutrAvidin y Streptavidin fueron de Pierce Biotechnology, Inc.

Clonación, expresión y purificación de prostasina: El dominio extracelular de la prostasina humana (Ala33-Leu321 ) que albergaba un marcador Flag C-terminal se expresó usando el sistema de expresión de baculovirus con células T. ni. Después de 72 horas de incubación, se cosechó el sobrenadante, y el medio aclarado se cargó en una columna de anticuerpo anti-Flag M2-agarosa (Sigma) . La proteina ligada se eluyó con glicina, 100 m , pH 3,0, y se neutralizó de inmediato con Tris, 1 M, pH 8,0. La forma cimógena obtenida de prostasina se activó con matriptasa recombinante a temperatura ambiente durante 16 horas. A continuación, la prostasina de dos cadenas activada se purificó mediante la remoción de la matriptasa con marca (His)8 sobre una columna de Ni-NTA. La prostasina fue adicionalmente purificada por medio de la cromatografía de exclusión por tamaño usando una columna S-200.

Clonación, expresión y purificación de hepsina de ratón: El dominio extracelular de la hepsina de ratón ( Ser45-Pro 16 ) que portaba una marca His C-terminal se expresó usando el sistema de expresión de baculovirus con células T. ni, en condiciones similares a las de la hepsina humana (Moran et al., 2006). Después de 72 horas de incubación, se cosechó el sobrenadante, y el medio aclarado se cargó en una columna de Ni-NTA (Qiagen) , preequilibrada con un tampón que contenia Tris, 50 mM-HCl, pH 8,0, NaCl, 300 mM. La proteína ligada se eluyó con un tampón que contenía Tris, 50 mM-HCl, pH 8,0, NaCl, 300 mM, e imidazol, 250 mM.

Clonación, expresión y purificación de MSP recombinante y KD1 : Se expresó MSP recombinante en células de ovario de hámster chino según lo descripto (Wahl et al., 1997). KDl se expresó y se purificó según lo descripto (Shia et al., 2005) .

Construcción de biblioteca para la exhibición de fagos de Fab: La biblioteca, designada biblioteca YSGX, se construyó según lo descripto previamente usando un fagémido para la exhibición de fagos Fab (pF1359) (Lib D en (Fellouse et al., 2007)) . La diversidad de la biblioteca es de alrededor de 2 x 1010.

Selección y caracterización de Fabs antihepsina . exhibidos por fagos: Para los experimentos de exhibición de fagos, utilizamos hepsina biotinilada (= biotina-hepsina) y hepsina biotinilada en complejo con 3, 4-dicloro-isocumarina (DCI) (= biotina-hepsina : DCI ) . La hepsina fue biotinilada usando el kit Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce, Catálogo NRO. 21327) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Parte de la hepsina biotinilada se usó para formar un complejo de biotina-hepsina : DCI mediante la incubación con DCI, 100 µ?, y el mantenimiento de esta concentración de DCI durante los posteriores experimentos de lavado. Los experimentos previos con DCI mostraron que una exposición de 40 minutos de hepsina a DCI, 25-50 µ?, inhibió por completo la actividad de hepsina en ensayos enzimáticos con sustrato S2765. Para la primera ronda de lavado, se incubaron 10 mg de biotina-hepsina o biotina-hepsina : DCI con 1 mi de biblioteca YSGX en la concentración de 1 x 1013pfu/ml a 4°C durante 1,5 h, en ausencia o presencia de 100 mM de DCI, respectivamente. El fago ligado al blanco se capturó durante 15 minutos con 100 mi de estreptavidina Dynabeads® yOne . El fago ligado se eluyó con HC1, 0,1 M, se neutralizó de inmediato, y luego se amplificó siguiendo el protocolo convencional (Sidhu et al., 2000) . Desde la segunda ronda en adelante, se incubaron 2 mg de biotina-hepsina o biotina-hepsina : DCI con 400 mi de fago amplificado a 4°C durante 1,5 horas, sin o con 100 mM de DCI, respectivamente. El fago ligado a biotina-hepsina o biotina-hepsina: DCI se capturó durante 15 minutos con inmunoplacas Maxisorp (NUNC) revestidas con NeutrAvidin o estreptavidina (alternadamente entre las rondas) y se bloqueó con regulador de bloqueo (PBS, 0,5% (p/v) BSA) . Después de cinco rondas de selección, se produjeron fagos a partir de clones individuales cultivados en un formato de 96 pocilios, y los sobrenadantes de cultivo se diluyeron tres veces en PBS, 0,5% (p/v) de BSA, 0,1% (v/v) de Tween 20 (tampón PBT) . Los sobrenadantes de fagos diluidos se incubaron durante 1 hora con biotina-hepsina o biotina-hepsina : DCI inmovilizada sobre inmunoplacas Maxisorp de 384 pocilios revestidos con Neutravidin (NUNC) . Las placas se lavaron seis veces con PBS, 0, 05% (v/v) de Tween 20 (regulador PT) y se incubaron 30 minutos con conjugado de peroxidasa de rábano rusticano/anticuerpo anti-M13 (dilución 1:5000 en regulador PBT) (Pharmacia) . Las placas se lavaron seis veces con tampón PT, y dos veces con PBS, se desarrollaron durante 15 min con sustrato de 3, 3' , 5, 5' -tetrametil-bencidina/H202 peroxidasa (Kirkegaard & Perry Laboratories), se templaron con H3P04, 1,0 M, y se midió la absorción en forma espectrofotométrica a 450 nm.

Se usó un ensayo ELISA de competición de fagos de un solo punto a fin de identificar los Fabs exhibidos en fagos que se unen al mismo epitopo de hepsina donde se une KD1. Los clones individuales cultivados en formato de 96 pocilios y los sobrenadantes de cultivo se diluyeron cinco veces en regulador PBT con o sin KD1, 200 nM, y se incubaron con biotina-hepsina inmovilizada sobre inmunoplacas Maxisorp de 384 pocilios revestidas con NeutrAvidin (NUNC) , durante 1 hora. Se lavó la placa, y se detectó el fago ligado por anti-M13-HRP como se describe anteriormente. Para cada clon, se calculó la relación de A450 en ausencia o presencia de 200 nM de KD1. Cualquier clon con una relación superior a 2 se consideró en dirección a epitopo similar a KD1. Dichos clones se sometieron a un ensayo ELISA de competición de fagos detallado con KD1, donde se usó una concentración de serie de KDl (inicio a partir de 10 mM, dilución serial, 1:3) a fin de competir con Fab exhibido por fago ligado a hepsina.

Expresión y purificación de IgG25 y Fab25 antihepsina: Generalmente, a lo largo de esta solicitud, la forma IgG de anticuerpo 25 es designada con el prefijo Ab, y la forma Fab del anticuerpo 25 es designada con el prefijo Fab. Se introdujo un codón de detención entre la cadena pesada y el gen 3 en el fagémido codificador del Fab25. El fagémido resultante se transformó en E. Coli. cepa 34B8. La colonia individual se cultivó durante la noche a 37 °C en 30 mi de medio LB suplementado con 50 mg/ml de carbenicilina . Se inocularon 5 mi del cultivo en 500 mi de medio completo C.R.A.P. (para preparar 1 litro: 3,57 g (NH4)2S04, 0,71 g de NaCitrato-2H20, 1,07 g de KC1, 5,36 g de extracto de levadura, 5,36 g de Hycase SF. Se agrega agua desionizada hasta 872 mi. Se ajusta el pH con KOH a 7,3. Autoclave. Enfriamiento hasta 55°C y adición de 110 mi de MOPS, 1 , pH 7,3, 11 mi de glucosa al 50% y 7 mi de MgS04, 1 M) suplementado con carbenicilina (50 mg/ml) y cultivado a 30°C durante 24 horas. La proteina Fab25 se purificó usando resina de proteina A agarosa.

El dominio variable de la cadena ligera y la cadena pesada de los Fabs seleccionados se clonó en un plásmido a base de pRK5 con el dominio constante de la cadena ligera humana o la cadena pesada (IgGl humano) para la expresión transiente en células de ovario de hámster chino (CHO) . La proteina IgG25 se purificó mediante el uso de la cromatografía de proteína A agarosa.

Ensayos enzimáticos con sustratos sintéticos: Se incubaron Fab25, IgG25, Fab de control, o IgG de control con hepsina (1 nM para humana, y 2 n , para hepsina de ratón) en tampón Hepes (Hepes, 20 mM, pH 7,5, NaCl, 150 m ; CaC12, 5 mM; 0,01% de Tritón X-100) durante 40 min a temperatura ambiente. Para los experimentos con 3, -dicloro-isocumarina (DCI), se incubó hepsina (1 nM) con DCI en tampón Hepes que contenía 0,5% de DMSO, durante 40 min. Se agregó S2765 (concentración final de 0,2 mM) , y se midieron los índices lineales del incremento en la absorbancia a 405 nm en un lector de microplaca cinético (Versamax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) . La información se expresó como la actividad enzimática fraccional (vi/vo) y se adaptó a un programa de adaptación de curva de regresión de cuatro parámetros (Kaleidagraph Versión 3.6, Synergy Software) a fin de determinar los valores IC50. Los valores son el promedio ± SD de tres experimentos independientes. Los valores Kiapp para Fab25 e IgG25 se calcularon mediante la adaptación de la información a la ecuación para los sistemas de inhibición de unión estrecha (Morrison, 1969; Olivero et al., 2005) .

A fin de estudiar la especificidad de Fab25, se incubó un grupo de 9 serina proteasas de tipo tripsina con 1 µ? de Fab25 durante 40 min, en tampón Hepes. Se agregaron los sustratos cromógenos apropiados, y se midieron los índices lineales del incremento en la absorbancia a 405 nm, en un lector de microplaca cinético. Las concentraciones de cada enzima y el sustrato cromógeno utilizadas fueron las siguientes: hepsina, 1 nM; S2765, 0,5 mM; matriptasa, 0,5 nM; S2765, 0,5 mM; prostasina, 5 nM; S2765, 0,5 mM; plasmina, 2 nM; S2366, 0,5 mM; kalikreína plasmática, 2 nM; S2366, 0,5 mM; Factor Xla, 0,5 nM; S2366, 0, 5 mM; FXIIa, 5 nM; S2288, 0,5 mM; uPA, 5 nM; S2444, 0,5 mM; marapsina, 50 nM; Spectrozyme® FVIIa, 0,2 mM; HGFA, 10 nM; Spectrozyme® FVIIa, 0,2 mM. La información se expresó como actividad enzimática fraccional (vi/vo) , y fue el promedio ± SD de 3 experimentos independientes.

Se usó un grupo de sustratos pNa comerciales, todos, con un residuo Pl Arg, de modo de estudiar la inhibición de hepsina por Fab25. Los 8 sustratos fueron S2765, S2266, S2288, S2366, S2444, Chromozym TH, Spectrozyme flXa y Spectrozyme FVIIa. El ensayo se llevó a cabo como se describe con anterioridad, excepto que la concentración de Fab25 y Fab de control se fijó en 100 nM. La concentración de sustratos fue de 0,5 mM. La información se expresó como porcentaje de inhibición de actividad no inhibida (sin Fab) y es el promedio ± SD de cuatro experimentos independientes.

Ensayos enzimáticos con sustratos macromoleculares : Con el objetivo de medir la activación de pro-uPA mediada por hepsina, se diluyó sucesivamente Fab25 con tampón HBSA (Hepes, 20 mM, pH 7,5; NaCl, 150 nM; CaC12, 5 mM; 0,5 mg/ml de BSA) y se incubó con hepsina durante 35 min a temperatura ambiente. La reacción enzimática se inició mediante la adición de pro-uPA. Las concentraciones de hepsina y pro-uPA en la mezcla de reacción fueron 0,5 nM y 100 nM, respectivamente. Con intervalos de 45 segundos, se transfirieron alícuotas de 50 µ? a una placa de 96 pocilios que contenía 150 µ?/pocillos de reactivo .de detención HAI-2 (667 nM) . Luego de la adición de S2444 (0, 5 mM) , se midieron los índices lineales del incremento en la absorbancia a 405 nm, en un lector de microplaca cinético. La información se expresó como la actividad enzimática fraccional (vi/vo) y se adaptó a un programa de adaptación de curva de regresión de cuatro parámetros (Kaleidagraph) a fin de determinar los valores IC50.

Para los ensayos de activación de Factor VII, se incubó hepsina con Fab25 o Fab de control durante 5 min en tampón Hepes antes de la adición de factor VII. Las concentraciones en la mezcla de reacción fueron: hepsina, 50 n ; Fab, 500 nM; y factor VII, 8 µ??. Después de 0,5 h y 2 h de incubación a 37oC, se tomaron alícuotas y se analizaron por SDS-PAGE (gel gradiente 4-20%, InVitrogen) en condiciones reductoras. Los geles se tiñeron con SimplyBlueT (InVitrogen) .

Procesamiento proteolitico in vitro de Fab25 por hepsina: Se incubó Fab25 (3 mM) con hepsina, 10 nM, durante 24 h a temperatura ambiente, o bien en un tampón de bajo pH (Mes, 100 mM, pH 6,0; NaCl, 150 mM) o en un tampón de alto pH (Tris, 50 mM-HCl, pH 8,0; NaCl, 150 mM) . La reacción se detuvo mediante la adición de 20 ul de tampón de muestra 2X (con/sin b-mercaptoetanol) y se hizo bullir a 95°C durante 5 minutos. La proteólisis se controló por el cambio de movilidad de gel en un gel de gradiente de poliacrilamida 4-20% (p/v) teñido con azul brillante de Coomassie.

Ensayo de migración celular: Los ensayos de migración celular se efectuaron como se describe previamente (Tripathi et al., 2008), usando un soporte permeable de 24 pocilios, de tamaño de poro de 8,0 µp? FluoroBlok™ (BD Biosciences, Bedford, MA) . El reverso de los filtros se revistió con laminina de rata no tratada o tratada (1 g/ml) . La laminina se incubó en forma conjunta con hepsina o complejo de hepsina-Fab25 o solución salina regulada con fosfato (PBS) durante la noche a 4°C. Las inserciones luego se bloquearon con tampón de superbloqueo durante 1 hora. Se tripsinaron células cancerosas de próstata humanas DU145, se resuspendieron en medio libre de suero, se lavaron dos veces con medio libre de suero, y se sembraron las células (20.000) en la cámara superior de las inserciones. Después de 5 horas de incubación en 5% de C02 y a 37 °C, las células que quedaban en el filtro superior se rasparon suavemente usando un lienzo de algodón, y las inserciones se lavaron suavemente con PBS. Aquellas células que migraron a la cámara inferior se fijaron con 500 µ? de metanol durante 30 minutos, se secaron al aire durante 20 min, y se tiñeron con 500 µ? de YO-PRO-I, 10 mM (Invitrogen, Carlsbad, CA) durante 10 minutos. La placa se lavó con PBS, y se midió la fluorescencia en un lector de placa (Spectramax M5, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) usando una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 555 nm. A continuación, se tomaron imágenes de las placas con un microscopio invertido (1X81, Olympus) conectado a una cámara CCD con un objetivo de 10 x.

Unión de Fab25 a hepsina: Un sistema Octet-RED equipado con puntas biosensoras de estreptavidina SBC se obtuvo de ForteBio (Menlo Park, CA) . Antes del inicio del experimento, las puntas sensoras fueron prehumedecidas durante 15 minutos a 25 °C en un tampón que contenía . Hepes, 50 mM, pH 7,5; NaCl, 150 . mM; y 0,05% de Tween-20. Se capturó la hepsina biotinilada (7,5 mg/ml) en el sensor de estreptavidina durante 5 minutos con agitación á 1000 r. p. m. .Los sensores se lavaron brevemente con tampón, antes del sumergido en los pocilios de muestra que contenían Fab25 (dilución sucesiva doble iniciando a partir de 200 nM) y tampón de control. La asociación se controló durante 10 minutos, y se siguió la disociación durante 30 minutos. Se adaptó la información a un modelo de unión 1:1 usando el software de análisis Octet-RED.

Activación de Pro-MSP por hepsina expresada en la superficie celular en células LnCap: Las células LnCaP-34 se generaron conforme a lo descripto (Moran et al., 2006), a fin de sobreexpresar de manera estable la hepsina de modo de lograr un aumento de 5 veces en la expresión de hepsina en la superficie celular y un aumento de 3 veces en la actividad enzimática de hepsina, en comparación con las células LnCaP-17, que solo expresan hepsina endógena en concentraciones relativamente bajas, comparables con las células progenitoras LnCaP. Se lavaron las células confluentes LnCaP-17 y LnCap-34 cultivadas en placas de 24 pocilios, con medio RPMI-1640 libre de suero, y se incubaron solas o con diferentes inhibidores antihepsina (1 mM de anticuerpo antihepsina Fab25/1 mM de KDl/1 mM de Ac-KQLR-cmk) en medio RPMI-1640 libre de suero, durante 15 minutos a 37oC, antes de la adición de pro-MSP marcado con 1251 (25 mg/ml) . Después de la incubación durante 3 h a 37oC, se removieron alícuotas, y analizaron por SDS-PAGE (4-20% gel gradiente) (Invitrogen, Carlsbad, CA) , seguido de la exposición a películas de rayos X.

Resultados/Análisis .

A fin de identificar anticuerpos antihepsina que bloquean la actividad enzimática de hepsina, empleamos la clasificación de solución contra hepsina biotinilada sin inhibidor (biotina-hepsina) y contra hepsina biotinilada en complejo con DCI (biotina-hepsina : DCI ) . DCI es un inhibidor de serina proteasa sobre la base del mecanismo, que ocupa la cavidad SI formando aductos covalentes de monoacilo o diacilo con el Serl95 y His57 catalíticos (numeración de quimiotripsinógeno) (Fig. 9A) (Powers et al., 1989). Un modelo molecular de complejo de hepsina: DCI sobre la base de la estructura cristalina del complejo factor-D:DCI (código 1DIC PDB) (Colé et al., 1998) indicó que el anillo aromático del inhibidor DCI ocuparía la cavidad SI. Nuestros hallazgos previos ( u et al., 2007) indicaron que los anticuerpos anti-HGFA de bloqueo de función derivados de nuestras bibliotecas de exhibición de fagos Fab no ocupan la cavidad SI. Por lo tanto, DCK ligado a hepsina puede no interferir con la unión de anticuerpo, si bien podría ejercer influencias beneficiosas sobre la conformación de sitios activos, para favorecer las interacciones con anticuerpo. El sitio activo de serina proteasas de tipo tripsina se forma por varios bucles intrínsecamente móviles (el "dominio de activación") (Huber and Bode, 1978) . En particular, el bucle 220 forma parte de la cavidad SI y puede adoptar diversos estados de conformación en algunas serina proteasas (Johnson et al., 2005; Shia et al., 2005; Spraggon et al., 2009; Wilken et al., 2004). Solo las apoestructuras revelaron dichas conformaciones de bucles inusuales, mientras que las estructuras cocristalinas con un inhibidor de sitio activo mostraron sitios activos apropiadamente formados, más probablemente, debido a las fuerzas estabilizadoras aplicadas por el inhibidor (Arni et al., 1994; Shia et al., 2005; Spraggon et al., 2009) . La apoestructura de hepsina es desconocida, y todas las estructuras de hepsina publicadas son estructuras cocristalinas con un inhibidor de sitio activo (Herter et al., 2005; Somoza et al., 2003) . Por lo tanto, concluimos que la ocupación de la cavidad SI por DCI puede aplicar fuerzas estabilizadoras sobre la potencial flexibilidad del bucle, para favorecer el reconocimiento de anticuerpo. Los ensayos enzimáticos mostraron que las concentraciones de DCI superiores a 20 µ? lograron la completa inhibición de hepsina luego de un periodo, de incubación de 40 min (Fig. 9) . Por lo tanto, los experimentos de clasificación de fagos contra complejo de hepsina biotinilada : DCI se llevaron a cabo en presencia de 100 µ? de DCI .

Se usó una biblioteca de anticuerpos sintéticos minimalista con diversidad química restringida en regiones de determinación de complementariedad (CDR) , designada la biblioteca YSGX (Fellhouse et al, 2007), a fin de buscar un anticuerpo inhibidor contra hepsina mediante la clasificación de solución, donde se incubó biotina-hepsina o complejo de biotina-hepsina : DCI con la biblioteca Fab de exhibición de fagos. El lavado contra biotina-hepsina : DCI produjo un clon de unión de hepsina, designado HpsFab25 (también denominado "Fab25") , que se tornó dominante luego de 5 rondas de selección. Las secuencias HVR de Fab25 se muestran en la Figura 1. La CDR-H3 de HpsFab25 es muy larga (21 residuos), y HpsFab25 contenía tres residuos Lys.

Se efectuaron experimentos Elisa a fin de evaluar si la unión de Fab25 era inhibida por KD1, un inhibidor de hepsina que se une al sitio activo de hepsina. Como se muestra en la Figura 10, KD1 inhibió la unión de Fab25-fago a hepsina de manera dependiente de la concentración, lo que sugiere que Fab25 fue ligado a la región de sitio activo de hepsina, o cerca de ella, y en consecuencia, puede interferir con la actividad enzimática.

La capacidad de Fab25 para inhibir la actividad humana y de ratón se ensayó usando sustrato de hepsina sintético, S2765. Como se muestra en la Figura 11, Fab 25 inhibió la actividad de hepsina humana y de ratón de manera dependiente de la concentración, para alcanzar una inhibición completa en las concentraciones más altas ensayadas. El valor calculado de Kiapp fue 4,1 ± 1,0 n (n = 3) para hepsina humana, y 329 ± 51 nM (n = 3) para hepsina murina. Los experimentos adicionales con IgG25 mostraron la inhibición de hepsina humana con un valor Kiapp de 11,3 ± 1,7 nM (n = 3), mientras que un control de IgG no tuvo efecto (información no expuesta) . Los resultados mostraron que Fab25 inhibió hepsina humana en forma aproximadamente 80 veces más potente que hepsina murina. Esto sugirió que el sitio de unión de anticuerpo no es completamente conservado en hepsina de ratón. Debido a que el dominio de proteasa de hepsina de ratón no tiene inserciones ni deleciones en comparación con hepsina humana, la menor potencia de Fab25 probablemente se debió a los cambios en los aminoácidos importantes para la interacción con Fab25.

La afinidad de unión de Fab25 a hepsina humana determinó usando el análisis Octet RED. El valor Kd fue 2, +/- 0,45 nM.

La especificidad de Fab 25 se evaluó mediante la interrogación acerca de si inhibió la actividad enzimática de un grupo de serina proteasas de tipo tripsina. El grupo de serina proteasas de tipo tripsina incluyó algunos de los homólogos de dominio de proteasa más cercanos de hepsina, tales como kalikreina plasmática, prostasina, marapsina y plasmina. Los resultados (Figura 12) demostraron que Fab25 tenía una especificidad exclusiva hacia hepsina, ya que no afectó la actividad enzimática de las serina proteasas examinadas en una concentración que fue 250 veces mayor que el valor Kiapp determinado para hepsina.

Se determinó el efecto de Fab25 sobre el procesamiento mediado por hepsina de pro-uPA y Factor VIII. Como se muestra en la Figura 13A, Fab25 inhibió la actividad de hepsina hacia pro-uPA con un valor IC50 de 3,3 ± 0,4 nM (n = 3), que fue comparable con su potencia en el ensayo de pNA (Tabla 1) . En concentraciones de Fab superiores a 100 nM, la inhibición fue completa y comparable con la fuerte inhibición en el ensayo de activación de factor VII (Figura 13B) . El Factor VII es un sustrato relativamente pobre para hepsina, que requiere altas concentraciones de hepsina en el ensayo (50 nM) . Por lo tanto, aun cuando Fab25 se usó en una concentración de 500 nM, logró una relativamente baja relación de Fab25 : hepsina (10:1), en comparación con los experimentos de activación de pro-uPA (relaciones de hasta 600:1), lo que puede explicar que la inhibición durante el experimento de 2 h extendido no fue completa.

La hepsina preferencialmente disocia sustratos luego de un Pl Arg (Herter et al., 2005); sin embargo, también reconoce sustratos con Pl Lys (Moran et al., 2006) . Por lo tanto, consideramos la posibilidad de que hepsina pueda disociar el bucle Fab CDR-H3, que contenia tres residuos Lys y era inusualmente larga. La precedencia proviene de estudios recientes sobre el anticuerpo antimatriptasa E3, que sufrió la disociación por matriptasa luego de un residuo Pl-Arg en un bucle larga CDR-H3 (Farady et al., 2008) . Por lo tanto, Fab25 se expuso a hepsina durante periodos de tiempo prolongados en diferentes condiciones de pH. Fab25 migró como una banda de 50 kDa en condiciones no reductoras, y como una banda de 25 kDa, en condiciones reductoras, y no pudieron identificarse productos de degradación de bajo peso molecular (Figura 14) . Por lo tanto, Fab25 fue resistente a la proteólisis de hepsina cuando se expuso a hepsina durante periodos de tiempo prolongados. Esta conclusión es consistente con nuestra hipótesis de que el complejo de biotina-hepsina : DCI favoreció la selección de Fab exhibido por fagos que se unen fuera de la cavidad SI.

Recientemente, se ha establecido que la laminina es un sustrato para hepsina (Tripathi et al) . El estudio además sugirió que la disociación de laminina por hepsina puede aumentar fisiológicamente la migración de la estirpe celular de cáncer de próstata DU145. Estudiamos si Fab25 inhibía la migración dependiente de laminina de las células DU145. Los resultados de este experimento (Figura 15) demostraron que Fab25 neutralizó en forma eficaz la actividad proteolítica de hepsina, y en consecuencia, bloqueó el procesamiento de su sustrato laminina.

Además, evaluamos la capacidad de Fab25 para inhibir la actividad de hepsina hacia un grupo de sustratos sintéticos. Los resultados expuestos en la Tabla 1 demostraron que Fab25 inhibió la disociación mediada por hepsina, de todos los sustratos de pNA el >90%. Debido a que los sustratos de pNA ocupan todos los subsitios S1-S3 en hepsina, puede concluirse que el anticuerpo interfirió con fuerza con las interacciones de sustrato en estos subsitios. El hallazgo de que a pesar de la diversidad química de las posiciones P2 y P3 de los sustratos de pNA, la inhibición fue del >90% para todos los sustratos, argumenta un fuerte efecto de anticuerpo en los sitios S2 y/o S3 en lugar de influencias sutiles en estos sitios. Si estos efectos son o no de naturaleza alostérica o son de impedimento estérico directo queda aún por ser dilucidado. Además, debido a que Fab25 fue seleccionado contra hepsina inhibida por DCI, no es probable que Fab inhiba hepsina por la ocupación directa de la cavidad SI.

Tabla 1. Inhibición por Fab25 de la actividad de hepsina hacia un grupo de sustratos sintéticos. La hepsina se incubó con 100 nM de Fab25 o Fab de control durante 40 min antes de la adición de 8 diferentes sustratos de pNA. Las velocidades lineales iniciales se midieron en un lector de microplaca cinético, y la actividad enzimática se expresó como porcentaje de actividad de hepsina sin Fab presente.

Fab25 demostró inhibir la actividad de hepsina en forma uniforme el >90% en todos los ensayos funcionales usando una diversidad de sustratos sintéticos y macromoleculares .

El procesamiento proteolitico de pro-MSP por hepsina nativamente expresada sobre la superficie celular se controló en la estirpe celular LnCap-34 (Moran et al., 2006) . Las células LnCap-34 que expresaban hepsina fueron capaces de procesar el 1251-pro-MSP (Fig.16). La actividad proteolitica del procesamiento de pro-MSP se debió principalmente a hepsina, ya que los tres inhibidores de hepsina (Ac-KQLR-clorometilcetona, KD1 y Fab25) bloquearon en forma eficaz la disociación proteolitica.

Lista de referencia parcial.

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Si bien la invención precedente se ha descrito en cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo para los propósitos de claridad de comprensión, las descripciones y los ejemplos no deben interpretarse como una limitación del alcance de la invención.

Claims (42)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo antihepsina aislado, donde una forma monovalente del anticuerpo se une a hepsina humana con una afinidad de menor o igual a 10 nM o mejor, en donde la forma monovalente del anticuerpo une la hepsina de ratón con una afinidad menor o igual de 330 nM, y en donde el anticuerpo une la hepsina presente en un complejo que comprende hepsina y un inhibidor de serina proteasa que se une al subsitio SI de hepsina humana.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el inhibidor de serina proteasa es 3, -dicloro-isocumarina (DCI) .

3. El anticuerpo de la reivindicación 1, donde el anticuerpo se une a una región de unión del dominio Kunitz de hepsina.

4. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo bloque el substrato que une al subsitio 2 de hepsina y/o subsitio 3 de hepsina.

5. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo inhibe la activación mediada por hepsina de la proteína estimulante de macrofagos (MSP) .

6. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo inhibe la migración celular dependiente de laminina .

7. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco y/o seis secuencias de región hipervariable (HVR) seleccionadas del grupo que consiste en: (a) HVR-L1 que comprende la secuencia RASQSVSSAVA (SEQ ID N0:1) ; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia SASSLYS (SEQ ID NO : 2 ) ; (c) HVR-L3 que comprende la secuencia QQYYSSYYLLT (SEQ ID NO: 3) ; (d) HVR-H1 que comprende la secuencia GFNFSYSYMH (SEQ ID NO : 4 ) ; (e) HVR-H2 que comprende la secuencia ASIYSYYGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 5) ; y (f) HVR-H3 que comprende la secuencia ARSDSWSYKSGYTQKIYSKGLDY (SEQ ID NO: 6) .

8. El anticuerpo de la reivindicación 7, donde el anticuerpo comprende (a) HVR-H3 que comprende la secuencia ARSDSWSYKSGYTQKIYSKGLDY (SEQ ID NO: 6), (b) HVR-L3 que comprende la secuencia QQYYSSYYLLT (SEQ ID NO:3), y HVR-H2 que comprende la secuencia ASIYSYYGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 5) .

9. El anticuerpo de la reivindicación 7, donde el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia GFNFSYSYMH (SEQ ID N0:4); (b) HVR-H2 que comprende la secuencia ASIYSYYGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 5) y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia ARSDSWSYKSGYTQKIYSKGLDY (SEQ ID NO: 6) .

10. El anticuerpo de la reivindicación 9, donde el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia RASQSVSSAVA (SEQ ID NO:l); (b) HVR-L2 que comprende la secuencia SASSLYS (SEQ ID NO:2); y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia QQYYSSYYLLT (SEQ ID NO: 3) .

11. El anticuerpo de la reivindicación 7, donde el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia RASQSVSSAVA (SEQ ID N0:1); (b) HVR-L2 que comprende la secuencia SASSLYS (SEQ ID N0:2); y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia QQYYSSYYLLT (SEQ ID NO: 3).

12. El anticuerpo de las reivindicaciones 9 u 11, que además comprende una secuencia de marco de dominio variable de cadena pesada o dominio variable de cadena ligera mostrada en la Figura 3, 4, 5 ó 6.

13. El anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende (a) una secuencia VH que tiene al menos 95% de identidad de secuencia y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; o que tiene al menos 95% de identidad de secuencia para la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9; o (c) una secuencia VH como en (a) y una secuencia VL como en (b) .

14. El anticuerpo de la reivindicación 13, que comprende una secuencia VH de la SEQ ID NO: 10.

15. El anticuerpo de la reivindicación 13, que comprende una secuencia VL de la SEQ ID NO: 9.

16. El anticuerpo de la reivindicación 13, que comprende una secuencia VH de la SEQ ID NO: 10 y una secuencia VL de la SEQ ID NO: 9.

17. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es un anticuerpo IgGl de largo completo.

18. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de marco de consenso del subgrupo K humana.

19. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de marco de consenso del subgrupo III humana de cadena pesada.

20. Ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

21. Una célula huésped que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 20.

22. Un método para hacer un anticuerpo que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 21, de modo que se produzca el anticuerpo.

23. El método de la reivindicación 22, que además comprende recuperar el anticuerpo del cultivo de célula huésped.

24. Un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo de la reivindicación 1 y un agente citotóxico.

25. Una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo de la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable.

26. La formulación farmacéutica de la reivindicación 25, que además comprende un agente terapéutico adicional.

27. El anticuerpo de la reivindicación 1 para su uso como un medicamento.

28. El anticuerpo de la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de cáncer.

29. El anticuerpo de la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de un desorden inmune.

30. El anticuerpo de la reivindicación 1 para su uso en la inhibición de la migración celular.

31. El anticuerpo de la reivindicación 1 para su uso en la inhibición de la actividad · enzimática de hepsina.

32. Uso del anticuerpo de la reivindicación 1 para su uso en la inhibición de la actividad enzimática de hepsina.

33. El uso de la reivindicación 32, en donde el medicamento es para el tratamiento de cáncer.

34. El uso de la reivindicación 32, en donde el medicamento es para el tratamiento de un desorden inmune.

35. El uso de la reivindicación 32, en donde el medicamento es para inhibir la migración celular o inhibir la actividad enzimática de hepsina.

36. Un método para hacer un anticuerpo de proteasa antiserina, que comprende seleccionar el anticuerpo que une la serine proteasa presente en un complejo que comprende (a) serina proteasa; y (b) un inhibidor de serina proteasa que se une a un subsitio SI.

37. El método de la reivindicación 36, en donde la serina proteasa es hepsina.

38. El método de la reivindicación 36, en donde el inhibidor de serina proteasa es 3, -dicloro-isocoumarina .

39. El método de la reivindicación 36, en donde el inhibidor de serina proteasa se une a los residuos Serl95 y His57 de aminoácido catalíticos de hepsina, de lo cual se inactiva la hepsina.

40. El método de la reivindicación 36, en donde, antes de seleccionar el anticuerpo, el anticuerpo es incubado con serina proteasa e inhibidor de serina proteasa.

41. El método de la reivindicación 37, que además comprende seleccionar anticuerpos que compiten por el enlace de hepsina con un dominio Kunitz.

42. El método de la reivindicación 41, en donde el dominio Kunitz es KD1.