CN102648211B - 抗hepsin抗体及其使用方法 - Google Patents

抗hepsin抗体及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了hepsin抗体，及包含这些抗体的组合物和使用这些抗体的方法。

Description

抗HEPSIN抗体及其使用方法
对相关申请的交叉引用
此申请要求2009年10月22日提交的美国临时申请No.61/253,953的权益，通过述及将其内容收入本文。
发明领域
一般而言，本发明涉及分子生物学领域。更具体的说，本发明关注抗hepsin抗体，及其用途。
发明背景
hepsin是一种在上皮细胞的表面上表达的II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSP)。417个氨基酸的该蛋白质包含短的N端胞质域、跨膜域和单个清道夫受体富含半胱氨酸域，其紧压C端蛋白酶域(Somoza et al(2003)Structure 11(9),1123-1131)。不清楚hepsin的生理功能。尽管它在胚胎发生的很早期表达(Vu etal(1997)J Biol Chem 272(50),31315-31320)，hepsin缺陷小鼠是可存活的且正常发育(Yu et al(2000)Thromb Haemost 84(5),865-870;Wu et al(1998)JClin Invest 101(2),321-326)。发现hepsin对肝再生和对于凝固相关生理功能不是至关重要的(同上)。一项最近的研究证明了hepsin敲除小鼠听力受损(Guipponi et al.(2007)Am J Pathol 171:608-616)。然而，hepsin涉及卵巢[(Tanimoto et al(1997)Cancer Res 57(14),2884-2887);WO2001/62271]和前列腺癌。数项基因表达研究将hepsin鉴定为前列腺癌受到最高度诱导的基因之一(Dhanasekaran et al(2001)Nature 412,822-826;Luo et al(2001)Cancer Res61(12),4683-4688;Magee et al(2001)Cancer Res 61(15),5692-5696;Stamey etal(2001)J Urol 166(6),2171-2177;Stephan et al(2004)J Urol 171(1),187-191;Welsh et al(20010)Cancer Res 61(16),5974-5978)。发现hepsin RNA水平在正常前列腺和良性增生中较低，但在前列腺癌中强烈升高，特别是晚期阶段((Dhanasekaran et al(2001)Nature 412,822-826;Luo et al(2001)Cancer Res61(12),4683-4688;Magee et al(2001)Cancer Res 61(15),5692-5696;Stamey etal(2001)J Urol 166(6),2171-2177;Stephan et al(2004)J Urol 171(1),187-191;Welsh et al(20010)Cancer Res 61(16),5974-5978)。用单克隆抗hepsin抗体进行的hepsin蛋白染色显示了骨转移部位处和晚期阶段原发性肿瘤中的hepsin表达最高(Xuan et al(2006)Cancer Res 66(7),3611-3619)，与升高的hepsinRNA水平与较高的Gleason等级和肿瘤进展有关的发现一致((Luo et al(2001)Cancer Res 61(12),4683-4688;Magee et al(2001)Cancer Res 61(15),5692-5696;Stamey et al(2001)J Urol 166(6),2171-2177;Stephan et al(2004)JUrol 171(1),187-191;Chen et al(2003)J Urol 169(4),1316-1319)。
hepsin在前列腺癌中的作用的实验证据来自Klezovitch等人的一项研究(Klezovitch et al(2004)Cancer Cell 6(2),185-195)，其证明了在非转移性前列腺癌的小鼠模型中，hepsin的过表达导致原发性肿瘤进展和转移。有趣的是，hepsin过表达与基底膜破坏有关(同上)，这指出了hepsin活性以某种方式与基底膜成分的降解有联系的可能性。在体外，hepsin能够将潜伏的生长因子肝细胞生长因子原(HGF原)转变成它的活性双链形式(HGF)，其诱导Met受体信号传导(Herter et al(2005)Biochem J 390(Pt 1),125-136;Kirchhofer et al(2005)FEBS Lett 579(9),1945-1950;WO2006/014928)。hepsin还能够将uPA原转变成其活性形式(Moran et al,(2006)J Biol Chem.281(41):30439-46)，及在体外切割核纤层蛋白(Tripathi et al.(2008)J Biol Chem.283:30576)。因为HGF/Met途径涉及侵入性肿瘤生长和转移，所以有可能hepsin的过表达在前列腺癌中激活HGF/Met轴(Herter et al(2005)Biochem J 390(Pt 1),125-136;Kirchhofer etal(2005)FEBS Lett 579(9),1945-1950;WO2006/014928)。hepsin还显示出在体外切割其它底物，主要是凝固相关蛋白(Herter et al,id;Kazama et al(1995)JBiol Chem 270(1),66-72)。然而，不知道它们在肿瘤发生中的作用。
清楚的是仍然需要具有最适于开发成治疗剂的临床属性的药剂。本文所述发明满足了此需求并提供了其它好处。
通过述及将本文中所引用的所有参考文献（包括专利申请和出版物）完整收入本文。
发明概述
本发明部分基于多种hepsin结合物（诸如抗体，及其片段）的鉴定。hepsin代表了一种重要的且有利的治疗靶，而且本发明提供了基于药剂对hepsin的结合的组合物和方法。如本文中所描述的，本发明的hepsin结合物提供了重要的治疗剂和诊断剂，供靶向与hepsin信号传导途径的表达和/或活性有关的病理性疾患中使用。因而，本发明提供了与hepsin结合有关的方法、组合物、试剂盒、和制品。
胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶（诸如hepsin）的活性位点由几个内在活动的环（“活化域”）形成(Huber and Bode,1978)。特别地，220环形成S1袋的一部分且能在一些丝氨酸蛋白酶中采取多种构象状态(Johnson et al.,2005;Shia etal.,2005;Spraggon et al.,2009;Wilken et al.,2004)。然而，丝氨酸蛋白酶与活性位点抑制剂的共晶体结构显示正确形成的活性位点，最有可能是由于由抑制剂施加的稳定力(Arni et al.,1994;Shia et al.,2005;Spraggon et al.,2009)。推理得出丝氨酸蛋白酶抑制剂对S1袋的占据可对丝氨酸蛋白酶活性位点环灵活性施加稳定力，促进丝氨酸蛋白酶活性位点的抗体识别。如此，为了鉴定阻断hepsin酶活性的抗hepsin抗体，获得了结合与丝氨酸蛋白酶抑制剂3,4-二氯-异香豆素(DCI)复合的hepsin的抗体，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂占据S1袋。
本发明提供了结合hepsin的抗体。在一个方面，本发明的特征是一种分离的结合hepsin的抗体。
在一个方面，本发明提供一种分离的抗hepsin抗体，其中该抗体的单价形式（诸如Fab形式）以约10nM或更好的结合亲和力特异性结合人hepsin。在一些实施方案中，所述抗体以约6nM或更好的结合亲和力特异性结合人hepsin。如本领域完全确立的，配体对其受体的结合亲和力可以使用多种测定法来测定，而且以多种定量数值来表述。因而，在一个实施方案中，结合亲和力表述成Kd值，而且反映了内在结合亲和力（例如具有最小化的亲合效应）。通常且优选的是，结合亲和力是在体外测量的，无论是在无细胞背景下还是在细胞相关背景下。可以使用本领域已知的多种测定法之任一来获得结合亲和力测量，包括本文中所描述的测定法，包括例如Biacore、放射免疫测定法(RIA)、和ELISA。
在另一个方面，本发明提供结合hepsin中库尼茨(Kunitz)域结合区的抗hepsin抗体。在一个方面，本发明提供一种分离的抗hepsin抗体，其与库尼茨域竞争对hepsin的结合。在一个实施方案中，所述库尼茨域序列为HAI-1或HAI-1B的库尼茨域1(KD1)。在一个实施方案中，该库尼茨域序列为与人HAI-1的野生型KD1具有至少约70%,75%,80%,85%,90%,95%,97%,98%,99%序列同一性的变体KD1序列，其中所述变体序列至少具有与野生型KD1相当的抑制hepsin活性的能力。在一个实施方案中，所述库尼茨域序列为HAI-2的库尼茨域之一或二者。在一个实施方案中，变体HAI-2库尼茨域序列与野生型人HAI-2的相应库尼茨域具有约70%至99%、约75%至98%、约80%至97%、85%至95%序列同一性，其中所述序列至少具有与野生型HAI-2相当的抑制hepsin活性的能力。
在一个方面，本发明提供结合hepsin催化位点的抗hepsin抗体。
在一个方面，本发明提供在s1亚位点以外结合hepsin的抗hepsin抗体。在一些实施方案中，该抗体结合hepsin s2和/或s3亚位点。
在一个方面，本发明提供结合催化灭活的hepsin的抗hepsin抗体。
在一个方面，本发明提供对hepsin蛋白水解有抗性的抗hepsin抗体。在一些实施方案中，在容许hepsin切割hepsin底物的条件下将该抗体对hepsin暴露24小时。
在一个方面，本发明提供结合复合物中存在的hepsin的抗hepsin抗体，该复合物包含hepsin和结合hepsin S1亚位点的丝氨酸蛋白酶抑制剂。在一些实施方案中，复合物中存在的hepsin是灭活的。在一些实施方案中，该丝氨酸蛋白酶抑制剂为3,4-二氯-异香豆素(3,4-dichloro-isocoumarin,DCI)。在一些实施方案中，该丝氨酸蛋白酶抑制剂结合hepsin催化性氨基酸残基Ser195和His57，由此hepsin被灭活。
在一个方面，本发明提供特异性结合人hepsin且实质性抑制体内和/或体外hepsin酶活性的抗hepsin抗体。在一个实施方案中，该酶活性包含hepsin对多肽底物的切割。在一个实施方案中，hepsin的多肽底物为巨噬细胞刺激性蛋白原(MSP原)、uPA原、因子VII和HGF原中的一种或多种。hepsin对MSP原的活化记载于2009年10月22日提交的共同未决的、共同拥有的美国临时专利申请No.61/253,990。在一个实施方案中，该酶活性包含hepsin对合成底物的切割。在一些实施方案中，该hepsin合成底物为表1所示底物。
在一个方面，本发明提供抗hepsin抗体，其中该抗体实质性抑制人和/或小鼠hepsin催化活性。在一些实施方案中，单价形式的抗hepsin抗体以约（在一些实施方案中，小于或等于）4nM的Ki抑制人hepsin催化活性。在一些实施方案中，单价形式的抗hepsin抗体以约（在一些实施方案中，小于或等于）330nM的Ki抑制小鼠hepsin催化活性。
在一个方面，本发明提供抗hepsin抗体，其中该抗体实质性抑制hepsin对uPA原的切割。在一些实施方案中，该抗hepsin抗体以约3nM或更强的IC50抑制hepsin对uPA原的切割。
在一个方面，本发明提供抗hepsin抗体，其中该抗体实质性抑制层粘连蛋白依赖性细胞迁移。
在一个方面，本发明提供抗hepsin抗体，其中该抗体通过包括选择结合复合物的抗体的方法生成，该复合物包含(a)hepsin和(b)结合hepsin S1亚位点的丝氨酸蛋白酶抑制剂的。在一些实施方案中，复合物中存在的hepsin是灭活的。在一些实施方案中，该丝氨酸蛋白酶抑制剂为3,4-二氯-异香豆素(DCI)。在一些实施方案中，该丝氨酸蛋白酶抑制剂结合hepsin催化性氨基酸残基Ser195和His 57，由此hepsin被灭活。在一些实施方案中，在选择抗体之前，将抗体与hepsin和丝氨酸蛋白酶抑制剂一起温育。在一些实施方案中，该方法进一步包括选择与库尼茨域竞争hepsin结合的抗体的步骤。在一些实施方案中，该库尼茨域为KD1。
在一个方面，本发明提供抗hepsin抗体，其中该抗体通过包括选择（鉴定）与库尼茨域竞争hepsin结合的抗体的方法生成。在一些实施方案中，该库尼茨域为KD1。
在一个方面，本发明提供不受hepsin实质性切割的抗hepsin抗体。在一些实施方案中，该抗hepsin抗体对hepsin切割有实质性抗性。
一般地，本发明的抗hepsin抗体是拮抗性抗体。
在一个方面，本发明提供一种抗hepsin抗体，其包含至少一个、两个、三个、四个、五个、和/或六个选自下组的高变区(HVR)序列：
(a)HVR-L1，其包含序列RASQSVSSAVA(SEQ ID NO:1)，
(b)HVR-L2，其包含序列SASSLYS(SEQ ID NO:2)，
(c)HVR-L3，其包含序列QQYYSSYYLLT(SEQ ID NO:3)，
(d)HVR-H1，其包含序列GFNFSYSYMH(SEQ ID NO:4)，
(e)HVR-H2，其包含序列ASIYSYYGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:5)，和
(f)HVR-H3，其包含序列ARSDSWSYKSGYTQKIYSKGLDY(SEQ IDNO:6)。
在一个方面，本发明提供一种抗hepsin抗体，其包含(a)轻链，该轻链包含(i)HVR-L1，其包含序列RASQSVSSAVA(SEQ ID NO:1)；(ii)HVR-L2，其包含序列SASSLYS(SEQ ID NO:2)；和(iii)HVR-L3，其包含序列QQYYSSYYLLT(SEQ ID NO:3)；和/或(b)重链，该重链包含(i)HVR-H1，其包含序列GFNFSYSYMH(SEQ ID NO:4)；(ii)HVR-H2，其包含序列ASIYSYYGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:5)；和(iii)HVR-H3，其包含序列ARSDSWSYKSGYTQKIYSKGLDY(SEQ ID NO:6)。
在一个方面，本发明提供一种抗hepsin抗体，其包含HVR-L1，该HVR-L1包含序列SEQ ID NO:1。在一个方面，本发明提供一种抗hepsin抗体，其包含HVR-L2，该HVR-L2包含序列SEQ ID NO:2。在一个方面，本发明提供一种抗hepsin抗体，其包含HVR-L3，该HVR-L3包含序列SEQ ID NO:3。在一个方面，本发明提供一种抗hepsin抗体，其包含HVR-H1区，该HVR-H1区包含序列SEQ ID NO:4。在一个方面，本发明提供一种抗hepsin抗体，其包含HVR-H2区，该HVR-H2区包含序列SEQ ID NO:5。在一个方面，本发明提供一种抗hepsin抗体，其包含HVR-H3区，该HVR-H3区包含序列SEQ ID NO:6。
在一个方面，抗hepsin抗体包含轻链可变区和/或重链可变区，该轻链可变区包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3，其中各自依次包含序列RASQDVN/STAVA(SEQ ID NO:7)、SEQ ID NO:2、3，该重链可变区包含HVR-H1、HVR-H2、和HVR-H3，其中各自依次含有SEQ ID NO:4、5、6。
在一个方面，抗hepsin抗体包含轻链可变区和/或重链可变区，该轻链可变区包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3，其中各自依次包含序列RASQDVN/STAVA(SEQ ID NO:7)、SEQ ID NO:1、序列SASFLYS(SEQ IDNO:8)、SEQ ID NO:3，该重链可变区包含HVR-H1、HVR-H2、和HVR-H3，其中各自依次含有SEQ ID NO:4、5、6。
在一个方面，抗hepsin抗体包含轻链可变区和/或重链可变区，该轻链可变区包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3，其中各自依次包含SEQ ID NO:7、8、3，该重链可变区包含HVR-H1、HVR-H2、和HVR-H3，其中各自依次含有SEQ ID NO:4、5、6。
氨基酸序列SEQ ID NO:1-6关于各个HVR编号（即H1、H2或H3），如图1所示，编号方式与下文所述Kabat编号系统一致。
本发明的抗体可包含任何合适的可变域框架序列，前提是对hepsin的结合亲和力得到基本上保留。例如，在有些实施方案中，本发明的抗体包含人亚组III重链框架共有序列。在这些抗体的一个实施方案中，所述框架共有序列包含第71位、第73位和/或第78位处的替代。在这些抗体的有些实施方案中，第71位是A，第73位是T，和/或第78位是A。在一个实施方案中，这些抗体包含huMAb4D5-8(Genentech，Inc.，South San Francisco，CA，USA)(在美国专利No.6,407,213 & 5,821,337，及Lee et al.，J.Mol.Biol.(2004)，340(5):1073-1093中也有提及)的重链可变域框架序列。在一个实施方案中，这些抗体进一步包含人κI轻链框架共有序列。在有些实施方案中，所述框架共有序列包含第66位处的替代。在有些实施方案中，第66位是G。在一个具体的实施方案中，这些抗体包含huMAb4D5-8的轻链HVR序列，如美国专利No.6,407,213 & 5,821,337中所记载的。在一个实施方案中，这些抗体包含huMAb4D5-8(Genentech，Inc.，South San Francisco，CA，USA)(在美国专利No.6,407,213 & 5,821,337，及Lee et al.，J.Mol.Biol.(2004)，340(5):1073-1093中也有提及)的轻链可变域序列。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变域，其中框架序列包含图2A-B公开的序列，而且HVR H1、H2、和H3序列分别为SEQ ID NO:4、5、和/或6。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变域，其中框架序列包含SEQ ID NO 14-15、48、和/或16的序列，而且HVR H1、H2、和H3序列分别为SEQ ID NO:4、5、和/或6的序列。在另一个实施方案中，框架序列包含SEQID NO 14-15、43、和/或16的序列，而且HVR H1、H2、和H3序列分别为SEQID NO:4、5、和/或6。
在一个特别的实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变域，其中框架序列分别包含SEQ ID NO 17-20；49-51和20；52-54和20；和/或55-57 & 20的序列，而且HVR L1、L2、和L3序列分别为SEQ ID NO:1、2、和/或3。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变域，其中框架序列包含SEQ IDNO 17-18、58和/或20的序列，而且HVR L1、L2、和L3序列分别为SEQ ID NO:1、2、和/或3。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变域，其中框架序列包含SEQ ID NO 17、18、19和/或20的序列，而且HVR L1、L2、和L3序列分别为SEQ ID NO:1、2、和/或3。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变域和轻链可变域，在重链可变域中，框架序列包含SEQ ID NO 14-15、43和/或16的序列，而且HVRH1、H2、和H3序列分别为SEQ ID NO:4、5、和/或6，在轻链可变域中，框架序列包含SEQ ID NO 17-18、58和/或20的序列，而且HVR L1、L2、和L3序列分别为SEQ ID NO:1、2、和/或3。
在另一个方面，本发明的抗体包含重链可变域和/或轻链可变域，该重链可变域包含序列SEQ ID NO:10，该轻链可变域包含序列SEQ ID NO:9。
在另一个方面，本发明的抗体包含重链可变域和轻链可变区，该重链可变域包含序列SEQ ID NO:10。
在另一个方面，本发明的抗体包含轻链可变域和重链可变域，该轻链可变域包含序列SEQ ID NO:9。
本发明抗体的有些实施方案包含人源化4D5抗体(huMAb4D5-8)(Genentech，Inc.，South San Francisco，CA，USA)(在美国专利No.6,407,213及Lee et al.，J.Mol.Biol.(2004)，340(5):1073-1093中也有提及)的轻链可变域，如下文SEQ ID NO:11所描绘的。
1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg ValThr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln GlnLys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser GlyVal Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile SerSer Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107(SEQ ID NO:11)
（HVR残基标有下划线）
在一个实施方案中，huMAb4D5-8轻链可变域序列在第30位、第66位、和第91位中一个或多个位置处被修饰（分别为Asn、Arg、和His，如上文以粗体/斜体标示的）。在一个实施方案中，经修饰的huMAb4D5-8序列包含第30位Ser、第66位Gly、和/或第91位Ser。因而，在一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变域，该轻链可变域包含下文SEQ ID NO:45所示序列：
1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg ValThr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln GlnLys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser GlyVal Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile SerSer Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107(SEQ ID NO:45)
（HVR残基标有下划线）。
在一个方面，本发明提供了一种抗hepsin抗体，其与上文所述任何抗体竞争对hepsin的结合。在一个方面，本发明提供了一种抗hepsin抗体，其与上文所述任何抗体结合hepsin上相同或相似表位。
如本领域所知道的，和如下文更详细描述的，描述抗体高变区的氨基酸位置/边界可以有所变化，这取决于本领域中已知的背景和各种定义（如下文所述的）。可变域（区）内的有些位置可以看作杂合高变位置，因为这些位置在一组标准下可认为在高变区内，而在不同的一组标准下被认为在高变区外。在延伸的高变区中也能找到这些位置中的一处或多处（如下文进一步定义的）。
在有些实施方案中，该抗体是单克隆抗体。在其它实施方案中，该抗体是多克隆抗体。在有些实施方案中，该抗体选自下组：嵌合抗体，亲和力成熟抗体，人源化抗体和人抗体。在某些实施方案中，该抗体是抗体片段。在有些实施方案中，该抗体是Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、或scFv。
在一个实施方案中，该抗体是嵌合抗体，例如如下的抗体，其包含来自非人供体的抗原结合序列，且该序列被嫁接至异源的非人、人、或人源化序列（例如框架和/或恒定域序列）。在一个实施方案中，该非人供体是小鼠。在另一个实施方案中，抗原结合序列是合成的，例如通过诱变得到的（例如噬菌体展示筛选等）。在一个具体的实施方案中，本发明的嵌合抗体具有鼠V区和人C区。在一个实施方案中，该鼠轻链V区是融合至人卡帕（κ）轻链的。在另一个实施方案中，该鼠重链V区是融合至人IgG1C区的。
本发明的人源化抗体包括那些在框架区(FR)中具有氨基酸替代的及在所嫁接的CDR中具有改变的亲和力成熟变体。CDR或FR中的替代氨基酸不限于那些存在于供体或受体抗体中的。在其它实施方案中，本发明的抗体进一步包含Fc区中的、导致改善的效应器功能（包括增强的CDC和/或ADCC功能和B细胞杀伤）的氨基酸残基改变。本发明的其它抗体包括那些具有增强稳定性的特定改变的那些抗体。在其它实施方案中，本发明的抗体包含Fc区中的、导致降低的效应器功能（例如降低的CDC和/或ADCC功能和/或降低的B细胞杀伤）的氨基酸残基改变。在有些实施方案中，本发明的抗体以降低的对人补体因子C1q和/或天然杀伤(NK)细胞上人Fc受体的结合为特征。在有些实施方案中，本发明的抗体以降低的对人FcγRI、FcγRIIA、和/或FcγRIIIA的结合（诸如结合缺失）为特征。在有些实施方案中，本发明的抗体是属于IgG类的（例如IgG1或IgG4）且包含E233、L234、G236、D265、D270、N297、E318、K320、K322、A327、A330、P331、和/或P329（编号方式依照EU索引）中的至少一处突变。在有些实施方案中，该抗体包含突变L234A/L235A或D265A/N297A。
在一个方面，本发明提供了hepsin结合多肽，其包含本文中所提供的任何抗原结合序列，其中该hepsin结合多肽特异性结合hepsin，例如人和/或猕猴和/或小鼠hepsin。
本发明的抗体结合（诸如特异性结合）hepsin，而在有些实施方案中，其可调控（例如抑制）以下的一个或多个方面：hepsin活性（诸如hepsin酶活性）和/或任何生物学重要的hepsin和/或hepsin多肽底物生物学途径的破坏，和/或肿瘤、细胞增殖性病症或癌症的治疗和/或预防；和/或与hepsin表达和/或活性（诸如升高的hepsin表达和/或活性）有关的病症的治疗或预防。在有些实施方案中，该hepsin抗体特异性结合由hepsin（例如人和/或小鼠hepsin）组成的或基本上由hepsin（例如人和/或小鼠hepsin）组成的多肽。在一个实施方案中，hepsin酶活性包括hepsin对多肽底物的切割。在一个实施方案中，hepsin的多肽底物为巨噬细胞刺激性蛋白原(MSP原(pro-MSP))、uPA原(pro-uPA)、因子VII和HGF原中的一种或多种。
在一个实施方案中，本发明的抗体不是2006年出版的Cancer Research第66卷第3611-3619页中记载的抗hepsin抗体（例如图4中例示的抗体1A12、85B11、94A7、A6、A174、A21和/或A24）、或PCT公开文本WO2004/033630中披露的分离的hepsin抗体（例如第93页和图15A-D中提到的抗体47A5、14C7、46D12、38E2、37G10、31C1、11C1和/或72H6）、或Xuan et al(2006)Cancer Res 66(7),3611中披露的分离的hepsin抗体、或WO2007/149932中披露的hepsin抗体。
在一个实施方案中，本发明的抗体不与下述抗体竞争对人hepsin的结合：2006年出版的Cancer Research第66卷第3611-3619页中记载的抗hepsin抗体（例如图4中例示的抗体1A12、85B11、94A7、A6、A174、A21和/或A24）、或PCT公开文本WO2004/033630中披露的分离的hepsin抗体（例如第93页和图15A-D中提到的抗体47A5、14C7、46D12、38E2、37G10、31C1、11C1和/或72H6）、或Xuan et al(2006)Cancer Res 66(7),3611中披露的分离的hepsin抗体、或WO2007/149932中披露的hepsin抗体。
在一个实施方案中，本发明的抗体不与下述抗体结合人hepsin上的相同表位：2006年出版的Cancer Research第66卷第3611-3619页中记载的抗hepsin抗体（例如图4中例示的抗体1A12、85B11、94A7、A6、A174、A21和/或A24）、或PCT公开文本WO2004/033630中披露的分离的hepsin抗体（例如第93页和图15A-D中提到的抗体47A5、14C7、46D12、38E2、37G10、31C1、11C1和/或72H6）、或Xuan et al(2006)Cancer Res 66(7),3611中披露的分离的hepsin抗体、或WO2007/149932中披露的hepsin抗体
在一个方面，本发明提供了组合物，其包含一种或多种本发明的抗体及载体。在一个实施方案中，所述载体是药学可接受的。
在另一个方面，本发明提供了核酸，其编码本发明的抗hepsin抗体。
在又一个方面，本发明提供了载体，其包含本发明的核酸。
在另一个方面，本发明提供了组合物，其包含一种或多种本发明的核酸及载体。在一个实施方案中，所述载体是药学可接受的。
在一个方面，本发明提供了宿主细胞，其包含本发明的核酸或载体。载体可以是任何类型的，例如重组载体，诸如表达载体。可使用多种宿主细胞中任一种。在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞，例如大肠杆菌。在另一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
在另一个方面，本发明提供了制备本发明抗体的方法。例如，本发明提供了制备抗hepsin抗体（如本文中所定义的，其包括全长抗体及其片段）的方法，所述方法包括培养包含编码人源化抗体的核酸的宿主细胞，使得该核酸表达。在一些实施方案中，上述方法进一步包括自宿主细胞培养物回收该抗体。在一些实施方案中，自宿主细胞培养液回收该抗体。在一些实施方案中，该方法进一步包括将回收的抗体与药学可接受载体、赋形剂、或载体组合以制备包含人源化抗体的药物配制剂。在一些实施方案中，本发明提供生成抗hepsin抗体的方法，所述方法包括选择结合复合物的抗体，该复合物包含(a)hepsin和(b)结合hepsin S1亚位点的丝氨酸蛋白酶抑制剂。在一些实施方案中，复合物中存在的hepsin是灭活的。在一些实施方案中，该丝氨酸蛋白酶抑制剂为3,4-二氯-异香豆素(DCI)。在一些实施方案中，该丝氨酸蛋白酶抑制剂结合hepsin催化性氨基酸残基Ser195和His 57，由此hepsin被灭活。在一些实施方案中，在选择抗体之前，将抗体与hepsin和丝氨酸蛋白酶抑制剂一起温育。在一些实施方案中，该方法进一步包括选择与库尼茨域竞争hepsin结合的抗体的步骤。在一些实施方案中，该库尼茨域为KD1。
在一个方面，本发明提供了一种制品，其包含容器；和装在该容器内的组合物，其中所述组合物包含一种或多种本发明的hepsin抗体。在一个实施方案中，所述组合物包含本发明的核酸。在另一个实施方案中，包含抗体的组合物进一步包含载体，所述载体在有些实施方案中是药学可接受的。在一个实施方案中，本发明的制品进一步包含关于对个体施用组合物（例如抗体）的指示（诸如关于本文中所描述的任何方法的指示）。
在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含装有组合物的第一容器，所述组合物包含一种或多种本发明的抗hepsin抗体；和装有缓冲液的第二容器。在一个实施方案中，所述缓冲液是药学可接受的。在一个实施方案中，包含抗体的组合物进一步包含载体，所述载体在有些实施方案中是药学可接受的。在另一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含关于对个体施用组合物（例如抗体）的指示。
hepsin途径涉及多种生物学和生理学功能，包括例如HGF/c-met途径的激活、MSP/Ron途径的激活、基底膜破坏/降解、基质降解、等。这些功能继而常常在病症诸如癌症中失调。如此，在另一个方面，本发明提供抑制基底膜破坏/降解和/或基质降解的方法，所述方法包括使细胞或组织与本发明的拮抗剂接触，由此基底膜破坏/降解和/或基质降解受到抑制。在还有另一个方面，本发明提供抑制基底膜破坏/降解和/或基质降解的方法，所述方法包括对具有与异常基底膜破坏/降解和/或基质降解有关的状况的细胞、组织、和/或受试者施用本发明的拮抗剂，由此基底膜破坏/降解和/或基质降解受到抑制。
在一个方面，本发明提供用于治疗或预防与升高的hepsin活性有关的病症的方法，所述方法包括对需要此类治疗的受试者施用有效量的本发明拮抗剂，由此有效治疗或预防所述病症。在一个实施方案中，所述病症为癌症。
在又一个方面，本发明提供本发明的抗hepsin抗体在制备用于病症（诸如癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症）的治疗性和/或预防性处理的的药物中的用途。在一些实施方案中，所述癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症为前列腺癌。在一些实施方案中，所述癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症为卵巢癌或肾癌。
在一个方面，本发明提供本发明的核酸在制备用于病症（诸如癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症）的治疗性和/或预防性处理的的药物中的用途。在一些实施方案中，在一些实施方案中，所述癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症为前列腺癌。在一些实施方案中，所述癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症为卵巢癌或肾癌。
在另一个方面，本发明提供本发明的表达载体在制备用于病症（诸如癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症）的治疗性和/或预防性处理的的药物中的用途。在一些实施方案中，所述癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症为前列腺癌。在一些实施方案中，所述癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症为卵巢癌或肾癌。
在还有另一个方面，本发明提供本发明的宿主细胞在制备用于病症（诸如癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症）的治疗性和/或预防性处理的的药物中的用途。在一些实施方案中，所述癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症为前列腺癌。在一些实施方案中，所述癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症为卵巢癌或肾癌。
在又一个方面，本发明提供本发明的制品在制备用于病症（诸如癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症）的治疗性和/或预防性处理的的药物中的用途。在一些实施方案中，所述癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症为前列腺癌。在一些实施方案中，所述癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症为卵巢癌或肾癌。
在一个方面，本发明还提供本发明的试剂盒在制备用于病症（诸如癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症）的治疗性和/或预防性处理的的药物中的用途。在一些实施方案中，所述癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症为前列腺癌。在一些实施方案中，所述癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症为卵巢癌或肾癌。
本发明提供可用于调控与hepsin表达和/或信号传导诸如升高的表达和/或信号传导或不想要的表达和/或信号传导）有关的病症的方法和组合物（。
本发明的方法可用于影响任何合适病理状态。本文中描述了例示性病症，而且包括选自下组的癌症：非小细胞肺癌，卵巢癌，甲状腺癌，睾丸癌，子宫内膜癌，头颈癌（例如头颈鳞状细胞癌），脑癌（例如成神经细胞瘤或脑膜瘤），头颈癌（例如头颈鳞状细胞癌），脑癌（例如成神经细胞瘤或脑膜瘤），皮肤癌（例如黑素瘤、基底细胞癌、或鳞状细胞癌），膀胱癌（例如移行细胞癌），乳腺癌，胃癌，结肠直肠癌(CRC)，肝细胞癌，宫颈癌，肺癌，胰腺癌，前列腺癌，和肾癌，和子宫内膜癌。
在一个实施方案中，本发明的方法所靶向的细胞是癌细胞。例如，癌细胞可以是选自下组的癌细胞：乳腺癌细胞，结肠直肠癌细胞，肺癌细胞（例如非小细胞肺癌细胞），甲状腺癌细胞，多发性骨髓瘤细胞，睾丸癌细胞，乳头状癌细胞，结肠癌细胞，胰腺癌细胞，卵巢癌细胞，宫颈癌细胞，中枢神经系统癌细胞，骨源性肉瘤细胞，肾癌细胞，肝细胞癌细胞，膀胱癌细胞（例如移行细胞癌细胞），胃癌细胞，头颈鳞癌细胞，黑素瘤细胞，白血病细胞，子宫内膜癌细胞，和结肠腺瘤细胞。在一个实施方案中，本发明的方法所靶向的细胞是高度增殖性和/或增生性细胞。在另一个实施方案中，本发明的方法所靶向的细胞是发育异常细胞。在还有另一个实施方案中，本发明的方法所靶向的细胞是转移性细胞。
本发明的方法可进一步包含别的治疗步骤。例如，在一个实施方案中，该方法进一步包含将被靶定的细胞和/或组织（例如癌细胞）暴露于辐射处理(radiation treatment)或化疗剂的步骤。
在一个方面，本发明提供了如下的方法，其包括与有效量的另一种治疗剂组合地施用有效量的抗hepsin抗体，所述另一种治疗剂诸如抗血管发生剂、另一抗体、化疗剂、细胞毒剂、免疫抑制剂、前体药物、细胞因子、细胞毒性放疗、类固醇、止吐药、癌症疫苗、镇痛药、或生长抑制剂。例如，与抗癌剂或抗血管发生剂组合地使用抗hepsin抗体以治疗各种赘生性或非赘生性疾患。
根据要治疗的具体癌症适应证，本发明的组合疗法可以与别的治疗剂诸如化疗剂或别的疗法诸如放疗或手术组合。许多已知的化疗剂可以在本发明的组合疗法中使用。优选地，会使用那些作为具体适应证的标准治疗的化疗剂。要组合使用的每种治疗剂的剂量或频率优选与相应药剂在没有其它药剂的情况中使用时的剂量或频率相同、或小于相应药剂在没有其它药剂的情况中使用时的剂量或频率。
在另一个方面，本发明提供了本文所述任何抗hepsin抗体，其中该抗hepsin抗体包含可检测标记物。
在另一个方面，本发明提供了本文所述任何抗hepsin抗体与hepsin的复合物。在有些实施方案中，该复合物是在体内的或在体外的。在有些实施方案中，该复合物包含癌细胞。在有些实施方案中，所述抗hepsin抗体是可检测标记的。
附图简述
图1：抗hepsin抗体的重链和轻链HVR环序列。该图显示重链HVR序列，H1、H2和H3，及轻链HVR序列，L1、L2和L3。序列编号方式如下：克隆25（HVR-H1是SEQ ID NO:4；HVR-H2是SEQ ID NO:5；HVR-H3是SEQ IDNO:6；HVR-L1是SEQ ID NO:1；HVR-L2是SEQ ID NO:2；HVR-L3是SEQ IDNO:3）；氨基酸位置是如下文所述依照Kabat编号系统给编号的。
图2A、2B、和3描绘了例示性的受体人共有框架序列，用于以如下序列标识符实施本发明。
重链可变域(VH）共有框架（图2A、2B）
人VH亚组I共有框架减去Kabat CDR（分别为SEQ ID NO:21-23和16）
人VH亚组I共有框架减去延伸的高变区（分别为SEQ ID NO:24-25、23和16；24-26和16；及24-25、27和16）
人VH亚组II共有框架减去Kabat CDR（分别为SEQ ID NO:28-30和16）
人VH亚组II共有框架减去延伸的高变区（分别为SEQ ID NO:31-32、30和16；31-33和16；及31-32、34和16）
人VH亚组II共有框架减去延伸的
人VH亚组III共有框架减去Kabat CDR（分别为SEQ ID NO:35-37和16）
人VH亚组III共有框架减去延伸的高变区（分别为SEQ ID NO:14-15、37和16；14-15、38和16；及14-15、43和16）
人VH受体框架减去Kabat CDR（分别为SEQ ID NO:39、36、40和16）
人VH受体框架减去延伸的高变区（分别为SEQ ID NO:14-15、40和16；及14-15、41和16）
人VH受体2框架减去Kabat CDR（分别为SEQ ID NO:39、36、42和16）
人VH受体2框架减去延伸的高变区（分别为SEQ ID NO:14-15、42和16；14-15、44和16；及14-15、48和16）
轻链可变域（VL）共有框架（图3）
人VLκ亚组I共有框架（分别为SEQ ID NO:17-20）
人VLκ亚组II共有框架（分别为SEQ ID NO:49-51和20）
人VLκ亚组III共有框架（分别为SEQ ID NO:52-54和20）
人VLκ亚组IV共有框架（分别为SEQ ID NO:55-57和20）
图4描绘了huMAb4D5-8轻链（以出现的次序，分别为SEQ ID NO:17-18、58和20）和重链（以出现的次序，分别为SEQ ID NO:14-15、48和16）的框架区序列。以上标/粗体表示的数字指出依照Kabat的氨基酸位置。
图5描绘了huMAb4D5-8轻链（以出现的次序，分别为SEQ ID NO:17-20）和重链（以出现的次序，分别为SEQ ID NO:14-15、43和16）的修饰的/变异的框架区序列。以上标/粗体表示的数字指出依照Kabat的氨基酸位置。
图6描绘了抗hepsin抗体单抗25重链可变区(SEQ ID NO:10)和轻链可变区(SEQ ID NO:9)。
图7：天然人hepsin的氨基酸序列的一个实施方案。
图8A和B：天然人hepsin的氨基酸序列的另一个实施方案。
图9：3,4-二氯-异香豆素(DCI)对hepsin的灭活。A.将hepsin与浓度渐增的DCI一起温育40分钟后针对S2765底物的酶活性的浓度依赖性抑制。B.依照(Powers et al.,1989)，DCI的化学结构及其与hepsin的潜在加合物。
图10：KD1与抗hepsin Fab噬菌体竞争对hepsin的结合。浓度渐增的KD1存在下Fab25噬菌体对hepsin的结合。
图11：Fab25对人和鼠hepsin酶活性的抑制。将人(hu)和鼠(mu)hepsin与Fab25或对照Fab(ctrl Fab)一起温育40分钟，之后添加S2765底物。在动力学微量板读数仪上测量初始线性速度，并将酶活性表述为分数活性(vi/vo)。
图12：Fab25的特异性。将Fab25(1μM)与hepsin和9种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶一起温育40分钟，之后添加合成的对硝基苯胺(pNA)底物。在动力学微量板读数仪上测量初始线性速度，并将酶活性表述为分数活性(vi/vo)。
图13：Fab25对hepsin的大分子底物加工的抑制。A.Fab25对uPA原活化的抑制。在两阶段酶测定法中测定Fab25对hepsin介导的uPA原加工的影响。在动力学微量板读数仪上测量初始线性速度，并将酶活性表述为分数活性(vi/vo)。通过使用uPA标准曲线，无hepsin抑制的uPA形成速率测定为0.81±0.22μM uPA/min(n=3)。对3种已知底物实施Fab25对hepsin底物加工的抑制：B.因子VII(FVII)；C.HGF原；和D.MSP原。hepsin对因子VII的切割在Fab25和对照Fab(ctrl Fab)存在或缺失下进行0.5小时和2.0小时，而HGF原和MSP原切割实验实施30分钟。通过SDS-PAGE（还原性条件）分析反应等分试样并对凝胶染色。
图14：延长对hepsin的暴露后，Fab25完整性的影响。Fab25中的CDR-H3环含有能够被hepsin潜在切割的三个赖氨酸和一个精氨酸残基，但是在pH6.0或pH 8.0温育24小时后没有观察到hepsin对Fab25的蛋白水解加工。通过4-20%(w/v)聚丙烯酰胺梯度凝胶上的凝胶泳动率变动来监测蛋白水解，并用考马斯亮蓝染色。
图15：Fab25对DU145细胞的层粘连蛋白依赖性迁移的抑制。A.将无血清Dulbecco氏改良Eagle氏培养基中的DU145细胞(2x104)添加至fluoroblok插件经预处理的上室，并允许于37°C迁移5小时。温育后，清洗非迁移细胞和培养基，并将那些迁移至滤器底部的细胞固定、用YO-PRO-I染色、并使用倒置显微镜成像。对固定有细胞的经预处理的滤器（层粘连蛋白、与hepsin共温育的层粘连蛋白、与hepsin:Fab25复合物共温育的层粘连蛋白或PBS对照）采集代表性图像。B.来自用YO-PRO底物染色的细胞的相对荧光单位(R.F.U)的测量，它们减去了参照PBS孔。用经hepsin加工的层粘连蛋白处理的DU145细胞具有与用层粘连蛋白单独处理的细胞相比显著升高的迁移。Fab25存在下hepsin对层粘连蛋白的加工缺失使得DU145迁移降低。
图16：A.LnCap-34细胞中细胞表面表达的hepsin对MSP原的活化。将稳定过表达hepsin的LnCap-34细胞血清饥饿并用125I-MSP原单独或与不同抑制剂组合处理3小时。重组hepsin(10nM)用作阳性对照。在3小时后观察到MSP原加工与实验起点相比的显著升高。抑制剂KQLR(SEQ ID NO:12)、KD1和抗hepsin抗体Fab25有效阻断MSP原的活化。B.LnCap-34细胞中细胞表面表达的hepsin对HGF原的活化。将LnCap-34细胞在不同浓度的Fab25(20nM–0.15nM)存在下用125I-HGF原处理并温育3小时。重组hepsin(10nM)用作阳性对照。在3小时后观察到HGF原加工与实验起点相比的显著升高。抗hepsin抗体Fab25以浓度依赖性方式有效阻断HGF原的活化。
图17：A.使用表面等离振子共振来测量Ab25对活性人hepsin的结合亲和力。对捕捉有Ab25的CM5生物传感器芯片注射hepsin的连续稀释液(0.39nM至200nM)注射3分钟，并监测解离15分钟。实验数据的拟合给出平衡解离常数速率(KD)10.6nM。B.因为Ab25对hepsin原的结合展现出快速的动力学，所以通过稳态亲和力测量法测量结合亲和力。对捕捉有Ab25的CM5生物传感器芯片注射hepsin原的连续稀释液(195nM至80μM)2分钟。通过稳态分析自Req针对hepsin原浓度的曲线图确定平衡解离速率(KD=5.52μM)。
图18：Fab25结合活性hepsin的等温滴定测热实验。结合反应是放热的，而且结合的化学计量为1∶1，如预测的。来自ITC的解离常数(KD)为6.1nM，与先前来自BIAcore的数据相关性极好。结合的焓(ΔH)和熵(TΔS)为-27.5kcal/mol和-16.3kcal/mol，显示了该结合是焓驱动的，具有不利的熵。
发明详述
本文中的发明提供了抗hepsin抗体，其对于例如与hepsin的表达和/或活性（诸如升高的表达和/或活性或不想要的表达和/或活性）有关的疾病状态的治疗或预防是有用的。在有些实施方案中，本发明的抗体用于治疗肿瘤、癌症、和/或细胞增殖性病症。
在另一个方面，本发明的抗hepsin抗体作为用于hepsin的检测和/或分离，诸如各种组织和细胞类型中hepsin的检测的试剂找到了效用。
本发明进一步提供了制备和使用抗hepsin抗体的方法，及编码抗hepsin抗体的多核苷酸。
通用技术
本文中描述或提到的技术和规程一般得到了本领域技术人员的充分理解，而且通常利用常规方法得以采用，诸如例如下列文献中记载的广泛应用的方法：Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3rd.edition(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel,et al.eds.,(2003))；丛书METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press,Inc.):PCR2:A PRACTICAL APPROACH(M.J.MacPherson,B.D.Hames and G.R.Taylor eds.(1995))；Harlow and Lane,eds.(1988)ANTIBODIES,ALABORATORY MANUAL；及ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney,ed.(1987))。
定义
“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)根据Lowry法的测定，抗体重量超过95%，最优选重量超过99%，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）及使用Coomassie蓝或优选的银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
“分离的”核酸分子指已经鉴定且与核酸的天然来源中通常与之关联的至少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。分离的核酸分子不同于在自然界中发现它时的形式或背景。分离的核酸分子因此与存在于天然细胞中时的核酸分子有区别。然而，分离的核酸分子包括通常表达该核酸（例如抗体编码核酸）的细胞中所包含的核酸分子，例如当所述核酸分子在所述细胞中的染色体定位不同于它在天然细胞中的染色体定位时。
术语“依照Kabat的可变域残基编号方式”或“依照Kabat的氨基酸位置编号方式”及其变体指Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)中的抗体编辑用于重链可变域或轻链可变域的编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨基酸，对应于可变域FR或CDR的缩短或插入。例如，重链可变域可包含H2残基52后的单一氨基酸插入（依照Kabat为残基52a）及重链FR残基82后的插入残基（例如依照Kabat为残基82a、82b和82c等）。给定抗体的Kabat残基编号方式可通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列比对同源区来确定。
短语“基本上相似”或“基本上相同”在用于本文时表示两个数值（通常一个涉及本发明的抗体而另一个涉及参照/比较抗体）之间足够高的相似程度，以致本领域技术人员将认为在用所述数值（例如Kd值）所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有很小的或没有生物学和/或统计学显著性。作为参照/比较抗体该数值的函数，所述两个数值之间的差异优选小于约50%、优选小于约40%、优选小于约30%、优选小于约20%、或优选小于约10%。
“结合亲和力”通常指分子（例如抗体）的单一结合位点与其结合配偶体（例如抗原）之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员（例如抗体与抗原）之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。希望Kd是1x10-7、1x10-8、5x10-8、1x10-9、3x10-9、5x10-9、或甚至1x10-10或更强。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的那些。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原且趋于容易解离，而高亲和力抗体通常更快速地结合抗原且趋于保持更长时间的结合。本领域知道测量结合亲和力的多种方法，其中任一种都可用于本发明的目的。下文描述了具体的示例性实施方案。
在一个实施方案中，依照本发明的“Kd”或“Kd值”是通过如下测定法所述使用Fab型式的感兴趣抗体及其抗原进行的放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量的：通过在存在未标记抗原的滴定系列的条件下，用最小浓度的125I标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的平板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(Chen等, J Mol Biol 293:865-881(1999))。为了确定测定条件，用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)包被微量滴定板(Dynex)过夜，随后用PBS中的2%(w/v)牛血清白蛋白在室温（约23°C）封闭2-5小时。在非吸附平板(Nunc #269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与连续稀释的感兴趣Fab混合（例如与Presta等,Cancer Res.57:4593-4599(1997)中抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致）。然后将感兴趣Fab保温过夜；不过，保温可持续更长时间（例如65个小时）以保证达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板以进行室温保温（例如1小时）。然后除去溶液，并用含0.1% Tween-20的PBS洗板8次。平板干燥后，加入150μl/孔闪烁液(MicroScint-20;Packard)，然后在Topcount伽马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20%的浓度用于竞争性结合测定法。依照另一实施方案，Kd或Kd值是通过表面等离振子共振测定法使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在25°C使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,BIAcoreInc.)。用10mM乙酸钠pH 4.8将抗原稀释至5μg/ml（约0.2μM），然后以5μl/分钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25°C以约25μl/分钟的流速注入在含0.05% Tween 20的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab（0.78nM至500nM）。在一些实施方案中，对表面等离振子共振测定法使用下述修改：将抗体固定化至CM5生物传感器芯片以实现大约400RU，并为了动力学测量，以约30ul/min的流速注射靶蛋白（例如hepsin-IIIb或-IIIc）在25°C的PBST缓冲液中的两倍连续稀释液（始于67nM）。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcore Evaluation Software 3.2版)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以比率koff/kon计算。参见例如Chen,Y.等,J Mol Biol 293:865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过106 M-1 S-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(a stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)或8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS,pH 7.2中的20nM抗抗原抗体（Fab形式）在25°C的荧光发射强度（激发=295nm；发射=340nm，16nm带通）的升高或降低。
依照本发明的“结合速率”（on-rate,rate of association,association rate）或“kon”也可通过上文所述相同的表面等离振子共振技术使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在25°C使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)来测定。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,BIAcore Inc.)。用10mM乙酸钠pH 4.8将抗原稀释至5μg/ml（约0.2μM），然后以5μl/分钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25°C以约25μl/分钟的流速注入在含0.05%Tween 20的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab（0.78nM至500nM）。在一些实施方案中，对表面等离振子共振测定法使用下述修改：将抗体固定化至CM5生物传感器芯片以实现大约400RU，并为了动力学测量，以约30ul/min的流速注射靶蛋白（例如hepsin-IIIb或-IIIc）在25°C的PBST缓冲液中的两倍连续稀释液（始于67nM）。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcoreEvaluation Software 3.2版)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以比率koff/kon计算。参见例如Chen,Y.等,J Mol Biol 293:865-881(1999)。然而，如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过106 M-1 S-1，那么结合速率优选使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS,pH 7.2中的20nM抗抗原抗体（Fab形式）在25°C的荧光发射强度（激发=295nm；发射=340nm，16nm带通）的升高或降低。
术语“载体”在用于本文时意指能够运输与其连接的其它核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，指其中可连接另外的DNA区段的环状双链DNA环。另一类载体是噬菌体载体。另一类载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在其所导入的宿主细胞中自主复制（例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体）。其它载体（例如非附加型哺乳动物载体）可在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，由此随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”（或简称为“重组载体”）。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体常常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。
“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物，或者是可通过DNA或RNA聚合酶或者通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含经过修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。如果有的话，对核苷酸结构的修饰可以在装配聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以由非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在合成后进一步修饰，诸如通过与标记物偶联。其它类型的修饰包括例如“帽”，将一个或多个天然存在的核苷酸用类似物替代，核苷酸间修饰诸如例如具有不带电荷连接（例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等）和具有带电荷连接（例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等）的修饰，含有悬垂模块(pendant moiety)诸如例如蛋白质（例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等）的修饰、具有嵌入剂（例如吖啶、补骨脂素等）的修饰、含有螯合剂（例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等）的修饰、含有烷化剂的修饰、具有经修饰连接（例如α端基异构核酸(anomericnucleic acid)等）的修饰、以及未修饰形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖类中的任何羟基可以用例如膦酸(phosphonate)基团、磷酸(phosphate)基团替换，用标准保护基团保护，或活化以制备与别的核苷酸的别的连接，或者可偶联至固体或半固体支持物。5'和3'末端OH可磷酸化或者用胺或1-20个碳原子的有机加帽基团模块取代。其它羟基也可衍生成标准保护基团。多核苷酸还可含有本领域普遍知道的核糖或脱氧核糖糖类的类似物形式，包括例如2'-氧-甲基、2'-氧-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮-核糖，碳环糖类似物，α-端基异构糖，差向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，无环类似物及脱碱基核苷类似物诸如甲基核糖核苷。可用备选连接基团替换一个或多个磷酸二酯连接。这些备选连接基团包括但不限于以下实施方案，其中磷酸酯用P(O)S（“硫代酸酯”(thioate)）、P(S)S（“二硫代酸酯”(dithioate)）、(O)NR2（“酰胺酯”(amidate)）、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2（“甲缩醛”(formacetal)）替代，其中R或R'各自独立为H或者取代的或未取代的烃基（1-20个C），任选含有醚(-O-)连接、芳基、烯基、环烃基、环烯基或芳烃基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。前述描述适用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
“寡核苷酸”在用于本文时一般指短的多核苷酸，一般是单链，一般是合成的，长度一般但不是必需小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”与“多核苷酸”并不互相排斥。上文关于多核苷酸的描述同样且完全适用于寡核苷酸。
关于肽或多肽序列的“百分比(%)氨基酸序列同一性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的比对可以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于测量比对的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大比对所需的任何算法。然而，为了本发明的目的，%氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2获得的，其中下文表A中提供了ALIGN-2程序的完整源代码。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(US Copyright Office,Washington D.C.,20559)，并以美国版权注册号TXU510087注册。公众可通过Genentech公司(South San Francisco,California)得到ALIGN-2程序，或者可以自例如WO2007/001851中提供的源代码来汇编。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统，优选数码UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性（或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一%氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A）如下计算：
分数X/Y 乘 100
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的%氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的%氨基酸序列同一性。
在一些实施方案中，两种或更多种氨基酸序列是至少50%、60%、70%、80%、或90%相同的。在一些实施方案中，两种或更多种氨基酸序列是至少95%、97%、98%、99%、或甚至100%相同的。除非另有具体说明，本文中所使用的所有%氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。
如本文中所使用的，除非另有明确的或上下文说明，术语“hepsin”指任何天然的或变异的hepsin多肽。术语“天然序列”明确涵盖天然存在的截短形式（例如胞外结构域序列或跨膜亚基序列)、天然存在的变体形式（例如可变剪接形式）和天然存在的等位变体。术语“野生型hepsin”通常指包含天然存在hepsin蛋白质的氨基酸序列的多肽。术语“野生型hepsin序列”通常指在天然存在hepsin中找到的氨基酸序列。在一个实施方案中，天然序列hepsin多肽包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列（见图7）。在一些实施方案中，天然序列hepsin多肽包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列（见图8）。
“hepsin多肽变体”或其变异意指与本文中所公开的天然序列hepsin多肽序列具有至少约80%氨基酸序列同一性的hepsin多肽，一般是本文中所定义的活性hepsin多肽。此类hepsin多肽变体包括例如在天然氨基酸序列的N-或C-末端添加或删除一个或多个氨基酸残基的hepsin多肽。通常，hepsin多肽变体与本文中所公开的天然序列hepsin多肽序列具有至少约80%的氨基酸序列同一性，或者至少约81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性。通常，hepsin变异多肽的长度为至少约10个氨基酸，或者长度为至少约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600个氨基酸，或更多。任选的是，hepsin变异多肽与天然hepsin多肽序列相比具有不超过一处保守氨基酸替代，或者与天然hepsin多肽序列相比具有不超过2、3、4、5、6、7、8、9或10处保守氨基酸替代。
“酪氨酸激酶抑制剂”指一定程度抑制酪氨酸激酶（诸如hepsin受体）的酪氨酸激酶活性的分子。
“抑制”指与参照相比减小或降低活性、功能、和/或量。
蛋白质“表达”指基因中编码的信息转换成信使RNA(mRNA)，然后转换成蛋白质。
在本文中，“表达”感兴趣蛋白质（诸如hepsin）的样品或细胞指其中测定出存在编码该蛋白质的mRNA或蛋白质（包括其片段）的样品或细胞。
“免疫偶联物”（可互换地称作“抗体-药物偶联物”或“ADC”）指抗体偶联至一种或多种细胞毒剂，诸如化疗剂，药物，生长抑制剂，毒素（例如蛋白质毒素，细菌，真菌，植物，或动物起源的酶活性毒素，或其片段），或放射性同位素（即放射偶联物）。
“阻断性”抗体或抗体“拮抗剂”指抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性的抗体。优选的阻断性抗体或拮抗性抗体完全抑制抗原的生物学活性。
“裸抗体（裸露的抗体）”指未偶联异源分子诸如细胞毒性模块或放射性标记物的抗体。
具有指定抗体的“生物学特征”的抗体指拥有该指定抗体区别于其它结合相同抗原的抗体的一项或多项生物学特征的抗体。
为了筛选结合抗原上感兴趣抗体所结合的表位的抗体，可以实施常规交叉阻断测定法，诸如Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,Ed Harlow and David Lane(1988)中所记载的。
为了延长包含本发明氨基酸序列的抗体或多肽的半衰期，可如例如美国专利No.5,739,277中所记载的将补救受体结合表位附着于抗体（尤其是抗体片段）。例如，可以将编码补救受体结合表位的核酸分子与编码本发明多肽序列的核酸在同一读码框内相连接，使得由改造后的核酸分子编码的融合蛋白包含补救受体结合表位和本发明的多肽序列。在用于本文时，术语“补救受体结合表位”指IgG分子（例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4）的Fc区中负责延长IgG分子体内血清半衰期的表位(例如Ghetie et al.,Ann.Rev.Immunol.18:739-766(2000),表1)。其Fc区中有替代且血清半衰期延长的抗体还记载于WO00/42072；WO 02/060919；Shields et al.,J.Biol.Chem.276:6591-6604(2001)；Hinton,J.Biol.Chem.279:6213-6216(2004))。在另一个实施方案中，还可以通过例如附着其它多肽序列来延长血清半衰期。例如，可以将在本发明的方法中有用的抗体或其它多肽附着于血清清蛋白或血清清蛋白中结合FcRn受体或血清清蛋白结合肽的那部分，使得血清清蛋白结合该抗体或多肽，例如此类多肽序列披露于WO01/45746。在一个优选的实施方案中，待附着的血清清蛋白肽包含氨基酸序列DICLPRWGCLW(SEQ ID NO:13)。在另一个实施方案中，Fab的半衰期通过这些方法得到了延长。血清清蛋白结合肽序列还可参见Dennis et al.,J.Biol.Chem.277:35035-35043(2002)。
“片段”指多肽和核酸分子的一部分，其优选含有参比核酸分子或多肽全长的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、或更多。所述片段可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100、200、300、400、500、600、或更多个核苷酸，或者10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、190、200或更多个氨基酸。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”以最广义互换使用，包括单克隆抗体（例如全长或完整单克隆抗体）、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体（例如双特异性抗体，只要它们展现出期望的生物学活性），而且还可以包括某些抗体片段（如本文中更为详细描述的）。抗体可以是人的、人源化的和/或亲和力成熟的。
术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体序列间差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作互补决定区(CDR)或高变区的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个CDR连接。每条链中的CDR通过FR非常接近地保持在一起，并与另一条链的CDR一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,National Institute of Health,Bethesda,MD.(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞的（细胞）毒性中抗体的参与。
用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有一个抗原结合位点，及剩余的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab′)2片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。
“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。在双链Fv种类中，此区由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv种类中，一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽接头共价相连，使得轻链和重链能在与双链Fv种类类似的“二聚体”结构中相结合。正是在这种构造中，各可变域的三个CDR相互作用而在VH-VL二聚体表面上确定了抗原结合位点。六个CDR共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域（或只包含对抗原特异的三个CDR的半个Fv）也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。
Fab片段还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab'的称谓。F(ab')2抗体片段最初是作为在Fab'片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab'片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联。
根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体（免疫球蛋白）的“轻链”可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
根据其重链恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类。免疫球蛋白有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类（同种型），例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。将与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的。“抗体片段”只包含完整抗体的一部分，其中所述部分优选保留该部分存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项、优选大多数或所有功能。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点，如此保留结合抗原的能力。在另一个实施方案中，抗体片段，例如包含Fc区的抗体片段，保留与Fc区存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项生物学功能，诸如FcRn结合、抗体半衰期调控、ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体片段是体内半衰期与完整抗体基本上相似的单价抗体。例如，这样的抗体片段可包含一个抗原结合臂且其与能够赋予该片段以体内稳定性的Fc序列相连。
术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个高变区：三个在VH中（H1、H2、H3），三个在VL中（L1、L2、L3）。本文中使用且涵盖许多高变区的叙述。Kabat互补决定区(CDR)是以序列变异性为基础的，而且是最常用的(Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。Chothia改为指结构环的位置(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM高变区代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触(contact)”高变区是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些高变区中每一个的残基。
高变区可包括如下“延伸的高变区”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97(L3)及VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变区残基是依照Kabat等,见上文编号的。
“框架”或“FR”残基指可变域中除本文中所定义的高变区残基外的那些残基。
非人（例如鼠）抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白（受体抗体）中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种（供体抗体）诸如小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones等,Nature 321:522-525(1986);Riechmann等,Nature 332:323-329(1988);Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还可参见以下综述及其引用的参考文献：Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy，Asthma & Immunol.1:105-115(1998);Harris,Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995);Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)。
“嵌合”抗体（免疫球蛋白）中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567;Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。本文中所使用的人源化抗体是嵌合抗体的一个子集。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。一般而言，scFv多肽在VH与VL结构域之间还包含多肽接头，使得scFv能够形成结合抗原所需的结构。关于scFv的综述参见Pluckthun,在Rosenburg和Moore编的《The Pharmacology of MonoclonalAntibodies》第113卷中,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。
“抗原”指抗体可选择性结合的预定抗原。靶抗原可以是多肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其它天然存在的或合成的化合物。优选地，靶抗原是多肽。
术语“双抗体(diabody)”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链（VH-VL）中包含相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的记载于例如EP 404,097;WO 93/11161;及Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)。
“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个CDR中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。优选的亲和力成熟的抗体将具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知规程来生成。Marks等,Bio/Technology 10:779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了CDR和/或框架残基的随机诱变：Barbas等,PNAS(USA)91:3809-3813(1994);Schier等,Gene 169:147-155(1995);Yelton等,J.Immunol.155:1994-2004(1995);Jackson等,J.Immunol.154(7):3310-9(1995);及Hawkins等,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。
抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区（天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区）且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体（例如B细胞受体）下调；和B细胞活化。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。该抗体“武装”(arm)细胞毒性细胞，而且是此类杀伤作用绝对要求的。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337或Presta美国专利No.6,737,056中所记载的。可用于此类测定法的有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中所披露的。
“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。优选的是，该细胞至少表达FcγRIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从其天然来源例如血液分离。
“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在其胞质结构域中。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见综述Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR的综述参见Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)；Capel等，Immunomethods 4：25-34(1994)；deHaas等，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括那些未来将会鉴定的。该术语还包括新生儿受体，FcRn，它负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer等，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等，J.Immunol.24：249(1994))并调节免疫球蛋白的稳态。WO 00/42072(Presta)记载了对FcR的结合提高或降低的抗体变体。在此明确收入该专利出版物的内容作为参考。还可参见Shields等,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。
测量对FcRn的结合的方法是已知的(参见例如Ghetie 1997,Hinton 2004)。可测定人FcRn高亲和力结合多肽与人FcRn的体内结合和血清半衰期，例如在表达人FcRn的转基因小鼠或经转染的人细胞系中，或者在施用了Fc变体多肽的灵长类动物中。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时对靶细胞的溶解。经典补体途径的激活是由补体系统第一组分(C1q)结合其关联抗原所结合的抗体（适宜亚类的）起始的。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所记载的。
具有更改的Fc区氨基酸序列及提高或降低的C1q结合能力的多肽变体记载于美国专利No.6,194,551B1和WO 99/51642。在此明确收入那些专利出版物的内容作为参考。还可参见Idusogie等,J.Immunol.164:4178-4184(2000)。
术语“含Fc区多肽”指包含Fc区的多肽，诸如抗体或免疫粘附素。Fc区的C-末端赖氨酸（依照EU编号系统的残基447）可以消除，例如在纯化多肽的过程中或者通过重组改造编码多肽的核酸。因此，依照本发明包含具有Fc区的多肽的组合物可包含具有K447的多肽、消除了所有K447的多肽、或具有与没有K447残基的多肽的混合物。
就本文目的而言，“受体人框架”是包含衍生自人免疫球蛋白框架或人共有框架的VL或VH框架之氨基酸序列的框架。“衍生自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含与之相同的氨基酸序列，或者可包含预先存在的氨基酸序列变化。当存在预先存在的氨基酸变化时，优选存在不超过5个，优选4个或更少，或者3个或更少预先存在的氨基酸变化。当VH中存在预先存在的氨基酸变化时，优选那些变化只位于71H、73H和78H中的三个、两个、或一个位置；例如，位于那些位置的氨基酸残基可以是71A、73T、和/或78A。在一个实施方案中，VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常见的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列亚组。通常，序列亚组是如Kabat等的亚组。在一个实施方案中，对于VL，所述亚组是如Kabat等的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，所述亚组是如Kabat等的亚组III。
“VH亚组III共有框架”包含从Kabat等的可变重链亚组III中的氨基酸序列获得的共有序列。在一个实施方案中，VH亚组III共有框架氨基酸序列包含下列各序列的至少一部分或整个：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO:14)        -H1-
WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO:15)                    -H2-
RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC(SEQ ID NO:43)   -H3-
WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:16)。
“VL亚组I共有框架”包含从Kabat等的可变轻链κ亚组I中的氨基酸序列获得的共有序列。在一个实施方案中，VL亚组I共有框架氨基酸序列包含下列各序列的至少一部分或整个：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)             -L1-
WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)                     -L2-
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:19)    -L3-
FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)。
在用于本文时，“抗体突变体”或“抗体变体”指抗体的氨基酸序列变体，其中物种依赖性抗体的一个或多个氨基酸残基发生了修饰。此类突变体与物种依赖性抗体必然具有小于100%的序列同一性或相似性。在一个的实施方案中，抗体突变体所具有的氨基酸序列与物种依赖性抗体的重链或轻链可变域的氨基酸序列具有至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、更优选至少90%、最优选至少95%的氨基酸序列同一性或相似性。关于此序列的同一性或相似性在本文中定义为在比对序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，候选序列中与物种依赖性抗体残基相同（即相同残基）或相似（即根据共同侧链特性来自同一组的氨基酸残基，见下文）的氨基酸残基的百分比。N-末端、C-末端、或对可变域（区）之外的抗体序列内部的延伸、删除、或插入都不应视为影响序列同一性或相似性。
“病症”或“疾病”指任何会受益于本发明的物质/分子或方法的治疗的疾患。这包括慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳动物倾向于所讨论病症的病理状况。本文中待治疗的病症的非限制性例子包括恶性和良性肿瘤；癌瘤、母细胞瘤和肉瘤。
“处理”和“治疗”(treatment)指治疗性处理和预防性措施二者。需要治疗的受试者包括那些早就患有良性、癌前、或非转移性肿瘤的以及要预防发生或复发的。
术语“治疗有效量”指在哺乳动物中治疗或预防疾病或病症的治疗剂量。在癌症的情况中，治疗有效量的治疗剂可减少癌细胞的数目；缩小原发性肿瘤的尺寸；抑制（即一定程度的减缓，优选阻止）癌细胞浸润入周围器官；抑制（即一定程度的减缓，优选阻止）肿瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；和/或一定程度的减轻一种或多种与病症有关的症状。根据药物可阻止现有癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度，它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。对于癌症疗法，体内功效可以通过例如评估存活持续时间、距疾病进展的时间(TTP)、响应率(RR)、响应持续时间、和/或生活质量来测量。
术语“癌（症）”和“癌（性）的”指向或描述哺乳动物中典型的以不受调节的细胞生长为特征的生理疾患。此定义中包括良性和恶性癌症。“早期癌症”或“早期肿瘤”指非侵入性的或转移性的，或者归为0期、I期、或II期癌症的癌症。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤（包括髓母细胞瘤和视网膜母细胞瘤）、肉瘤（包括脂肪肉瘤和滑膜细胞肉瘤）、神经内分泌肿瘤（包括类癌瘤、胃泌素瘤和胰岛细胞癌）、间皮瘤、施旺氏细胞瘤（包括听神经瘤）、脑膜瘤、腺癌、黑素瘤、和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌（例如上皮鳞状细胞癌）、肺癌包括小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺的腺癌和肺的鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric or stomach cancer)包括胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer or hepatic carcinoma)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌（包括转移性乳腺癌）、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney or renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食道癌、胆管肿瘤、及头和颈癌和多发性骨髓瘤。
术语“癌前”指典型地在癌之前或发展成癌的疾患或生长。“癌前”生长会具有以异常细胞周期调节、增殖、或分化为特征的细胞，这些可通过细胞周期调节、细胞增殖、或分化的标志物来测定。
“发育异常”指组织、器官、或细胞的任何异常生长或发育。优选的是，发育异常是高级的或癌前的。
“转移”指癌自其原发部位传播至身体中的其它位置。癌细胞能脱离原发性肿瘤，渗透入淋巴和血管，经由血流而循环和在身体中其它地方的正常组织中的远端病灶（转移）中生长。转移可以是当地的或远端的。转移是一个连续过程，视肿瘤细胞自原发性肿瘤脱落、经由血流而传播、并在远端部位停止而定。在新的部位，该细胞建立血供且能生长至形成危及生命的团块。
肿瘤细胞内的刺激性和抑制性分子途径调节这种行为，而且肿瘤细胞与远端部位中的宿主细胞之间的相互作用也是重要的。
“非转移的”指良性的或保留在原发部位且尚未渗透入淋巴或血管系统或渗透至原发部位以外的组织的癌症。一般而言，非转移性癌症指作为0期、I期、或II期癌症和偶尔的III期癌症的任何癌症。
“原发性肿瘤”或“原发性癌”指初始的癌症，而不是位于受试者身体中另一组织、器官、或位置中的转移病灶。
“良性肿瘤”或“良性癌”指仍然局限于起源部位且没有能力渗透、侵入、或转移至远端部位的肿瘤。
“肿瘤载荷”指身体中癌细胞的数目、肿瘤的尺寸、或癌的量。肿瘤载荷也称作肿瘤负荷。
“肿瘤数目”指肿瘤的数目。
“受试者”指哺乳动物，包括但不限于人或非人哺乳动物，诸如牛，马，犬，绵羊，或猫。优选地，受试者是人。
术语“抗癌疗法”指在治疗癌症中有用的疗法。抗癌治疗剂的例子包括但不限于例如化疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂、放射疗法中所使用的药剂、抗血管发生剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂、和其它治疗癌症的药剂，抗CD20抗体、血小板衍生生长因子抑制剂（例如GleevecTM(Imatinib Mesylate)）、COX-2抑制剂（例如celecoxib）、干扰素、细胞因子、结合一种或多种以下靶物的拮抗剂（例如中和性抗体）（ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA或VEGF受体、TRAIL/Apo2）、和其它生物活性和有机化学剂，等。本发明还包括它们的组合。
术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素（例如I131、I125、Y90和Re186）、化疗剂、和毒素诸如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素或其片段。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenins)（尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone)）；喜树碱(camptothecin)（包括合成类似物托泊替康(topotecan)）；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065（包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物）；隐藻素类(cryptophycins)（特别是隐藻素1和隐藻素8）；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin（包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1）；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)（例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Agnew(1994)Chem.Intl.Ed.Engl.33:183-186)；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团）、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)（包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星）、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)（尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin)）；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇类(taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、ABRAXANETM不含克列莫佛(Cremophor)、清蛋白改造纳米颗粒剂型帕利他塞(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Illinois)和多西他塞(doxetaxel)(Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂(platinum)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊本膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(Camptosar,CPT-11)（包括伊立替康及5-FU和亚叶酸的治疗方案）；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸类(retinoids)，诸如视黄酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)；考布他汀(combretastatin)；VELCADE bortezomib；REVLIMIDlenalidomide；亚叶酸(leucovorin)(LV)；奥沙利铂(oxaliplatin)，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR(例如Erlotinib(TarcevaTM))和VEGF-A的、降低细胞增殖的抑制剂；及任何上述物质的药剂学可接受的盐、酸或衍生物。
该定义还包括作用于调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂诸如抗雌激素类和选择性雌激素受体调控物类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)（包括他莫昔芬）、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)；抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)、依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、伏罗唑(vorozole)、来曲唑(letrozole)和阿那曲唑(anastrozole)；抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)、和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)（1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物）；反义寡核苷酸，特别是抑制涉及异常(abherant)细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf和H-Ras；核酶，诸如VEGF表达抑制剂（例如核酸）和HER2表达抑制剂；疫苗，诸如基因疗法疫苗，例如疫苗、疫苗和疫苗；rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂；rmRH；长春瑞滨(Vinorelbine)和埃斯波霉素(Esperamicins)(见美国专利No.4,675,187)；及任何上述物质的药剂学可接受的盐、酸或衍生物。
术语“前体药物”在用于本申请时指与母药(parent drug)相比对肿瘤细胞的细胞毒性较小并能够酶促活化或转变为更具活性母药形式的药用活性物质的前体和衍生物形式。参见例如Wilman,“Prodrugs in CancerChemotherapy”,Biochemical Society Transactions,14,pp.375-382,615thMeeting Belfast(1986)和Stella et al.,“Prodrugs:A Chemical Approach toTargeted Drug Delivery”,Directed Drug Delivery,Borchardt et al.,(ed.),pp.247-267,Humana Press(1985)。本发明的前体药物包括但不限于含磷酸盐/酯前体药物、含硫代磷酸盐/酯前体药物、含硫酸盐/酯前体药物、含肽前体药物、D-氨基酸修饰前体药物、糖基化前体药物、含β-内酰胺前体药物、含任选取代苯氧基乙酰胺的前体药物或含任选取代苯乙酰胺的前体药物、可转化为更具活性而无细胞毒性的药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前体药物。可衍生为本发明使用的前体药物形式的细胞毒性药物的例子包括但不限于上文描述的那些化疗剂。
“放射疗法”或“放疗”指使用定向伽马射线或贝塔射线来诱发对细胞的足够损伤，以限制细胞正常发挥功能的能力或全然破坏细胞。应当领会，本领域知道许多方式来确定治疗的剂量和持续时间。典型的治疗作为一次施用来给予，而典型的剂量范围为每天10-200个单位（戈瑞(Gray)）。
“生物学样品”（可互换地称作“样品”或“组织或细胞样品”）涵盖自个体获得的且可用于诊断或监测测定法的多种样品类型。该定义涵盖血液和生物学起源的其它液体样品、固体组织样品诸如活检标本或组织培养物或自其衍生的细胞、及其后代。该定义还涵盖在获得它们后已经进行过操作的样品，诸如用试剂处理、增溶、或富集某些成分诸如蛋白质或多核苷酸、或为切片目的而埋藏在半固体或固体基质中。术语“生物学样品”涵盖临床样品，而且还包括培养中的细胞、细胞上清液、细胞溶胞物、血清、血浆、生物学流体、和组织样品。生物学样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊液、羊水、腹膜液、或间质液；来自妊娠或个体发育中任何时间的细胞。在有些实施方案中，生物学样品是自原发性或转移性肿瘤获得的。生物学样品可含有在自然界中不与该组织天然混和的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素、诸如此类。
为本发明目的，组织样品的“切片”指一块或一片组织样品，例如从组织样品上切下来的一薄片组织或细胞。应当了解，可以制作多片组织样品切片并依照本发明进行分析。在有些实施方案中，将组织样品的同一切片用于形态学和分子两个水平的分析或者针对蛋白质和核酸二者进行分析的方法。
术语“标记物”在用于本文时指与试剂诸如核酸探针或抗体直接或间接偶联或融合，以便于检测它所偶联或融合的试剂的化合物或组合物。标记物可以是自身可检测的（例如放射性同位素标记物或荧光标记物），或者在酶标记物的情况中，可催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。
本发明的组合物及其制备和使用方法
本发明涵盖组合物（包括药物组合物），其包含抗hepsin抗体；和包含编码抗hepsin抗体的序列的多核苷酸。如本文中所使用的，组合物包含一种或多种结合hepsin的抗体，和/或一种或多种包含编码一种或多种结合hepsin的抗体的序列的多核苷酸。这些组合物可进一步包含合适的载体，诸如药学可接受的赋形剂，包括缓冲剂，它们是本领域公知的。
本发明还涵盖分离的抗体和多核苷酸的实施方案。本发明还涵盖基本上纯的抗体和多核苷酸的实施方案。
本发明还涵盖使用抗hepsin抗体（如本文中描述的或如本领域已知的）治疗病症，例如前列腺癌的方法。
组合物
本发明的抗hepsin抗体优选是单克隆的。本发明的范围还涵盖本文中所提供的抗hepsin抗体的Fab、Fab'、Fab'-SH和F(ab')2片段。这些抗体片段可通过传统手段来制备，诸如酶促消化，或者可以通过重组技术来生成。此类抗体片段可以是嵌合的或人源化的。这些片段可用于下文所列的诊断和治疗目的。
单克隆抗体是由一群基本上同质的抗体获得的，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变。如此，修饰语“单克隆”指明抗体的特征，即不是不同抗体的混合物。
本发明的抗hepsin单克隆抗体可使用最初由Kohler等,Nature 256:495(1975)记载的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)来制备。
在杂交瘤方法中，免疫小鼠或其它适宜的宿主动物，诸如仓鼠，以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体会特异性结合用于免疫的蛋白质。hepsin的抗体可以通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射hepsin和佐剂来生成。hepsin可以使用本领域众所周知的方法来制备，其中有些方法在本文中有进一步描述。例如，人和小鼠hepsin的重组生产在下文中有描述。在一个实施方案中，将动物用融合至免疫球蛋白重链Fc部分的hepsin免疫。在一个优选的实施方案中，将动物用hepsin-IgG1融合蛋白免疫。通常将动物针对hepsin的免疫原性偶联物或衍生物和单磷酰脂质A(MPL)/二棒分枝菌酸海藻糖(trehalose dicrynomycolate,TDM)Ribi Immunochem.Research,Inc.,Hamilton,MT)进行免疫，将溶液皮内注射于多个部位。2周后，对动物进行加强免疫。7-14天后，对动物采血，并对血清测定抗hepsin滴度。对动物进行加强免疫，直到滴度达到平台(plateaus)。
或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后，使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding,MonoclonalAntibodies:Principles and Practice,pp.59-103,Academic Press,1986)。
将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，若亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型的将含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷（HAT培养基），这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。
优选的骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持所选抗体生成细胞稳定的高水平生成抗体、并对诸如HAT培养基的培养基敏感的。在这些细胞中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，诸如那些可从索尔克研究所细胞分配中心(SalkInstitute Cell Distribution Center,San Diego,California,USA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤及可从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection,Rockville,Maryland,USA)获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞所衍生的。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已描述用于生成人单克隆抗体(Kozbor,J.Immunol.133:3001(1984);Brodeur等,Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications,pp.51-63,Marcel Dekker,Inc.,NewYork,1987)。
可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养液测定针对hepsin的单克隆抗体的生成。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。
单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson等,Anal.Biochem.107:220(1980)的Scatchard分析来测定。
在鉴定得到生成具有期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，该克隆可通过有限稀释规程进行亚克隆并通过标准方法进行培养(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103,AcademicPress,1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养。
可通过常规免疫球蛋白纯化规程，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养液、腹水或血清适当分开。
本发明的抗hepsin抗体可以通过使用组合文库筛选具有期望活性的合成抗体克隆来制备。在原理上，通过筛选噬菌体文库来选择合成抗体克隆，所述噬菌体文库含有展示融合至噬菌体外壳蛋白的各种抗体可变区片段(Fv)的噬菌体。通过针对期望抗原的亲和层析淘选此类噬菌体文库。表达能够结合期望抗原的Fv片段的克隆被吸附至抗原，从而与文库中不结合的克隆分开。然后将结合的克隆从抗原上洗脱，而且可以通过额外的抗原吸附/洗脱循环进一步富集。本发明的任何抗hepsin抗体可以如下获得，即设计合适的抗原筛选规程来选择感兴趣的噬菌体克隆，接着使用来自感兴趣的噬菌体克隆的Fv序列和Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,NIHPublication 91-3242,Bethesda MD(1991),卷1-3中记载的合适的恒定区(Fc)序列构建全长抗hepsin抗体克隆。实施例中公开了用于生成抗hepsin抗体的一种例示性方法。
抗体的抗原结合域由两个约110个氨基酸的可变(V)区形成，分别来自重链(VL)和轻链(VH)，都呈现三个高变环或互补决定区(CDR)。可变域可以功能性的展示在噬菌体上，或是作为单链Fv(scFv)片段（其中VH和VL通过短的、柔性的肽共价相连），或者作为Fab片段（其中它们各自与恒定域融合且非共价相互作用），如Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)所述。在用于本文时，编码scFv的噬菌体克隆和编码Fab的噬菌体克隆统称为“Fv噬菌体克隆”或“Fv克隆”。
VH和VL基因的全集可以通过聚合酶链式反应(PCR)分开克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以搜索抗原结合克隆，如Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)所述。来自经免疫来源的文库能提供对免疫原有高亲和力的抗体，无需构建杂交瘤。或者，可以克隆未免疫的全集，用于为广泛的非自身的及自身的抗原提供单一人抗体来源，无需任何免疫，如Griffiths等,EMBO J,12:725-734(1993)所述。最后，未免疫的文库还可以以合成方式来构建，即从干细胞克隆未重排的V基因片段，使用包含随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。
通过与次要外壳蛋白pIII融合，使用丝状噬菌体来展示抗体片段。抗体片段可以展示为单链Fv片段，其中VH与VL结构域通过柔性多肽间隔物在同一多肽链上相连，例如如Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)所述，或者展示为Fab片段，其中一条链与pIII融合，而另一条链分泌到细菌宿主细胞周质中，在此装配Fab-外壳蛋白结构，其通过取代一些野生型外壳蛋白而展示在噬菌体表面上，例如如Hoogenboom等,Nucl.Acids Res.,19:4133-4137(1991)所述。
一般而言，从收获自人或动物的免疫细胞获得编码抗体基因片段的核酸。如果希望文库偏向抗hepsin克隆，那么可以给个体免疫hepsin以产生抗体应答，并回收脾细胞和/或循环B细胞或其它外周血淋巴细胞(PBL)用于文库构建。在一个优选的实施方案中，如下得到了偏向抗hepsin克隆的人抗体基因片段文库，即在携带功能性人免疫球蛋白基因阵列（且缺乏功能性内源抗体生成系统）的转基因小鼠中产生抗hepsin抗体应答，使得hepsin免疫产生生成针对hepsin的人抗体的B细胞。生成人抗体的转基因小鼠的产生在下文中有描述。
可以如下获得抗hepsin反应性细胞群的进一步富集，即使用合适的筛选规程来分离表达hepsin特异性膜结合抗体的B细胞，例如通过用hepsin亲和层析或者细胞对荧光染料标记的hepsin的吸附及后续的流动激活细胞分选(FACS)进行的细胞分离。
或者，来自未免疫供体的脾细胞和/或B细胞或其它PBL的使用提供了可能的抗体全集的更佳展现，而且还容许使用hepsin在其中没有抗原性的任何动物（人或非人的）物种构建抗体文库。为了体外掺入抗体基因的文库构建，从个体收获干细胞以提供编码未重排抗体基因区段的核酸。可以从多种动物物种（诸如人、小鼠、大鼠、兔类、luprine、犬、猫、猪、牛、马、和鸟类等）获得感兴趣的免疫细胞。
从感兴趣的细胞回收编码抗体可变基因区段（包括VH和VL区段）的核酸并扩增。就重排的VH和VL基因文库而言，可以如下获得所需DNA，即从淋巴细胞分离基因组DNA或mRNA，接着用与重排的VH和VL基因的5'和3'末端匹配的引物进行聚合酶链式反应(PCR)，如Orlandi等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:3833-3837(1989)所述，由此构建多样性V基因全集供表达。可以从cDNA和基因组DNA扩增V基因，反向引物位于编码成熟V结构域的外显子的5'末端，正向引物基于J区段内部，如Orlandi等(1989)和Ward等,Nature,341:544-546(1989)所述。然而，为了从cDNA进行扩增，反向引物还可基于前导外显子(leader exon)内，如Jones等,Biotechnol.,9:88-89(1991)所述，正向引物基于恒定区内，如Sastry等,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),86:5728-5732(1989)所述。为了使互补性最大化，引物中可以掺入简并性，如Orlandi等(1989)或Sastry等(1989)所述。优选的是，如下将文库多样性最大化，即使用靶向每个V基因家族的PCR引物来扩增免疫细胞核酸样品中存在的所有可获得的VH和VL排列，例如如Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)或Orum等,Nucleic Acids Res.,21:4491-4498(1993)的方法所述。为了将所扩增的DNA克隆到表达载体中，可以在PCR引物的一端引入罕见的限制性位点作为标签，如Orlandi等(1989)所述，或者用带标签的引物进行进一步的PCR扩增，如Clackson等,Nature,352:624-628(1991)所述。
人工合成的重排的V基因全集可以在体外从V基因区段衍生。大多数人VH基因区段已经克隆和测序(Tomlinson等,J.Mol.Biol.,227:776-798(1992))，并定位(Matsuda等,Nature Genet.,3:88-94(1993))；这些克隆的区段（包括H1和H2环的所有主要构型）可用于生成多样性VH基因全集，用到编码序列和长度多样性的H3环的PCR引物，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。VH全集还可如下生成，所有序列多样性集中于单一长度的长H3环，如Barbas等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4457-4461(1992)所述。人Vκ和Vλ区段已经克隆和测序(Williams和Winter,Eur.J.Immunol.,23:1456-1461(1993))，而且可用于生成合成的轻链全集。基于一系列VH和VL折叠及L3和H3长度的合成的V基因全集会编码具有可观结构多样性的抗体。扩增编码V基因的DNA后，依照Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)的方法，可以在体外重排种系V基因区段。
抗体片段全集可以如下构建，即以数种方式将VH与VL基因全集联合在一起。可以在不同载体中创建各个全集，并在体外重组载体，例如如Hogrefe等,Gene,128:119-126(1993)所述，或者在体内通过组合感染来重组载体，例如Waterhouse等,Nucl.Acids Res.,21:2265-2266(1993)中记载的loxP系统。体内重组方法利用Fab片段的双链性质来克服因大肠杆菌转化效率施加的库容量限制。分别克隆未免疫的VH和VL全集，一个克隆入噬菌粒，另一个克隆入噬菌体载体。然后通过用噬菌体感染含噬菌粒的细菌使得每个细胞包含不同的组合来联合两种文库，库容量只受细胞存在数的限制（约1012个克隆）。两种载体都包含体内重组信号，使得VH与VL基因重组到单一复制子上，并共包装成噬菌体病毒粒。这些巨型文库提供了大量的具有优良亲和力(Kd-1为约10-8M)的多样性抗体。
或者，可以将全集依次克隆入同一载体，例如如Barbas等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:7978-7982(1991)所述，或者通过PCR装配到一起，然后克隆，如Clackson等,Nature,352:624-628(1991)所述。PCR装配还可用于将VH和VL DNA与编码柔性肽间隔物的DNA连接以形成单链Fv(scFv)全集。在另一种技术中，“细胞内PCR装配”用于通过PCR在淋巴细胞内联合VH与VL基因，然后克隆所连接基因的全集，如Embleton等,Nucl.Acids Res.,20:3831-3837(1992)所述。
未免疫文库(naive library)（天然的或合成的）生成的抗体可具有中等亲和力（Kd-1为约106-107M-1），但还可以如下在体外模拟亲和力成熟，即构建和再次选择次生文库，如Winter等(1994),见上文所述。例如，在Hawkins等,J.Mol.Biol.,226:889-896(1992)的方法或Gram等,Proc.Natl.Acad.SciUSA,89:3576-3580(1992)的方法中，使用易错聚合酶在体外随机引入突变(Leung等,Technique,1:11-15(1989))。另外，可以通过随机突变一个或多个CDR来进行亲和力成熟，例如在选定的个别Fv克隆中使用携带跨越感兴趣CDR的随机序列的引物进行PCR并筛选更高亲和力的克隆。WO 96/07754(公布于1996年3月14日)记载了用于在免疫球蛋白轻链的互补决定区中诱导诱变以创建轻链基因文库的方法。另一种高效方法是将通过噬菌体展示选出的VH或VL结构域与得自未免疫供体的天然存在V结构域变体组合，并在数轮链重新改组中筛选更高亲和力，如Marks等,Biotechnol.,10:779-783(1992)所述。此技术容许生成亲和力在10-9M范围的抗体和抗体片段。
hepsin核酸和氨基酸序列是本领域已知的。可以使用想要的hepsin区的氨基酸序列来设计编码hepsin的核酸序列。正如本领域公知的，hepsin有两种主要剪接同种型(isoform)，hepsin IIIb和hepsin IIIc。hepsin序列是本领域公知的，而且可以包括图7和8所示序列。
编码hepsin的核酸可以通过本领域已知的多种方法来制备。这些方法包括但不限于通过Engels等,Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.,28:716-734(1989)中记载的任何方法，诸如三酯、亚磷酸酯、磷酰胺酯(phosphoramidite)和H-膦酸酯法进行的化学合成。在一个实施方案中，编码hepsin的DNA的设计中使用表达宿主细胞所优选的密码子。或者，编码hepsin的DNA可以从基因组或cDNA文库分离。
构建编码hepsin的DNA分子后，将该DNA分子与表达载体，诸如质粒中的表达控制序列可操作连接，其中所述控制序列受到该载体转化的宿主细胞的识别。一般而言，质粒载体包含复制和控制序列，其衍生自与宿主细胞相容的物种。载体通常携带复制位点，以及编码能够在转化细胞中提供表型选择的蛋白质的序列。适于在原核和真核宿主细胞中表达的载体是本领域已知的，有些在本文中有进一步描述。可以使用真核生物体，诸如酵母或衍生自多细胞生物体诸如哺乳动物的细胞。
任选的是，编码hepsin的DNA与分泌前导序列可操作连接，导致表达产物被宿主细胞分泌到培养基中。分泌前导序列的例子包括stII、ecotin、lamB、疱疹GD、lpp、碱性磷酸酶、转化酶、和α-因子。适用于此处的还有蛋白A的36个氨基酸的前导序列(Abrahmsen等,EMBO J.,4:3901(1985))。
宿主细胞用上文所述本发明的表达或克隆载体转染，优选转化，并在常规营养培养基中培养，培养基可以为了诱导启动子、选择转化子、或扩增编码期望序列的基因而适当修改。
转染指宿主细胞摄取表达载体，无论任何编码序列事实上是否表达。本领域普通技术人员知道许多转染方法，例如CaPO4沉淀和电穿孔。若宿主细胞内存在此载体运转的任何指示，则认为转染成功。用于转染的方法是本领域众所周知的，有些在本文中有进一步描述。
转化指将DNA导入生物体，使得DNA可进行复制，或是作为染色体外元件，或是通过染色体整合。根据所用宿主细胞，使用适于所述细胞的标准技术进行转化。用于转化的方法是本领域众所周知的，有些在本文中有进一步描述。
用于生成hepsin的原核宿主细胞可以如Sambrook等,见上文一般所述进行培养。
用于生成hepsin的哺乳动物宿主细胞可以在多种培养基中培养，所述培养基是本领域众所周知的，有些在本文中有描述。
本发明公开的宿主细胞涵盖体外培养物中的细胞以及宿主动物体内的细胞。
hepsin的纯化可以使用本领域公认的方法来实现，本文描述了其中一些。
纯化的hepsin可以附着于合适的基质，诸如琼脂糖珠、丙烯酰胺珠、玻璃珠、纤维素、各种丙烯酸共聚物、羟基甲基丙烯酸酯凝胶、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸共聚物、尼龙、中性和离子载体、诸如此类，用于噬菌体展示克隆的亲和层析分离。hepsin蛋白对基质的附着可以通过Methods inEnzymology,卷44(1976)中记载的方法来实现。将蛋白质配体附着于多糖基质，例如琼脂糖、右旋糖苷或纤维素的常用技术涉及用卤化氰活化载体，随后将肽配体的脂肪族伯胺或芳香族伯胺偶联至活化后的基质。
或者，hepsin可用于包被吸附板的孔，在附着至吸附板的宿主细胞上表达，或用于细胞分选，或者偶联至生物素以用链霉亲合素包被的珠捕捉，或者用于本领域已知的用于淘选噬菌体展示库的任何其它方法。
在适于至少部分噬菌体颗粒结合吸附剂的条件下，使噬菌体文库样品接触固定化的hepsin。正常情况下，选择包括pH、离子强度、温度等等的条件来模拟生理条件。对结合至固相的噬菌体进行清洗，然后用酸洗脱，例如如Barbas等,Proc.Natl.Acad.Sci USA,88:7978-7982(1991)所述，或者用碱洗脱，例如如Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)所述，或者通过hepsin抗原竞争洗脱，例如在与Clackson等,Nature,352:624-628(1991)的抗原竞争法类似的规程中。噬菌体在单轮选择中可以富集20-1,000倍。此外，富集的噬菌体可以在细菌培养物中进行培养，并进行更多轮选择。
选择的效率取决于许多因素，包括清洗过程中解离的动力学，及单个噬菌体上的多个抗体片段是否能同时结合抗原。具有较快解离动力学（和弱结合亲和力）的抗体可以通过使用短时间的清洗、多价噬菌体展示、及固相中的高抗原包被密度来保留。高密度不仅通过多价相互作用而稳定了噬菌体，而且有利于已解离的噬菌体的再结合。具有较慢解离动力学（和强结合亲和力）的抗体的选择可以通过使用长时间的清洗和单价噬菌体展示（如Bass等,Proteins,8:309-314(1990)和WO 92/09690所述）及低抗原包被密度（如Marks等,Biotechnol.,10:779-783(1992)所述）来促进。
有可能在对hepsin具有不同亲和力的噬菌体抗体之间进行选择，甚至是亲和力略有差异的。然而，选定抗体的随机突变（例如如有些上文所述亲和力成熟技术进行）有可能产生许多突变体，多数结合抗原，少数具有更高的亲和力。通过限制hepsin，罕见的高亲和力噬菌体能竞争胜出。为了保留所有较高亲和力的突变体，可以将噬菌体与过量的生物素化hepsin一起温育，但是生物素化hepsin的摩尔浓度低于hepsin的目标摩尔亲和常数。然后用链霉亲合素包被的顺磁珠捕捉高亲和力的结合噬菌体。此类“平衡捕捉”容许依照结合亲和力来选择抗体，其灵敏性容许从大大过量的低亲和力噬菌体中分离出亲和力只有原值2倍的突变体克隆。还可以操作清洗结合至固相的噬菌体的条件来进行基于解离动力学的区分。
hepsin克隆可以进行活性选择。对应于此类hepsin抗体的Fv克隆可以如下选择：(1)如上所述自噬菌体文库分离hepsin克隆，并任选通过在合适的细菌宿主中培养所述群体来扩增所分离的噬菌体克隆群体；(2)对想要阻断活性的hepsin和想要不阻断活性的第二蛋白质进行选择；(3)将抗hepsin噬菌体克隆吸附至固定化的hepsin；(4)使用过量的所述第二蛋白质洗脱任何不想要的克隆，它们识别与所述第二蛋白质的结合决定簇交叠或共享的hepsin结合决定簇；并(5)洗脱在步骤(4)后保持吸附的克隆。任选地，具有期望的阻断/不阻断特性的克隆可通过一次或多次重复本文所述选择规程来进一步富集。
本发明的编码杂交瘤衍生单克隆抗体或噬菌体展示Fv克隆的DNA易于使用常规规程分离和测序（例如通过使用设计成自杂交瘤或噬菌体DNA模板特异性扩增感兴趣的重链和轻链编码区的寡核苷酸引物）。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到原本不生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞中，诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得期望单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerra等,Curr.Opinion in Immunol.,5:256(1993)及Pluckthun,Immunol.Rev.,130:151(1992)。
本发明的编码Fv克隆的DNA可以联合编码重链和/或轻链恒定区的已知DNA序列（例如适宜的DNA序列可得自Kabat等,见上文）以形成编码全长或部分重链和/或轻链的克隆。应当领会，任何同种型的恒定区都可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，而且此类恒定区可以得自任何人或动物物种。衍生自一种动物（诸如人）物种的可变域DNA，然后与另一动物物种的恒定区DNA融合以形成“杂合的”全长重链和/或轻链的编码序列的Fv克隆包括在本文所用“嵌合”和“杂合”抗体的定义中。在一个优选的实施方案中，衍生自人可变DNA的Fv克隆与人恒定区DNA融合以形成完全人的、全长或部分重链和/或轻链的编码序列。
还可以修饰本发明的编码衍生自杂交瘤的抗hepsin抗体的DNA，例如通过替代，即用人重链和轻链恒定域的编码序列代替衍生自杂交瘤克隆的同源鼠序列(例如如Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)中的方法)。通过共价接合免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列，可以进一步修饰编码杂交瘤或Fv克隆衍生抗体或片段的DNA。可以以该方式制备具有本发明的Fv克隆或杂交瘤克隆衍生抗体的结合特异性的“嵌合”或“杂合”抗体。
抗体片段
本发明涵盖抗体片段。在某些情况中，使用抗体片段，而不是完整抗体有优势。片段的较小尺寸容许快速清除，而且可导致更易于接近实体瘤。
已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto等,Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24:107-117(1992);Brennan等,Science 229:81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。Fab、Fv和scFv抗体片段都可在大肠杆菌中表达及由大肠杆菌分泌，如此容许容易的生成大量的这些片段。可从上文讨论的噬菌体抗体库中分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab'-SH片段并化学偶联以形成F(ab')2片段(Carter等,Bio/Technology10:163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab')2片段。包含补救受体结合表位残基、具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段记载于美国专利No.5,869,046。用于生成抗体片段的其它技术对于熟练从业人员将是显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)(参见例如WO 93/16185;美国专利No.5,571,894;及5,587,458)。Fv和sFv是具有完整结合位点、缺少恒定区的唯一类型；如此，它们适于在体内使用时降低非特异性结合。可构建sFv融合蛋白以生成效应器蛋白质在sFv的氨基或羧基末端的融合物。参见Antibody Engineering,Borrebaeck编,见上文。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利No.5,641,870中所记载的。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
人源化抗体
本发明涵盖人源化抗体。本领域知道用于人源化非人抗体的多种方法。例如，人源化抗体可具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称为“输入”残基，它们通常取自“输入”可变域。基本上可遵循Winter及其同事的方法进行人源化（Jones等,Nature 321:522-525(1986);Riechmann等,Nature 332:323-327(1988);Verhoeyen等,Science 239:1534-1536(1988)），即用（非人）高变区序列替代人抗体的相应序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体（美国专利No.4,816,567），其中显著少于完整的人可变域用非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是如下人抗体，其中有些高变区残基和可能的有些FR残基用啮齿类抗体类似位点的残基替代。
用于制备人源化抗体的人轻链和重链可变域的选择对于降低抗原性是非常重要的。依照所谓的“最适(best-fit)”方法，用啮齿类抗体的可变域序列对已知人可变域序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架（Sims等,J.Immunol.151:2296(1993);Chothia等,J.Mol.Biol.196:901(1987)）。另一种方法使用由特定轻链或重链亚组(subgroup)的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。相同框架可用于数种不同的人源化抗体（Carter等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285(1992);Presta等,J.Immunol.151:2623(1993)）。
更为重要的是，抗体在人源化后保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学特性。为了达到此目的，依照一种方法，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。通常可获得免疫球蛋白三维模型，这是本领域技术人员所熟悉的。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。通过检查这些显示图像容许分析残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可以从受体序列和输入序列中选出FR残基并组合，从而得到期望的抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力升高。一般而言，高变区残基直接且最实质性地涉及对抗原结合的影响。
人抗体
本发明的人抗hepsin抗体可以通过如上所述联合选自人衍生噬菌体展示库的Fv克隆可变域序列与已知的人恒定域序列来构建。或者，可以通过杂交瘤方法来生成本发明的人单克隆抗hepsin抗体。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系已有记载，例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987);及Boerner等,J.Immunol.,147:86(1991)。
现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物（例如小鼠）。例如，已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因会导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993);Jakobovits等,Nature 362:255-258(1993);Bruggermann等,Year inImmunol.7:33(1993)。
基因改组也可用于自非人（例如啮齿类）抗体衍生人抗体，其中人抗体具有与起始非人抗体相似的亲和力和特异性。依照此方法，它也称为“表位印记”(epitope imprinting)，如上所述通过噬菌体展示技术得到的非人抗体片段的重链或轻链可变区用人V结构域基因全集替换，产生非人链/人链scFv或Fab嵌合物群。用抗原进行的选择导致非人链/人链嵌合scFv或Fab的分离，其中人链恢复了在一级噬菌体展示克隆中消除相应的非人链后遭到破坏的抗原结合位点，即表位决定（印记，imprint）人链配偶体的选择。在重复该过程以替换剩余非人链时，得到人抗体（参见PCT WO 93/06213，公布于1993年4月1日）。与传统的通过CDR移植进行的非人抗体的人源化不同，此技术提供完全人的抗体，它们不含非人起源的FR或CDR残基。
双特异性抗体
双特异性抗体指对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体，优选人抗体或人源化抗体。在本案中，结合特异性之一针对hepsin，另一结合特异性针对任何其它抗原。例示性的双特异性抗体可结合hepsin的两种不同表位。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位于表达hepsin的细胞。这些抗体拥有hepsin结合臂和结合细胞毒剂（例如肥皂草毒蛋白、抗干扰素-α、长春花生物碱类、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原）的臂。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段（例如F(ab')2双特异性抗体）。
用于构建双特异性抗体的方法是本领域已知的。在传统上，双特异性抗体的重组生产基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种重链具有不同的特异性(Millstein和Cuello,Nature 305:537(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤（四源杂交瘤(quadroma)）生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。类似的规程披露于WO 93/08829,公布于1993年5月13日及Traunecker等,EMBO J.10:3655(1991)。
依照一种不同且更优选的方法，将具有期望结合特异性（抗体-抗原结合位点）的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。优选的是，与包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定域进行融合。优选在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和，在需要时，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了极大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相等比例表达导致高产量时或在该比例没有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一个表达载体。
在该方法的一个优选实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对（提供第二结合特异性）构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了便利的分离途径，因此发现这种不对称结构便于将期望的双特异性复合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法披露于WO94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh等,Methodsin Enzymology 121:210(1986)。
依照另一种方法，可改造一对抗体分子间的界面，以将从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含至少部分抗体恒定域CH3结构域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链（例如酪氨酸或色氨酸）替换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链（例如丙氨酸或苏氨酸）替换，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。
双特异性抗体包括交联或“异源偶联”抗体。例如，异源偶联物中的一种抗体可与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体已经建议用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4,676,980)，及用于治疗HIV感染(WO 91/00360；WO 92/00373；和EP 03089)。可使用任何便利的交联方法来制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，连同许多交联技术一起披露于美国专利No.4,676,980。
文献中还记载了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等,Science 229:81(1985)记载了通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab')2片段的规程。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫化物的形成。然后将产生的Fab’片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab'-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab'-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab'-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。
最新的进展便于从大肠杆菌直接回收Fab'-SH片段，这些片段可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等,J.Exp.Med.175:217-225(1992)记载了完全人源化的双特异性抗体F(ab′)2分子的生成。由大肠杆菌分开分泌每种Fab'片段，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达HER2受体的细胞和正常人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳腺肿瘤靶物的溶解活性。
还记载了从重组细胞培养物直接生成和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny等,J.Immunol.148(5):1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab'部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体，然后重新氧化以形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)记载的“双抗体”技术提供了构建双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因而，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段上的互补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体构建双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等,J.Immunol.152:5368(1994)。
涵盖具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等,J.Immunol.147:60(1991)。
多价抗体
多价抗体可以比二价抗体更快的受到表达该抗体所结合抗原的细胞的内在化（和/或异化）。本发明的抗体可以是可容易地通过编码抗体多肽链的核酸的重组表达而生成的、具有三个或更多抗原结合位点（例如四价抗体）的多价抗体（IgM类别以外的）。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多抗原结合位点。优选的二聚化结构域包含（或由其组成）Fc区或铰链区。在这种情况中，抗体会包含Fc区及Fc区氨基末端的三个或更多抗原结合位点。本文中优选的多价抗体包含（或由其组成）三个至约八个，但优选四个抗原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链（且优选两条多肽链），其中所述多肽链包含两个或多个可变域。例如，多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变域，VD2是第二可变域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，而n是0或1。例如，所述多肽链可包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文中的多价抗体优选进一步包含至少两条（且优选四条）轻链可变域多肽。本文中的多价抗体可包含例如约两条至约八条轻链可变域多肽。本文涵盖的轻链可变域多肽包含轻链可变域，且任选进一步包含CL域。
抗体变体
在有些实施方案中，涵盖本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗体的氨基酸序列变体是通过将适宜的核苷酸变化引入抗体核酸或通过肽合成而制备的。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基删除和/或插入和/或替代。可进行任何删除、插入和替代组合以获得最终的构建物，倘若最终的构建物具有期望的特征。可在制备序列时将氨基酸改变引入受试抗体氨基酸序列。
可用于鉴定抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的一种方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells,Science 244:1081-1085(1989)中所述。这里，鉴定一个残基或一组靶残基（例如带电荷的残基，诸如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸）并用中性或带负电荷的氨基酸（最优选丙氨酸或多丙氨酸）替代，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体，推敲那些对替代展示出功能敏感性的氨基酸位置。如此，尽管用于引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，然而突变本身的本质不必预先决定。例如，为了分析指定位点处突变的后果，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，并对所表达免疫球蛋白筛选期望的活性。
氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，长度范围由一个残基至包含上百或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其它插入变体包括将抗体的N或C端与酶（例如用于ADEPT）或延长抗体血清半衰期的多肽融合。
多肽的糖基化典型的或是N-连接的或是O-连接的。N-连接指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸（其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸）是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。如此，多肽中这些三肽序列任一的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
向抗体中添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个上述三肽序列而便利地完成（用于N-连接的糖基化位点）。所述改变还可通过向原始抗体的序列中添加或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行（用于O-连接的糖基化位点）。
若抗体包含Fc区，则可改变附着其上的碳水化合物。例如，美国专利申请US 2003/0157108(Presta,L.)中记载了有缺乏岩藻糖的成熟碳水化合物结构附着于抗体Fc区的抗体。还可参见US 2004/0093621(Kyowa Hakko KogyoCo.,Ltd.)。WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)和美国专利No.6,602,684(Umana等人)中提到了在附着于抗体Fc区的碳水化合物中有等分N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗体。WO 1997/30087(Patel等人)中报告了在附着于抗体Fc区的寡糖中有至少一个半乳糖残基的抗体。关于有更改的碳水化合物附着于其Fc区的抗体还可参见WO 1998/58964(Raju,S.)和WO 99/22764(Raju,S.)。关于具有改良糖基化的抗原结合分子还可参见US 2005/0123546(Umana等)。
本文中的优选糖基化变体包含Fc区，其中附着于Fc区的碳水化合物结构缺乏岩藻糖。此类变体具有改进的ADCC功能。任选的是，Fc区还包含进一步改进ADCC的一个或多个氨基酸替代，例如Fc区位置298、333和/或334处的替代（Eu残基编号方式）。涉及“脱岩藻糖型”或“岩藻糖缺乏型”抗体的出版物的例子包括：US 2003/0157108;WO 2000/61739;WO 2001/29246;US2003/0115614;US 2002/0164328;US 2004/0093621;US 2004/0132140;US2004/0110704;US 2004/0110282;US 2004/0109865;WO 2003/085119;WO2003/084570;WO 2005/035586;WO 2005/035778;WO2005/053742;Okazaki等J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004);Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)。生成脱岩藻糖化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986);美国专利申请号US 2003/0157108A1,Presta,L;及WO 2004/056312A1,Adams等,尤其是实施例11)和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖转移酶基因，FUT8，敲除的CHO细胞(Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004))。
另一类变体是氨基酸替代变体。这些变体在抗体分子中有至少一个氨基酸（至少两个、至少三个、至少四个或更多个）残基用不同残基替代。最有兴趣进行替代诱变的位点包括高变区，但是也涵盖FR改变。表A中“优选替代”栏显示了保守替代。如果此类替代导致生物学活性变化，那么可导入表A中称为“例示替代”的更多实质变化，或如下文参照氨基酸分类进一步所述，并筛选产物。
表A
  原始残基   例示替代   优选替代
  Ala(A)   Val;Leu;Ile   Val
  Arg(R)   Lys;Gln;Asn   Lys
  Asn(N)   Gln;His;Asp;Lys;Arg   Gln
  Asp(D)   Glu;Asn   Glu
  Cys(C)   Ser;Ala   Ser
  Gln(Q)   Asn;Glu   Asn
  Glu(E)   Asp;Gln   Asp
  Gly(G)   Ala   Ala
  His(H)   Asn;Gln;Lys;Arg   Arg
  Ile(I)   Leu;Val;Met;Ala;Phe;正亮氨酸   Leu
  Leu(L)   正亮氨酸;Ile;Val;Met;Ala;Phe   Ile
  Lys(K)   Arg;Gln;Asn   Arg
  Met(M)   Leu;Phe;Ile   Leu
  Phe(F)   Trp;Leu;Val;Ile;Ala;Tyr   Tyr
  Pro(P)   Ala   Ala
  Ser(S)   Thr   Thr
  Thr(T)   Val;Ser   Ser
  Trp(W)   Tyr;Phe   Tyr
  Tyr(Y)   Trp;Phe;Thr;Ser   Phe
  Val(V)   Ile;Leu;Met;Phe;Ala;正亮氨酸   Leu
对抗体生物学特性的实质性修饰可通过选择对维持以下方面的效果差异显著的替代来实现：(a)替代区域中多肽主链的结构，例如（折叠）片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。根据共同的侧链特性，天然存在残基可如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性、亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性的：Asp、Glu；
(4)碱性的：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；及
(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。
一类替代变体涉及替代亲本抗体（例如人源化或人抗体）的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体会具有改良的生物学特性。用于生成此类替代变体的一种便利方法涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。简而言之，将数个高变区位点（例如6-7个位点）突变，在各个位点产生所有可能的氨基酸替代。将如此生成的抗体展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与各个颗粒内包装的M13基因III产物的融合物。然后如本文所公开的对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性（例如结合亲和力）。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。所述接触残基及邻近残基是依照本文详述的技术进行替代的候选位点。一旦产生这样的变体，如本文所述对该组变体进行筛选，可选择在一种或多种相关测定法中具有优良特性的抗体用于进一步的开发。
编码抗体氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域知道的多种方法来制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离（在天然发生氨基酸序列变体的情况中），或者通过对较早制备的变体或非变体型式的抗体进行寡核苷酸介导的（或定点）诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。
可能希望在本发明的免疫球蛋白多肽的Fc区中引入一处或多处氨基酸修饰，由此生成Fc区变体。Fc区变体可包括在一个或多个氨基酸位置（包括铰链半胱氨酸）包含氨基酸修饰（例如替代）的人Fc区序列（例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区）。
依照此描述和本领域的教导，涵盖在有些实施方案中，本发明的方法中所使用的抗体与野生型对应抗体相比可在例如Fc区中包含一处或多处改变。与它们的野生型对应物相比，这些抗体仍会基本上保留治疗功效所需要的相同特性。例如，认为可在Fc区中进行将会导致C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性（CDC）改变（即或是增强或是削弱）的某些改变，例如WO99/51642中所述。还可参见关注Fc区变体其它例子的Duncan和Winter,Nature 322:738-40(1988);美国专利No.5,648,260;美国专利No.5,624,821;及WO94/29351。WO00/42072(Presta)和WO 2004/056312(Lowman)记载了对FcR的结合提高或降低的抗体变体。在此明确收入这些专利出版物的内容作为参考。还可参见Shields等J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。半衰期延长且对新生儿Fc受体(FcRn)（它负责将母体IgG转移给胎儿）(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)及Kim等,J.Immunol.24:249(1994))的结合改良的抗体记载于US2005/0014934A1(Hinton等)。这些抗体包含具有一处或多处改进Fc区与FcRn结合的替代的Fc区。具有改变的Fc区氨基酸序列且C1q结合能力升高或降低的多肽变体记载于美国专利No.6,194,551B1,WO99/51642。在此明确收入这些专利出版物的内容作为参考。还可参见Idusogie等J.Immunol.164:4178-4184(2000)。
抗体衍生物
可进一步修饰本发明的抗体以包含本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。优选的是，适于抗体衍生化的模块是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三口恶烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸（均聚物或随机共聚物）、和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇（例如甘油）、聚乙烯醇、及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着到抗体上的聚合物数目可以变化，而且如果附着了一个以上的聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于待改进抗体的具体特性或功能、抗体衍生物是否会用于指定条件下的治疗等。
筛选具有期望性质的抗体
本发明的抗体可以用本领域已知的各种测定法（本文中公开了其中一些）对其物理/化学性质和生物学功能进行表征。在有些实施方案中，抗体表征为如下任一项或多项：减弱或者阻断hepsin结合，减弱或者阻断hepsin活性，减弱或者阻断hepsin和/或hepsin底物（例如MSP原、uPA原、因子VII、HGF原）下游分子信号传导，和/或治疗和/或预防肿瘤、细胞增殖性病症或癌症，和/或治疗或预防与hepsin表达和/或活性（诸如升高的hepsin表达和/或活性）有关的病症。在一些实施方案中，hepsin活性为hepsin酶活性。在一个实施方案中，酶活性包含切割hepsin的多肽底物。在一个实施方案中，hepsin的多肽底物是巨噬细胞刺激性蛋白原（MSP原）、uPA原、因子VII和HGF原中的一种或多种。hepsin对MSP原的活化记载于共同未决的、共同拥有的于2009年10月22日提交的美国临时专利申请No.61/253,990。在一个实施方案中，酶活性包含切割hepsin的合成底物。在一些实施方案中，hepsin合成底物是表1中所示底物。
纯化的抗体还可以通过一系列测定法进行表征，包括但不限于N端测序、氨基酸分析、非变性大小排阻高压液相层析（HPLC）、质谱、离子交换层析和木瓜蛋白酶消化。
在本发明的某些实施方案中，对此处制备的抗体分析它们的生物学活性。在有些实施方案中，对本发明的抗体检验它们的抗原结合活性。本领域已知的并且可以在本文中使用的抗原结合测定法包括但不限于利用诸如以下技术的任何直接的或竞争性的结合测定法：Western印迹、放射免疫测定法、ELISA（酶联免疫吸附测定法）、“夹心式/三明治式”免疫测定法、免测沉淀测定法、荧光免疫测定法和蛋白A免疫测定法。在下面的实施例部分提供例示性的抗原结合和/或其它测定法。
如果想要抑制细胞生长的抗hepsin抗体，那么可以在测量细胞生长抑制的体外和/或体内测定法中测试候选抗体。用于检查癌细胞生长和/或增殖的方法是本领域公知的。用于测定细胞生长和/或增殖和/或凋亡的例示性方法包括例如BrdU掺入测定法、MTT、[3H]-胸苷掺入（例如TopCount测定法(PerkinElmer)）、细胞存活力测定法（例如CellTiter-Glo(Promega)）、等等。
在一个实施方案中，本发明涵盖具有效应器功能的抗体。在某些实施方案中，测量抗体的Fc活性。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以证实CDC和/或ADCC活性的降低/消除。例如，可以进行Fc受体（FcR）结合测定法以确保抗体缺失FcγR结合（因此可能缺失ADCC活性），但保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)第464页的表3概述了造血细胞上的FcR表达。美国专利No.5,500,362或5,821,337描述了用于评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的一个例子。本文中也例示了用于检测ADCC活性的一种测定法。可用于这些测定法的有用效应细胞包括外周血单个核细胞（PBMC）和天然杀伤（NK）细胞。或者/另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在诸如Clynes等PNAS(USA)95:652-656(1998)中公开的动物模型中。也可以进行C1q结合测定法以证实抗体不能结合C1q从而缺失CDC活性。为了评估补体激活，可以进行CDC测定法，例如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods 202:163(1996)所述。也可以利用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定。
载体、宿主细胞、和重组方法
为了重组生产本发明抗体，分离编码它的核酸，并将其插入可复制载体，用于进一步克隆（DNA扩增）或表达。可使用常规规程容易的分离编码抗体的DNA并测序（例如使用能够与编码抗体重链和轻链的基因性特异结合的寡核苷酸探针）。可利用许多载体。载体的选择部分取决于将要使用的宿主细胞。通常，优选的宿主细胞是原核或真核（通常是哺乳动物）起源的。应当领会，任何同种型的恒定区可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，而且此类恒定区可以从任何人或动物物种获得。
a．使用原核宿主细胞生成抗体：
i．载体构建
可使用标准重组技术来获得编码本发明抗体多肽构件的多核苷酸序列。可从抗体生成细胞诸如杂交瘤细胞分离期望的多核苷酸序列并测序。或者，可使用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一旦得到，将编码多肽的序列插入能够在原核宿主中复制并表达异源多核苷酸的重组载体。为了本发明，可使用本领域可获得的且知道的许多载体。适宜载体的选择将主要取决于将要插入载体的核酸的大小和将要用载体转化的具体宿主细胞。根据其功能（扩增或表达异源多核苷酸，或二者兼之）及其与它在其中驻留的具体宿主细胞的相容性，每种载体含有多种构件。载体构件通常包括但不限于：复制起点、选择标志基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入片段、和转录终止序列。
一般而言，与宿主细胞一起使用的质粒载体包含衍生自与这些宿主相容物种的复制子和控制序列。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标志序列。例如，通常用衍生自大肠杆菌物种的质粒pBR322转化大肠杆菌。pBR322包含编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，如此提供轻松鉴定转化细胞的手段。pBR322、其衍生物、或其它微生物质粒或噬菌体还可包含或经修饰而包含可被微生物生物体用于表达内源蛋白质的启动子。Carter等人，美国专利No.5,648,237中详细记载了用于表达特定抗体的pBR322衍生物的例子。
另外，可将包含与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体用作这些宿主的转化载体。例如，可使用噬菌体诸如λGEMTM-11来构建可用于转化易感宿主细胞诸如大肠杆菌LE392的重组载体。
本发明的表达载体可包含两种或更多启动子-顺反子对，它们编码每一种多肽构件。启动子是位于顺反子上游（5'）的非翻译调控序列，它调控顺反子的表达。原核启动子通常分成两类，诱导型的和组成性的。诱导型启动子指响应培养条件的变化（例如营养物的存在与否或温度变化）而启动受其控制的顺反子的升高水平转录的启动子。
众所周知受到多种潜在宿主细胞识别的大量启动子。通过限制酶消化切下源DNA中的启动子并将分离的启动子序列插入本发明载体，由此可将选择的启动子与编码轻链或重链的顺反子DNA可操作连接。天然启动子序列和许多异源启动子都可用于指导靶基因的扩增和/或表达。在有些实施方案中，使用异源启动子，因为与天然靶多肽启动子相比，它们通常容许所表达靶基因的更高转录和更高产量。
适用于原核宿主的启动子包括PhoA启动子、β-半乳糖苷酶和乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、和杂合启动子诸如tac或trc启动子。然而，在细菌中有功能的其它启动子（诸如其它已知的细菌或噬菌体启动子）也是合适的。它们的核苷酸序列已经发表，由此熟练工作人员能够使用提供任何所需限制性位点的接头或衔接头将它们与编码靶轻链和重链的顺反子可操作连接（Siebenlist等,Cell 20:269(1980)）。
在本发明的一个方面，重组载体内的每个顺反子都包含指导所表达多肽穿膜转运的分泌信号序列构件。一般而言，信号序列可以是载体的构件，或者它可以是插入载体的靶多肽DNA的一部分。为了本发明而选择的信号序列应当是受到宿主细胞识别并加工（即被信号肽酶切除）的信号序列。对于不识别并加工异源多肽的天然信号序列的原核宿主细胞，将信号序列用选自例如下组的原核信号序列替代：碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或热稳定的肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA、和MBP。在本发明的一个实施方案中，表达系统的两个顺反子中都使用的信号序列是STII信号序列或其变体。
在另一方面，依照本发明的免疫球蛋白的生成可在宿主细胞的细胞质中发生，因此不需要在每个顺反子内存在分泌信号序列。在那点上，免疫球蛋白轻链和重链在细胞质内表达、折叠和装配而形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株（例如大肠杆菌trxB-菌株）提供有利于二硫键形成的细胞质条件，从而容许所表达蛋白质亚基的正确折叠和装配。Proba和Pluckthun,Gene 159:203(1995)）。
适于表达本发明抗体的原核宿主细胞包括古细菌（Archaebacteria）和真细菌（Eubacteria），诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体。有用细菌的例子包括埃希氏菌属（Escherichia）（例如大肠埃希氏菌(E.coli)）、芽孢杆菌属（Bacillus）（例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)）、肠杆菌属（Enterobacteria）、假单胞菌属（Pseudomonas）（例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)）物种、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、粘质沙雷氏菌（Serratia marcescans）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、变形菌属（Proteus）、志贺氏菌属（Shigella）、根瘤菌属（Rhizobium）、透明颤菌属（Vitreoscilla）、或副球菌属（Paracoccus）。在一个实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一个实施方案中，使用大肠杆菌细胞作为本发明的宿主。大肠杆菌菌株的例子包括菌株W3110（Bachmann,Cellular and Molecular Biology，第2卷，Washington,D.C.，美国微生物学学会，1987，第1190-1219页；ATCC保藏号27,325）及其衍生物，包括具有基因型W3110 ΔfhuA(ΔtonA)ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41 kanR的菌株33D3（美国专利No.5,639,635）。其它菌株及其衍生物，诸如大肠杆菌294（ATCC 31,446）、大肠杆菌B、大肠杆菌λ1776（ATCC 31,537）和大肠杆菌RV308（ATCC 31,608）也是合适的。这些例子只是例示而非限制。本领域知道用于构建具有指定基因型的任何上述细菌衍生物的方法，参见例如Bass等,Proteins 8:309-314(1990)。通常必需考虑复制子在细菌细胞中的可复制性来选择适宜的细菌。例如，在使用众所周知的质粒诸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410来提供复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌属、或沙门氏菌属物种可能适于用作宿主。通常，宿主细胞应当分泌最小量的蛋白水解酶，而且可能希望在细胞培养中掺入额外的蛋白酶抑制剂。
ii．抗体生成
用上述表达载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的常规营养培养基中进行培养。
转化即将DNA导入原核宿主，使得DNA能够进行复制，或是作为染色体外元件或是通过染色体成分。根据所用宿主细胞，使用适于这些细胞的标准技术进行转化。采用氯化钙的钙处理通常用于具有坚固细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法采用聚乙二醇/DMSO。使用的还有一种技术是电穿孔。
在本领域知道的且适于培养选定宿主细胞的培养基中培养用于生成本发明多肽的原核细胞。合适培养基的例子包括添加了必需营养补充物的LB培养基(Luria broth)。在有些实施方案中，培养基还含有根据表达载体的构建而选择的选择剂，以选择性容许包含表达载体的原核细胞生长。例如，向用于培养表达氨苄青霉素抗性基因的细胞的培养基中添加氨苄青霉素。
除了碳、氮、和无机磷酸盐来源以外，还可含有适当浓度的任何必需补充物，或是单独加入或是作为与另一种补充物或培养基的混合物，诸如复合氮源。任选的是，培养基可含有一种或多种选自下组的还原剂：谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基乙酸盐/酯、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇。
在合适的温度培养原核宿主细胞。例如，对于培养大肠杆菌，优选的温度范围是约20℃至约39℃，更优选约25℃至约37℃，甚至更优选约30℃。主要取决于宿主生物体，培养基的pH可以是范围为约5至约9的任何pH。对于大肠杆菌，pH优选约6.8至约7.4，更优选约7.0。
如果本发明的表达载体中使用诱导型启动子，那么在适于激活启动子的条件下诱导蛋白质表达。在本发明的一个方面，使用PhoA启动子来控制多肽的转录。因而，为了诱导，在磷酸盐限制培养基中培养经过转化的宿主细胞。优选地，磷酸盐限制培养基是C.R.A.P培养基（参见例如Simmons等,J.Immunol.Methods 263:133-147(2002)）。根据所采用的载体构建物，可采用多种其它诱导物，正如本领域所知道的。
在一个实施方案中，所表达的本发明多肽分泌到宿主细胞的周质中并从中回收。蛋白质回收通常涉及破坏微生物，通常通过诸如渗透压震扰(osmoticshock)、超声处理或裂解等手段。一旦细胞遭到破坏，可通过离心或过滤清除细胞碎片或整个细胞。可以通过例如亲和树脂层析进一步纯化蛋白质。或者，蛋白质可能转运到培养液中并从中分离。可从培养液清除细胞，并将培养物上清液过滤和浓缩，用于进一步纯化所生成蛋白质。可使用普遍知道的方法诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹测定法进一步分离和鉴定所表达多肽。
在本发明的一个方面，通过发酵过程大量进行抗体生产。多种大规模补料-分批发酵规程可用于生产重组蛋白。大规模发酵具有至少1000升的容量，优选约1,000至100,000升的容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮来分配氧和养分，尤其是葡萄糖（优选的碳源/能源）。小规模发酵通常指在体积容量不超过约100升的发酵罐中进行的发酵，范围可以是约1升至约100升。
在发酵过程中，通常在将细胞在合适条件下培养至期望密度（例如OD550约180-220，在此阶段细胞处于早期稳定期）后启动蛋白质表达的诱导。根据所采用的载体构建物，可使用多种诱导物，正如本领域知道的和上文描述的。可在诱导前将细胞培养较短的时间。通常将细胞诱导约12-50小时，但是可使用更长或更短的诱导时间。
为了提高本发明多肽的产量和质量，可修改多项发酵条件。例如，为了改善所分泌抗体多肽的正确装配和折叠，可使用过度表达伴侣蛋白诸如Dsb蛋白（DsbA、DsbB、DsbC、DsbD、和/或DsbG）或FkpA（具有伴侣活性的一种肽基脯氨酰-顺式,反式-异构酶）的额外载体来共转化宿主原核细胞。已经证明伴侣蛋白促进在细菌宿主细胞中生成的异源蛋白质的正确折叠和溶解度。Chen等,J.Biol.Chem.274:19601-19605(1999);Georgiou等人，美国专利No.6,083,715;Georgiou等人，美国专利No.6,027,888;Bothmann和Plückthun,J.Biol.Chem.275:17100-17105(2000);Ramm和Plückthun,J.Biol.Chem.275:17106-17113(2000);Arie等,Mol.Microbiol.39:199-210(2001)）。
为了将所表达异源蛋白质（尤其是对蛋白水解敏感的异源蛋白质）的蛋白水解降至最低，可将蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌株用于本发明。例如，可修饰宿主细胞菌株，在编码已知细菌蛋白酶的基因中进行遗传突变，诸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI、及其组合。可以获得有些大肠杆菌蛋白酶缺陷菌株，参见例如Joly等,(1998)见上文;Georgiou等人，美国专利No.5,264,365;Georgiou等人，美国专利No.5,508,192;Hara等,Microbial Drug Resistance 2:63-72(1996)。
在一个实施方案中，在本发明的表达系统中使用蛋白水解酶缺陷且经过过度表达一种或多种伴侣蛋白的质粒转化的大肠杆菌菌株作为宿主细胞。
iii．抗体纯化
可采用本领域知道的标准蛋白质纯化方法。下面的规程是合适纯化规程的例示：免疫亲和或离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土或阳离子交换树脂诸如DEAE上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、和使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。
在一个方面，将固定化在固相上的蛋白A用于本发明全长抗体产物的免疫亲和纯化。蛋白A是来自金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureas）的41kD细胞壁蛋白质，它以高亲和力结合抗体Fc区。Lindmark等,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983)）。蛋白A固定化其上的固相优选具有玻璃或石英表面的柱子，更优选可控孔径玻璃柱或硅酸柱。在有些应用中，柱子以诸如甘油等试剂包被，试图防止污染物的非特异性粘附。
作为纯化的第一步，将衍生自如上所述细胞培养物的制备物施加到蛋白A固定化固相上，使得感兴趣抗体特异性结合蛋白A。然后清洗固相以清除与固相非特异性结合的污染物。最后通过洗脱从固相回收感兴趣抗体。
b．使用真核宿主细胞生成抗体：
载体构件通常包括但不限于如下一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。
(i)信号序列构件
在真核宿主细胞中使用的载体还可在感兴趣成熟蛋白质或多肽的N端包含信号序列或具有特异性切割位点的其它多肽。优选受到宿主细胞识别并加工（即被信号肽酶切除）的异源信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导，例如单纯疱疹病毒gD信号。
将这些前体区的DNA连接到编码抗体的DNA的读码框中。
(ii)复制起点
通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件。例如，SV40起点通常可能只因包含早期启动子才使用。
(iii)选择基因构件
表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素；(b)补足相应的营养缺陷；或(c)提供不能从复合培养基获得的关键营养物。
选择方案的一个例子利用药物来阻滞宿主细胞的生长。经异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，如此幸免于选择方案。此类显性选择的例子使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个例子是能够鉴定有能力摄取抗体核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白I和II优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如，首先通过将所有转化子在含有甲氨蝶呤（Mtx，DHFR的一种竞争性拮抗剂）的培养基中进行培养来鉴定经DHFR选择基因转化的细胞。在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系（例如ATCC CRL-9096）。
或者，可通过在含有针对选择标志的选择剂诸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素、新霉素或G418的培养基中培养细胞来选择经编码抗体、野生型DHFR蛋白、和另一种选择标志诸如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞（特别是包含内源DHFR的野生型宿主）。参见美国专利No.4,965,199。
(iv)启动子构件
表达和克隆载体通常包含受到宿主生物体识别的启动子，且与抗体多肽核酸可操作连接。已知真核细胞的启动子序列。事实上，所有真核基因都具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处发现的另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3'端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3'端添加聚腺苷酸(polyA)尾的信号。所有这些序列合适的插入真核表达载体中。
在哺乳动物宿主细胞中由载体转录抗体多肽受到例如从病毒（诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒（诸如2型腺病毒）、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒、和猿病毒40(SV40)）基因组获得的、来自异源哺乳动物启动子（例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子）的、来自热休克启动子的启动子的控制，倘若这些启动子与宿主细胞系统相容的话。
方便地以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便地以HindIII E限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利No.4,419,446中公开了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利No.4,601,978中记载了该系统的一种修改形式。或者，可使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。
(v)增强子元件构件
常常通过在载体中插入增强子序列来提高高等真核细胞对编码本发明抗体多肽的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因（珠蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、α-胎蛋白和胰岛素）的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点晚期侧的增强子（bp 100-270）、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期侧的增强子、和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参见Yaniv,Nature 297:17-18(1982)。增强子可剪接到载体中，位于抗体多肽编码序列的5'或3'位置，但是优选位于启动子的5'位点。
(vi)转录终止构件
在真核宿主细胞中使用的表达载体通常还包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5'端和偶尔的3'端获得。这些区域包含在编码抗体的mRNA的非翻译区中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO94/11026及其中公开的表达载体。
(vii)宿主细胞的选择和转化
适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括本文描述的高等真核细胞，包括脊椎动物宿主细胞。脊椎动物细胞在培养（组织培养）中的繁殖已经成为常规规程。有用哺乳动物宿主细胞系的例子有经SV40转化的猴肾CV1系（COS-7，ATCC CRL 1651）、人胚肾系（293细胞或为悬浮培养而亚克隆的293细胞，Graham等,J.Gen.Virol.36:59(1977)）、幼仓鼠肾细胞（BHK，ATCC CCL 10）、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR（CHO，Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980)）、小鼠塞托利(Sertoli)细胞（TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)）、猴肾细胞（CV1，ATCC CCL 70）、非洲绿猴肾细胞（VERO-76，ATCC CRL 1587）、人宫颈癌细胞（HELA，ATCC CCL2）、犬肾细胞（MDCK，ATCC CCL 34）、牛鼠(buffalo rat)肝细胞（BRL 3A，ATCC CRL 1442）、人肺细胞（W138，ATCC CCL 75）、人肝细胞（Hep G2，HB 8065）、小鼠乳瘤（MMT 060562，ATCC CCL 51）、TRI细胞（Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)）、MRC 5细胞、FS4细胞和人肝肉瘤(hepatoma)系（Hep G2）。
为了生成抗体，用上文所述表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的常规营养培养基中进行培养。
(viii)宿主细胞的培养
可在多种培养基中培养用于生成本发明抗体的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10（Sigma）、极限必需培养基（MEM，Sigma）、RPMI-1640（Sigma）、和Dulbecco氏修改Eagle氏培养基（DMEM，Sigma）适于培养宿主细胞。另外，可使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham等,Meth.Enz.58:44(1979);Barnes等,Anal.Biochem.102:255(1980);美国专利No.4,767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655;5,122,469;WO90/03430;WO 87/00195;或美国专利Re.30,985。任何这些培养基可根据需要补充激素和/或其它生长因子（诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子）、盐（诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐）、缓冲剂（诸如HEPES）、核苷酸（诸如腺苷和胸苷）、抗生素（诸如GENTAMYCINTM药物）、痕量元素（定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物）、和葡萄糖或等效能源。还可以适宜浓度含有本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件诸如温度、pH等即为表达而选择的宿主细胞先前所用的，这对于普通技术人员是显然的。
(ix)抗体的纯化
在使用重组技术时，可在细胞内生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么首先通过例如离心或超滤清除微粒碎片，或是宿主细胞或是裂解片段。如果抗体分泌到培养基中，那么通常首先使用商品化蛋白质浓缩滤器（例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元）浓缩来自这些表达系统的上清液。可在任何上述步骤中包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF以抑制蛋白水解，而且可包括抗生素以防止外来污染物的生长。
可使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析（优选的纯化技术是亲和层析）来纯化从细胞制备的抗体组合物。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2、或γ4重链的抗体（Lindmark等,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983)）。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3（Guss等,EMBO J.5:1567-1575(1986)）。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯容许获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含CH3结构域，则可使用Bakerbond ABXTM树脂（J.T.Baker，Phillipsburg，NJ）进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术诸如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSETM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂（诸如聚天冬氨酸柱）上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
在任何初步纯化步骤之后，可将含有感兴趣抗体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用层析，使用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度（例如约0-0.25M盐）进行。
免疫偶联物
本发明还提供了包含偶联有细胞毒剂的本文所述任何抗hepsin抗体的免疫偶联物（可互换的称为“抗体-药物偶联物”或“ADC”），所述细胞毒剂诸如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素（例如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段）或放射性同位素（即放射偶联物）。
抗体-药物偶联物在癌症治疗中用于局部投递细胞毒剂或细胞抑制剂（即用于杀死或抑制肿瘤细胞的药物）的用途（Syrigos和Epenetos,AnticancerResearch 19:605-614(1999);Niculescu-Duvaz和Springer,Adv.Drug Del.Rev.26:151-172(1997);美国专利No.4,975,278）容许将药物模块靶向投递至肿瘤，并在那儿进行细胞内积累，而系统施用这些未经偶联的药物试剂可能在试图消除的肿瘤细胞以外导致不可接受的对正常细胞的毒性水平（Baldwin等,Lancet 603-05(1986年3月15日);Thorpe，“Antibody Carriers Of CytotoxicAgents In Cancer Therapy:A Review”，在《Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications》中，A.Pinchera等人编，第475-506页，1985）。由此试图获得最大功效及最小毒性。多克隆抗体和单克隆抗体皆有报导可用于这些策略（Rowland等,Cancer Immunol.Immunother.21:183-87(1986)）。这些方法中所使用的药物包括道诺霉素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)和长春地辛(vindesine)（Rowland等,1986,见上文）。抗体-毒素偶联物中所使用的毒素包括细菌毒素诸如白喉毒素、植物毒素诸如蓖麻毒蛋白、小分子毒素诸如格尔德霉素(geldanamycin)（Mandler等,Jour.of the Nat.Cancer Inst.92(19):1573-1581(2000);Mandler等,Bioorganic & Med.Chem.Letters 10:1025-1028(2000);Mandler等,Bioconjugate Chem.13:786-791(2002)）、美登木素生物碱类（EP 1391213;Liu等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623(1996)）、和加利车霉素（Lode等,Cancer Res.58:2928(1998);Hinman等,Cancer Res.53:3336-3342(1993)）。毒素可通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制在内的机制发挥其细胞毒性和细胞抑制性的效果。有些细胞毒药物在与大的抗体或蛋白质受体配体偶联时趋于失活或活性降低。
（ibritumomab tiuxetan，Biogen/Idec）是由针对在正常和恶性B淋巴细胞表面上发现的CD20抗原的鼠IgG1κ单克隆抗体与通过硫脲接头-螯合剂所结合的111In或90Y放射性同位素构成的抗体-放射性同位素偶联物（Wiseman等,Eur.Jour.Nucl.Med.27(7):766-77(2000)；Wiseman等,Blood99(12):4336-42(2002);Witzig等,J.Clin.Oncol.20(10):2453-63(2002);Witzig等,J.Clin.Oncol.20(15):3262-69(2002)）。尽管ZEVALIN具有针对B细胞非何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤(NHL)的活性，然而施药在大多数患者中导致严重且长时间的血细胞减少。MYLOTARGTM（gemtuzumab ozogamicin，WyethPharmaceuticals），即由人CD33抗体与加利车霉素连接而构成的抗体-药物偶联物，在2000年批准用于经注射治疗急性骨髓性白血病（Drugs of the Future25(7):686(2000);美国专利No.4970198;5079233;5585089;5606040;5693762;5739116;5767285;5773001）。Cantuzumab mertansine（ImmunogenInc.），即由huC242抗体经二硫化物接头SPP与美登木素生物碱药物模块DM1连接而构成的抗体-药物偶联物，正在进行用于治疗表达CanAg的癌症诸如结肠癌、胰腺癌、胃癌和其它癌的II期试验。MLN-2704（Millennium Pharm.,BZLBiologics,Immunogen Inc.），即由抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)单克隆抗体与美登木素生物碱药物模块DM1连接而构成的抗体-药物偶联物，正在进行用于前列腺肿瘤潜在治疗的开发。将多拉司他汀(dolastatin)的合成类似物auristatin肽，auristatin E(AE)和单甲基auristatin(MMAE)与嵌合单克隆抗体cBR96（对癌瘤上的Lewis Y特异）和cAC10（对血液学恶性肿瘤上的CD30特异）偶联（Doronina等,Nature Biotechnology 21(7):778-784(2003)），且正在进行治疗性开发。
本文（例如上文）描述了可用于生成免疫偶联物的化疗剂。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链（来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)）、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)毒蛋白（PAPI、PAPII和PAP-S）、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。多种放射性核素可用于生成放射偶联抗体。例子包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。抗体和细胞毒剂的偶联物可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯（诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯）、活性酯类（诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯）、醛类（诸如戊二醛）、双叠氮化合物（诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺）、双重氮衍生物（诸如双(对-重氮苯甲酰基)乙二胺）、二异氰酸酯（诸如甲苯2,6-二异氰酸酯）、和双活性氟化合物（诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）的双功能衍生物。例如，可如Vitetta等,Science 238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO 94/11026。
本文还涵盖抗体与一种或多种小分子毒素诸如加利车霉素(calicheamicin)、美登木素生物碱类(maytansinoids)、多拉司他汀类(dolostatins)、aurostatins、单端孢霉素(trichothecene)和CC1065及这些毒素具有毒素活性的衍生物的偶联物。
i．美登素和美登木素生物碱类
在有些实施方案中，免疫偶联物包含偶联有一个或多个美登木素生物碱分子的本发明抗体（全长或片段）。
美登木素生物碱类是通过抑制微管蛋白多聚化来发挥作用的有丝分裂抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木（Maytenus serrata）分离得到（美国专利No.3,896,111）。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱类，诸如美登醇和C-3美登醇酯（美国专利No.4,151,042）。例如下列美国专利公开了合成美登醇及其衍生物和类似物：4,137,230;4,248,870;4,256,746;4,260,608;4,265,814;4,294,757;4,307,016;4,308,268;4,308,269;4,309,428;4,313,946;4,315,929;4,317,821;4,322,348;4,331,598;4,361,650;4,364,866;4,424,219;4,450,254;4,362,663;及4,371,533。
美登木素生物碱类药物模块在抗体药物偶联物中是有吸引力的药物模块，因为它们：(i)相对易于通过发酵或发酵产物的化学修饰、衍生化来制备；(ii)易于用适于通过非二硫化物接头的偶联抗体的官能团衍生化；(iii)在血浆中稳定；且(iv)有效针对多种肿瘤细胞系。
例如下列专利公开了包含美登木素生物碱类的免疫偶联物及其制备方法和治疗用途：美国专利No.5,208,020;5,416,064;及欧洲专利EP 0 425 235B1，明确将其公开内容收入本文作为参考。Liu等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8618-8623(1996)记载了包含与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接的称为DM1的美登木素生物碱的免疫偶联物。发现该偶联物具有针对培养的结肠癌细胞的高度细胞毒性，而且在体内肿瘤生长测定法中显示抗肿瘤活性。Chari等,Cancer Research 52:127-131(1992)记载了其中美登木素生物碱经二硫化物接头与结合人结肠癌细胞系上抗原的鼠抗体A7或结合HER-2/neu癌基因的另一种鼠单克隆抗体TA.1偶联的免疫偶联物。在体外在人乳癌细胞系SK-BR-3上测试了TA.1-美登木素生物碱偶联物的细胞毒性，该细胞系每个细胞表达3x105个HER-2表面抗原。药物偶联物达到了与游离美登木素生物碱药物程度相似的细胞毒性，这可通过增加每个抗体分子偶联的美登木素生物碱分子数目来提高。A7-美登木素生物碱偶联物在小鼠中显示低系统性细胞毒性。
抗体-美登木素生物碱偶联物可通过将抗体与美登木素生物碱分子化学连接且不显著削弱抗体或美登木素生物碱分子的生物学活性来制备。参见例如美国专利No.5,208,020，明确将其公开内容收入本文作为参考。每个抗体分子偶联平均3-4个美登木素生物碱分子在增强针对靶细胞的细胞毒性中显示功效，且对抗体的功能或溶解度没有负面影响，尽管预计甚至一个分子的毒素/抗体也将较之裸抗体的使用增强细胞毒性。美登木素生物碱类在本领域是众所周知的，而且可通过已知技术合成或从天然来源分离。例如美国专利No.5,208,020和上文提及的其它专利及非专利发表物中公开了合适的美登木素生物碱类。优选的美登木素生物碱类是美登醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过修饰的美登醇类似物，诸如各种美登醇酯。
本领域知道许多连接基团可用于制备抗体-美登木素生物碱偶联物，包括例如美国专利No.5,208,020或欧洲专利0 425 235 B1;Chari等,CancerResearch 52:127-131(1992);2004年10月8日提交的美国专利申请No.10/960,602中所公开的，明确将其公开内容收入本文作为参考。包含接头构件SMCC的抗体-美登木素生物碱类偶联物可以如2004年10月8日提交的美国专利申请No.10/960,602中所披露的来制备。连接基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团、或酯酶不稳定基团，正如上文所述专利中所公开的，优选二硫化物和硫醚基团。本文中描述和例示了别的连接基团。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和美登木素生物碱的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP),琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC),亚氨基硫烷(IT),亚氨酸酯（诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯）、活性酯类（诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯）、醛类（诸如戊二醛）、双叠氮化合物（诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺）、双重氮衍生物（诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺）、二异氰酸酯（诸如甲苯2,6-二异氰酸酯）、和双活性氟化合物（诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）的双功能衍生物。特别优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)（Carlsson等,Biochem.J.173:723-737(1978)）和N-琥珀酰亚氨基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫化物连接。
根据连接的类型，可将接头附着于美登木素生物碱分子的多个位置。例如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯连接。反应可发生在具有羟基的C-3位置、经羟甲基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置、和具有羟基的C-20位置。在一个优选的实施方案中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成连接。
ii．Auristatin和多拉司他汀
在有些实施方案中，免疫偶联物包含与多拉司他汀类(dolastatins)或多拉司他汀肽类似物及衍生物、auristatin类偶联的本发明抗体(美国专利No.5,635,483;5,780,588)。多拉司他汀类和auristatin类已经显示出干扰微管动力学、GTP水解、及核和细胞分裂(Woyke等(2001)Antimicrob.Agents andChemother.45(12):3580-3584)且具有抗癌(美国专利No.5,663,149)和抗真菌活性(Pettit et al(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42:2961-2965)。多拉司他汀或auristatin药物模块可经由肽药物模块的N（氨基）末端或C（羧基）末端附着于抗体(WO 02/088172)。
例示性的auristatin实施方案包括N-末端连接的单甲基auristatin药物模块DE和DF，披露于“Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation toLigands”,2004年11月5日提交的美国流水号10/983,340，明确将其公开内容完整收入本文作为参考。
典型的是，基于肽的药物模块可通过在两个或更多氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。此类肽键可依照例如肽化学领域众所周知的液相合成法来制备(参见E.和K.Lübke,The Peptides,卷1,pp 76-136,1965,Academic Press)。auristatin/多拉司他汀药物模块可依照以下文献中的方法来制备：美国专利No.US 5,635,483和5,780,588;Pettit等(1989)J.Am.Chem.Soc.111:5463-5465;Pettit等(1998)Anti-Cancer Drug Design 13:243-277;Pettit等Synthesis,1996,719-725;Pettit等(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.15:859-863;及Doronina(2003)Nat.Biotechnol.21(7):778-784;“Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”,2004年11月5日提交的美国流水号10/983,340，将其完整收入本文作为参考（披露了例如制备诸如MMAE和MMAF偶联至接头的单甲基缬氨酸化合物的接头和方法）。
iii.加利车霉素
在其它实施方案中，免疫偶联物包含偶联有一个或多个加利车霉素分子的本发明抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度生成双链DNA断裂。关于加利车霉素家族偶联物的制备参见美国专利No.5,712,374;5,714,586;5,739,116;5,767,285;5,770,701;5,770,710;5,773,001;和5,877,296（都授予美国Cyanamid公司）。可用的加利车霉素结构类似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰基-γ1I、PSAG和θI1（Hinman等,Cancer Research 53:3336-3342(1993);Lode等,Cancer Research 58:2925-2928(1998);及上述授予美国Cyanamid公司的美国专利）。可与抗体偶联的另一种抗肿瘤药物是QFA，它是一种抗叶酸药物。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易穿过质膜。因此，这些试剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的细胞毒效果。
iv．其它细胞毒剂
可与本发明抗体偶联的其它抗肿瘤剂包括BCNU、链佐星(streptozoicin)、长春新碱(vincristine)、5-氟尿嘧啶、美国专利No.5,053,394和5,770,710中记载的统称为LL-E33288复合物的试剂家族、及埃斯波霉素类(esperamicins)（美国专利No.5,877,296）。
可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链（来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)）、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白（PAPI、PAPII和PAP-S）、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。
本发明还涵盖抗体和具有核酸降解活性的化合物（例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶）之间形成的免疫偶联物。
为了选择性破坏肿瘤，抗体可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生成放射偶联抗体。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。在将偶联物用于检测时，它可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如tc99m或I123，或是包含自旋标记物用于核磁共振（NMR）成像（也称为磁共振成像，mri），诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以已知方式将放射性标记物或其它标记物掺入偶联物。例如，可生物合成肽，或是通过化学氨基酸合成法合成肽，其中使用涉及例如氟-19代替氢的合适氨基酸前体。可以经肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如tc99m或I123、Re186、Re188和In111。可以经赖氨酸残基来附着钇-90。IODOGEN法（Fraker等,Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57(1978)）可用于掺入碘-123。《Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy》（Chatal,CRC Press,1989）详细记载了其它方法。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯（诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯）、活性酯类（诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯）、醛类（诸如戊二醛）、双叠氮化合物（诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺）、双重氮衍生物（诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺）、二异硫氰酸酯（诸如甲苯2,6-二异氰酸酯）、和双活性氟化合物（诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）的双功能衍生物。例如，可如Vitetta等,Science 238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头（Chari等,Cancer Research 52:127-131(1992);美国专利No.5,208,020）。
本发明的化合物明确涵盖但不限于用下列交联剂制备的ADC：商品化（例如购自Pierce Biotechnology Inc.,Rockford,IL,U.S.A.）的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC和sulfo-SMPB、和SVSB（琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯）。见2003-2004年度应用手册和产品目录(Applications Handbookand Catalog)第467-498页。
v．抗体-药物偶联物的制备
在本发明的抗体-药物偶联物(ADC)中，将抗体(Ab)经接头(L)与一个或多个药物模块(D)偶联，例如每个抗体偶联约1个至约20个药物模块。可采用本领域技术人员知道的有机化学反应、条件和试剂通过数种路径来制备通式I的ADC，包括：(1)抗体的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应，形成Ab-L，随后与药物模块D反应；和(2)药物模块的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应，形成D-L，随后与抗体的亲核基团反应。本文中描述了用于制备ADC的别的方法。
Ab-(L-D)p                       I
接头可以由一种或多种接头构件构成。例示性的接头构件包括6-马来酰亚氨基己酰基("MC")、马来酰亚氨基丙酰基("MP")、缬氨酸-瓜氨酸("val-cit")、丙氨酸-苯丙氨酸("ala-phe")、对氨基苄氧羰基("PAB")、N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯("SPP")、N-琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1羧酸酯("SMCC')、和N-琥珀酰亚氨基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(″SIAB")。本领域知道别的接头构件，本文也描述了一些。还可参见“Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”,2004年11月5日提交的美国流水号10/983,340，将其完整内容收入本文作为参考。
在有些实施方案中，接头可包含氨基酸残基。例示性的氨基酸接头构件包括二肽、三肽、四肽或五肽。例示性的二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸（vc或val-cit）、丙氨酸-苯丙氨酸（af或ala-phe）。例示性三肽包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸（gly-val-cit）和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸（gly-gly-gly）。构成氨基酸接头构件的氨基酸残基包括那些天然存在的氨基酸，以及次要的氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。氨基酸接头构件可以在它们的特定酶（例如肿瘤相关蛋白酶，组织蛋白酶B、C和D，或纤溶酶蛋白酶）的酶促切割的选择性方面进行设计和优化。
抗体的亲核基团包括但不限于：(i)N末端氨基；(ii)侧链氨基，如赖氨酸；(iii)侧链硫醇基，例如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗体中糖的羟基或氨基。氨基、硫醇基、和羟基是亲核的，能够与接头模块上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烃基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即半胱氨酸桥。可通过还原剂诸如DTT（二硫苏糖醇）处理使抗体具有与接头试剂偶联的反应性。每个半胱氨酸桥理论上会如此形成两个反应性硫醇亲核体。可经由赖氨酸与2-亚氨基硫烷（Traut氏试剂）的反应，导致胺转变为硫醇，从而将额外亲核基团引入抗体。可以通过导入一个、两个、三个、四个、或更多个半胱氨酸残基（例如制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的突变型抗体）而将反应性硫醇基导入抗体。
还可通过修饰抗体来生成本发明的抗体-药物偶联物，即引入可与接头试剂或药物上的亲核取代基反应的亲电子模块。可用例如高碘酸盐氧化剂氧化糖基化抗体的糖，从而形成可与接头试剂或药物模块的胺基团反应的醛或酮基团。所得亚胺Schiff碱基可形成稳定的连接，或者可用例如硼氢化物试剂还原而形成稳定的胺连接。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可在蛋白质中生成羰（醛和酮）基团，它可与药物上的适宜基团反应（Hermanson，Bioconjugate Techniques）。在另一个实施方案中，包含N末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质可与偏高碘酸钠反应，导致在第一个氨基酸处生成醛（Geoghegan和Stroh,BioconjugateChem.3:138-146(1992);美国专利No.5,362,852）。此类醛可与药物模块或接头亲核体反应。
同样，药物模块上的亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯、和芳基酰肼基团，它们能够与接头模块上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烃基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基、和马来酰亚胺基团。
或者，可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒剂的融合蛋白。DNA的长度可包含各自编码偶联物两个部分的区域，或是彼此毗邻或是由编码接头肽的区域分开，该接头肽不破坏偶联物的期望特性。
在又一个实施方案中，可将抗体与“受体”（诸如链霉亲合素）偶联从而用于肿瘤预先靶向，其中对个体施用抗体-受体偶联物，接着使用清除剂由循环中清除未结合的偶联物，然后施用与细胞毒剂（例如放射性核苷酸）偶联的“配体”（例如亲合素）。
使用抗hepsin抗体的方法
本发明的特征在于hepsin抗体的使用，作为旨在自这种治疗剂的活性提供有益效应的特定治疗方案的一部分。本发明在治疗各种阶段的、各种类型的癌症中特别有用。
术语癌症涵盖增殖性病症的集合，包括但不限于癌前生长、良性肿瘤、和恶性肿瘤。良性肿瘤仍然局限于起源部位且没有能力渗透、侵入、或转移至远端部位。恶性肿瘤会侵入并损害它们周围的其它组织。它们还能获得脱离起源部位并传播至身体其它部分（转移）（通常经由血流或在淋巴结所处位置经由淋巴系统）的能力。原发性肿瘤以发生它们的组织类型来分类；转移性肿瘤以衍生癌细胞的组织类型来分类。随着时间消逝，恶性肿瘤的细胞变得越来越异常，而且表现出更不像正常细胞。癌细胞外观的这种变化称作肿瘤等级(tumor grade)，而且将癌细胞描述为完全分化的(well-differentiated)（低级）、中度分化的(moderately-differentiated)、不良分化的(poorly-differentiated)、或未分化的(undifferentiated)（高级）。完全分化的细胞相当正常，表现为和类似它们起源的正常细胞。未分化的细胞指已经变得如此异常以致于不再可能确定其起源的细胞。
癌症分期系统描述癌症在解剖学上已经传播了多远，而且试图将具有相似预后和处理的患者置于相同分期组中。可实施数项测试来帮助癌症分期，包括活检和某些影像检测诸如胸部x-射线、乳房x射线照片、骨扫描、CT扫描、和MRI扫描。验血和临床评估也用于评估患者的整体健康和检测癌症是否已经传播至某些器官。
为了对癌症分期，美国癌症联合委员会(American Joint Committee onCancer)首先使用TNM分类系统将癌症（特别是实体瘤）置于字母分类中。给癌症指派字母T（肿瘤大小）、N（可触知的结节）、和/或M（转移）。T1、T2、T3、和T4描述渐增的原发性病灶尺寸；N0、N1、N2、N3指示渐进发展中的结节累及；而M0和M1反映远端转移的存在与否。
在第二种分期方法中，也称作整体阶段分组(Overall Stage Grouping)或罗马数字分期(Roman Numeral Staging)，将癌症分成0期至IV期，掺入了原发性病症的尺寸以及结节传播和远端转移的存在。在这种系统中，将癌症分组成四期，以罗马数字I至IV表示，或者归类为“复发”。对于有些癌症，0期称作“原位”或“Tis”，诸如乳腺癌的原位导管癌或原位小叶癌。高级腺瘤也可归类为0期。一般而言，I期癌症是小的局限性癌症，其通常是可治愈的，而IV期通常代表不能手术治疗的或转移性的癌症。II期和III期癌症通常是局部高级的和/或展现出涉及局部淋巴结。一般而言，较高期数指示更严重的(extensive)疾病，包括更大的肿瘤尺寸和/或癌症传播至邻近原发性肿瘤的附近淋巴结和/或器官。这些阶段有精确定义，但是定义对每一种癌症是不同的，而且是熟练技术人员已知的。
许多癌症登记诸如NCI的“监视流行病学和最终结果程序”(Surveillance,Epidemiology,and End Results Program)(SEER)使用概括分期(summarystaging)。这种系统用于所有类型的癌症。它将癌症病历分成五大类：
“原位”指只存在于它开始的细胞层中的早期癌症。
“局限性的”指癌症限于它开始的器官，没有传播的证据。
“区域性的”指癌症已经传播超出起源（原发性）部位至附近的淋巴结或器官和组织。
“远端的”指癌症自原发性部位传播至远端器官或远端淋巴结。
“未知的”用于描述没有足够信息来指明阶段的情况。
另外，癌症在原发性肿瘤被清除后几个月或几年复现是常见的。在所有可见的肿瘤都被根除后复现的癌症称作复发性疾病。在原发性肿瘤的区域中复现的疾病是局部复发的，而作为转移复现的疾病称作远端复发。
肿瘤可以是实体瘤或者是非实体瘤或软组织肿瘤。软组织肿瘤的例子包括白血病（例如慢性髓细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia)、急性髓细胞性白血病(acute myelogenous leukemia)、成人急性成淋巴细胞性白血病(adult acute lymphoblastic leukemia)、急性髓细胞性白血病(acute myelogenousleukemia)、成熟B细胞急性成淋巴细胞性白血病(mature B-cell acutelymphoblastic leukemia)、慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocyticleukemia)、多形核细胞性白血病(polymphocytic leukemia)、或毛细胞性白血病(hairy cell leukemia)）或淋巴瘤（例如非何杰金氏淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、或何杰金氏病(Hodgkin’s disease)）。实体瘤包括血液、骨髓、或淋巴系统以外的身体组织的任何癌症。实体瘤可进一步分成上皮细胞起源的那些和非上皮细胞起源的那些。上皮细胞实体瘤的例子包括胃肠道、结肠、乳腺、前列腺、肺、肾、肝、胰腺、卵巢、头和颈、口腔、胃、十二指肠、小肠、大肠、肛门、胆囊、唇(labium)、鼻咽、皮肤、子宫、男性生殖器官、泌尿器官、膀胱、和皮肤的肿瘤。非上皮起源的实体瘤包括肉瘤、脑瘤、和骨瘤。定义部分中记载了肿瘤的其它例子。
在一些实施方案中，本文中的患者进行诊断测试，例如在治疗之前和/或期间和/或之后。一般而言，如果进行诊断测试，那么可以从需要治疗的患者获得样品。若受试者患有癌症，则样品可以是肿瘤样品或其它生物学样品，诸如生物学流体，包括但不限于血液、尿液、唾液、腹水或衍生物诸如血清和血浆等等。
本文中的生物学样品可以是固定的样品，例如福尔马林固定、石蜡包埋的(FFPE)样品，或者是冷冻的样品。
用于测定mRNA或蛋白质表达的方法有多种，包括但不限于基因表达概况分析、聚合酶链式反应(PCR)包括定量实时PCR(qRT-PCR)、微阵列分析、基因表达系列分析(serial analysis of gene expression,SAGE)、MassARRAY、通过大量平行签名测序(Massive Parallel Signiture Sequencing,MPSS)进行的基因表达分析、蛋白质组学、免疫组化(IHC)等。优选对mRNA定量。所述mRNA分析优选使用聚合酶链式反应(PCR)技术或通过微阵列分析来进行。若采用PCR，则优选的PCR形式是定量实时PCR(qRT-PCR)。在一个实施方案中，如果上文提到的一种或多种基因的表达处于中值或高于中值，例如与相同肿瘤类型的其它样品相比，那么认为是阳性表达。可以在与基因表达的测量基本上同时测定中值表达水平，或者可以事先测定。
多篇已发表的期刊论文(例如Godfrey等,J.Molec.Diagnostics 2:84-91(2000)；Specht等,Am.J.Pathol.158:419-29(2001))中给出了使用固定的、石蜡包埋的组织作为RNA来源的代表性基因表达概况分析方案的步骤：包括mRNA分离、纯化、引物延伸和扩增。简单的说，一种代表性方法首先将石蜡包埋的肿瘤组织样品切成约10微米厚的切片。然后提取RNA并除去蛋白质和DNA。分析RNA浓度后，如果需要可以包括RNA修复和/或扩增步骤，并使用基因特异性启动子逆转录RNA，然后PCR。最后分析数据，根据所检验肿瘤样品中鉴定的特征性基因表达模式来确定患者可用的最佳治疗选项。
可以直接地或间接地测定基因或蛋白质表达的检测。
可以（直接地或间接地）测定癌症中的hepsin表达或扩增。多种诊断/预后测定法可用于此目的。在一个实施方案中，可通过IHC来分析hepsin过表达。可将来自肿瘤活检的石蜡包埋组织切片进行IHC测定法并对照如下hepsin蛋白质染色强度标准：
得分0：未观察到染色或者在少于10%的肿瘤细胞中观察到膜染色。
得分1+：在超过10%的肿瘤细胞中检测到微弱的/刚刚可察觉的膜染色。所述细胞只在其部分膜中有染色。
得分2+：在超过10%的肿瘤细胞中观察到微弱至中等的完全膜染色。
得分3+：在超过10%的肿瘤细胞中观察到中等至强烈的完全膜染色。
在一些实施方案中，那些hepsin过表达评估得分为0或1+的肿瘤可表征为hepsin未过表达，而那些得分为2+或3+的肿瘤可表征为hepsin过表达。
或者/另外，可对福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤组织进行FISH测定法以测定肿瘤中hepsin扩增或翻译的存在和/或程度（如果有的话）。
可以直接地（例如通过磷酸ELISA测试，或其它检测磷酸化受体的手段）间接地（例如通过检测活化的下游信号传导途径成分，检测受体二聚体（例如同二聚体，异二聚体），检测基因表达序型等等）测定hepsin活化。
检测核酸突变的方法是本领域公知的。通常而非必需的是，扩增样品中的靶核酸以提供所希望的材料量，来确定是否存在突变。扩增技术是本领域公知的。例如，扩增产物可以涵盖或不涵盖所有编码感兴趣的蛋白质的核酸序列，只要该扩增产物包含怀疑突变所在的特定氨基酸/核酸序列位置。
包含靶核酸的样品可通过本领域公知的方法获得，而且它们适于特定类型和位置的肿瘤。组织活检通常用于获得有代表性的肿瘤组织片。可选地，可以已知或认为包含感兴趣的肿瘤细胞的组织/流体的形式间接获取肿瘤细胞。例如，肺癌损伤的样品可通过切除术、支气管镜检、细针抽吸、支气管刷检、或从痰/唾液、胸膜液或血液中获得。可从肿瘤或从其它身体样品诸如尿、痰或血清中检测出突变的基因或基因产物。上述用于检测肿瘤样品中突变的靶基因或基因产物的同样技术可用于其它身体样品。癌细胞从肿瘤上脱落下来，并出现在这些身体样品中。通过筛选这些身体样品，可实现对于诸如癌的疾病的简单早期诊断。另外，通过对这些身体样品测试突变的靶基因或基因产物，可监测治疗的进程。
对组织制备物富集肿瘤细胞的手段是本领域已知的。例如，可以从石蜡或低温保存的切片中分离组织。癌细胞也可通过流式细胞术或激光捕捉显微解剖而与正常细胞分开。这些以及其它从正常细胞中分离肿瘤的技术是本领域公知的。如果肿瘤组织被正常细胞高度污染，那么检测突变可能较为困难，然而最小化污染和/或假阳/阴性结果的技术是已知的，其中一些在下文有描述。例如，也可以对样品评估生物标志物（包括突变）的存在情况，所述标志物已知与感兴趣的肿瘤细胞有关而与相应的正常细胞无关，反之亦然。
在一些情况中，癌症过表达或不过表达hepsin。可在诊断或预后测定法中通过评估细胞上存在的hepsin水平的升高（例如通过免疫组化测定法；IHC）来测定hepsin过表达。或者/另外，可测量细胞中编码hepsin的核酸的水平，例如通过荧光原位杂交(FISH；参见1998年10月公布的WO 98/45479)、Southern印迹或聚合酶链式反应(PCR)技术，诸如实时定量PCR(RT-PCR)。在上述测定法之外，熟练从业人员还可利用多种体内测定法。例如，可将患者身体内的细胞暴露于任选用可检测标记物例如放射性同位素标记的抗体，并且可评估该抗体对患者身体内细胞的结合，例如通过外部扫描放射性或通过分析取自事先已暴露于所述抗体的患者的活检。
化疗剂
本发明的联合疗法可进一步包含一种或多种化疗剂。组合施用包括使用分开的配制剂或单一药物配制剂的共施用或同时施用和任一次序的序贯施用，其中优选有一段时间所有活性剂同时发挥它们的生物学活性。
如果施用的话，由于药物的组合作用或可归于抗代谢物化疗剂施用的消极副作用，通常以关于它们已知的或任选降低的剂量施用化疗剂。可依照制造商的说明书或根据从业人员凭经验确定的那样使用此类化疗剂的制备和剂量给药日程。
本文中公开了可组合的多种化疗剂。
配制、剂量和施用
会以与优良医学实践一致的方式配制、剂量给药和施用本发明中所使用的治疗剂。在此内容中考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体受试者、患者个体的临床状况、病症的起因、投递药剂的部位、施药的方法、施药的日程安排、要组合的药剂的药物-药物相互作用、和医学从业人员知道的其它因素。
使用本领域已知的标准方法通过将具有期望纯度的活性成分与任选的生理学可接受载体、赋形剂或稳定剂混合来制备治疗用配制剂(Remington’sPharmaceutical Sciences(第20版),A.Gennaro编,2000,Lippincott,Williams &Wilkins,Philadelphia,PA)。可接受的载体包括盐水，或缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量（少于约10个残基）多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或PEG。
任选但优选的是，配制剂含有药学可接受盐，优选氯化钠，且优选大约为生理浓度。任选的是，本发明的配制剂可含有药学可接受防腐剂。在一些实施方案中，防腐剂的浓度范围为0.1-2.0%，典型的是v/v。合适的防腐剂包括药学领域已知的那些。苯甲醇、酚、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、和对羟基苯甲酸丙酯是优选的防腐剂。任选的是，本发明的配制剂可包括药学可接受表面活性剂，其浓度为0.005-0.02%。
本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化合物，优选活性互补且彼此没有不利影响的那些。合适的是，此类分子以对于预定目的有效的量组合。
活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中（例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊）、在胶状药物传递系统中（例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊）、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于Remington’s PharmaceuticalSciences,见上文。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有本发明抗体的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质以定型产品的形式存在，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶（例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)）、聚交酯（美国专利No.3,773,919）、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM（由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体）及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够持续释放分子100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当胶囊化抗体在体内长时间保持时，它们可能由于暴露于37°C的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可根据相关机制来设计稳定化理性策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫醇-二硫化物互换而形成分子间S-S键，那么可通过修饰巯基残基、自酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂、和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定。
依照已知方法给人类患者施用本发明的治疗剂，诸如静脉内施用（像推注或通过一段时间里的连续输注），通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、表面、或吸入路径。回体(ex vivo)策略也可用于治疗性应用。回体策略涉及用编码hepsin拮抗剂的多核苷酸转染或转导自受试者获得的细胞。然后将经过转染或转导的细胞返回受试者。细胞可以是极其多种类型之任一，包括但不限于造血细胞（例如，骨髓细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、T细胞、或B细胞）、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、或肌肉细胞。
例如，如果hepsin拮抗剂是抗体，那么通过任何合适手段施用抗体，包括胃肠外、皮下、腹膜内、肺内、和鼻内，及（如果想要局部免疫抑制治疗的话）病灶内施用。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。另外，合适的是，通过脉冲输注来施用抗体，特别是使用递减剂量的抗体。优选的是，通过注射给予剂量给药，最优选的是，通过静脉内或皮下注射给予剂量给药，这部分取决于施药是短期的还是长期的。
在另一个例子中，在病症或肿瘤位置允许时，局部施用hepsin拮抗性化合物，例如通过直接注射，而且可以周期性重复注射。也可以在手术切除肿瘤后系统地/全身地将hepsin拮抗剂投递至受试者或直接投递至肿瘤细胞，例如肿瘤或肿瘤床，用以预防或降低局部复发或转移。
组合中的治疗剂的施用通常在规定的时间段里进行（通常是数分钟、数小时、数天或数周，这取决于所选择的组合）。联合疗法旨在涵盖这些治疗剂以序贯方式的施用（也就是说，其中在不同时间施用每一种治疗剂），以及这些治疗剂或治疗剂中至少两种以基本上同时的方式的施用。
可以通过相同路径或不同路径来施用治疗剂。例如，可以通过静脉内注射来施用组合中的抗hepsin抗体，同时可以口服施用所述组合中的化疗剂。或者，例如，可以口服施用这两种治疗剂，或者可以通过静脉内注射来施用这两种治疗剂，这取决于具体的治疗剂。治疗剂的施用次序也随着具体药剂而变化。
根据疾病的类型和严重程度，施用于患者的初始候选剂量是约1μg/kg至100mg/kg每种治疗剂，例如或是通过一次或多次分开施药或是通过连续输注。根据上文所述因素，典型日剂量的范围可以是约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于持续数天或更长的重复施药，根据状况，持续治疗直至根据上文所述方法的测量，癌症得到治疗。然而，其它剂量方案也可能是有用的。
本申请涵盖通过基因疗法来施用hepsin抗体。参见例如1996年3月14日公布的WO96/07321，其关注使用基因疗法来产生胞内抗体。
制品
在本发明的另一个方面，提供了包含可用于治疗、预防和/或诊断上文所述病症的物质的制品。制品包括容器和贴在所述容器上或与其相联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小管、注射器等。容器可用各种材料制成，诸如玻璃或塑料。容器中装有其自身或在联合其它组合物时有效治疗、预防和/或诊断疾患的组合物，而且可具有无菌存取口（例如容器可以是具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小管）。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装插页指示该组合物用于治疗选择的疾患，诸如癌症。此外，制品可包括(a)其中装有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中装有组合物的第二容器，其中所述组合物包含别的细胞毒剂。本发明此实施方案中的制品还可包括指示第一和第二抗体组合物可用于治疗特定疾患例如癌症的包装插页。或者/另外，制品还可包括第二（或第三）容器，其中装有药学可接受的缓冲剂，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。它还可包括商业和用户立场上所需的其它物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。
下面是本发明方法和组合物的实施例。应当理解，根据上文提供的一般描述，可实施各种其它实施方案。
实施例
材料和方法
试剂和蛋白质：合成对硝基苯胺底物S2765(=DiaPharma FXa底物)、S2266、S2288、S2366、S2444来自DiaPharma(Westchester,OH)，ChromozymTH来自Roche Diagnostics(Indianapolis,IN)，Spectrozyme(#299)和FVIIa来自American Diagnostica(Greenwich,CT)。3,4-二氯-异香豆素、BSA和Tween-20来自Sigma-Aldrich。
纤溶酶和因子XIa来自Haematologic Technologies Inc.(Essex Junction,VT)，血浆激肽释放酶来自Calbiochem(La Jolla,CA)，因子VII和因子XIIa来自Enzyme Research(South Bend,IN)，尿激酶型纤溶酶原活化剂(uPA)来自American Diagnostica，uPA原来自Fitzgerald Industries Int.(Concord,MA)。大鼠层粘连蛋白来自Millipore(Temecula,CA)。hepsin(人)、matriptase、小皮伞菌素(marapsin)、肝细胞生长因子活化剂(HGFA)、肝细胞生长因子原(HGF原)、自HGFA抑制剂-1(HAI-1)和HAI-2衍生的库尼茨域抑制剂-1(KD1)如先前所述重组表达并纯化(Kirchhofer et al.,2003;Kirchhofer et al.,2005;Li et al.,2009;Moran et al.,2006;Peek et al.,2002;Shia et al.,2005)。作为对照抗体，我们使用通过抗体噬菌体展示(Ganesan et al.,2009;Wu et al.,2007)生成的抗HGFA Fab或IgG(Fab40,Fab58,Fab75,IgG75)。
M13-KO7辅助噬菌体来自New England Biolabs。Maxisorp免疫板来自Nalgen NUNC International(Naperville,IL)。MyOne链霉亲合素来自Invitrogen(Carlsbad,CA)。3,3’,5,5’-四甲基-联苯胺/H2O2(TMB)过氧化物酶底物来自Kirkegaard and Perry Laboratories,Inc。中性亲合素和链霉亲合素来自Pierce Biotechnology,Inc。
prostasin的克隆、表达、和纯化：用T.ni细胞使用杆状病毒表达系统表达人prostasin包含C端flag标签的胞外域(Ala33-Leu321)。72小时温育后，收获上清液并在抗Flag M2抗体-琼脂糖柱(Sigma)上加载澄清后的培养液。用100mM甘氨酸,pH 3.0洗脱结合的蛋白质并立即用1M Tris pH 8.0中和。将获得的酶原形式的prostasin用重组matriptase于室温活化16小时。此后，通过在Ni-NTA柱上清除带(His)8标签("His8"披露为SEQ ID NO:59)的matriptase来纯化活化的双链prostasin。使用S-200柱通过大小排阻层析来进一步纯化prostasin。
小鼠hepsin的克隆、表达、和纯化：在与人hepsin(Moran et al.,2006)相似的条件下用T.ni细胞使用杆状病毒表达系统表达小鼠hepsin包含C端His标签的胞外域(Ser45-Pro416)。72小时温育后，收获上清液并在用含有50mMTris-HCl,pH 8.0,300mM NaCl的缓冲液预平衡的Ni-NTA柱(Qiagen)上加载澄清后的培养液。用含有50mM Tris-HCl,pH 8.0,300mM NaCl和250mM咪唑的缓冲液洗脱结合的蛋白质。
重组MSP和KD1的克隆、表达和纯化：如(Wahl et al.,1997)所述在中国仓鼠卵巢细胞中表达重组MSP。如(Shia et al.,2005)所述表达并纯化KD1。
用于Fab噬菌体展示的文库构建：如先前所述使用用于进行Fab噬菌体展示的噬菌粒(pF1359)构建称作YSGX文库的文库((Fellouse et al.,2007)中的文库D)。文库的多样性为2x1010左右。
噬菌体展示的抗hepsin Fab的选择和表征：对于噬菌体展示实验，我们使用生物素化hepsin(=生物素-hepsin)和与3,4-二氯-异香豆素(DCI)复合的生物素化hepsin(=生物素-hepsin:DCI)。使用Sulfo-NHS-LC-生物素试剂盒(Pierce,产品目录#21327)依照制造商的说明将hepsin生物素化。一些生物素化hepsin用于形成生物素-hepsin:DCI复合物，即与100μM DCI一起温育并在后续淘选实验中维持此DCI浓度。用DCI进行的在先实验显示了在用S2765底物进行的酶测定法中将hepsin对25-50μM DCI暴露40分钟则完全抑制hepsin活性。对于第一轮淘选，分别在100μM DCI缺失或存在下将10μg生物素-hepsin或生物素-hepsin:DCI与1ml浓度为1x1013pfu/ml的YSGX文库一起于4°C温育1.5小时。用100μlMyOne链霉亲合素对结合至靶物的噬菌体捕捉15分钟。用0.1M HCl洗脱结合的噬菌体，立即中和，然后遵循标准方案(Sidhu et al.,2000)扩增。自第二轮起，分别在无或有100μM DCI下将2μg生物素-hepsin或生物素-hepsin:DCI与400μl扩增的噬菌体一起于4°C温育1.5小时。用经中性亲合素或链霉亲合素(或者在各轮之间)包被并经封闭缓冲液(PBS,0.5%(w/v)BSA)封闭的Maxisorp免疫板(NUNC)对结合至生物素-hepsin或生物素-hepsin:DCI的噬菌体捕捉15分钟。五轮选择后，自以96孔形式培养的各个克隆生成噬菌体，并将培养物上清液在PBS,0.5%(w/v)BSA,0.1%(v/v)Tween 20(PBT缓冲液)中稀释三倍。将稀释的噬菌体上清液与在经中性亲合素包被的384孔Maxisorp免疫板(NUNC)上固定化的生物素-hepsin或生物素-hepsin:DCI一起温育1小时。将板用PBS,0.05%(v/v)Tween 20(PT缓冲液)清洗六次，并与辣根过氧化物酶/抗M13抗体缀合物(在PBT缓冲液中1:5000稀释)(Pharmacia)一起温育30分钟。将板用PT缓冲液清洗六次，用PBS清洗两次，用3,3’,5,5’-四甲基-联苯胺/H2O2过氧化物酶底物(Kirkegaard &Perry Laboratories)显色15分钟，用1.0M H3PO4淬灭并于450nm以分光光度法测量吸收。
使用单点噬菌体竞争ELISA来鉴定与KD1结合相同hepsin表位的噬菌体展示Fab。以96孔形式培养各个克隆，将培养物上清液在有或无200nM KD1的PBT缓冲液中稀释五倍，和与在经中性亲合素包被的384孔Maxisorp免疫板(NUNC)上固定化的生物素-Hepsin一起温育1小时。清洗板，并如上文所述通过抗M13-HRP检测结合的噬菌体。对于每一个克隆，计算200nM KD1缺失对200nM KD1存在下的A450的比值。认为任何比值超过2的克隆与KD1靶向相似表位。对此类克隆进行详细的与KD1的噬菌体竞争ELISA，其中使用一系列浓度的KD1(自10μM开始，1:3连续稀释)来与结合至hepsin的噬菌体展示Fab竞争。
抗hepsin Fab25和IgG25表达和纯化：一般地，贯穿本申请，IgG形式的抗体25命名有前缀Ab，而Fab形式的抗体25命名有前缀Fab。将一个终止密码子引入编码Fab25的噬菌粒上重链与基因3之间。将所得噬菌粒转化入大肠杆菌菌株34B8。将单菌落在30ml补充有50μg/ml羧苄青霉素的LB培养基中于37°C培养过夜。将5ml培养物接种入500ml完全C.R.A.P.培养基(为了制备1升：3.57g(NH4)2SO4,0.71g柠檬酸钠-2H2O,1.07g KCl,5.36g酵母提取物,5.36g Hycase SF。添加872ml去离子水。将pH用KOH调节至7.3。高压灭菌。冷却至55°C并添加110ml 1M MOPS pH 7.3,11ml 50%葡萄糖和7ml补充有羧苄青霉素(50μg/ml)的1M MgSO4)，并于30°C培养24小时。使用蛋白A琼脂糖树脂纯化Fab25蛋白质。
将选定Fab的轻链和重链可变域克隆入具有人轻链或重链(人IgG1)恒定域的基于pRK5的质粒，用于在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中瞬时表达。通过使用蛋白A琼脂糖层析纯化IgG25蛋白质。
用合成底物进行的酶测定法：将Fab25,IgG25,对照Fab或对照IgG与hepsin(1nM用于人，2nM用于小鼠hepsin)一起在Hepes缓冲液(20mM Hepes,pH 7.5,150mM NaCl,5mM CaCl2,0.01% Triton X-100)中于室温温育40分钟。对于用3,4-二氯-异香豆素(DCI)进行的实验，将hepsin(1nM)与DCI一起在含有0.5%DMSO的Hepes缓冲液中温育40分钟。添加S2765(终浓度0.2mM)，并在动态微量板读数仪(Versamax,Molecular Devices,Sunnyvale,CA)上测量405nm吸光度上升的线性速率。数据表述成分数酶活性(vi/vo)并拟合四参数回归曲线拟合程序(Kaleidagraph Version 3.6,Synergy Software)以确定IC50值。数值为三次独立实验的平均值±SD。通过将数据拟合紧密结合抑制系统的方程来计算Fab25和IgG25的Kiapp值(Morrison,1969;Olivero et al.,2005)。
为了检查Fab25特异性，将一组9种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶与1μMFab25一起在Hepes缓冲液中温育40分钟。添加适宜的显色底物，并在动态微量板读数仪上测量405nm吸光度上升的线性速率。所使用的每种酶和显色底物的浓度如下：1nM Hepsin-0.5mM S2765,0.5nM matriptase-0.5mMS2765,5nM prostasin-0.5mM S2765,2nM纤溶酶-0.5mM S2366,2nM血浆激肽释放酶–0.5mM S2366,0.5nM因子XIa–0.5mM S2366,5nMFXIIa–0.5mM S2288,5nM uPA–0.5mM S2444,50nM小皮伞菌素–0.2mMFVIIa,10nM HGFA–0.2mMFVIIa。数据表述成分数酶活性(vi/vo)，而且是3次独立实验的平均值±SD。
使用一组商品化pNA底物（都具有P1Arg残基）来检查Fab25对hepsin的抑制。8种底物为S2765,S2266,S2288,S2366,S2444,Chromozym TH,Spectrozyme fIXa和Spectrozyme FVIIa。测定法如上文所述进行，只是Fab25和对照Fab的浓度固定于100nM。底物的浓度为0.5mM。数据表述成无抑制活性（无Fab）的百分比抑制，而且是四次独立实验的平均值±SD。
用大分子底物进行的酶测定法：为了测量hepsin介导的uPA原活化，将Fab25在HBSA缓冲液(20mM Hepes,pH 7.5,150nM NaCl,5mM CaCl2,0.5mg/ml BSA)中连续稀释，并与hepsin一起于室温温育35分钟。酶反应通过添加uPA原来起始。反应混合物中hepsin和uPA原的浓度分别为0.5nM和100nM。以45秒间隔，将50μl等分试样转移至装有150μl/孔终止试剂HAI-2(667nM)的96孔板。添加S2444(0.5mM)后，在动态微量板读数仪上测量405nm吸光度上升的线性速率。数据表述成分数酶活性(vi/vo)并拟合四参数回归曲线拟合程序(Kaleidagraph)以确定IC50值。
对于因子VII活化测定法，将hepsin与Fab25或对照Fab一起在Hepes缓冲液中温育5分钟，之后添加因子VII。反应混合物中的浓度为：50nM hepsin,500nM Fab和8μM因子VII。于37°C温育0.5小时和2小时后，取出等分试样并在还原条件下通过SDS-PAGE(4-20%梯度凝胶,InVitrogen)进行分析。将凝胶用SimplyBlueTM(InVitrogen)染色。
hepsin对Fab25的体外蛋白水解加工：将Fab25(3μM)与10nM hepsin一起于室温温育24小时，或是在低pH缓冲液(100mM Mes pH 6.0,150mM NaCl)中或是在高pH缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0,150mM NaCl)中。反应通过添加20uL 2X样品缓冲液(有/无β-巯基乙醇)并于95°C煮沸5分钟来终止。通过用考马斯亮蓝染色的4-20%(w/v)聚丙烯酰胺梯度凝胶上的凝胶泳动率变动来监测蛋白水解。
细胞迁移测定法：使用24孔8.0μm孔径FluoroBlokTM可透过支持物(BDBiosciences,Bedford,MA)如先前所述实施细胞迁移测定法(Tripathi et al.,2008)。用未处理的或经处理的大鼠层粘连蛋白(1μg/ml)包被滤器的底面。将层粘连蛋白与hepsin或hepsin-Fab25复合物或磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)一起于4°C共温育过夜。然后将插件用superblock缓冲液封闭1小时。将DU145人前列腺癌细胞用胰蛋白酶处理，在无血清培养基中重悬浮，用无血清培养基清洗两次，并在插件的上室中接种细胞(20,000)。于5%CO2和37°C温育5小时后，使用棉签温和擦取上部滤器上剩余的细胞，并用PBS温和清洗插件。将那些迁移至下室的细胞用500μl甲醇固定30分钟，风干20分钟，并用500μl10μM YO-PRO-I(Invitrogen,Carlsbad,CA)染色10分钟。用PBS清洗板，并在读板仪(Spectramax M5,Molecular Devices,Sunnyvale,CA)中测量荧光，使用激发波长485nm和发射波长555nm。随后，用连接CCD照相机、带10x物镜的倒置显微镜(IX81,Olympus)对板成像。
Fab25对hepsin的结合：配备有链霉亲合素SBC生物传感器尖头的Octet-RED系统购自ForteBio(Menlo Park,CA)。在开始实验之前，将传感器尖头在含有50mM Hepes pH 7.5,150mM NaCl和0.05% tween-20的缓冲液中于25°C预湿15分钟。在1000rpm摇动下在链霉亲合素传感器上对生物素化hepsin(7.5μg/ml)捕捉5分钟。将传感器在缓冲液中简单清洗，之后将它们浸入装有Fab25(2倍连续稀释，自200nM开始)和缓冲液对照的样品孔。监测结合10分钟，并跟踪解离30分钟。使用Octet-RED分析软件将数据拟合1∶1结合模型。
LnCap细胞中细胞表面表达hepsin对MSP原的活化：如(Moran et al.,2006)所述生成LnCaP-34细胞，以稳定过表达hepsin，导致与只以与亲本LnCaP细胞相当的相对较低的水平表达内源hepsin的LnCaP-17细胞相比hepsin细胞表面表达升高5倍且hepsin酶活性升高3倍。将在24孔板中培养的汇合的LnCaP-17和LnCap-34细胞用无血清RPMI-1640培养基清洗，并单独地或与不同抗hepsin抑制剂(1μM抗hepsin抗体Fab25/1μM KD1/1μMAc-KQLR-cmk("KQLR"披露为SEQ ID NO:12))一起在无血清RPMI-1640培养基中于37°C温育15分钟，之后添加125I标记的MSP原(25μg/ml)。于37°C温育3小时后，取出等分试样并通过SDS-PAGE(4-20%梯度凝胶)(Invitrogen,Carlsbad,CA)分析，接着对X射线胶片曝光。
LnCap细胞中细胞表面表达hepsin对HGF原的活化：将在24孔板中培养的汇合的LnCap-34细胞用无血清RPMI-1640培养基清洗，并单独地或与重组hepsin(10nM)或与不同浓度的Fab25(20nM-0.15nM)一起在无血清RPMI-1640培养基中于37°C温育15分钟，之后添加125I标记的HGF原(25μg/ml)。于37°C温育3小时后，取出等分试样并通过SDS-PAGE(4-20%梯度凝胶)(Invitrogen,Carlsbad,CA)分析，接着对X射线胶片曝光。
通过表面等离振子共振测定的Ab25对hepsin的结合：在BIAcoreTM-3000仪器(GE Health Care,NJ)上实施了表面等离振子共振测量以测定Ab25的结合亲和力。在CM5生物传感器芯片上化学固定化（胺偶联）家兔抗人IgG，并捕捉Ab25以给出大约350个响应单位(RU)。为了动力学测量，于25°C以30μl/min流速注射HBS-P缓冲液中活性hepsin的两倍连续稀释液(1nM至500nM)。使用简单一对一Langmuir结合模型(BIA-Evaluation)获得结合速率(ka)和解离速率(kd)，并计算(kd/ka)平衡解离常数(KD)。由于快速的动力学，使用稳态测量来测定hepsin原与Ab25的结合亲和力。在捕捉的抗体(Ab25)传感器芯片上注射hepsin原的两倍连续稀释液(195nM至100mM)以实现最大结合(Rmax)及达到稳态平衡。使用BIA-Evaluation计算Req值并个别地针对C(hepsin原的浓度)绘图以确定KD。
等温滴定量热术：在ITC200仪器(GE healthcare)上实施TC实验。使用含有50mM HEPES pH 7.5和150mM NaCl的缓冲液在大小排阻层析柱(SuperdexS200,GE healthcare)上分开纯化Fab25和hepsin。给样品室(204μl)加载hepsin(14μM)，而注射器中的Fab25浓度为138μM。滴定实验通常由20次注射组成，每次2μL体积和180秒持续时间，各次添加间间隔3分钟。搅动速率为1000rpm。对原始数据整合，对非特异性热修正，对浓度标准化，并依照1:1结合模型来分析，假设有一组相同的结合位点。(登记等温滴定曲线，并使用与ITC仪器一起提供的ORIGIN软件分析。对数据整合以提供滴定曲线；并通过使用非线性最小二乘法拟合，自曲线提取结合常数KA、结合热(ΔH)、和结合化学计量。
结果/讨论
为了鉴定阻断hepsin酶活性的抗hepsin抗体，我们采用针对生物素化hepsin（无抑制剂）(生物素-hepsin)和针对与DCI复合的生物素化hepsin(生物素-hepsin:DCI)的溶液分选。DCI是一种基于机制的丝氨酸蛋白酶抑制剂，其通过与催化性Ser195和His57(糜蛋白酶原编号方式)形成共价单酰基或二酰基加合物而占据S1袋(图9A)(Powers et al.,1989)。hepsin:DCI复合物基于因子D:DCI复合物晶体结构(PDB code 1DIC)(Cole et al.,1998)的分子模型指示DCI抑制剂的芳香环会占据S1袋。我们先前的发现(Wu et al.,2007)指示自我们的Fab噬菌体展示文库衍生的功能阻断性抗HGFA抗体不占据S1袋。因此，hepsin结合的DCI可能不干扰抗体结合，但是能对活性位点构象发挥有益影响，有利于与抗体的相互作用。胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的活性位点是由几个内在活动的环（“活化域”）形成的(Huber and Bode,1978)。特别地，220环形成S1袋的一部分且能在一些丝氨酸蛋白酶中采取多种构象状态(Johnsonet al.,2005;Shia et al.,2005;Spraggon et al.,2009;Wilken et al.,2004)。只有脱辅基(apo)结构揭示此类环构象，而与活性位点抑制剂的共晶体结构显示正确形成的活性位点，最有可能是由于抑制剂施加的稳定力(Arni et al.,1994;Shiaet al.,2005;Spraggon et al.,2009)。Hepsin脱辅基结构是未知的，而且所有已发表的hepsin结构都是与活性位点抑制剂的共晶体结构(Herter et al.,2005;Somoza et al.,2003)。因此，我们推理DCI对S1袋的占据可对潜在环灵活性施加稳定力，有利于抗体识别。酶测定法显示超出20μM的DCI浓度在40分钟温育期后导致完全hepsin抑制(图9)。因此，在100μM DCI存在下进行针对生物素化hepsin:DCI复合物的噬菌体分选实验。
通过溶液分选使用命名为YSGX文库的，互补决定区(CDR)处化学多样性受限的最低限度合成抗体文库(Fellhouse et al,2007)来搜索针对hepsin的抑制性抗体，其中将生物素-hepsin或生物素-hepsin:DCI复合物与噬菌体展示Fab文库一起温育。针对生物素-hepsin:DCI的淘选产生一个hepsin结合克隆，命名为HpsFab25(也称作“Fab25”)，其在5轮选择后变得占优势。Fab25的HVR序列显示于图1。HpsFab25的CDR-H3很长(21个残基)，而且HpsFab25含有三个Lys残基。
实施ELISA实验来测试Fab25结合是否受KD1（一种结合hepsin活性位点的hepsin抑制剂）抑制。如图10中所示，KD1以浓度依赖性方式抑制Fab25噬菌体对hepsin的结合，提示Fab25结合hepsin活性位点区或其附近，且因此可能干扰酶活性。
使用合成hepsin底物S2765测试了Fab25抑制人和小鼠活性的能力。如图11中所示，Fab 25以浓度依赖性方式抑制人和小鼠hepsin活性，在测试的最高浓度达到完全抑制。计算Kiapp对人hepsin为4.1±1.0nM(n=3)，对小鼠hepsin为329±51nM(n=3)。别的用IgG25进行的实验显示它以11.3±1.7nM(n=3)的Kiapp抑制人hepsin，而对照IgG没有效果（数据未显示）。结果显示了Fab25以比鼠hepsin高约80倍的效力抑制人hepsin。这提示抗体结合位点在小鼠hepsin不是完全保守的。因为小鼠hepsin的蛋白酶域与人hepsin相比既没有插入又没有删除，所以Fab25降低的效力大概是由于对与Fab25的相互作用而言重要的氨基酸的变化。
使用Octet RED分析来测定Fab25对人hepsin的结合亲和力。Kd为2.55+/-0.45nM。
通过询问Fab 25是否抑制一组胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的酶活性测试了Fab 25的特异性。该组胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶包括hepsin的一些最接近蛋白酶域同源物，诸如血浆激肽释放酶、prostasin、marapsin和纤溶酶。结果(图12)证明Fab25具有针对hepsin的独占特异性，因为它在比对hepsin测定的Kiapp值高250倍的浓度不影响所检查的丝氨酸蛋白酶的酶活性。
测定了Fab25对hepsin介导的uPA原和因子VIII加工的影响。如图13A中所示，Fab25抑制hepsin针对uPA原的活性，IC50值为3.3±0.4nM (n=3)，与它在pNA测定法中的效力相当(表1)。在超出100nM的Fab浓度，抑制是完全的，而且与因子VII活化测定法中的强抑制相当(图13B)。因子VII是一种相对较差的hepsin底物，要求测定中的hepsin浓度较高(50nM)。因此，尽管以500nM使用Fab25，这导致与uPA原活化实验(高至600:1的比)相比相对较低的Fab25:hepsin比(10:1)，这可能说明延长的2小时实验期间的抑制是不完全的。
Hepsin优先在P1 Arg后面切割底物(Herter et al.,2005)，但也识别具有P1Lys的底物(Moran et al.,2006)。因此，我们考虑了hepsin可能切割Fab CDR-H3环的可能性，该环含有三个Lys残基，而且异常地长。优先来自最近关于抗matriptase抗体E2的研究，其在长CDR-H3环中的P1-Arg残基后面经历matriptase切割(Farady et al.,2008)。因此，在不同pH条件下将Fab25暴露于hepsin延长的时间段。Fab25在非还原条件下作为50kDa条带迁移，在还原条件下作为25kDa条带迁移，而且鉴定不到低分子量降解产物(图14)。因此，Fab25在暴露于hepsin延长的时间段时对hepsin蛋白水解有抗性。此结论与我们的假设，即生物素-hepsin:DCI复合物有利于选择在S1袋以外结合的噬菌体展示Fab一致。
最近确立了层粘连蛋白是hepsin的一种底物(Tripathi et al)。该研究还提示hepsin对层粘连蛋白的切割可在生理学上增强前列腺癌细胞系DU145的迁移。我们检查了Fab25是否抑制层粘连蛋白依赖性DU145细胞迁移。此实验的结果(图15)证明Fab25有效中和hepsin的蛋白水解活性且因此阻断其底物层粘连蛋白的加工。
我们还测试了Fab25抑制hepsin针对一组合成底物的活性的能力。表1之所示结果证明了Fab25将hepsin介导的对所有pNA底物的切割抑制>90%。因为pNA底物占据hepsin上的S1-S3亚位点，所以能得出结论，抗体强烈干扰这些亚位点处的底物相互作用。尽管pNA底物的P2和P3位置的化学多样性，对所有底物的抑制>90%的发现支持S2和/或S3位点处的强抗体效应而非这些位点处的微小影响。这些效应是否是变构性质的或直接空间位阻仍然有待阐明。另外，因为Fab25是针对DCI抑制的hepsin而选择的，所以Fab会通过直接占据S1袋来抑制hepsin是不太可能的。
表1：Fab25对hepsin针对一组合成底物的活性的抑制。将hepsin与100nMFab25或对照Fab一起温育40分钟，之后添加8种不同pNA底物。在动态微量板读数仪上测量初始线性速度，并且酶活性表述成相对于无Fab存在下hepsin活性的百分比。
表1
a反应混合物中100nM Fab
b对照为无Fab下的hepsin酶活性
Fab25在使用多种合成的和大分子的底物的所有功能测定法中显示出一致地将hepsin活性抑制>90%。
在LnCap-34细胞系(Moran et al.,2006)上监测细胞表面上天然表达的hepsin对MSP原的蛋白水解加工。表达hepsin的LnCap-34细胞能够加工125I-MSP原(图16)。MSP原加工的蛋白水解活性主要由于hepsin，因为所有三种hepsin抑制剂(Ac-KQLR-氯甲基酮("KQLR"披露为SEQ ID NO:12)、KD1和Fab25)有效阻断蛋白水解切割。
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尽管为了清楚理解的目的已经通过举例说明的方式较为详细的描述了上述发明，说明书和实施例不应解释为限制发明范围。

Claims (14)

1.一种分离的抗hepsin抗体，其中该抗体结合复合物中存在的hepsin，该复合物包含hepsin和结合人hepsin S1亚位点的丝氨酸蛋白酶抑制剂，且其中该抗体包含：
(a)HVR-H1，其由序列GFNFSYSYMH(SEQ ID NO:4)组成；
(b)HVR-H2，其由序列ASIYSYYGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:5)组成；
(c)HVR-H3，其由序列ARSDSWSYKSGYTQKIYSKGLDY(SEQ ID NO:6)组成；
(d)HVR-L1，其由序列RASQSVSSAVA(SEQ ID NO:1)组成；
(e)HVR-L2，其由序列SASSLYS(SEQ ID NO:2)组成；和
(f)HVR-L3，其由序列QQYYSSYYLLT(SEQ ID NO:3)组成。
2.权利要求1的抗体，其中该丝氨酸蛋白酶抑制剂为3,4-二氯-异香豆素(DCI)。
3.权利要求1的抗体，其中该抗体抑制hepsin介导的巨噬细胞刺激性蛋白(MSP)活化。
4.权利要求1的抗体，其中该抗体抑制层粘连蛋白依赖性细胞迁移。
5.权利要求1的抗体，其进一步包含选自SEQ ID NO：14-15、48和16；和SEQ ID NO：14-15、43和16所示重链可变域框架序列或选自SEQ ID NO：17-20；SEQ ID NO：49-51和20；SEQ ID NO：52-54和20；SEQ ID NO：55-57和20；和SEQ ID NO：17-18、58和20所示轻链可变域框架序列。
6.权利要求1的抗体，其包含(a)氨基酸序列SEQ ID NO:10所示的VH序列；或(b)氨基酸序列SEQ ID NO:9所示的VL序列。
7.权利要求6的抗体，其包含VH序列SEQ ID NO:10和VL序列SEQ IDNO:9。
8.前述权利要求任一项的抗体，其为全长IgG1抗体。
9.权利要求1-7任一项的抗体，其中该抗体包含人κ亚组共有框架序列和/或该抗体包含重链人亚组III共有框架序列。
10.权利要求8的抗体，其中该抗体包含人κ亚组共有框架序列和/或该抗体包含重链人亚组III共有框架序列。
11.分离的核酸，其编码前述权利要求任一项的抗体。
12.一种免疫偶联物，其包含权利要求1的抗体和细胞毒剂。
13.一种药物配制剂，其包含权利要求1的抗体和药学可接受载体。
14.一种生成抗丝氨酸蛋白酶抗体的方法，其包括选择结合复合物中存在的丝氨酸蛋白酶的抗体，该复合物包含(a)丝氨酸蛋白酶和(b)结合S1亚位点的丝氨酸蛋白酶抑制剂，其中该丝氨酸蛋白酶抑制剂为3,4-二氯-异香豆素，且其中该丝氨酸蛋白酶为hepsin。
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