CN104822706A - Ron组合物及其使用方法 - Google Patents

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L·桑特尔
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M·哈森
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Abstract

本发明涉及RON组合物、尤其是包含RON激动剂的RON组合物，和使用该组合物治疗疾病的方法。本发明还涉及诊断RON相关疾病或MSP相关疾病。

Description

RON组合物及其使用方法
相关申请
本申请涉及并要求2012年11月30日提交的美国临时申请号61/732,048和2013年5月15日提交的美国临时申请号61/823,744的优先权权益，所述专利申请通过引用的方式完整并入本文。
序列表
本申请含有通过EFS网提交的序列表并因而通过引用方式将其完整并入。所述ASCII副本在2013年11月20日创建，命名为P5505R1-WO_SL.txt，大小是382千比特。
相关技术背景
克罗恩氏病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)是以肠道内部慢性炎症反应为特征的两种炎性肠病(IBD)形式。在CD和UC患者中检查单核苷酸多态性(SNP)频率的全基因组相关性研究(GWAS)已经鉴定到许多共有的和独特的易感性等位基因。使用GWAS和候选基因方法，已经鉴定到巨噬细胞刺激蛋白(MSP)中认为与CD和UC易感性相关的多态性。参见例如，Barrett等人,2008,Nat Genet 40:955-62，和Consortium WTCC.2007,Nature 447:661-78。
负责这种增加的遗传风险的可能起因性等位基因是MSP中导致氨基酸689处精氨酸变成半胱氨酸(689R至689C)的非同义编码性SNP(rs3197999)。参见Goyette等人,2008,Mucosal Immunol 1:131-8。
MSP是由肝表达的纤维蛋白溶酶原相关的可溶性生长因子，以不能够结合其受体(Met家族受体酪氨酸激酶，Recepteur d’Origine Nantais(RON))的无活性单链蛋白(MSP原)形式分泌至血清中。MSP原在R483和V484之间的蛋白酶剪切使其转变成能够以高亲和力结合RON并诱导受体信号传导的有活性、二硫键连接的双链α/β异二聚体。参见Gaudino等人,1994,EMBO J 13:3524-32和Wang等人，1994,Science 266:117-9。α链包含N末端PAN结构域和后续的4个三环结构域，β-链含有C末端胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶结构域。MSP原可以由许多不同的丝氨酸蛋白酶以蛋白酶解方式激活，所述丝氨酸蛋白酶包含参与凝血级联和在炎症反应期间诱导的那些。参见例如，Wang等人,1994,J Biol Chem 269:3436-40。因此，MSP在组织损伤部位的切割导致RON局部激活。
已经报道RON表达在上皮细胞、巨噬细胞亚群、神经内分泌组织和正在发育的骨中，并且已经与诱导上皮细胞增殖、存活、移行和黏附于胞外基质关联。参见例如Iwama等人,1995,Blood 86:3394-403、Gaudino等人,1995,Oncogene 11:2627-37、Danilkovitch等人,1999,Exp Cell Res248:575-82和Danilkovitch等人,2000,Mol Cell Biol 20:2218-27。最近，已经提出MSP-RON途径是炎症反应的关键负向调节物。主要基于对鼠腹膜巨噬细胞的脂多糖和干扰素-γ刺激的研究，发现RON信号传导抑制促炎性因子的表达并上调可能参与组织修复的途径。参见例如，Chen等人,1998,J Immunol,161:4950-9和Wilson等人,2008,J Immunol,181:2303-10。RON在先天炎症反应中的阻抑作用已经得到体内研究支持，所述体内研究显示在RON中具有定向突变的小鼠显示出增强的内毒素攻击敏感性。参见Waltz等人,2001,J Clin Invest,108:567-76。这些体外和体内研究导致了以下推论：与MSP 689C多态性相关的增加的IBD遗传风险是由MSP和RON之间结合作用的改变、以及RON介导的巨噬细胞活化抑制作用方面的缺陷所导致的直接结果。参见Khor等人,2011,Nature 474:307-17、Gorlatova等人,2011,PLoS One 6:e27269。矛盾的是，更为近来的研究发现，689C多态性增加人单核细胞系中的MSP刺激性活性，引起更大的体外移行和增殖。Hauser等人,2012,Genes Immun 13:321-7。
因此，需要更好地理解MSP多态性在RON信号传导和RON相关疾病(包括IBD)中的作用、和更好的疗法用于治疗。
发明概述
本申请提供涉及受体d’Origine Nantais(RON)的试剂和组合物，尤其是RON激动剂，以及其使用方法和生产方法。在一个方面，本发明提供一种RON激动剂，其包含抗RON激动剂抗体或其抗原结合片段、或者与RON结合的巨噬细胞刺激蛋白(MSP)融合蛋白或其功能性片段。在一些实施方案中，RON激动剂包含MSP融合蛋白或其功能性片段。在一些实施方案中，MSP融合蛋白包含MSPβ和融合结构部分。在某些优选的实施方案中，融合结构部分包含二聚化结构域，包括而不限于免疫球蛋白Fc结构域。在一些实施方案中，免疫球蛋白Fc结构域包含IgG Fc结构域；并且在某些其他实施方案中，Fc结构域是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc结构域。在某些其他实施方案中，Fc结构域是IgG1Fc结构域。在一些实施方案中，Fc结构域还包含D265A和N297A(DANA)突变。在某些具体实施方案中，融合蛋白是二聚体。在某些其他实施方案中，融合蛋白在RON结合方面是双价的。在某些其他实施方案中，MSP融合蛋白还包含连接MSPβ和融合结构部分的接头、优选地肽接头。在一些实施方案中，肽接头具有2至20个氨基酸残基长度、优选地4-16个氨基酸残基长度和更优选地8-16个氨基酸残基长度。在一些实施方案中，肽接头具有16个氨基酸残基长度。在某些其他实施方案中，肽接头具有4个氨基酸残基长度。在某些具体实施方案中，MSP融合蛋白是人MSP融合蛋白。在其他实施方案中，MSP融合蛋白包含人MSPβ。在某些其他实施方案中，MSP融合蛋白包含人IgG1Fc结构域。在一些实施方案中，RON激动剂包含与SEQ ID NO:20、22或24的氨基酸序列具有至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的MSP融合蛋白。在某些其他实施方案中，RON激动剂包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的MSP融合蛋白。在某些具体实施方案中，MSP融合蛋白包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
在另外的其他实施方案中，RON激动剂包含抗RON激动剂抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗RON激动剂抗体包含单克隆抗体YW651.1或2E5.8.1的一个或多个高变区。在某些其他实施方案中，抗体是抗人RON激动剂抗体。在某些其他实施方案中，抗体是单克隆抗体、嵌合抗体人抗体、双特异性抗体或人源化抗体。
在另一个方面，本发明提供了包含一种或多种本文所述的RON激动剂和可药用载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含人MSP融合蛋白或其功能性片段。在某个实施方案中，药物组合物包含含有SEQ ID NO:20的氨基酸序的人MSP融合蛋白。在某些其他实施方案中，药物组合物包含抗人RON激动剂抗体或其抗原结合片段。
在又一个方面，本发明提供在有需求的受试者中治疗MSP相关的或RON相关的疾病或病症的方法，所述方法包括步骤：向受试者施用如本文所述的RON激动剂或包含该RON激动剂的药物组合物。在一些实施方案中，RON相关的疾病或病症与降低的RON活性相关。在某些具体实施方案中，降低的RON活性与上皮细胞增殖、存活或移行相关。在一些实施方案中，降低的RON活性与伤口愈合方面的缺陷、病况或障碍相关。在某些其他实施方案中，降低的RON活性与消化道或皮肤中上皮伤口愈合方面的缺陷、病况或障碍相关。在某些其他实施方案中，RON相关的疾病或病症包括而不限于炎性肠病(IBD)(包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病)、原发性硬化性胆管炎、或伤口愈合上的缺陷、病况或障碍。在某些其他实施方案中，IBD是溃疡性结肠炎。在另外的其他实施方案中，IBD是克罗恩氏病。
在一些实施方案中，伤口愈合上的缺陷、病况或障碍是纤维化疾病。在某些其他实施方案中，伤口愈合上的缺陷，病况或障碍与慢性上皮损伤相关，所述慢性上皮损伤包括而不限于特发性肺纤维化、硬皮病和原发性胆汁性肝硬化。在某些其他实施方案中，伤口愈合是上皮伤口愈合。在某些具体实施方案中，上皮伤口愈合缺陷发生在腔室、通道或管道的上皮衬层中。在一些实施方案中，上皮伤口愈合缺陷发生在肠的上皮衬层中。在一些实施方案中，上皮伤口愈合缺陷发生在结肠的上皮衬层中。不限于特定机制，在一些实施方案中，增强的上皮伤口愈合由增加的上皮增殖、存活和/或移行反映或实现。在某些其他实施方案中，伤口愈合由伤口闭合程度度量。在某些其他实施方案中，上皮伤口愈合缺陷出现在皮肤中。在一些实施方案中，伤口是慢性伤口、压力性伤口或压力性溃疡。在某些其他实施方案中，上皮伤口愈合缺陷与糖尿病相关。在一些实施方案中，伤口是糖尿病性伤口或糖尿病性溃疡，包括糖尿病性足溃疡。在某些具体实施方案中，受试者是糖尿病受试者。在某些其他实施方案中，受试者是糖尿病人患者。在一些实施方案中，RON激动剂包含人MSP融合蛋白或其功能性片段、或者抗人RON抗体或其抗原结合片段。在某些其他实施方案中，RON激动剂包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明方法还包括步骤：检测受试者中的血清MSP水平，任选地检测正常对照中的血清MSP水平，并且当受试者中的血清MSP水平与正常对照中的血清MSP水平相比较低时，向受试者施用RON激动剂或包含该RON激动剂的药物组合物。在某些其他实施方案中，该方法还包括步骤：检测受试者中的血清MSP水平，并且当受试者中的血清MSP水平与在正常对照中预先确定的血清MSP水平相比较低时，向受试者施用RON激动剂或包含该RON激动剂的药物组合物。在一些实施方案中，该方法还包括检测正常对照中血清MSP水平的步骤。在某些其他实施方案中，该方法还包括步骤：检测受试者中rs3197999多态性的存在，并且当受试者中检出rs3197999多态性时和/或当受试者中的血清MSP水平比正常对照低时，向受试者施用RON激动剂。在某些其他实施方案中，该方法还包括步骤：当受试者中检出rs3197999多态性并且受试者中的血清MSP水平比正常对照低时，向受试者施用RON激动剂。在一些实施方案中，RON激动剂包含人MSP融合蛋白或其功能性片段、或者抗人RON抗体或其抗原结合片段。在某些其他实施方案中，RON激动剂包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。可以通过本领域已知的任何方法，包括而不限于ELISA测定法，测量血清MSP水平。可以通过本领域已知的任何方法检测rs3197999多态性；示例性方法包括使用基于测序或基于PCR的测定法，如Applied Biosystem提供的TaqMan平台(TaqMan SNP基因分型分析，目录号4351379，Carlsbad，CA)，检测。
在另一个方面，本发明提供增强有需求的受试者中上皮伤口愈合的方法，所述方法包括向受试者施用RON激动剂或包含该RON激动剂的药物组合物的步骤。在又一个方面，本发明提供一种增加上皮细胞增殖、存活和/或移行的方法，所述方法包括使细胞与RON激动剂接触。在又一个方面，本发明提供一种增加有需求的受试者中上皮细胞增殖、存活和/或移行的方法，所述方法包括向受试者施用RON激动剂或包含该RON激动剂的药物组合物。在一些实施方案中，受试者患有IBD。在某些其他实施方案中，IBD是溃疡性结肠炎。在某些其他实施方案中，IBD是克罗恩氏病。在一些实施方案中，将RON激动剂或包含本发明激动剂的药物组合物有利地施用于已接受了外科手术的受试者，以增强在外部或内部手术切开后伤口愈合。在某些其他实施方案中，受试者是糖尿病受试者。在另外的其他实施方案中，受试者是糖尿病人患者。因此，在又一个方面中，本发明提供一种增强糖尿病受试者中上皮伤口愈合的方法。在一些实施方案中，上皮伤口愈合发生在糖尿病受试者的皮肤中。在一些实施方案中，RON激动剂包含人MSP融合蛋白或其功能性片段、或者抗人RON抗体或其抗原结合片段。在某些其他实施方案中，RON激动剂包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
在这些方面的一些实施方案中，所述方法还包括步骤：检测(1)rs3197999多态性的存在和/或(2)受试者的血清MSP水平，当受试者中检出rs3197999多态性时或当受试者的血清MSP水平比正常对照低时，向受试者施用RON激动剂。在一些实施方案中，该方法还包括检测正常对照中血清MSP水平的步骤。在一些实施方案中，该方法还包括步骤：(a)检测受试者中rs3197999多态性的存在并且当受试者中检出rs3197999多态性时向受试者施用RON激动剂，或(b)检测受试者中的血清MSP水平并且当受试者中的血清MSP水平与正常对照中的血清MSP水平相比较低时，向受试者施用RON激动剂。在某些其他实施方案中，该方法还包括步骤：当受试者中检出rs3197999多态性并且受试者中的血清MSP水平比正常对照低时，向受试者施用RON激动剂。
在又一个方面，本发明提供在有需求的受试者中治疗糖尿病的方法，所述方法包括向受试者施用RON激动剂或包含该RON激动剂的药物组合物的步骤。在另一个方面，本发明提供在有需求的受试者中降低血糖的方法，所述方法包括向受试者施用RON激动剂或包含该RON激动剂的药物组合物的步骤。在又一个方面，本发明提供治疗与糖尿病相关的病状的方法。在一些实施方案中，病状是但不限于糖尿病酮症酸中毒、代谢性酸中毒、高血糖、高血糖高渗性综合征或代谢综合征。在这些方面的一些实施方案中，RON激动剂包含人MSP融合蛋白或其功能性片段、或者抗人RON抗体或其抗原结合片段。在某些其他实施方案中，RON激动剂包含SEQ IDNO:20的氨基酸序列。
在这些方面的某些其他实施方案中，治疗糖尿病的方法还包括步骤：(a)检测受试者中rs3197999多态性的存在并且当受试者中检出rs3197999多态性时向受试者施用RON激动剂，和/或(b)检测受试者中的血清MSP水平并且当受试者中的血清MSP水平与正常对照中的血清MSP水平相比较低时，向受试者施用RON激动剂。
在一些实施方案中，还包括步骤：检测受试者中rs3197999多态性的存在，检测受试者中的血清MSP水平，并且当受试者中检出rs3197999多态性时和/或当受试者中的血清MSP水平比正常对照中低时，向受试者施用RON激动剂。在另外的其他实施方案中，该方法还包括步骤：检测受试者中rs3197999多态性的存在，检测受试者中的血清MSP水平，并且当受试者中检出rs3197999多态性时和当受试者中的血清MSP水平比正常对照中低时，向受试者施用RON激动剂。
在又一个方面，本发明提供一种在疑似患有IBD的试验受试者中诊断IBD的方法，所述方法包括步骤(a)检测或确定受试者的血清MSP水平，(b)任选地检测或确定正常对照的血清MSP水平，和(c)如果受试者的血清MSP水平低于对照的血清MSP水平，诊断该受试者患有IBD。在又一个方面，本发明提供一种在疑似有罹患IBD风险的试验受试者中诊断IBD的方法，所述方法包括步骤(a)检测或确定受试者的血清MSP水平，(b)任选地检测或确定正常对照的血清MSP水平，和(c)如果受试者的血清MSP水平低于对照的血清MSP水平，诊断该受试者有罹患IBD的风险。在一些实施方案中，该方法还包括步骤：确定试验受试者中rs3197999多态性的存在，并且当受试者中检出rs3197999多态性时，诊断受试者患有IBD或有罹患IBD的风险。
在又一个方面，本发明提供诊断疑似患有或有风险患有伤口愈合缺陷、病况或障碍的受试者的方法，包括步骤(a)检测受试者的血清MSP水平或检测受试者中rs3197999多态性的存在；(b)任选地检测正常对照的血清MSP水平；和(c)如果受试者的血清MSP水平低于正常对照的血清MSP水平，诊断受试者患有或有风险患有伤口愈合缺陷。在一些实施方案中，该方法还包括检测正常对照的血清MSP水平的步骤。在一些实施方案中，该方法还包括步骤：检测受试者的血清MSP水平并检测受试者中rs3197999多态性的存在，并且当受试者中检出rs3197999多态性时或当受试者的血清MSP水平低于正常对照的血清MSP水平时，诊断受试者患有或有风险患有伤口愈合缺陷、病况或障碍。在某些其他实施方案中，该方法还包括步骤：检测受试者的血清MSP水平并检测受试者中rs3197999多态性的存在，并且当受试者中检出rs3197999多态性且当受试者的血清MSP水平低于正常对照的血清MSP水平时，诊断受试者患有或有风险患有伤口愈合缺陷、病况或障碍。在一些实施方案中，伤口愈合是上皮细胞伤口愈合。在一些实施方案中，受试者患有IBD或有风险患有IBD。在某些其他实施方案中，受试者是糖尿病受试者。
在另一个方面，本发明提供使用本发明的抗RON抗体或MSP融合蛋白检测样品中RON的方法。在又一个方面，本发明提供了使用抗RON抗体或MSP融合蛋白在受试者中或在来自受试者的样品中诊断与改变的RON表达水平相关的疾病或病状的方法。
在以上全部方面的一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在以上全部方面的某些其他实施方案中，受试者是人。在以上全部方面的某些其他实施方案中，受试者是患有糖尿病的人。
在又一个方面，本发明提供分离的核酸分子，其具有编码RON激动剂的多核苷酸序列。在一些实施方案中，分离的核酸分子包含编码抗RON抗体的多核苷酸序列。在某些其他实施方案中，分离的核酸分子包含编码MSP融合蛋白的多核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸分子包含与SEQID NO:19、21或23的多核苷酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的多核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸分子包含SEQ ID NO:19、21或23的多核苷酸序列。在某些具体实施方案中，核酸分子包含SEQ ID NO:19的多核苷酸序列。
在另一个方面，本发明提供包含多核苷酸序列的载体，所述多核苷酸序列编码RON激动剂。在又一个方面，本发明提供宿主细胞，所述宿主细胞包含含有多核苷酸序列的核酸分子或包含多核苷酸序列的载体，其中所述多核苷酸序列编码RON激动剂。在一些实施方案中，载体是包含编码抗RON抗体的多核苷酸序列的表达载体。在某些其他实施方案中，载体是包含编码MSP融合蛋白的多核苷酸序列的表达载体。在某些具体实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。本发明也提供一种产生MSP融合蛋白的方法，所述方法包括步骤(a)在允许表达MSP融合蛋白的条件下培养宿主细胞；和(b)回收MSP融合蛋白。
在另一个方面，本发明提供分离的RON激动剂抗体。在一些实施方案中，RON激动剂抗体包含与单克隆抗体YW651.1或2E5.8.1的高变区序列至少95％相同的高变区序列。在一些实施方案中，抗体是抗人RON激动剂抗体。
在其他方面，本发明提供包含多核苷酸序列的分离核酸分子，所述多核苷酸序列编码RON激动剂抗体。在一些实施方案中，抗体是抗人RON激动剂抗体。在另一个方面，本发明提供包含多核苷酸序列的载体，所述多核苷酸序列编码抗人RON抗体。在又一个方面，本发明提供宿主细胞，所述宿主细胞包含含有编码抗体的多核苷酸的核酸分子，或包含含有编码抗体的多核苷酸序列的载体。在一些实施方案中，载体是包含多核苷酸序列的表达载体，所述多核苷酸序列编码分离的抗体。本发明也提供一种产生本文所述的分离抗体的方法，所述方法包括步骤(a)在允许表达分离抗体的条件下培养宿主细胞；和(b)回收分离的抗体。
在又一个方面，本发明提供RON激动剂用于制备治疗MSP相关或RON相关的疾病或病症的药物的用途。在一些实施方案中，MSP相关或RON相关的疾病或病症是IBD或伤口愈合，特别地是上皮伤口愈合，的缺陷。在某些其他实施方案中，RON激动剂是抗人RON抗体或人MSP融合蛋白。
本发明的具体实施方案将从以下对某些优选实施方案的更详细描述和权利要求书显而易见。
除非上下文另外清楚地指明，否则上文描述的任何和全部实施方案可以适用于本发明的任何和全部方面。
附图简述
图1A-D显示了检验RON在小鼠髓样细胞群体和上皮细胞群体中表达的结果。图1A显示所示细胞群体或组织的单细胞悬液的直方图，其中使用鼠RON特异性单克隆抗体(Ph4抗体，Genentech)(Chaudhuri等人，提交用于发表的手稿)或同种型对照抗体(加阴影直方图)，通过流式细胞术分析所述单细胞悬液的RON表达。对巨噬细胞群体设门，其中对离体来源的细胞使用CD45+F4/80+CD11b+MHC II类+，对骨髓培养细胞使用F4/80+CD11b+。结肠上皮细胞设门为CD45-E钙黏着蛋白+。图1B显示来自正常小鼠结肠的组织切片的免疫组织化学染色的显微照片，显示了RON在上皮细胞的基底外侧面表达。图1C展示来自正常小鼠结肠的组织切片的免疫荧光染色的显微照片，其中对所述组织切片进行RON染色并且对细胞核进行复染。白色箭头显示单个上皮细胞的顶面。图1D显示来自小鼠结肠的组织切片的免疫荧光染色的显微照片，其中在用硫酸葡聚糖钠(DSS)处理后6日取得所述组织，进行RON、MHC II类、F4/80染色，并进行细胞核复染(A-D)。显示单独染色和合并图像(A-D)。图1E显示RON的免疫荧光染色的显微照片。比例尺＝100μm(B)，10μm(C)，20μm(D)和40μm(E)。这些图涉及实施例1。
图2A-D展示实施例1中描述的结果，显示RON在人类中由上皮细胞优先地表达。图2A显示人细胞系和原代细胞中RON表达的定量RT-PCR调查结果。栏1：HEK293对照，栏2-4：上皮细胞系(HCT115、HT29、HPC4)，栏5-6：单核细胞系(U937、THP-1)，栏7：人CD14+单核细胞(monos)，和栏8-11：保持未处理的或用所示刺激物处理的单核细胞来源的巨噬细胞(MDM)。栏1-7中的数据是三份独立样品的均数+/-SD，栏8-11中的数据是两个供体的均数。图2B显示单细胞悬液的RON表达的流式细胞分析的直方图。用人RON特异性单克隆抗体(克隆1A2.2，Chaudhuri等人,2011,J Biol Chem.286(37):32762-74)或同种型对照抗体(加阴影直方图)染色细胞。将MDM设门为CD14+CD33+。图2C显示来自正常结肠、UC结肠和CD结肠的组织切片的显微照片，对所述组织切片进行RON表达的免疫组织化学染色。比例尺＝100μm。图2D总结了在人肠道活组织检查样品中定量RT-PCR分析RON表达的数据，其中所述人肠道活组织检查样品取自正常个体以及UC患者和CD患者的未发炎区域和发炎区域。图2E显示从溃疡性结肠炎患者切除的肠组织的单细胞悬液中RON表达的流式细胞分析的直方图，其中使用人RON特异性单克隆抗体(克隆1A2.2)或同种型对照抗体(加阴影直方图)进行分析。将巨噬细胞设门为CD45+CD14+HLADR+并且将上皮细胞设门为CD45-EpCAM+细胞。巨噬细胞数据代表六个供体，上皮细胞数据代表三个供体。图2F显示来自多个供体的切除肠组织的巨噬细胞和上皮细胞中RON表达的定量结果。显示患者数目。数据表示RON染色对同种型对照染色的平均荧光强度比。点划线表示比率1:1，即缺少RON表达。N，无IBD。图2G描述的直方图显示未处理的细胞或用与图2E相同的消化条件处理的细胞中RON表达水平。
图3A-E显示实施例2重组人MSP蛋白结合研究的结果。图3A是这项研究中使用的重组人MSP蛋白的示意图。显示了含有由二硫键连接的α和β链的野生型MSP蛋白(SEQ ID NO:12)，指出了PAN结构域(N)、三环结构域(K)、丝氨酸蛋白酶样结构域(SPL)。单链MSP(scMSP)(SEQ IDNO:6)是组成型无活性的，原因是蛋白酶剪切位点处的R483E突变(箭头)。产生689R形式和689C形式的全长MSP蛋白和MSPβ蛋白(分别是SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:10)。图3B显示使用平板结合的RON-Fc(SEQ IDNO:44)和可溶性MSP的无细胞结合试验的结果。显示每组三个重复的均数。曲线代表针对4参数方程拟合的剂量-反应曲线，针对MSP 689R、689C、MSPβ689R(SEQ ID NO：2、4和8)和MSPβ689C(SEQ ID NO:10)分别产生了EC50值0.1、0.2、0.05和0.1nM。图3C展示MSP蛋白与固定化RON Sema/PSI结合的SPR分析结果，以响应单位显示相对响应。数据代表三次独立实验。图3D显示MSP与RON结合的放射配体结合试验结果。显示了与3T3-hRON细胞的竞争结合(大图)，用来产生亲和力和斯卡查德图(插图)。显示三次独立实验的均数+/-标准差(SD)。图3E是与MSP b(PDB代码2ASU)(显示在顶部)结合的RON Sema/PSI(PDB代码4FWW)(显示在底部)结构的同源模型。将RON和MSPβ与Met/HGFβ复合物(PDB代码1SHY)在总体上对齐。星号标出在RON内的MSPβ接触残基的预测位置。MSPβ残基689突变成半胱氨酸并由箭头标出。RON的残基A223位于的假S1口袋顶部。
图4A-B展示考马斯亮兰染色的凝胶电泳图，其显示MSP原的蛋白酶解加工。由MSP原和MSP组成的纯化MSP 689R(图4A)和MSP 689C(图4B)与渐增量的hepsin混合并在还原条件下通过凝胶电泳分析。显示与MSP原、MSPα和MSPβ对应的相对迁移率。数据代表三次独立实验。数据涉及实施例3。
图5A展示在所示处理的A2780-hRON细胞和BxPC3细胞中总Akt和pAkt的蛋白质印迹分析的照片。一式三份进行印迹并且显示pAkt/总比率的均数。图5B显示MSD分析用scMSP或MSP变体处理的3T3-hRON细胞的结果。显示三次处理的均值+/-SD。数据代表三次独立实验。图5C显示来自用scMSP或MSP变体处理的3T3-hRON细胞的划痕试验的图像。在划痕后在所示时间自相同的细胞培养物获取图像。短划线代表初始划痕的位置。图5D显示对来自3T3-hRON细胞划痕试验的结果的定量，所述3T3-hRON细胞用培养基单独处理或用scMSP或MSP变体处理。显示三次处理的均值+/-SD。数据代表三次独立实验。图5E显示对来自亲本3T3细胞(不表达RON受体)的划痕试验结果的定量，所述亲本3T3细胞用scMSP或MSP变体处理。显示三次处理的均值，误差线显示标准差。数据代表三次独立实验。这些图涉及实施例4。
图6A总结了实施例5分析来自EMBARK队列的正常、UC患者和CD患者的DNA样品中rs3197999等位基因的结果。C等位基因编码MSP689R，T等位基因编码MSP 689C。显示每个组的等位基因频率和数目。图6B显示EMBARK受试者的匹配血清样品中由ELISA测定的血清MSP浓度，结果按rs3197999基因型分组。*，p＝0.0009；**，p<0.001。图6C显示按基因型和疾病状态分组的血清MSP浓度。图6D显示MSP ELISA测定在重组人MSP变体和scMSP上的灵敏度。误差线代表标准差。
图7A涉及实施例5，其显示使用对pcDNA5/FRT中MSP表达盒特异的引物在稳定转染的细胞上获得的定量PCR数据的柱形图。使用ΔCT方法，将MSP盒的值对总DNA归一化。显示了两个表达689R的克隆和两个表达689C的克隆的值。数据是三份独立样品的均数，误差线代表标准差。亲本293FlpIn细胞。图7B的柱形图显示ELISA测定的结果，所述ELISA测定测量稳定转染的细胞克隆向细胞上清液分泌的MSP。通过CellTiter-Glo测定法(Promega)，相对于细胞量的差异，控制ELISA值。显示了两个表达689R的克隆和两个表达689C的克隆的值。数据是三份独立样品的均数并且误差线代表标准差。亲本293FlpIn细胞。
图8描述了MSPβ-IgG Fc融合蛋白的设计。人或小鼠MSPβ与具有或没有长4、8、12或16个氨基酸残基的肽接头的小鼠IgG2a的Fc结构域融合。在实施例部分中描述融合蛋白的克隆。
图9显示了检查人全长MSP、人及鼠和不同MSPβ-Fc融合蛋白对鼠RON-Fc的结合活性的结合测定试验的实验设计和结果。该图涉及实施例6。
图10显示实施例7的结果，显示在体外MSPβ-Fc融合蛋白与小鼠RON(mRON)结合并且激活mRON信号传导。图10A-B显示各种mMSPβ-IgG2a蛋白与细胞表面上表达mRON的3T3细胞(A)或亲本3T3细胞(B)结合的结合数据。图10C显示蛋白质印迹分析的图像，所述分析检测人原代结肠细胞中由m12m(mMSPβ-L12-mIgG2a，SEQ ID NO:30)融合蛋白诱导的磷酸化Akt(顶部小图)或总Akt(底部小图)。图10D的图总结接头长度对3T3-mRON稳定细胞中mRON激活的影响。图10E的柱形图显示激活作用依赖于3T3细胞中mRON表达。
图11显示实施例8的实验设计和结果，其中在小鼠结肠上皮细胞上检查MSP融合蛋白的体内结合作用。将注射PBS的、注射抗豚草同种型对照的、和注射MSPβ-L12-mIgG2a的小鼠的结肠上皮切片，用Alexa Fluor647缀合的山羊抗小鼠抗体(Invitrogen)染色，并且使用Leica SPE共聚焦显微镜(Leica Microsystems)检测信号。
图12A显示在体内检查RON激动作用的实施例9的实验设计。图12B显示蛋白质印迹分析的图像，其中在野生型或RON敲除小鼠中在小鼠结肠裂解物内检测由MSPβ-Fc融合物或抗豚草同种型对照诱导的磷酸化Akt。图12C总结了通过用多种mMSPβ-Fc融合蛋白测量Akt磷酸化获得的RON激活水平。
图13A显示了检验结肠上皮组织中RON信号传导的实验设计。使用抗磷酸Akt抗体，通过免疫组织化学，对来自注射MSPβ-Fc融合蛋白的小鼠(图13C)或注射抗豚草同种型对照的小鼠(图13B)的结肠组织切片，进行染色。这些图涉及实施例9。
图14A和图14C展示了抗RON单克隆抗体2E5.8.1和YW651.1与3T3-mRON细胞表面上表达的mRON结合的曲线。图14B和图14D显示的结果说明，结合作用是RON特异的，因为在不表达mRON的亲本3T3细胞中未检测到结合作用。这些图涉及实施例10。
图15A-B展示实施例11的结果，显示3T3-mRON细胞或对照细胞中由MSP融合蛋白和抗mRON激动剂抗体诱导的Akt磷酸化。
图16的柱形图总结抗RON抗体阻断RON测定试验的结果，如实施例12中所述。
图17展示了检验RON激动剂抗体下调RON的实施例13的实验设计。
图18的柱形图总结实施例13的结果，显示激动剂抗体不下调RON。
图19A展示实施例14的结果，显示在3T3-mRON细胞中MSP融合蛋白和Ron激动剂抗体对伤口愈合的影响。在RON阴性的亲本3T3细胞中显示无影响(图19B)。
图20A显示实施例15的实验设计、以及在分离自注射了RON激动剂抗体的小鼠的结肠细胞中体内RON活性测定试验的结果。图20B-C显示在db/db小鼠(B)或WT和RON TK-/-小鼠(C)中在用激动剂抗体YW651.1处理或不处理的情况下在无伤口皮肤中pAKT诱导的结果。*，p<0.003；**，p<0.0001。
图21A显示的曲线总结实施例16的体内伤口愈合试验的数据，其中在db/db糖尿病小鼠中使用RON激动剂抗体YW651.1进行所述试验。图21B显示用对照抗体或激动剂抗体YW651.1-IgG2a处理的db/db小鼠中在第4日或第20日的皮肤伤口闭合的拍摄图像。图21C展示受伤组织中激动剂抗体诱导pAKT的定量性数据。
图22总结实施例16的结果，显示RON激动剂抗体在降低db/db小鼠血糖水平上的作用。
发明详述
本文中引用的全部出版物、专利和专利申请特此通过参考的方式明确并入用于全部目的。
在本申请范围内，除非另外声明，否则所用的技术可以在几种熟知参考文献的任一者中找到，如：Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Sambrook等人,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press)和PCRProtocols:A Guide to Methods and Applications(Innis等人1990.Academic Press,San Diego,CA)。
如本文中所用，除非上下文另外清楚地说明，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数称谓。例如，对“一种分离的抗体”的提及意指一种或多种分离的抗体。
除非上下文另外清楚地指明，否则下文描述的任何和每个实施方案适用于本发明的任何和每个方面。除非上下文另外清楚地说明，否则在不同方面之中和之间的全部实施方案可以组合。
I.定义
如本文所用的术语MSP包括来自任何哺乳动物来源的任何天然MSP，所述哺乳动物来源包括哺乳动物如灵长类(例如人)和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。术语MSP涵盖“全长MSP”、“MSP原”和缺少前导序列(例如，信号肽或信号序列)的分泌型MSP。如本文所用，全长MSP和MSP原具有相同的长度，但差异在于:MSP原为尚未进行蛋白酶解加工以产生α链和β链的无活性MSP。MSP原由转化酶如丝氨酸蛋白酶hepsin进行蛋白酶解切割以产生α和β链，所述链形成由二硫键连接的异二聚体(全长MSP)。前导序列在成熟之前切去，活性的MSP蛋白从细胞分泌。在一些实施方案中，MSP还涵盖天然存在的MSP变体，例如，剪接变体或等位变体。在某些其他实施方案中，MSP包含在不削弱功能的情况下促进重组产生蛋白质的一或多个突变。这类突变例如包括具有组氨酸标签(His标签)的MSP、人MSP中的C672A、和小鼠MSP中的C677A。在某些具体实施方案中，该MSP是人MSP。SEQ ID NO:2中显示示例性人MSP的氨基酸序列。
MSPβ指含有RON结合部位的MSP的β链。MSPβ单独足以与RON结合。在某些有利实施方案，二聚化MSPβ促进RON结合和募集。在一些实施方案中，MSPβ构建体含有在MSPβ从细胞分泌到胞外环境之前移除的外源前导序列(例如，如SEQ ID NO:55中所示的HGF前导序列)。在某些其他实施方案中，将突变引入MSPβ中，以移除在全长MSP情况下与MSPα链形成二硫键的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，突变是在人MSPβ中的C588S或C588A突变，或小鼠MSPβ中的C593S或C593A突变。在本公开全文，MSP或MSPβ的氨基酸残基编号基于MSP原的氨基酸残基编号。
在一些实施方案中，MSP融合蛋白包含MSPβ和融合结构部分。在某些其他实施方案中，MSP融合蛋白包含MSPβ的功能性片段和融合结构部分。在某些其他实施方案中，MSP融合蛋白包含MSPβ和融合结构部分，或其功能性片段。
术语蛋白质的“功能性片段”指比全长蛋白质短但仍保留全长蛋白的期望功能(如与RON结合)的截短多肽。在一些实施方案中，MSP融合蛋白的功能性片段包含人MSP的氨基酸序列V484-M708、V484-V700或V484-F694。参见Carafoli等人,FEBS J 272(22):5799-807。基于本领域已知的MSP序列和结构和本文提供的指导，本领域的普通技术人员能够设计并制备适用于本发明的MSP功能性片段。
术语“scMSP”或“单链MSP”指在MSP原切割位点的P1位置中含有突变的不可切割的无活性MSP原。例如，单链人MSP含有阻断hepsin切割的R483E突变。scMSP可以含有如所示的其他突变(如R689C)。
在某些方面，本发明提供治疗方法或诊断方法，所述方法包括步骤：检测在试验受试者中的血清MSP水平，当受试者的血清MSP水平低于正常对照时，向受试者施用RON激动剂或作出RON相关疾病或MSP相关疾病的诊断。在正常对照中的血清MSP水平可以是在群体中先前测量的或已知的已知平均正常水平，或可以每次测量。在一些实施方案中，“正常对照”或“对照”在本上下文中指具有野生型MSP基因的个体、优选地人。在某些其他实施方案中，对照样品源自不具有rs3197999多态性的个体，优选地人。
术语“RON激动剂”指刺激RON活性和/或通过RON激活RON下游信号传导事件的分子。在一些实施方案中，通过Akt的磷酸化测量RON活性。本领域技术人员能够分析其他RON下游效应子作为RON激动剂活性的指示。在一些实施方案中，RON激动剂是MSP融合蛋白。在某些优选的实施方案中，MSP融合蛋白包含能够形成二聚体的融合结构部分。在某些其他实施方案中，二聚体MSP融合蛋白结合并募集细胞表面上的RON，刺激RON信号传导。在一些实施方案中，融合蛋白是Fc融合蛋白。可以理解，融合结构部分可以是能够二聚化的另一分子。这种融合结构部分包括而不限于亮氨酸拉链基序。在某些其他实施方案中，二聚体RON激动剂包含通过接头、优选地柔性接头、最优选地柔性肽接头连接的两个MSPβ结构域。
术语“rs3197999多态性”指人MSP基因座中的R689C突变。可以通过本领域已知的任何合适方法，包括而不限于测序、限制性片段长度多态性分析、PCR分析如基于TaqMan的qPCR测定法，或通过微阵列方案如SNP阵列，检测rs3197999多态性的存在。本领域技术人员能够设计用于检测多态性的合适引物和探针。
出于本文目的，“人构架”是这样的构架，它包含源自人免疫球蛋白构架或人共有构架(如下文定义)的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架的氨基酸序列。“源自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的受体人构架可以包含与其相同的氨基酸序列，或它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小、或2或更小。在一些实施方案中，VL受体人构架在序列上与VL人免疫球蛋白构架序列或人共有构架序列相同。
“亲和力”指分子(例如，抗体)的单一结合位点及其结合配偶体(例如，抗原)之间非共价相互作用的总和的强度。除非另外指出，否则如本文所用，“结合亲和力”指固有结合亲和力，反映结合对子的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶物Y的亲和力通常可以由解离常数(Kd)代表。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量，包括本文所述的那些方法。本申请中描述了用于测量结合亲和力的具体举例说明性和示例性实施方案。
“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中存在一个或多个改变的抗体，其中与不拥有这些改变的亲本抗体相比，所述改变导致抗体对抗原的亲和力改善。
术语“抗RON抗体”和“与RON结合的抗体”指这样的抗体，所述抗体能够以足够亲和力结合RON，从而该抗体可用作靶向RON的诊断药和/或治疗药。在一个实施方案中，抗RON抗体与不相关的非RON蛋白结合的程度小于该抗体与RON结合的约10％，如通过放射免疫测定试验(RIA)所测量。在一些实施方案中，与RON结合的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM(例如10-8M或更小、例如从10-8M至10-13M、例如从10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在一些实施方案中，抗RON抗体与在不同物种的RON之间保守的RON表位结合。在某些优选的实施方案中，抗RON抗体是激动剂抗RON抗体。
术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。
“抗体片段”或“抗原结合片段”指不同于完整抗体的分子，所述分子包括完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv；Fab；Fab'；Fab’-SH；F(ab')2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和从抗体片段形成的多特异性(包括双特异性)抗体。
术语“嵌合”抗体指这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分源自不同来源或物种。
抗体的“类”指由抗体重链拥有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种可以进一步划分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ和μ。
“效应子功能”指随抗体同种型变动的、归因于抗体Fc区的那些生物学活性。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)；Fc受体结合作用；抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；和B细胞活化。
药物(例如，药物制剂)的“有效的……量”、“有效量”或“治疗有效量”指，按所需剂量和时间段，所述量可以有效地实现期望的治疗或预防结果，例如刺激RON信号传导、促进上皮增殖或增强伤口愈合。构成“有效量”或“治疗有效量”的化合物的量可以根据疾病的严重性、待治疗患者的状况或年龄、或施用途径而变动，但是可以由本领域普通技术人员常规地确定。
术语“Fc区”在本文中用来定义含有至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链C端区域。该定义包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文中另外说明，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基编号根据Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interes,第5版,Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述的EU编号体系，也称作EU索引。
“构架”或“FR”指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由4个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR序列和FR序列通常按以下顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，指所述抗体具有与天然抗体结构基本上相似的结构或具有含有如本文定义的Fc区的重链。
“人抗体”是具有如下氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列、或对应于从利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人来源产生的抗体的氨基酸序列。人抗体的该定义特别地排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有构架”是这样的构架，它代表在选择的一组人免疫球蛋白VL或VH构架序列中最常见的氨基酸残基。通常，所选的该组人免疫球蛋白VL或VH构架序列来自可变结构域序列的亚组。通常，该序列亚组是如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest(目的免疫蛋白质的序列)，第5版，NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991)，第1-3卷中描述的亚组。在一个实施方案中，对于VL，该亚组是如上文Kabat等人中描述的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，该亚组是如上文Kabat等人中描述的亚组III。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在一些实施方案中，人源化抗体将包含至少1个、并且一般2个可变结构域的基本上全部，其中HVR(例如，CDR)的全部或基本上全部相应于非人抗体的，而FR的全部或基本上全部相应于人抗体的。人源化抗体任选地可以包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体的“人源化形式”例如，非人抗体，指已经历过人源化的抗体。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”指，抗体可变结域中在序列上高变(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上确定的环(“高变环”)，和/或含有抗原接触残基(“抗原接触者”)的每个区域。通常，抗体包含六个HVR：VH中三个(H1、H2、H3)和VL中三个(L1、L2、L3)。本文中的示例性HVR包括(a)存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处的高变环(Chothia和LeskJ.Mol.Biol.196:901-917(1987))；(b)存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处的CDR(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；(c)存在于氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处的抗原接触残基(MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。
除非另外说明，否则可变域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据上文Kabat等人编号。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，奶牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，个体或受试者是人。
“分离的”抗体是已经与其自然环境的组分分开的抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳法)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)所确定。关于评估抗体纯度的方法的综述，见，例如，Flatman等人,2007,J.Chromatogr.B 848:79-87。
“分离的”核酸指已经与其自然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括包含于通常含有该核酸分子的细胞内的核酸分子，只是该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
“编码抗RON抗体的分离核酸”指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或多个核酸分子，包括在单一载体或分开载体中的该核酸分子、和存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的该核酸分子。
如本文中所用的术语“单克隆抗体”指从基本上均一的抗体群体获得的抗体，所述基本上均一的抗体群体是指，除了可能的变体抗体之外，构成该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，所述变体可以例如含有天然突变或在生产单克隆抗体制备物期间出现，这类变体通常以微小的量存在。与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物中的每个单克隆抗体都针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”指该抗体从基本上均一的抗体群体获得的特征，而不应解释为要求通过任何特定方法产生该抗体。例如，可以通过多种技术产生可用于本发明的单克隆抗体，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于产生单克隆抗体的这些方法和其他示例性方法。
“裸抗体”指不与异源部分(例如，细胞毒性部分)或放射标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。
“天然抗体”指具有各种结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是由二硫键结合的两条相同轻链和两条相同重链组成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。从N端至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，也称作可变重链结构域或重链可变结构域，随后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N端至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，也称作可变轻链结构域或轻链可变结构域，随后是一个恒定轻链(CL)结构域。抗体的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而划分成两种类型之一，称作κ(Kappa)和λ(Lambda)。
相对于参考多肽序列，“氨基酸序列同一性百分数(％)”定义为，比对序列并根据需要引入空位以实现最大序列同一性百分数后，不将任何保守性置换考虑为序列同一性的部分，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。为了确定氨基酸序列同一性百分数而进行的比对，可以按本领域的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的序列在全长范围内的最大对齐而需要的任何算法。然而，出于本文目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.授权，源代码已经随用户文档提交至华盛顿特区20559的美国版权局，其登记在美国版权登记号TXU510087下。ALIGN-2程序可从Genentech,Inc.,South San Francisco,加利福尼亚州公开获得，或可以从源代码编译。应当将ALIGN-2程序编译在UNIX操作系统(包括Digital UNIX V4.0D)上使用。全部序列比较参数由ALIGN-2程序设定并且不变动。
在使用ALIGN-2比较氨基酸序列的情况下，如下计算给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B、同给定氨基酸序列B或相对于给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(这可以备选地描述为：与给定氨基酸序列B、同给定氨基酸序列B或相对于给定氨基酸序列B具有或包含某个氨基酸序列同一性％的给定氨基酸序列A)：
100乘以分数X/Y
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评定为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。可以理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对于B的氨基酸序列同一性％将不等于B相对于A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别声明，否则本文所用的全部氨基酸序列同一性％值使用ALIGN-2计算机程序如上一段落中描述而获得。
术语“药物制剂”指一种制备物，所述制备物的形式允许其中所含的活性成分的生物活性有效，并且不含有对于待施用该制剂的受试者具有不可接受的毒性的其它组分。
“可药用载体”指药物制剂中除活性成分之外的对受试者无毒的成分。可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文所用，“治疗”(和其语法变型，如动词“治疗”或分词“治疗”)指，意欲改变所治疗的个体的天然过程的临床介入，其可以为了预防或在临床病理学过程期间实施。期望的治疗效果包括，但不限于，防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进程。
术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链中参与抗体结合抗原的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别是VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freemanand Co.，第91页(2007))。单个VH结构域或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。而且，结合特定抗原的抗体可以利用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域分别筛选互补性VL结构域或VH结构域文库而分离。参见，例如，Portolano等人,1993,J.Immunol.150:880-887；Clarkson等人,1991,Nature 352:624-628。
如本文所用，术语“载体”指能够使与其连接的另一核酸增殖的核酸分子。该术语包括自我复制型核酸结构的载体、以及并入已经引入了该载体的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与它们有效连接的核酸表达。这类载体在本文中称作“表达载体”。
II.组合物和方法
在一个方面，本发明部分地基于RON激动剂和使用该激动剂治疗MSP相关或RON相关的疾病或病症的方法。在一些实施方案中，提供与人RON结合的抗体。本发明的抗体例如可用于诊断或治疗MSP相关的或RON相关的疾病。
A.示例性抗RON抗体
在一个方面，本发明提供与人RON结合的分离抗体。在一些实施方案中，抗RON抗体是具有RON活性的激动剂。在某些其他实施方案中，RON激动剂抗体刺激RON下游信号传导——由Akt磷酸化示例。在某些其他实施方案中，与RON结合后，RON激动剂抗体不触发表面RON的下调。
在本发明的又一个方面，根据任一上述实施方案的抗RON抗体是单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗RON抗体是抗体片段，例如，Fv、Fab、Fab’、scFv、双体抗体(diabody)或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，抗体是全长抗体，例如，完整IgG1抗体或如本文定义的其他抗体类别或同种型。
在又一个方面，以下1-7章节中描述的任何特征可以单独地或组合地并入根据任何上述实施方案的抗RON抗体中。
1.抗体亲和力
在一些实施方案中，本文提供的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如从10-8M至10-13M，例如，从10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
在一个实施方案中，通过放射标记的抗原结合测定法(RIA)测量Kd。在一个实施方案中，RIA用Fab形式的目的抗体及其抗原进行。例如，通过以下方式测量Fab对抗原的溶液结合亲和力：在滴定系列的未标记抗原存在下用小浓度的(125I)标记的抗原平衡Fab，随后用抗Fab抗体包被的板捕获结合的抗原(参见，例如，Chen等人，1999,J.Mol.Biol.293:865-881)。为了建立该测定法的条件，将多孔板(Thermo Scientific)用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/mL抗Fab捕获抗体(Cappel Labs)包被过夜，随后用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室温(大约23℃)封闭2至5小时。在非吸附性板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与目的Fab的连续稀释物混合(例如，与Presta等人，1997,Cancer Res.57:4593-4599中评估抗VEGF抗体Fab-12一致)。随后将目的Fab温育过夜；然而，温育可以持续更长时间(例如，约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕获平板以在室温温育(例如，1小时)。随后移除溶液并将平板用PBS中的0.1％聚山梨醇酯20洗涤8次。当平板已经干燥时，添加150μl/孔闪烁剂(MICROSCINT-20TM；Packard)，将平板在TOPCOUNT TMγ计数器(Packard)上计数10分钟。选择产生小于或等于20％最大结合的每种Fab的浓度，用于竞争性结合测定试验中。
根据另一个实施方案，使用表面等离子体共振测定法测量Kd。例如，使用-2000或-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)的测定法在25℃采用固定化抗原CM5芯片以约10个响应单位(RU)进行。在一个实施方案中，根据供应商说明书，以盐酸N-乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE，Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠，pH 4.8稀释至5μg/ml(约0.2μM)，随后以5μl/分钟的流速注射以实现偶联蛋白的大约10个响应单位(RU)。抗原注射后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，在25℃以大约25μl/分钟的流速注射含0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中Fab的2倍连续稀释物(例如，0.78nM至500nM)。使用简单一对一Langmuir结合模型(评价软件3.2版)，通过同时拟合结合和解离传感图(sensorgram)，计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)计算为koff/kon比。参见，例如，Chen等人,1999,J.Mol.Biol.293:865-881。如果通过以上表面等离子体共振测定法显示结合速率超过106M-1s-1，则可以使用荧光猝灭技术测定结合速率，其中在光谱仪，如配备停流(stop-flow)的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌型比色杯的8000-系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic))中，在存在递增浓度的抗原下，在25℃测量在PBS,pH 7.2中20nM抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或减少。
2.抗体片段
在一些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段和下文描述的其他片段。关于某些抗体片段的综述，见Hudson等人，2003,Nat.Med.9:129-134。关于scFv片段的综述，见例如Pluckth ü n,引自The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编著,(Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)；还参见WO 93/16185；和美国专利号5,571,894和5,587,458。关于包含救援受体(salvage receptor)结合表位残基和具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论，见美国专利号5,869,046。
双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，可以是双价或双特异性的。参见例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三体抗体和四体抗体还在Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)中描述。
单一结构域抗体是包含抗体的重链可变域的全部或一部分或轻链可变域的全部或一部分的抗体片段。在一些实施方案中，单一结构域抗体是人单一结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。
可以通过多种技术产生抗体片段，包括但不限于蛋白酶解消化完整抗体以及由重组宿主细胞产生(例如，大肠杆菌或噬菌体)。
3.嵌合和人源化抗体
在一些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体例如在美国专利号4,816,567；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))中描述。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类如猴的可变区)和人恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类别转换”抗体，其中类或亚类已经相对亲本抗体发生改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在一些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。一般，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR例如CDR(或其部分)源自非人抗体并且FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地也可以包含至少一部分人恒定区。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基置换为来自非人抗体(例如，HVR残基所源自的抗体)的相应残基，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体和制造它们的方法综述在例如Almagro和Fransson，2008,Front.Biosci.13:1619-1633中，并且例如还描述在Riechmann等人,1998,Nature 332:323-329；Queen等人,1989,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA86:10029-10033；美国专利号5,821,337,7,527,791,6,982,321,和7,087,409；Kashmiri等人,2005,Methods 36:25-34(描述特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,1991,Mol.Immunol.28:489-498(描述“表面重塑”)；Dall'Acqua等人,2005,Methods 36:43-60(描述“FR改组”)；和Osbourn等人,2005,Methods 36:61-68和Klimka等人,2000,Br.J.Cancer,83:252-260(描述FR改组的“导向选择”方法)。
可以用于人源化的人构架区包括但不限于：使用“最佳配合”法选择的构架区(见，例如，Sims等人,1993,J.Immunol.151:2296)；从特定的轻链或重链可变区亚组的人抗体的共有序列衍生的构架区(见，例如，Carter等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285；和Presta等人,1993,J.Immunol.,151:2623)；人成熟(体细胞突变的)构架区或人种系构架区(见，例如，Almagro和Fransson,2008,Front.Biosci.13:1619-1633)；和从筛选FR文库得到的构架区(见，例如，Baca等人,1997,J.Biol.Chem.272:10678-10684和Rosok等人,1996,J.Biol.Chem.271:22611-22618)。
4.人抗体
在一些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。可以使用本领域已知的多种技术产生人抗体。人抗体一般地描述在van Dijk等人,2001,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74和Lonberg,2008,Curr.Opin.Immunol.20:450-459中。
可以通过施用免疫原至转基因动物制备人抗体，其中所述转基因动物已经被修饰成响应于抗原攻击而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。这类动物一般含有全部或部分人免疫球蛋白基因座，其替换内源免疫球蛋白基因座、或在染色体外存在或整合入动物染色体。在这类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座通常已经失活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，见Lonberg,2005,Nat.Biotech.23:1117-1125。还见，例如，描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述技术的美国专利号5,770,429；描述K-M小鼠技术的美国专利号7,041,870；和描述Veloci技术的美国专利申请公开号US2007/0061900)。可以进一步修饰来自这类动物产生的完整抗体的人可变区，例如，与不同的人恒定区组合。
也可以通过基于杂交瘤的方法产生人抗体。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤细胞系和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系。(参见，例如，Kozbor 1984,J.Immunol.,133:3001；Brodeur等人,Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner等人,1991,J.Immunol.,147:86)。在Li等人,2006,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562中还描述了借助人B-细胞杂交瘤技术产生人抗体。其它方法包括例如在美国专利号7,189,826(描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,2006,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(描述人-人杂交瘤)中描述的那些。人杂交瘤技术(三体瘤技术)还在Vollmers和Brandlein,2005,Histology andHistopathology,20(3):927-937以及Vollmers和Brandlein,2005,Methodsand Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91中描述。
也可以通过分离从人源噬菌体展示文库中选择的Fv克隆可变结构域序列，产生人抗体。这类可变域序列随后可以与期望的人恒定结构域组合。下文描述用于从抗体文库选择人抗体的技术。
5.源自文库的抗体
可以通过对组合文库筛选具有所需活性或多种活性的抗体，分离本发明的抗体。例如，本领域已知用于产生噬菌体展示文库并对这类文库筛选拥有所需结合特征的抗体的多种方法。这类方法例如综述于Hoogenboom等人，《Methods in Molecular Biology》178:1-37(O'Brien等人编著,Human Press,Totowa,NJ,2001)中，并且例如还在McCafferty等人,Nature 348:552-554；Clackson等人,1991,Nature 352:624-628；Marks等人,1992,J.Mol.Biol.222:581-597；Marks和Bradbury,引自Methods inMolecular Biology 248:161-175(Lo编著,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人,2004,J.Mol.Biol.338(2):299-310；Lee等人,2004,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093；Fellouse,2004,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472；和Lee等人,2004,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132中描述。
在某些噬菌体展示法中，VH基因和VL基因库分别由聚合酶链反应(PCR)克隆并且在噬菌体文库中随机重组，随后可以对所述噬菌体文库筛选结合抗原的噬菌体，如Winter等人,1994,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455中所述。噬菌体一般以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段的形式展示抗体片段。来自免疫来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，无需构建杂交瘤。备选地，可以(例如，从人)克隆天然库，以在不进行任何免疫的情况下提供针对广泛的非自身抗原和自身抗原的单一抗体来源，如Griffiths等人,1993,EMBO J,12:725-734所述。最后，也可以通过从干细胞克隆未重排的V-基因区段并使用含有随机序列的PCR引物以编码高度可变的CDR3区并实现体外重排，从而合成产生幼稚文库(liberary)，如Hoogenboom和Winter,1992,J.Mol.Biol.,227:381-388所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公布例如包括：美国专利号5,750,373和美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
从人抗体文库分离的抗体或抗体片段被视为本文中的人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在一些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在一些实施方案中，所述结合特异性之一针对RON、优选针对人RON，而其它特异性针对任何其他抗原。在一些实施方案中，双特异性抗体可以与RON、优选地人RON的两个不同表位结合。双特异性抗体也可以用来将细胞毒性剂局限于表达RON的细胞。双特异性抗体可以被制备为全长抗体或抗体片段。
用于产生多特异性抗体的技术包括，但不限于，重组共表达具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对(见Milstein,C.和Cuello,A.C.,1983,Nature 305:537、WO 93/08829和Traunecker等人,EMBO J.1991,10:3655)，和“结-扣”(knob-in-hole)工程化(例如，见美国专利号5,731,168)。也可以通过以下方式产生多特异性抗体：工程化静电转向效应用于产生抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段(例如，见美国专利号4,676,980，和Brennan等人，1985,Science,229:81)；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体(例如，见Kostelny等人，1992,J.Immunol.,148(5):1547-1553)；使用“双体抗体(diabody)”技术以产生双特异性抗体片段(例如，见Hollinger等人，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448)；和使用单链Fv(sFv)二聚体(例如，见Gruber等人，1994,J.Immunol.,152:5368)；以及制备三特异性抗体，如在例如Tutt等人，1991,J.Immunol.147:60)中所述那样。
本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“Octopus antibody”(见，例如US 2006/0025576A1)。
本文的抗体或片段还包括“双重功能FAb”或“DAF”，其包含与RON以及另一种不同抗原结合的抗原结合位点(例如参见，US2008/0069820)。
7.抗体变体
在一些实施方案中，考虑本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能想要改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。可以通过向编码抗体的核苷酸序列引入适宜修饰或通过肽合成，制备该抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如在抗体的氨基酸序列中缺失和/或插入和/或置换残基。可以产生缺失、插入和置换的任意组合以获得最终构建体，条件是所述最终构建体拥有想要的特征，例如抗原结合作用。
a)置换变体、插入变体和缺失变体
在一些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。用于置换诱变的目的位点包括HVR和FR。保守性置换显示在表1中“优选置换”标题下。更为实质性的变化提供在表1中“示例性置换”标题，并且参考氨基酸侧链类别在下文进一步描述。可以将氨基酸置换引入目的抗体中并且对产物筛选所需的活性，例如，保留/改善的抗原结合作用、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC。
表1
原始残基 示例性置换 优选的置换
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp、Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu，Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
氨基酸可以根据共同的侧链特性分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu；Ile；
(2)中性亲水：Cys、Ser、Thr、Asn；Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性置换需要将这些组之一的成员交换为另一组的成员。
一类置换变体涉及置换亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步研究的所得变体相对于亲本抗体在某些生物学特性方面具有修饰(例如，改善)(例如，增加的亲和力、降低的免疫原性)和/或基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。示例性置换变体是亲和力成熟抗体，所述抗体可以例如，使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术，如本文所述的那些技术，便利地产生。简而言之，将一个或多个HVR残基突变，将变体抗体在噬菌体上展示，筛选特定生物活性(例如结合亲和力)。
可以在HVR中进行改变(例如，置换)，例如以改善抗体亲和力。这类改变可以在HVR“热点”——在体细胞成熟期间以高频率经历突变的密码子所编码的残基(见，例如，Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或接触抗原的残基中作出，对所产生的变体VH或VL测试结合亲和力。例如在Hoogenboom等人，引自Methods in Molecular Biology178:1-37(O'Brien等人编著，Human Press,Totowa,NJ,(2001))中已经描述了通过构建二级文库并从中重新选择而实现亲和力成熟。在亲和力成熟的一些实施方案中，可以通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)的任一种，将多样性引入所选择用于成熟的可变基因中。随后产生二级文库。随后筛选该文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及HVR定向方案，其中将几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机化。可以特别地鉴定参与抗原结合的HVR残基，例如，使用丙氨酸扫描诱变或建模。CDR-H3和CDR-L3尤其经常被靶向。
在一些实施方案中，置换、插入或缺失可以在一个或多个HVR中进行，只要该改变不实质降低抗体结合抗原的能力即可。例如，可以在HVR中实施不实质降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文中提供的保守性置换)。改变可以例如发生在HVR的抗原接触残基外。在上文提供的变体VH和VL序列的一些实施方案中，每个HVR可以不改变，或可以含有不多于一个、两个或三个氨基酸置换。
一种用于鉴定可以作为诱变靶的抗体残基或区域的有用方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells 1989,Science,244:1081-1085所述。在这种方法中，鉴定一个残基或靶残基组(例如，带电荷残基如arg、asp、his、lys和glu)，用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替换以确定该抗体与抗原的相互作用是否受影响。可以在对于初始置换显示出功能敏感性的氨基酸位置处引入进一步置换。备选地或额外地，测定抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点。可以将这类接触残基和邻近残基作为置换候选物予以打靶或消除。可以筛选变体以确定它们是否含有所需的特性。
氨基酸序列插入包括长度变化从1个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基端和/或羧基端融合、以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入性变体包括抗体的N末端或C末端与酶(例如针对ADEPT的酶)或增加抗体血清半衰期的多肽融合。
b)糖基化变体
在一些实施方案中，改变本文提供的抗体以增加或减少抗体发生糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列从而创造或移除一个或多个糖基化位点，便利地实现向抗体添加或删除糖基化位点。
在抗体包含Fc区的情况下，可以改变与之连接的糖。哺乳动物细胞产生的天然抗体一般包含分枝的、二天线型的寡糖，所述寡糖通常借助N联连接至Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright等人,1997,TIBTECH 15:26-32。该寡糖可以包括各种糖，例如，甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及与二天线寡糖结构的“茎部”中GlcNAc连接的岩藻糖。在一些实施方案中，可以修饰本发明抗体中的寡糖以产生某些特性改善的抗体变体。
在一个实施方案中，提供抗体变体，所述抗体变体具有与Fc区(直接或间接)连接的缺少岩藻糖的糖结构。例如，抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。可以通过以下方式确定岩藻糖的量：通过MALDI-TOF质谱法测量，相对于与Asn297连接的全部糖结构(例如复杂结构、杂合结构和高甘露糖结构)的总和，计算Asn297处糖链中的岩藻糖的平均量，例如，如WO 2008/077546中所述。Asn297指位于Fc区中约位置297处的天冬酰胺残基(Fc区残基的Eu编号)；然而，Asn297也可以位于位置297的上游或下游±3个氨基酸位置，即，位置294和位置300之间，原因在于抗体中的微小序列变异。这类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。参见，例如，美国专利公开号US2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。与“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺陷型”抗体变体相关的出版物的例子包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括在蛋白质岩藻糖基化方面具有缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka等人，1986,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545；美国专利申请号US 2003/0157108 A1，Presta,L；和WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其在实施例11)，和敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki等人，2004,Biotech.Bioeng.87:614；Kanda,Y.等人，2006,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688；和WO 2003/085107)。
还可以提供具有平分型(bisected)寡糖的抗体变体，例如，其中与抗体Fc区连接的二天线寡糖通过GlcNAc平分。这类抗体变体可以具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。这类抗体变体的例子例如在WO2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利号6,602,684(Umana等人)；和US2005/0123546(Umana等人)中描述。也提供在与Fc区连接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这类抗体变体可以具有改善的CDC功能。这类抗体变体例如在WO 1997/30087(Patel等人)；WO1998/58964(Raju,S.)；和WO 1999/22764(Raju,S)中描述。
c)Fc区变体
在一些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的抗体的Fc区中，因而产生Fc区变体。Fc区变体可以包含人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)，所述的人Fc区序列在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如，置换)。
在一些实施方案中，本发明考虑具有一些但非全部效应子功能的抗体变体，这使所述抗体变体成为下述应用的有利候选物，在所述应用中抗体的体内半衰期重要而某些效应子功能(如补体和ADCC)是不必要或有害的。可以实施体外和/或体内细胞毒性测定法以证实CDC和/或ADCC活性降低/耗尽。例如，可以实施Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺少FcγR结合作用(因此可能缺少ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达而单核细胞表达 和造血细胞上的FcR表达汇总于Ravetch和Kinet,1991,Annu.Rev.Immunol.9:457-492的第464页上的表3中。评估目的分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子在美国专利号5,500,362(见，例如，Hellstrom,I.等人，1986,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063)和Hellstrom,I等人，1985,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82:1499-1502；US5,821,337(参见Bruggemann,M.等人，1987,J.Exp.Med.166:1351-1361)中描述。备选地，可以使用非放射性分析方法(见，例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA；和CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI)。用于此类测定法的效应细胞括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选或额外地，可以在体内，例如，在动物模型中，如在Clynes等人,1998,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656公开的那种动物模型中，评估目的分子的ADCC活性。也可以实施C1q结合测定法，以证实抗体不能结合C1q并因此缺少CDC活性。参见，例如，WO 2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定法(见，例如，Gazzano-Santoro等人,1996,J.Immunol.Methods202:163；Cragg,M.S.等人,2003,Blood 101:1045-1052；和Cragg,M.S.和M.J.Glennie,2004,Blood 103:2738-2743)。也可以使用本领域已知的方法确定FcRn结合作用和体内清除率/半衰期(见，例如，Petkova,S.B.等人,2006,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769)。
效应子功能减少的抗体包括置换了Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一或多个的抗体(美国专利号6,737,056)。这类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个或更多个位置处具有置换的Fc突变体，包括残基265和297置换成丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
描述了具有FcR结合作用改善或削弱的某些抗体变体。(参见，例如，美国专利号6,737,056；WO 2004/056312，和Shields等人,2001,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604)。
在一些实施方案中，抗体变体包含具有可以改善ADCC的一个或多个氨基酸置换(例如，在Fc区的位置298、333和/或334处的置换)(残基的EU编号)的Fc区。
在一些实施方案中，在Fc区内做出改变，所述改变导致变更(即改善或削弱)的C1q结合作用和/或补体依赖细胞毒性(CDC)，例如，如美国专利号6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等人,2000,J.Immunol.164:4178-4184中所述。
在US 2005/0014934 A1(Hinton等人)中描述了具有增加的半衰期和改善的新生儿Fc受体(FcRn)结合作用的抗体，所述受体FcRn负责转移母体IgG至胎儿(Guyer等人,J.Immunol.117:587和Kim等人,J.Immunol.24:249)。这些抗体包含具有一个或多个置换的Fc区，其中所述置换改善Fc区与FcRn的结合。这类Fc变体包括在Fc区残基238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434的一个或多个处具有置换(例如，Fc区残基434置换)的那些抗体(美国专利号7,371,826)。
也参见涉及Fc区变体其他例子的Duncan和Winter,1988,Nature322:738-40)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO94/29351。
d)半胱氨酸工程化抗体变体
在一些实施方案中，可能想要产生半胱氨酸工程化的抗体，例如，“硫代MAb”，其中所述抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基置换。在特定的实施方案中，被置换的残基位于抗体的可及位点处。通过用半胱氨酸置换这些残基，由此将反应性巯基安置在抗体的可及位点处，其可以用来将抗体缀合至其他结构部分，如药物部分或接头-药物部分，以产生免疫缀合物，如本文中进一步所述。在一些实施方案中，可以用半胱氨酸置换以下残基的任何一个或多个：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。可以例如在美国专利号7,521,541中所述，产生半胱氨酸工程化的抗体。
e)抗体衍生物
在一些实施方案中，还可以修饰本文提供的抗体，以含有本领域已知并易于获得的其它非蛋白质部分。适于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-二氧戊环、聚1,3,6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、和葡聚糖或聚(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，丙三醇)、聚乙烯醇、和它们的混合物。聚乙二醇丙醛可以具有制造方面的优点，原因在于其在水中的稳定性。这种聚合物可以具有任何分子量，并可以是分枝或不分枝的。与抗体连接的聚合物的数目可以变动，并且如果连接多于一个聚合物，它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可以基于以下考虑事项确定，包括但不限于待改善的抗体特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于限定情况下的治疗中，等等。
在另一个实施方案中，提供了抗体和非蛋白质部分的缀合物，其中所述非蛋白质部分可以通过暴露于辐射而被选择性加热。在一个实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等人,2005,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605)。辐射可以具有任何波长，并包括，但不限于这样的波长——所述波长不伤害普通细胞，但是可以将非蛋白质部分加热至可以杀伤临近于抗体-非蛋白质部分的细胞的温度。
B.重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物产生抗体，例如，如美国专利号4,816,567中所述。在一个实施方案中，提供了编码本文所述的抗RON激动剂抗体的分离核酸。该核酸可以编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含抗体VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在又一个实施方案中，提供包含该核酸的一个或多个载体(例如，表达载体)。在又一个实施方案中，提供包含该核酸的宿主细胞。在这样一个实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经转化了)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体VL的氨基酸序列和包含抗体VH的氨基酸序列，或(2)包含编码含有抗体VL的氨基酸序列的核酸的第一载体、和包含编码含有抗体VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供一种产生抗RON抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达抗体的条件下培养如上文提供的包含编码抗体的核酸的宿主细胞，和任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
为了重组产生抗RON抗体，分离编码抗体的核酸(例如，如上文所述)，并插入一个或多个载体中用于进一步克隆和/或在宿主细胞中表达。可以使用常规方法(例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，容易地分离核酸并测序。
用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，尤其当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，见例如，美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。(还参见Charlton,Methods in MolecularBiology,第248卷(B.K.C.Lo编著,Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第245-254页，其描述在大肠杆菌中表达抗体片段)。在表达后，可以将抗体从细菌细胞沉淀分离于可溶性级分中并且可以进一步纯化抗体。
除原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母是编码抗体的载体的合适克隆宿主或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”的真菌和酵母菌株，这导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gerngross,2004,Nat.Biotech.22:1409-1414，和Li等人,2006,Nat.Biotech.24:210-215。
表达糖基化抗体的合适宿主细胞还可以源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定了可以与昆虫细胞一起使用、尤其是用于转染草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞的许多杆状病毒株。
也可以利用植物细胞培养物作为宿主。参见，例如，美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适应于悬浮培育的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(如Graham等人,1977,J.Gen Virol.36:59中所述的293或293T细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(如在例如Mather,1980,Biol.Reprod.23:243-251中所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；布法罗大鼠肝脏细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺瘤细胞(MMT060562)；TRI细胞，如在例如Mather等人,1982,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68中所述；MRC5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216)；和骨髓瘤细胞系如Y0、NS0和Sp2/0。关于适于产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，见，例如，Yazaki和Wu，Methods inMolecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编著，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。
C.免疫缀合物
本发明也提供包含与一种或多种细胞毒性剂，如化疗药或药物、生长抑制剂、毒素(例如，细菌源、真菌源、植物源或动物源的蛋白质毒素、酶活性毒素，或其片段)、或放射性同位素缀合的本文抗RON抗体的免疫缀合物。
在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，所述药物包括但不限于美登木素生物碱(maytansinoid)(参见美国专利号5,208,020，5,416,064和欧洲专利EP0425235B1)；澳瑞司他汀(auristatin)如单甲基澳瑞司他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利号5,635,483和5,780,588和7,498,298)；海兔毒素(dolastatin)；加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物(参见美国专利号5,712,374,5,714,586,5,739,116,5,767,285,5,770,701,5,770,710,5,773,001和5,877,296；Hinman等人,1993,Cancer Res.53:3336-3342和Lode等人,1998,Cancer Res.58:2925-2928)；蒽环类(anthracycline)如柔红霉素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(参见2006,Current Med.Chem.13:477-523；Jeffrey等人,2006,Bioorganic&Med.Chem.Letters16:358-362；Torgov等人,2005,Bioconj.Chem.16:717-721；Nagy等人,2000,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829-834；Dubowchik等人,2002,Bioorg.&Med.Chem.Letters 12:1529-1532；King等人,2002,J.Med.Chem.45:4336-4343；和美国专利号6,630,579)；氨甲蝶呤；长春地辛；紫杉烷(taxane)，如多西紫杉醇(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、拉罗他赛(larotaxel)、替司他赛(tesetaxel)和ortataxel；单端孢菌毒素(trichothecene)；和CC1065。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的如本文所述的抗体，所述酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉毒素A链、白喉毒素的非结合性活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-5)、苦瓜(momordica charantia)抑制蛋白、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制蛋白、多花白树毒蛋白、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢菌毒素。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的如本文所述的抗体。多种放射性同位素可用于产生放射性缀合物。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时，它可以包含用于闪烁研究的放射性原子，例如tc99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也称作磁共振成像，mri)的自旋标记物，如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以使用多种双官能蛋白质偶联剂产生抗体和细胞毒性剂的缀合物，所述双官能蛋白质偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(如己二亚氨酸二甲酯盐酸)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、双-叠氮化合物(如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(如双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2,6-二异氰酸甲苯酯)、和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta等人,Science 238:1098(1987)中所述，制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于放射性核素与抗体缀合的示例性螯合剂。见WO94/11026。接头可以是促进细胞毒性剂在细胞中释放的“可切割接头”。例如，可以使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头或含有二硫键的接头(Chari等人,Cancer Res.52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
免疫缀合物或ADC在本文中明确地考虑，但不限于，采用交联剂制备的这类缀合物，所述交联剂包括但不限于可商业获得的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、和磺基-SMPB、和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)(例如，来自PPierce Biotechnology,Inc.，Rockford，伊利诺伊州，美国)。
D.用于诊断和检测的方法和组合物
在一些实施方案中，本文提供的任何抗RON抗体可用于检测RON在生物样品中的存在。如本文所用，术语“检测”涵盖定量或定性检测。在一些实施方案中，生物样品包括细胞或组织，如肠(intestine)、结肠、皮肤，神经内分泌组织、正在发育的骨、上皮细胞和定居腹膜小噬细胞。
在一个实施方案中，提供在诊断或检测方法中使用抗RON抗体。在又一个方面，提供一种检测RON在生物样品中存在的方法。在一些实施方案中，该方法包括：使生物样品与如本文所述的抗RON抗体在允许抗RON抗体与RON结合的条件下接触，并且检测抗RON抗体和RON之间是否形成复合物。该方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，抗RON抗体用来选择适于用抗RON抗体治疗的受试者，例如其中RON是选择患者的生物标记物。
可以使用本发明抗体诊断的示例性病症包括而不限于肿瘤、肿瘤进展和肿瘤转移。在一些实施方案中，提供标记的抗RON抗体。标记物包括但不限于，可以直接检测的标记物或部分(如荧光、发色、电子致密、化学发光和放射性标记)，以及间接检测(例如借助酶促反应或分子相互作用)的部分，如酶或配体。示例性标记物包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I、荧光团如稀土元素螯合物，或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、伞形酮、萤光素酶例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利号4,737,456)、萤光素、2,3-二氢二氮杂萘二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、杂环氧化酶如尿酸氧化酶和黄嘌呤氧化酶，与利用过氧化氢氧化染料前体的酶如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶偶联，生物素/抗生物素蛋白、自旋标记物、噬菌体标记物、稳定自由基等。
E.药物制剂
可以通过以下方式制备冻干制剂或水溶液形式的如本文所述的抗RON抗体和/或MSP融合蛋白的药物制剂：将具有所需纯度的该抗体或重组蛋白与一种或多种任选的可药用载体混合(Remington's PharmaceuticalSciences第16版,Osol,A.(编著)(1980))。可药用载体一般在所用的剂量和浓度对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂如磷酸、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苯扎溴铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性可药用载体还包括间质药物分散剂，如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20(Baxter International,Inc.)。在美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中描述了一些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20。在一个方面，sHASEGP与一种或多种其它糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。
示例性冻干抗体制剂在美国专利号6,267,958中描述。含水抗体制剂包括在美国专利号6,171,586和WO2006/044908中描述的那些制剂，后一类制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
本文中的制剂也可以根据正在治疗的特定适应症的需要而含有一种以上的活性成分，优选地具有互补活性、相互无不利影响的那些活性成分。例如，可能期望进一步提供抗炎治疗或抗高血糖治疗，包括而不限于，免疫抑制剂如TNF抑制剂、美沙拉秦(mesalazine)、类固醇、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤(Azathioprine)，或抗高血糖药物如胰岛素、胰岛素类似物、二甲双胍(metformin)、磺酰脲类(sulfonylureas)或格列酮类(glitazones)。这些活性成分可以适宜地以对于预期目的有效的量组合存在。
活性成分可以截留在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微囊中(分别地，例如，羟甲基纤维素或明胶微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊)、胶态药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米囊)中、或粗乳液中。这些技术在Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编著(1980)中公开。
可以制备持续释放制品。持续释放制品的合适例子包括含有抗体的固态疏水性聚合物的半透性基质，所述基质可以为成型制品(例如薄膜或微囊)的形式。
待用于体内施用的制剂通常是无菌的。可以例如通过借助无菌滤膜过滤容易地实现无菌性。
F.治疗方法和组合物
本文提供的任何RON激动剂可以用于治疗方法中。
在一个方面，提供了RON激动剂作为药物使用。在其他方面，提供RON激动剂用于治疗MSP相关的或RON相关的疾病或病症。在一些实施方案中，该疾病或病症是IBD、糖尿病或伤口愈合缺陷。在一些实施方案中，提供抗RON激动剂抗体用于治疗方法中。在一些实施方案中，本发明提供在治疗患有IBD、糖尿病或伤口愈合缺陷的个体的方法中使用抗RON抗体，所述方法包括向该个体施用有效量的抗RON抗体。在一个这样的实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的至少一种其它治疗药，例如，如下文描述的治疗药。在其他实施方案中，本发明提供抗RON抗体用于增强上皮伤口愈合。在一些实施方案中，本发明提供在增强个体的伤口愈合的方法中使用抗RON抗体，所述方法包括向该个体施用有效量的抗RON抗体以增强上皮伤口愈合。根据以上任何实施方案，“个体”优选地是人。
在又一个方面，本发明提供抗RON抗体在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，药物用于治疗IBD、伤口愈合缺陷或糖尿病。在又一个实施方案中，药物用于治疗IBD、伤口愈合缺陷或糖尿病的方法中，所述方法包括向患有IBD、伤口愈合缺陷或糖尿病的个体施用有效量的药物。在一个这样的实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的至少一种其它治疗药。非限制的示例性其它治疗药包括免疫抑制剂如TNF抑制剂、美沙拉秦、类固醇、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤、或抗高血糖治疗药如胰岛素、胰岛素类似物、二甲双胍、磺酰脲类或格列酮。在又一个实施方案中，药物用于增强伤口愈合、上皮增殖或移行、或降低血糖。在又一个实施方案中，药物用于增强个体的伤口愈合、上皮增殖或移行、或降低血糖的方法中，所述方法包括向该个体施用有效量的药物以增强伤口愈合、上皮增殖或移行、或降低血糖。根据以上任何实施方案，“个体”可以是人。
存在测量伤口愈合的多种方式。经常拍摄图像以计算线性尺度、周长和面积。图像J程序(NIH)允许从图像测量伤口面积。最终的愈合预后可以从初始愈合速率、基于周界向中心的迁移而外推得出。这可以使用许多数学公式进行，其中最常见的改良Gilman公式。如果愈合缓慢/不充分，可以进行伤口边缘的活组织检查以排除感染和恶性肿瘤。
在又一个方面，本发明提供一种用于治疗IBD、伤口愈合缺陷或糖尿病的方法。在一个实施方案中，该方法包括向患有这些疾病的个体施用有效量的抗RON抗体。在这样一个实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的至少一种其它治疗药(如下文描述)。根据以上任何实施方案，“个体”可以是人。
在又一个方面，本发明提供了包含本文提供的任何RON激动剂的药物制剂，例如，用于前述任何治疗方法中。在一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何RON激动剂和可药用载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何抗RON抗体或MSP融合蛋白和至少一种其它治疗剂，例如，如下文描述。
本发明的RON激动剂可以在疗法中单独或与其他药物组合使用。例如，本发明的抗体可以与至少一种其它治疗药共施用。在一些实施方案中，其它治疗药是免疫抑制剂如TNF抑制剂、美沙拉秦、类固醇、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤，或抗高血糖药如胰岛素、胰岛素类似物、二甲双胍、磺酰脲类或格列酮类。
以上提到的联合疗法涵盖联合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在相同或分开的制剂中)、和分开施用——在该情况下，本发明激动剂的施用可以在施用其它治疗药(一种或多种)之前、同时和/或之后进行。在一个实施方案中，抗RON抗体的施用和其它治疗药的施用彼此发生在约一个月内，或约一周、两周或三周内，或约一、二、三、四、五或六日内。
本发明的Ron激动剂(和任何其它的治疗药)可以通过任何合适的手段施用，所述的合适手段包括肠胃外、局部、肺内和鼻内以及，如果需要局部治疗，病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，如静脉内或皮下注射，这部分地取决于施用是否为短暂或长期。本文考虑各种给药方案，包括但不限于单次或经多个时间点多次施用、快速浓注施用和脉冲输注。在一些实施方案中，全身性或局部施用RON激动剂。在一些实施方案中，局部施用RON激动剂。
本发明的RON激动剂将以符合良好医学实践的方式配制、定剂量和施用。在该情况下考虑的因素包括正在治疗的具体病症、正在治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、病症原因、送递药物的部位、施用方法、施用计划、和医疗执业者已知的其他因素。抗体不需要，但是可以任选地，与目前用来预防或治疗所讨论病症的一种或多种药物一起配制。其他药物的有效量取决于制剂中存在的抗体的量、疾病类型或疗法、和上文讨论的其他因素。这些药物通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以约1％至99％的本文所述剂量使用，或以经验地/临床上确定适宜的任何剂量和任何途径使用。
可以将用于局部施用的药物组合物配制为例如局部用凝胶剂的形式。参见例如，US 5,192,734(Genentech)。在一些实施方案中，组合物可以在纤维素衍生物存在下配制。在某些其他实施方案中，局部用制剂可以在施用之前用足够的缓冲液或稀释剂从冻干制剂重构。在一些实施方案中，配制RON激动剂以局部施用至具有上皮伤口愈合缺陷的受试者。在某些具体实施方案中，上皮伤口愈合发生在皮肤中。在某些其他具体实施方案中，受试者是患有糖尿病的人。在某些其他实施方案中，包含本发明RON激动剂的局部用制剂可以用来在内部或外部手术切开后改善伤口愈合。
对于预防或治疗疾病，本发明激动剂的适宜剂量(当单独或与一种或多种其他其它治疗药组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、激动剂的类型、疾病的严重性和过程，激动剂是否出于预防或治疗目的施用、先前疗法、患者的临床史和对激动剂的反应、以及主治医师的判断。激动剂可以适宜地一次性或经过一系列治疗而施用给患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)激动剂可以是向患者施用的起始候选剂量，无论是否例如通过一个或多个单独施用或通过连续输注来施用。取决于上文提到的因素，一个典型的每日剂量可以是从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于在几日或更长时间的重复施用，取决于病状，治疗通常将持续直至对疾病症状的所需抑制作用出现。抗体的一个示例性剂量为约0.05mg/kg至约10mg/kg。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg中的一种或多种剂量(或其任意组合)。该剂量可以间歇地施用，例如，每周或每3周(例如，从而使患者接受约2个至约20个，或例如约6个剂量的抗体)。可以施用较高的初始荷载剂量，随后是一个或多个较低剂量。示例性给药方案包括施用。然而，可以使用其他剂量方案。通过常规技术和测定法，可以容易地监测疗法的进展。
可以理解，前述任何制剂或治疗方法都可以使用本发明免疫缀合物替代抗RON抗体或联合抗RON抗体来实施。
G制品(articles of manufacture)
在本发明的另一个方面，提供制品，所述制品含有可用于治疗、预防和/或诊断上文描述的病症的物质。制品包括容器和在该容器上或与之关联的标签或说明书。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、静脉内输液袋等。容器可以从多种材料如玻璃或塑料形成。容器容纳可以单独自身或与其它组合物组合时有效治疗、预防和/或诊断病症的组合物，并且可以具有无菌进入口(例如容器可以是静脉内输液袋或是具有皮下注射针头可穿透的瓶塞的小瓶)。组合物中的至少一种活性物质是本发明的抗体。标签或说明书说明该组合物用于治疗选择的病状。另外，制品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的激动剂；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含其他细胞毒性剂或治疗药。在本发明的这个实施方案中制品还可以包含指示组合物可以用来治疗特定病状的说明书。备选或额外地，该制品可以还包含第二(或第三)容器，其包含可药用缓冲剂，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer溶液和葡萄糖溶液。它可以还包括从商业和用户角度看期望的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。
可以理解，前述任何制品都可以包含本发明的免疫缀合物，以替代抗RON抗体或联合抗RON抗体。
后续的实施例举例说明本发明的具体实施方案及其各种用途。它们仅出于解释性目的阐述，不得认为限制本发明。
实施例
重组蛋白的克隆、表达和纯化
将重组人MSP原689R或689C(C672A)(分别是SEQ ID NO:2或4)、人MSP 689R或689C(HGF前导序列，V484-G711；C588S，有和无C672A)(SEQ IDNOs:8和9)克隆至具有C末端6-His标签的pRK表达载体中。先前显示C672A突变是获得正确折叠的蛋白质所需要的(Wahl等人,1997,JBiol Chem,272:15053–6)。将R483E突变引入人MSP原切割位点的P1位置中，以产生scMSP(R483E、C672A)(SEQ ID NO:6)——不可切割的无活性形式的单链MSP原(scMSP)。全部突变均用QuikChange II XL位点定向诱变试剂盒(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)产生。人MSP的天然前导序列(或信号肽)是M1-G18。
将含有C672A突变(SEQ ID NO:2)的人全长MSP、人MSPβ(HGF前导序列，V484-G711，C672A，C588S)(SEQ ID NO:9)和鼠MSPβ(HGF前导序列，V489-E716，HGF前导序列C677A，C593A)(SEQ ID NO:16)(均具有C末端His标签)克隆至pRK载体中。将构建体在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中瞬时表达2周。通过Ni-NTA亲和层析、随后通过在Superdex 20010/300GL或Superdex 7510/300GL(GE Healthcare,Piscataway,NJ)上大小排阻层析，纯化分泌型蛋白。
通过在CHO细胞中表达，将包含Sema、PSI和IPT1结构域(天然前导序列+E25-M682)的重组人RON作为与人IgG1的Fc融合物(RON-Fc)(SEQ ID NO:44)产生。参见Ronsin等人,1993,Oncogene 8(5):1195-202；Gherardi等人,2003,Proc Natl Acad Sci U S A.100(21):12039-44；和Lu等人,2007,Cancer Lett.257(2):157-64.2007年9月21日电子出版。将通过多种接头长度与重链鼠IgG2a或人IgG1的C末端Fc区分隔的重组人MSPβ(HGF前导序列，V484-G711，C672A，C588S)或鼠MSPβ(HGF前导序列，V489-E716，C677A，C593A)克隆至含有人HGF信号序列(M1-G31)的pRK载体中(SEQ ID NO:55)(Ashkenazi等人,1997,Current Opinion inImmunology 9:195-200)。人MSP可以激活人RON和小鼠RON，而小鼠MSP仅激活小鼠RON。
为了消除融合蛋白与Fc受体的结合，产生在鼠IgG2a和人IgG1Fc重链中具有两个突变(人IgG1中D265A和N297A，称作DANA)的变体(Shields RL等人,2001,J Biol Chem 276:6591–6604；和Gong等人,2005,JI mmunol.174(2):817-26)。如上文，将构建体克隆至pRK载体中并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达。在MabSelect Sure柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ)上通过亲和层析、随后在Superdex 200 10/300GL上通过大小排阻层析，纯化MSPβ-Fc融合物，以基于其洗脱谱分离单体蛋白。蛋白质在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中纯化并贮存在4℃。将RON-Fc在MabSelect Sure柱(GE Healthcare)上通过亲和层析、随后通过大小排阻层析(Superdex 200 10/300GL)纯化。
将含有C末端His标签的重组人RON Sema/PSI(天然前导序列+残基E25-P568)克隆至Gateway载体pENTR/D-TOPO(Life Technologies)中，所述载体包含蜜蜂蜂毒肽分泌信号，以使用Bac-to-Bac系统(LifeTechnologies)产生重组杆状病毒。在ESF921培养基(Expression Systems,Woodland,CA)中，以感染复数3，用重组杆状病毒感染粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)昆虫细胞(1x106个细胞/ml)。在72小时温育后，将RONSema/PSI通过Ni-NTA亲和层析、随后在Superdex 200 10/300GL(GEHealthcare)上通过大小排阻层析纯化，并在-20℃贮存于HEPES缓冲盐水(HBS)中。
在CHO细胞中表达含有人IgG1重链的C末端Fc区(mRON-hFc)(SEQ ID NO:50)或His标签(mRON-His)(SEQ ID NO:52)的重组鼠RON Sema/PSI/IPT1(天然前导序列+R33-V684)。将mRON-His通过Ni-NTA亲和层析、随后在Superdex 200 10/300GL(GE Healthcare)上通过大小排阻层析纯化，并在-20℃贮存于HEPES缓冲盐水(HBS)中。如上纯化Fc-融合蛋白。
如Moran等人,J Biol Chem,281:30439–46)中所述，表达并纯化携带C末端His标签的人重组hepsin的胞外结构域(sHepsin)(SEQ ID NO:54)。通过使用抗体噬菌体展示，产生了抑制hepsin酶活性的抗体25(Fab25).随后在大肠杆菌中表达并如先前所述纯化(Ganesan等人,Protein Eng DesSel 25:127-33)。
下表2中汇总了本文中描述的全部构建体。
表2
细胞分离、分化和培养
根据标准方案培养细胞系。在具有10％小牛血清(Sigma)的高葡萄糖DMEM(Cellgro)中培养3T3细胞。在结肠细胞培养基(Celprogen)中维持人原代结肠细胞(Celprogen)。亲本3T3细胞和A2780细胞用鼠RON稳定转染以分别产生3T3-mRON细胞和A2780-mRON细胞(Chaudhuri等人,2011,J Biol Chem 286:32762-74)，为此向培养基补充400μg/ml G418。使用Flp-In系统(Life Technologies)，根据制造商的说明书产生用MSP稳定转染的细胞系。将在位置672处具有野生型残基的重组人MSP原689R或689C(Q19-G711)克隆至pcDNA5/FRT(Life Technologies)中，用来转染293Flp-In细胞(Life Technologies)。将转染的细胞铺种在补充有100μg/mlZeocin(Life Technologies)的培养基中，并在三周后用克隆皿(Sigma-Aldrich)挑出抗Zeocin集落。再铺种克隆以证实潮霉素敏感性和Zeocin抗性。
将人外周血单核细胞(PBMC)用Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)通过密度梯度离心从血液分离。用单核细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec)从PBMC纯化单核细胞。通过在补充有20％胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100μg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺和100ng/ml M-CSF(R&DSystems)的RPMI中，温育CD14+单核细胞1周，获得人单核细胞来源的巨噬细胞。将巨噬细胞在RPMI加5％FBS中用100ng/ml LPS和20ng/ml或20ng/ml IL-4处理18小时，或在RPMI加20％FBS中在IgG包被的平板上用100ng/ml LPS处理24小时。
通过在DMEM加10％FBS、100U/mL青霉素、100μg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺和30％来自L929细胞的条件培养基中温育未分级分离的骨髓细胞，获得鼠骨髓来源的巨噬细胞。在培养的第3日添加新鲜生长培养基并且在第7日收获贴壁巨噬细胞。在这个时间点，细胞均一地是F4/80和CD11b阳性。
在稳态条件下或在腹膜内注射1ml 3％巯基乙酸后4日，通过用9mlRPMI腹膜灌洗，从小鼠收获腹膜渗出液细胞。细胞用RPMI洗涤1次并重悬于FACS缓冲液中。以具有一定改良的方法(Egen等人,2008,Immunity 28:271-84)，获得肝脏单核细胞。简而言之，通过门静脉用3ml消化缓冲液灌注肝脏，所述消化缓冲液由RPMI外加0.2mg/ml LiberaseTL和0.1mg/ml DNA酶I(Roche Applied Science)组成。将肝脏切除并在37℃在消化缓冲液中进一步温育40分钟。通过反复抽吸手工破裂后，将肝脏细胞悬液在Hanks平衡盐溶液(HBSS)(Life Technologies)中洗涤，重悬于35％Percoll中，并以800x g离心20分钟，收集细胞沉淀物。将红细胞用Ack裂解缓冲液(Lonza)裂解并将细胞重悬于FACS缓冲液中。对于鼠结肠的单细胞悬液，将结肠从动物取出，用HBSS冲洗，切成2cm小片，并且在37℃在持续振摇下在含有EDTA和DTT的HBSS中温育15分钟。使该温育保持短时间，以避免丢失上皮细胞。在RPMI中洗涤组织2次，切碎，并在37℃持续振摇下在RPMI外加0.2mg/ml Liberase TL和0.1mg/ml DNA酶中温育20分钟。将含有单核细胞和上皮细胞的悬液过滤通过100μm滤器和70μm滤器，洗涤，并重悬于FACS缓冲液中。
通过与Mayo Clinic(Rochester,Minnesota)合作，从1位结肠癌患者、2位UC患者和3位CD患者获得人肠切除样品。采集匹配的血清样品、DNA样品和肠活组织检查RNA样品，作为Genentech资助的多中心EMBARK观察IBD临床试验的一部分。从全部人受试者获得知情同意书。
通过解剖出浆膜、肌肉层和粘膜下层，留下大约三克包含固有层和上皮的组织，制备切除肠组织的单细胞悬液。将该悬液在30℃在轨道摇床上在具有5mM DTT的50ml HBSS中、随后在具有1mM EDTA的50mlHBSS中温育15分钟。将组织在50ml RPMI加10％FBS中洗涤2次，切碎成0.5cm小片，并且在37℃在轨道摇床上在50ml RPMI、10％FBS、1.5mg/ml胶原蛋白酶VIII(Sigma-Aldrich)、0.1mg/ml DNA酶I中消化20分钟。将消化的组织通过70μm孔滤器过滤，洗涤，并重悬于FACS缓冲液(PBS加2％FBS)中。对于白细胞纯化，将细胞沉淀，重悬于中7ml等渗35％Percoll(GE Healthcare)，置于6ml等渗60％Percoll层下，并且在4℃以2000转/分钟离心20分钟。收集在Percoll界面的细胞，洗涤，并重悬于FACS缓冲液中。
小鼠
C57Bl/6、C57Bl/6重组酶激活基因(RAG)-2缺陷小鼠和db/db小鼠从Jackson实验室获得。RON.ko小鼠(在Waltz等人,2001,J Clin Invest.108(4):567-76中描述)缺少RON的酪氨酸激酶结构域，该结构域已经通过基因打靶而移除。全部动物实验获得Genentech研究机构动物护理和使用委员会批准。
流式细胞术
用荧光色素标记的抗F4/80(克隆BM8)、CD11b(克隆M1/70)、MHC II类(克隆M5/114.15.2)和小鼠RON(克隆PH4，Genentech,Inc.,South SanFrancisco,CA)的抗体或鼠IgG2a同种型对照抗体(Genentech，Inc)，染色鼠细胞。用荧光色素标记的抗CD14(克隆61D3)、CD16(克隆3G8)、CD45(克隆HI30)EpCAM(克隆VU1D9)、MHC II类(LN3)和人RON(克隆1A2.2，Genentech,Inc.)的抗体或鼠IgG2a同种型对照抗体(Genentech,Inc.)，染色人细胞。除非另行说明，全部其他抗体均购自Abcam、BD Biosciences、Biolegend或eBioscience。将离体分析的鼠细胞和人细胞用LIVE/DEADAqua或Violet生存力染液(Life Technologies)染色。在LSRII流式细胞仪(BD Biosciences)上分析细胞。基于大小和生存力染色，鉴定活细胞，并且通过使用Flowjo软件(Treestar,Ashland,OR)对所示细胞群体设门而确定RON表达。
MSP结合测定试验
a.MSP与平板固定化RON的结合
将MaxiSorp板(Nalge Nunc International)在4℃用50mM碳酸钠缓冲液pH 9.6中的2μg/ml兔抗人IgG Fc特异性抗体(JacksonImmunoResearch实验室)包被过夜。在用分析缓冲液(50mM HEPES pH7.2，150mM NaCl，5mM CaCl2，1％BSA和0.1％Tween-20)封闭后，添加在分析缓冲液中的1μg/ml RON-Fc融合蛋白，将平板在室温伴以温和振摇温育1小时。用PBS+0.05％Tween-20洗涤后，添加MSP(1000nM-0.2pM，2倍稀释系列)，保持1小时。使用抗His-HRP(Qiagen Inc.)，随后添加TMB/H2O2底物(Thermo Scientific)，检测结合的MSP。反应用1MH3PO4终止，在SpectraMax Plus384平板读数仪(Molecular Devices，LLC)上测量在450nm的吸光度(A450)。使用Kaleidagraph(Synergy Software)通过4参数拟合，确定MSP的半数最大有效浓度(EC50)。
b.通过表面等离子体共振法(SPR)对MSP与RON结合的动力学测量
使用配备研究级CM5传感芯片(GE Healthcare)的Biacore 3000光生物传感器，测定RON与MSPβ-Fc融合蛋白以及MSP蛋白与RON-Fc融合物的结合动力学。胺偶联试剂N-乙基-N’-二甲氨基-丙基碳二亚胺(EDC)、N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)和乙醇胺钠HCl,pH 8.5从GE Healthcare获得。用标准偶联方案将兔抗人IgG1或兔抗鼠IgG2a(Jackson ImmunoResearch实验室)结合到生物传感器表面上。用无蛋白质偶联情况下经历胺偶联程序的生物传感器芯片，校正非特异性结合作用。为了确定RON对MSPβ-Fc融合物的结合亲和力，在三个固定化抗Fc表面的每个表面上捕获50响应单位至100响应单位(RU)的MSPβ-Fc。将HBS-P缓冲液(10mM HEPES，pH 7.5，150mM NaCl，0.005％P20)中各种浓度(500-3.9nM，2倍稀释系列)的RON-His在25℃以流速30μL/分钟注射并且监测解离240秒。在各测量之间，将生物传感器表面用120秒10mM甘氨酸-HCl pH 1.5脉冲并随后用运行缓冲液洗涤120秒以再生。
为了确定MSP蛋白对hRON-Fc或mRON-Fc融合蛋白的结合动力学，在三个固定化抗人Fc表面的每个表面上捕获50响应单位至100响应单位(RU)。将HBS-P缓冲液(10mM HEPES，pH 7.5，150mM NaCl，0.005％P20)中各种浓度(50-0.78nM，2倍稀释系列)的MSP、MSPβ、MSPα或scMSP在25℃以流速30μL/分钟注射并且监测解离4分钟。在各测量之间，将生物传感器表面用2分钟10mM甘氨酸-HCl pH 1.5脉冲以再生。
将每个数据集总体上对简单一对一Langmuir结合模型(BIA评价4.1，GE Healthcare)拟合，以确定动力学参数kon和koff。平衡解离常数(KD)随后计算为这些速率常数之比(koff/kon)。
c.通过表面等离子体共振法对YW651.1-IgG2a与RON结合的动力学测量
使用BIAcore-3000仪。简而言之，根据供应商的说明书(GEHealthcareBiosciences)，将CM5生物传感器芯片用N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)试剂活化，并且应用人抗体捕获试剂盒以偶联山羊抗人Fc IgG以在每个流动小室上实现大约10000响应单位(RU)，随后用1M乙醇胺封闭未反应的基团。
对于动力学测量，捕获mRON-Fc(目录号431-MS，与人IgG1融合的mRON胞外结构域，R&D System)抗原以实现大约250RU，随后将抗mRON Fab(0.49nM至250nM)的两倍连续稀释物在HBS-P缓冲液(0.01MHEPES pH 7.4，0.15M NaCl，0.005％表面活性剂P20)中在25℃以流速30μl/分钟注射。使用简单一对一朗langmuir结合模型(BIAcore评估软件3.2版)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(KD)计算为koff/kon比。
d.通过生物层干涉测量法(BLI)对MSP与RON结合的动力学测量
使用Octet RED384(ForteBio，Inc)实施MSP与RON结合的实时动力学测量。将样品或缓冲液以每孔200μl体积分配至96孔微量滴定板(Greiner Bio-One North America,Inc.)中。将抗人IgG Fc生物传感器用于本实验。每个实验由三个步骤组成：与PBS分析缓冲液中1:10稀释的ForteBio动力学缓冲液温育120秒以建立平衡(基线)，与分析缓冲液中的10μg/ml RON-Fc温育以用结合靶包被生物传感器900秒(加载)，在含有各种浓度(75-4.7nM，2倍稀释系列)的分析缓冲液中与MSP、MSPβ或scMSP温育400秒(结合)，与分析缓冲液温育400秒以测量MSP的解离速率(解离)。运行温度维持在30℃。通过Octet数据采集7.0软件自动生成数据。使用ForteBio分析软件7.0，将每个数据集合总体上对简单一对一结合模型拟合以确定动力学参数ka和kd。平衡解离常数(KD)随后计算为这些速率常数之比(koff/kon)。
e.通过放射配体结合测定法对MSP与RON结合的平衡测量
将MSP蛋白使用Iodogen法(Thermo Scientific)碘化，并使用NAP-5柱通过凝胶过滤法从游离Na125I纯化。比活性是12.26至18.65μCi/μg。竞争反应混合物由50μL体积中从5μM开始连续10次稀释1倍至2倍的固定浓度的碘化MSP和未标记的MSP构成。3T3-hRon细胞用结合缓冲液洗涤，所述结合缓冲液由含有1％牛血清白蛋白、325nM人IgG、50mMHEPES(pH 7.2)和0.1％叠氮化钠的DMEM组成。将0.2ml结合缓冲液中的150,000个细胞添加至竞争反应混合物。将竞争反应物与细胞在室温温育2小时，转移至Multiscreen滤板(MIllipore)，用结合缓冲液洗涤4次。将滤器在Wallac Wizard 1470γ计数器(PerkinElmer Life and AnalyticalSciences)上计数。使用NewLigand软件(Genentech，Inc)测定结合亲和力(Munson等人,1980，Anal Biochem 107:220-39)。
Akt磷酸化的蛋白质印迹
将A2780-hRON细胞和BxPC3细胞在含有0.5％BSA的培养基中培育过夜。将细胞在37℃用100ng/ml MSP 689R、MSP 689C处理20分钟或不处理。通过用冰冷的PBS洗涤细胞单层2次，制备样品，随后添加SDS-PAGE样品缓冲液并由BCA蛋白质测定法(Thermo Scientific，Rockford，IL)定量。将蛋白质(20μg)在4％–20％Tris-甘氨酸凝胶(LifeTechnologies)上电泳，转移至硝酸纤维素膜并在室温用Odyssey封闭缓冲液(Li-Cor Biosciences)封闭1小时。将膜在4℃用Akt多克隆抗体(CellSignaling Technology)和磷酸-Akt单克隆抗体Ser473(Cell SignalingTechnology)探测过夜。在洗涤后，将膜与IRDyeTM800缀合的山羊抗小鼠IgG(Rockland Immunochemicals)和AlexaFluor 680山羊抗兔IgG(LifeTechnologies)温育1小时。使用Odyssey红外成像系统(Li-Cor Biosciences)检测磷酸化激酶和总激酶表达的量。
对于在表达mRON的3T3细胞中mRON的MSPβ-Fc活化，使用Mini-Protein Tetra Cell(Biorad)，通过SDS-PAGE分离10-50ug蛋白质裂解物上清液，并根据制造商的说明书转移至Tetra Cell中的PVDF膜(Millipore)。根据制造商的说明书,用抗磷酸Akt抗体(克隆D9E，CellSignaling Technology)或多克隆抗Akt抗体(Cell Signaling Technology)，随后用HRP缀合的山羊抗兔抗体,探测印迹物。通过将膜与SuperSignalWest Pico溶液(Thermo Fisher)温育并对胶片曝光，将蛋白质条带可视化。
在固定的组织切片上免疫荧光和免疫组织化学
为了免疫荧光染色，将小鼠结肠切下，用PBS彻底冲洗，并在PLP缓冲液(含有0.1M L-赖氨酸[pH 7.4]、2mg/ml NaIO4和10mg/ml多聚甲醛的0.05M磷酸盐缓冲液)中固定过夜，随后在30％蔗糖中脱水，并包埋于OCT冷冻介质(Sakura Finetek)中。在CM3050S cryostat(LeicaMicrosystems)上切出12μm厚的切片，贴至Superfrost Plus载玻片(VWR)。将切片在10％驴血清(Jackson ImmunoResearch实验室)中封闭并使用以下第一抗体染色：F4/80-AlexaFluor647(克隆BM8，eBiosciences)，MHC II类-FITC(克隆M5/114.15.2，BD Biosciences)和山羊抗小鼠RON(R&D Systems)。用驴抗山羊AlexaFluor568(Life Technologies)显现山羊抗体。用Hoechst33342(Life Technologies)复染细胞核，用Prolong Gold(LifeTechnologies)封片。使用Leica SPE共聚焦显微镜(Leica Microsystems)获得图像。
将小鼠皮肤切下并在PLP缓冲液(含有0.1M L-赖氨酸[pH 7.4]、2mg/ml NaIO4和10mg/ml多聚甲醛的0.05M磷酸盐缓冲液)中固定过夜，随后在30％蔗糖中脱水，并包埋于OCT冷冻介质(Sakura Finetek)中。在CM3050S cryostat(Leica Microsystems)上切出12μm厚的切片，贴至Superfrost Plus载玻片(VWR)。将切片在含有0.2％TritonX-100(Sigma)的10％驴血清(Jackson ImmunoResearch实验室)中封闭，使用以下第一抗体染色：F4/80-FITC(克隆BM8，eBiosciences)、E-钙黏着蛋白-Alexa Fluor647(克隆DECMA-1，e Biosciences)和山羊抗小鼠RON(R&D Systems)。用驴抗山羊AlexaFluor568(Life Technologies)显现山羊抗体。用Hoechst33342(Life Technologies)复染细胞核，用Prolong Gold(LifeTechnologies)封片。使用LSM510共聚焦显微镜(Carl ZeissMicroimaging)，获得图像。
为了人组织上的免疫组织化学，从福尔马林固定、石蜡包埋的肠组织切出4μm切片。染色在Ventana Discovery XT Autostainer平台(VentanaMedical Systems)上进行。使用Ventana即用型试剂，进行脱石蜡、内源性过氧化物酶阻断以及使用CC1标准抗原修复法预处理。随后将山羊多克隆抗人RON抗体(R&D Systems)在3％BSA/PBS中稀释至0.5μg/ml，将切片在37℃温育32分钟。随后将切片与未缀合的兔-抗山羊第二接头抗体(Vector Labs)温育，随后与抗兔OMNIMAP-HRP试剂盒(Ventana MedicalSystems)和ChromoMap DAB比色试剂(Ventana Medical Systems)温育。将载玻片用苏木精(Ventana Medical Systems)复染，脱水，透明，封片用于观察。
为了鼠组织上的免疫组织化学，从福尔马林固定、石蜡包埋的肠组织切出4μm切片。将切片在二甲苯中脱石蜡并通过梯度乙醇系列再水化。随后使用靶修复溶液(DAKO)，预处理切片以便抗原修复。使用KPL封闭液(KPL,Inc.)，封闭切片的内源性过氧化物酶活性，使用抗生物素蛋白/生物素封闭试剂盒(Vector Labs)封闭抗生物素蛋白/生物素，并且用TNB封闭缓冲液(Perkin Elmer)封闭IgG结合作用。将切片在4℃与2.5μg/ml的抗鼠RON山羊多克隆抗体(R&D Systems)温育过夜。随后将切片与生物素化的驴抗山羊第二抗体(Jackson ImmunoResearch实验室)温育，随后与ABC-HRP Elite试剂(Vector Labs)温育。使用金属增强型DAB比色过氧化物酶底物(Thermo Scientific)，完成显色。随后将切片用Myer苏木精(Rowley Biochemical Institute)复染，脱水，用二甲苯透明，封片以观察。
定量PCR或RT-PCR
为了确定EMBARK队列成员的rs3197999基因型，在Taqman SNP基因分型测定法(Applied Biosystems)中使用10ng基因组DNA。为了比较稳定转染的293Flp-In细胞中MSP表达盒的量，用DNeasy试剂盒(Qiagen)分离基因组DNA并且用Taqman通用PCR主混合物(Applied Biosystems)分析50ng。使用对MSP表达盒DNA特异的引物，5’-CCACTGCTTACTGGCTTATCG-3'(SEQ ID NO:56),5’-TCTTCAGCATCTGCCACATC-3'(SEQ ID NO:57)和taqman探针5’-TAGCGCTACCGGACTCAGAT-3'(SEQ ID NO:58)。将MSP DNA量对GAPDH DNA归一化，其中使用ΔCT法用Taqman基因表达分析(Applied Biosystems)对所述GAPDH DNA定量。为了分析上皮细胞系和髓样细胞中的RON mRNA表达，用RNeasy试剂盒以柱内DNA酶消化法(Qiagen)分离总RNA。用Quantitect Probe RT-PCR试剂盒(Qiagen)分析80ng RNA，并且使用ΔCT法将RON表达对RPL19表达归一化。对于RON扩增，使用引物5’-AGGGCAGTCCTGCAACAT-3’(SEQ ID NO:59)、5’-GAGTCCACTGTGCCCAGAA-3’(SEQ ID NO:60)，和TaqMan探针5’-ACAGGGTCCACAGCAGGCACTC-3’(SEQ ID NO:61)。对于RPL19扩增，使用引物5’-CAATGCCAACTCCCGTCAG-3'(SEQ ID NO:62)，5’-GTCACAGGCTTGCGGATGA-3'(SEQ ID NO:63)，和TaqMan探针5’-AGATCCGGAAGCTCATCAAAGATGGGCT-3'(SEQ ID NO:64)。反应在ABI 7500实时PCR系统上进行并用7500软件(Applied Biosystems)分析。
为了分析肠道活检物中的mRNA表达，使用TissueLyzer(Qiagen)以3mm均化组织样品，并使用RNeasy试剂盒(Qiagen)分离RNA。使用Agilent RNA 6000Pico试剂盒(Agilent Technologies)以Agilent 2100Bioanalyzer评估RNA完整性。使用人RON引物对Hs00899925_m1(Applied Biosystems)和GAPDH引物对Hs99999905_m1(Applied Biosystems)，在BioMark HD系统(Fluidigm)上进行反应。使用ΔΔCT法，将RON表达对GAPDH和参比人RNA样品归一化。
MSP的ELISA测定
为了分析人血清，将MaxiSorp板在4℃用0.05M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液pH 9.6中的1μg/ml抗hMSPα抗体(R&D Systems)包被过夜，随后在室温在封闭缓冲液(PBS，0.5％BSA，15ppm Proclin pH 7.4)中温育1小时。将样品稀释于分析稀释剂(PBS，0.5％BSA，0.05％Tween20，15ppmProclin)中，添加至平板，并在室温温育2小时。将生物素化的多克隆山羊抗人MSP(R&D Systems)在分析稀释剂中稀释至100ng/ml，添加至平板，并在室温温育1小时。将Amdex链霉亲和素-HRP(GE Healthcare)在分析稀释剂中稀释至50ng/ml，添加至平板，并在室温温育30分钟。通过与TMB/H2O2底物(KPL,Inc)温育15分钟，添加1M H3PO4并测量450nm处吸光度(A450)，以读取结合作用。通过与MSP 689R、MSP 689C、scMSP689R和scMSP 689C的标准曲线比较，计算MSP浓度，其中对于所述标准曲线，以2.5倍增量从2ng/ml滴定至0.0082ng/ml。
为了分析来自稳定转染了MSP原的细胞的上清液，将MicrotestELISA板(BD Falcon)在4℃用PBS中的1μg/ml抗hMSPα抗体(R&DSystems)包被过夜，随后在室温在起始封闭缓冲液(Thermo Scientific)中温育1小时。将样品稀释于起始封闭缓冲液中，添加至平板，并在室温温育2小时。将生物素化的多克隆山羊抗人MSP(R&D Systems)在起始封闭缓冲液中稀释至1μg/ml，添加至平板，并在室温温育1小时。将链霉亲和素-HRP(EMD Millipore)在起始封闭缓冲液中1:10,000稀释，添加至平板，并在室温温育20分钟。通过与TMB/H2O2底物(R&D Systems)温育15分钟，添加1M H3PO4并测量A450，对结合作用读数。为了控制细胞量的差异，通过添加CellTiter-Glo并用Glomax光度计(Promega)测量发光，定量相对细胞密度。ELISA结果除以发光值以对细胞密度进行控制。
3T3和3T3-mRON细胞中借助MSPβ-IgG2a激动剂和抗RON激动剂 抗体实现的RON激动作用
将3T3细胞或3T3-mRON细胞接种在具有0.5％小牛血清的DMEM中并允许贴壁过夜。次日，移除培养基，在37℃用单独的培养基、抗豚草IgG2a同种型对照、MSP、h16m、m16m、m4m、m8m、m12m、或m16mMSPβ-IgG2a激动剂(15nM至1pM，在培养基中5倍稀释系列)、RON激动剂抗体2E5.8.1或YW651.1(15nM至1pM，在培养基中5倍稀释系列)，处理细胞30分钟。将细胞在MSD裂解缓冲液中在冰上裂解15分钟。为了检测Akt磷酸化，将裂解物添加至MULTI-SPOT 96孔4-Spot磷酸(Ser473)/总Akt平板(Meso Scale Discovery)，根据制造商的说明书温育并在SECTOR成像仪6000(Meso Scale Discovery)中读数。使用Prism软件包(GraphPad)计算EC50值。
鼠结肠和皮肤中对MSPβ-IgG2a和RON抗体激动剂活性的体内分析
为了测量结肠裂解物中的Akt磷酸化，将每组五只雌性C57Bl/6小鼠用PBS中稀释至100ul体积的5mg/kg m12m MSPβ-IgG2a激动剂、RON激动剂抗体2E5.8.1-IgG2a、RON激动剂抗体YW651.1-IgG2a或相同同种型的抗豚草对照抗体静脉内接种。在1小时后，从小鼠收获结肠，用冷PBS冲洗，并使用GentleMACS M管(Miltenyi Biotec)在500ul MSD裂解缓冲液中匀浆。为了检测Akt磷酸化，将上清液通过蛋白质印迹分析法分析，或添加至MULTI-SPOT 96孔4-Spot磷酸(Ser473)/总Akt平板(MesoScale Discovery)，根据制造商的说明书温育并在SECTOR成像仪6000(Meso Scale Discovery)中读数。为了测量皮肤裂解物中的Akt磷酸化，在第0日，将雌性db/db小鼠用异氟烷麻醉，并且将背部的背侧部分(从肩胛至腰部区域)剃毛，以Nair移除毛茬，并用无菌水、酒精、碘伏淋洗并重复酒精淋洗。将动物以腹卧方式放置，使用6mm冲孔装置形成两个6mm直径的全厚度皮肤伤口，中线左侧1cm和右侧1cm。围绕每个伤口放置一个内直径10-12mm、厚度0.5mm的硅氧烷框架，框架由强力胶水固定就位。在伤口和框架上方放置一个2cm2的Tegaderm或Op-site。在第4日，将小鼠用PBS中稀释至100ul体积的5mg/kg RON激动剂抗体YW651.1-IgG2a或相同同种型的抗豚草对照抗体腹膜内接种。在1小时后，收获伤口周围2mm皮肤环状物和来自非伤口区域的6mm皮肤片，并且使用GentleMACS M管在300ul MSD裂解缓冲液中匀浆。
为了测量切片的结肠组织中的Akt磷酸化，将每组四只雌性C57Bl/6小鼠用PBS中稀释至100ul体积的5mg/kg m12m MSPβ-IgG2a激动剂或相同同种型的抗豚草对照抗体静脉内接种。对新鲜切制的4μm厚福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)、封于玻璃载片上的组织切片，进行免疫组织化学。载玻片在二甲苯中脱石蜡并经过梯度乙醇至蒸馏水进行再水化。将载玻片在99℃用靶修复溶液(Dako)预处理20分钟并冷却20分钟。随后将载玻片分别用KPL封闭液(Kierkegaard and Perry Laboratories，MD，美国)和抗生物素蛋白/生物素封闭液(Vector Laboratories)处理。在室温用由3％BSA中的10％正常山羊血清组成的封闭血清，封闭非特异性IgG结合作用30分钟。将第一抗体即抗pAKT克隆D9E(兔单克隆抗体，#4060L，Cell Signaling Technologys)在室温于载玻片上在封闭血清中以0.375μg/ml温育60分钟。洗载玻片，在室温与山羊抗兔生物素化第二抗体(VectorLaboratories，CA，美国)以7.5μg/ml温育30分钟，随后在Vectastain ABCElite试剂(Vector Laboratories)中温育。随后在Pierce金属增强型DAB(Thermo Scientific)中温育载玻片。随后，将载玻片复染、脱水，用盖玻片覆盖。
体外伤口愈合测定法
将亲本3T3细胞或3T3-mRON细胞悬浮于具有0.5％BCS的DMEM中并且接种在胶原蛋白包被的96孔板中。次日，使用WoundMaker 96(Essen Bioscience)，在每个孔中产生划痕。在PBS中洗涤两次后，将单独的培养基或含有15nM MSP 689R、MSP 689C、scMSP、抗豚草IgG2a(0.6nM、0.12nM或3nM)、MSP(3nM)，RON激动剂抗体2E5.8.1-IgG2a(0.6nM或0.12nM)，RON激动剂抗体YW651.1-IgG2a(0.6nM或0.12nM)的培养基或作为对照的空白，添加至各孔。将细胞在IncuCyte成像系统(Essen Bioscience)中温育32小时，每隔数小时成像。使用IncuCyte软件包(Essen Bioscience)，相对于划痕外部的密度，计算划痕内部的细胞密度。使用ImageJ(美国国家健康研究院)，用高斯滤波器、反差增强和投影，统一地对图像实施事后分析(post-analysis)。还参见Abramoff等人,2004,Biophotonics International 11:36-42。
糖尿病小鼠中体内伤口愈合测定和葡萄糖测量
在第0日，将雌性db/db小鼠用异氟烷麻醉，并且将背部的背侧部分(从肩胛至腰部区域)剃毛，以Nair移除毛茬，并用无菌水、酒精、碘伏淋洗并重复酒精淋洗。将动物以腹卧方式放置，使用6mm冲孔装置形成两个6mm直径的全厚度皮肤伤口，中线左侧1cm和右侧1cm。围绕每个伤口放置一个内直径10-12mm、厚度0.5mm的硅氧烷框架，框架由强力胶水固定就位。在伤口和框架上方放置2cm2的Tegaderm或Op-site。在第-4日开始，每四日，将每组六只动物用100μg抗豚草IgG2a或RON激动剂抗体YW651.1腹腔内接种。每四日，使用数字式卡尺，测量每个伤口的水平尺寸和垂直尺寸，确定均数。伤口用Nikon D200数码照相机照相。每四日，通过尾部切口抽取2μl血液并用One Touch葡萄糖计测量血糖。
实施例1在肠和皮肤中RON主要由上皮细胞表达
已经假设MSP 689C多态性通过干扰RON介导的巨噬细胞活性抑制作用而增加IBD风险(参见例如，Goyette等人,2008,Mucosal Immunol1:131-8，Gorlatova等人,2011,PLoS One 6:e27269)。但是，尽管已经证实RON表达和对巨噬细胞的抑制活性(参见例如，1998,J Immunol161:4950-9)，但是这些报告主要依赖于使用鼠腹膜巨噬细胞群体的研究，这与IBD可能具有有限的相关性。因此，为了鉴定可能被源自689C多态性的MSP活性改变所影响的细胞类型，表征在稳态和炎性状况下多个鼠和人细胞类型中的RON表达。
使用流式细胞术，首先检查小鼠中的RON表达模式。与先前报道(例如，Iwama等人,Blood 1995,86:3394-403)一致，定居性和巯基乙酸引发的腹膜巨噬细胞表达高水平的RON受体。在其他鼠巨噬细胞群体(包括肝脏枯否细胞(Kupffer cells)和体外培养的骨髓来源巨噬细胞(BMM))上也发现较低水平的RON(图1A)。还在从解剖的结肠组织分离的细胞上检查了RON表达。仅观察到在固有层巨噬细胞群体上的RON弱染色，但是在结肠上皮细胞上观察到相对强的染色(图1A)。为了进一步确定肠组织和皮肤组织中的RON表达模式，在来自鼠结肠的组织切片上进行免疫组织化学(IHC)染色并且在来自鼠结肠和皮肤的组织切片上进行免疫荧光法(IF)染色。检测到肠上皮上的强RON染色，局限于各上皮细胞的基底外侧表面(图1B和图1C)。皮肤上的强RON染色也局限于上皮细胞(图1E)。与流式细胞分析一致，固有层中的RON染色弱并且不能与背景区分。值得注意地，RON在结肠上皮和固有层细胞上的相对表达在炎症的状况下不变化。从饮用水中持续6日提供3％硫酸葡聚糖钠(DSS)以诱导结肠炎的小鼠收获结肠，其显示优势的上皮RON表达，并且用巨噬细胞标志物共染色未揭示该细胞类型具有可检测表达(图1D)。
鉴于鼠RON由肠上皮细胞而不由肠巨噬细胞强表达，重新讨论了RON在肠道炎症的背景下调节巨噬细胞活性的作用。为了将这些研究结果扩展至人和IBD，表征不同人细胞类型和组织的RON表达。与人髓样细胞群体(包括原代CD14+单核细胞、单核细胞来源巨噬细胞(MDM)和单核的细胞系)相比，在多个人上皮细胞系中检测到实质更高水平的RON转录物(图2A)。用各种刺激物如干扰素-γ、LPS、或IL4处理MDM培养物未能诱导明显的RON上调(图2A)。这些数据与流式细胞分析一致，显示RON蛋白在上皮细胞表面上但是不在单核细胞/巨噬细胞群体上表达(图2B)。
尽管以上数据表明RON在稳态条件下不在人单核细胞/巨噬细胞群体中表达，但是这些表达模式可能在IBD的情形下改变。正常组织、UC组织和CD组织中RON表达的IHC分析展示了于上皮细胞的优势定位，这类似于小鼠中所观察到的情况(图2C，来自11位UC患者、9位CD患者和8位正常个体的组织切片的代表性图像)。但是，在这些切片上也观察到一定的固有层染色，这可能代表背景染色或其它细胞类型上的RON表达。值得注意地，通过IHC或通过定量分析从正常患者、UC患者和CD患者获得的肠道活检组织中的RON转录物，RON表达在正常组织和疾病组织之间并无实质性变动(图2C和图2D)。后面的这些数据与以下相符：RON由上皮细胞表达，但是不由与发炎的活检样品相关的募集的炎性细胞群体表达。
为了进一步确定IBD组织中的RON表达模式，通过流式细胞术检查来自IBD患者(图2E)和对照的切除人肠道样品的单细胞悬液。对来自多个供体的切除肠组织的巨噬细胞和上皮细胞上的RON表达进行定量，图2F中显示结果。
根据较早的观察，RON在上皮细胞上强表达，但是在巨噬细胞群体上如果表达的话也表达不良(图2E和图2F)。如图2G中所显示，通过流式细胞分析排除了组织加工程序和酶消化程序影响RON染色的可能性，该图显示：用以从肠切除物产生单细胞悬液的酶消化方案不影响RON表达的水平。这些数据显示，在人类中，RON由上皮细胞群体而非髓样细胞群体高度表达。与鼠免疫系统相反，在人巨噬细胞群体中在稳态或疾病状况下没有检测到高水平的RON受体表达。在小鼠和人类中，RON均由肠上皮组成型高度表达，位于该细胞的基底外侧表面。结果表明689C MSP多态性可能通过上皮固有效应而造成IBD形成的风险增加。
实施例2 MSP 689R和689C变体以相似的亲和力结合RON
在已经确定上皮细胞是人肠中MSP活性的可能靶标后，检查了689C多态性对RON激活的影响。从哺乳动物细胞表达和纯化几种形式的重组MSP(图3A-B)，包括全长形式的689R和689C MSP变体，其中与先前公开的研究一致，所述变体需要在氨基酸672(C672A)处半胱氨酸置换成丙氨酸以获得正确折叠的蛋白质。参见Gorlatova等人,PLoS One,6:e27269和Wahl等人,19971997,J Biol Chem 272:15053-6。还表达并纯化了组成型无活性单链MSP(scMSP)蛋白作为对照，所述蛋白在氨基酸483(R483E)处携带防止蛋白酶剪切成活性双链形式的精氨酸至谷氨酸突变。最后，产生MSPβ-链(MSPβ)——负责与RON高亲和力相互作用的结构域——的重组689R和689C形式。参见Danilkovitch等人,1999,J Biol Chem274:29937-43和Wang等人,1997,J Biol Chem 272:16999-7004。重要地，成功表达并且纯化在位置672处无突变的MSPβ蛋白，并且因此代表这个结构域的野生型序列。
在MSP与固定化RON结合的无细胞测定中，689R和689C蛋白质变体显示重叠的剂量-反应曲线。如预期，scMSP突变体显示与RON包被的平板微小结合(图3B)。为了更精确地对MSP与RON的相互作用定量，表面等离子体共振法(SPR)用来确定可溶性MSP 689R和689C与固定化RON的亲和力。在689R和689C形式的全长MSP或MSPβ之间未观察到RON结合动力学的显著差异，并且利用直接或间接RON固定时对scMSP未观察到结合作用(图3C和表3)。使用生物层干涉测量法(BLI)(一项用于实时定量分子相互作用的相关技术)，获得了类似的结果(表3)。未观察到MSPβ中突变位置672对689R或689C变体结合RON的能力的影响(表3)，表明全长MSP不受其表达所必需的C672A突变的影响。
表3 MSP 689R和689C蛋白对RON的结合动力学和亲和力
aSPR在25℃捕获RON-Fc，bSPR在25℃使用固定化RON Sema/PSI，cBLI在30℃使用RON-Fc，d放射配体在室温与3T3-hRON细胞结合2小时，e放射配体在冰上与3T3-hRON细胞结合4小时。
为了证实以上结果，使用标记的MSP 689R和689C蛋白和表达人RON的细胞系，进行放射配体结合测定法。与无细胞测定一致，竞争结合和斯卡查德分析揭示MSP变体之间在RON结合亲和力方面无显著差异(图3D和表3)。总之，这些数据显示689C多态性不影响MSP和RON之间的结合。这个结论与RON结合MSPβ的同源模型(homology model)相符。简而言之，使用来自蛋白质数据库的MSPβ(2ASU)、RON Sema/PSI(4FWW)和与HGFβ复合的Met Sema/PSI(1SHY)的坐标，产生人RONSema/PSI结合MSPβ的同源模型。参见Carafoli等人,2005,FEBS J272:5799-807；Chao等人,2012,PLoS One 7:e41912；和Stamos等人,2004,EMBO J 23:2325-35。使用Pymol(PyMOL Molecular Graphics System，版本1.4.1LLC)(用来显示全部结构)，将RON和MSPβ与Met/肝细胞生长因子(HGFβ)复合物整体对齐。使用Pymol，将MSPβ残基689突变成半胱氨酸。该同源模型显示，残基689远离推定的MSP-RON界面(图3E)。
实施例3 MSP原689R和689C变体发生相似的蛋白酶解激活
由于MSP的蛋白酶解激活是控制体内RON活性的关键调控点，接下来检查这个过程在MSP 689R和689C之间是否不同。假定由于表达期间存在的内源蛋白酶活性，重组MSP在从转染细胞的上清液纯化之后以(未切割的)无活性MSP原和(切割的)活性MSP形式存在。检查切割并激活MSP原的蛋白酶hepsin完全切割689R或689C单链蛋白的能力。参见Ganesan等人,2011,Mol Cancer Res 9:1175-86。
将MSP原在室温与sHepsin按1:100比例在激活缓冲液(50mMTris-HCl，pH 8.0，150mM NaCl，0.05％Chaps)中温育过夜，以产生活性MSP。通过添加10倍摩尔过量的抗hepsin(Fab25)，随后进行蛋白A-琼脂糖凝胶层析(GE Healthcare)，移除sHepsin。这导致MSP原完全转化成活性双链形式。为了确定激活动力学，将MSP原(100μg/mL，1.25μM)在37℃与多种浓度(100nM–97pM，2倍稀释系列)的sHepsin温育1小时，或将1.25μM MSP原在室温与激活缓冲液中的12.5nM sHepsin温育0.5、1、2、4、6、8、16或24小时。通过添加SDS-PAGE样品缓冲液终止反应，随后在还原条件下在4％–20％Tris-甘氨酸凝胶(LifeTechnologies)上电泳分析。
在1小时的时段内没有观察到在完全切割这些变体所需要的hepsin浓度上存在明显差异(图4)。这些数据表明689C多态性并非通过差异性影响MSP原的蛋白酶解激活而改变RON信号传导。
实施例4 MSP 689R和689C变体诱导相似的强RON信号传导
尽管本文中呈献的研究揭示在蛋白酶解激活或RON结合作用方面MSP变体之间无差异，但是689C多态性仍然可能通过RON受体影响MSP依赖性信号转导。为解决这一点，在几个RON表达细胞系上确定MSP变体的下游生物学效应。通过蛋白质印迹分析显示，用全长激活的MSP 689R或689C蛋白体外刺激A2780-hRON(Chaudhuri等人,2011,J Biol Chem286:32762-74)和BxPC3引起了相似水平的磷酸化Akt(pAkt)(图5A)。
另外，对3T3-hRON细胞中pAkt诱导情况的定量性Meso ScaleDiscovery(MSD)分析未能揭示在宽范围的剂量范围MSP 689R和689C活性存在差异(图5B)。简而言之，在具有0.5％小牛血清(BCS)的DMEM中接种3T3-RON细胞。次日，将细胞用各个滴度的MSP 689R、MSP 689C、scMSP(250nM至4pM，培养基中的1.5倍稀释系列)或单独的培养基处理30分钟，在MSD裂解缓冲液(Meso Scale Discovery)中裂解。为了检测Akt磷酸化，将裂解物添加至MULTI-SPOT 96孔4-Spot磷酸(Ser473)/总Akt平板(Meso Scale Discovery)，根据制造商的说明书温育并在SECTOR成像仪6000(Meso Scale Discovery)中读数。如MSD分析所显示，与其缺少RON结合作用一致，scMSP不诱导强pAkt信号。
已经报道RON信号传导诱导细胞增殖、存活和移行，这些在伤口修复过程中发挥重要作用。参见Nanney等人,1998,J Invest Dermatol111:573-81和Santoro等人,2003,Dev Cell 2003；5:257-71。为了确定689C多态性是否影响针对MSP的这些下游细胞反应，使用一种体外细胞单层划痕模型，在MSP变体存在或不存在时评价划痕闭合。在3T3-mRON细胞的汇合单层中产生划痕，并且随后将培养物用MSP 689R、MSP 689C、单独的培养基或无活性scMSP处理。用MSP 689R或689C处理导致相似的划痕宽度，所述划痕宽度小于未处理的或scMSP处理的培养物(图5C和图5D)。这些MSP诱导的反应依赖于RON表达，因为在RON阴性3T3细胞中未观察到处理效应(图5E)。总之，这些数据显示689C多态性不改变MSP与RON受体结合、借助RON受体传导信号或引发功能性反应的能力。此外，它们证实了MSP依赖性RON信号传导驱动与伤口修复有关的细胞反应的能力。
实施例5 MSP 689C多态性的携带者具有减少量的血清MSP
MSP由肝脏优势表达，在那里它分泌至血清中并且以相对高的浓度循环。参见Yoshimura等人,1993,J Biol Chem 268:15461-8。接下来，针对MSP 689R和MSP 689C，检查了循环型MSP的量。在来自204位供体的匹配人血清样品和DNA样品上分析了rs3197999基因型和MSP血清浓度。与此前的遗传研究一致，与无病个体相比，UC患者和CD患者中富含MSP次等位基因(图6A)。参见例如Anderson等人,2011,Nat Genet 43:246-52；Anderson等人,2009,Gastroenterology 136:523-9e3；Barrett等人,2008,Nat Genet 40:955-62。然而，鉴于该等位基因对总体IBD风险的适中贡献和与GWAS队列相比我们的研究组的数量相对小，这些结果没有达到统计显著性。
为了建立rs3197999基因型和血清MSP浓度之间的关系，开发了测量人血清中MSP的ELISA测定法。该测定法对于检测MSP 689R蛋白和MSP 689C蛋白具有相等的灵敏度并且不受蛋白质激活状态影响(图6D)。对rs3197999基因分型的队列中血清MSP浓度的分析揭示，与携带两个拷贝MSP 689R变体的个体相比，MSP 689C多态性的杂合携带者具有低27％(p<0.0001)的MSP量而纯合携带者具有低50％(p<0.0001)的MSP量(图6B)。这些降低的血清MSP浓度不是IBD的继发效应，因为正常个体和诊断患有CD或UC的患者显示相似的基因型依赖性MSP浓度降低(图6C)。
为了调查689C多态性导致血清MSP水平降低的机制，产生稳定转染的细胞系，所述细胞系带有位于相同基因组座位的、组成型启动子下游的单拷贝MSP 689R或689C cDNA。定量PCR分析证实各个克隆携带相同量的整合MSP DNA，并且通过ELISA测量细胞培养上清液中的MSP蛋白量(图6D)。这些研究揭示689C多态性不影响细胞产生的MSP的量，从而反对该多态性影响蛋白质合成或分泌的观点。
总之，这些数据显示689C多态性与降低水平的循环型MSP相关，并且表明由此导致的RON途径活性减少可以影响肠上皮细胞中的伤口修复效率，导致IBD易感性增加。
实施例6 MSPβ-IgG2a蛋白以高亲和力结合RON
为了作为RON激动剂发挥作用，MSPβ-IgG2a融合蛋白必须结合RON受体。为了分析结合作用，表面等离子体共振法用来测量全长人MSP，人和小鼠MSPβ和多种人和小鼠MSPβ-IgG2a融合物对固定化RON受体的亲和力。结果显示，大多数MSPβ-IgG2a融合蛋白以个位数的纳摩尔范围的高亲和力结合RON，类似于MSP——天然RON配体(图9)。具有缺少效应子功能的突变IgG2a结构域(D265A和N297A)的融合蛋白对RON，与具有野生型IgG2a的融合蛋白，具有相似的亲和力(图9)。
实施例7 MSPβ-IgG2a蛋白在体外作为RON激动剂发挥作用
为了在细胞中诱导RON信号传导，MSPβ-IgG2a融合蛋白必须结合在细胞表面上表达的全长RON。为了确定该情况是否发生，用鼠RON稳定转染的3T3细胞(3T3-mRON细胞)与各个滴度的融合蛋白或抗豚草IgG2a抗体(作为同种型对照)温育。温育后对3T3-mRON细胞的流式细胞分析显示，MSPβ-IgG2a蛋白在2ng/ml至5μg/ml的宽浓度范围结合细胞表面上的RON。相同同种型的抗豚草对照抗体的结合作用极小，并且仅在高浓度观察到(图10A)。结合作用是RON依赖的，因为采用RON阴性亲本3T3细胞时不发生结合(图10B)。
MSP与RON的结合诱导RON信号传导，并且如果MSPβ-IgG2a蛋白作为RON激动剂发挥作用，则它们与RON的结合也应当诱导信号传导。为确保MSPβ-IgG2a蛋白在生物学相关细胞类型中诱导信号传导，将内源表达RON的人原代结肠细胞用m12m激动剂刺激。
在平板中，将人原代结肠细胞系HPC1(Celprogen)接种在具有0.5％胎牛血清的RPMI培养基中并贴壁过夜。次日，移除培养基，在37℃用0.5ml培养基或在培养基中稀释至浓度0.4nM或0.75nM的m12m MSPβ-IgG2a激动剂处理细胞30分钟。将细胞在MSD裂解缓冲液(Meso Scale Discovery)中在冰上裂解15分钟。为了检测Akt磷酸化，通过蛋白质印迹分析法分析上清液。细胞裂解物的蛋白质印迹分析显示在丝氨酸473处诱导Akt磷酸化——RON信号传导下游的修饰(图10C)。
为了更详细地评价MSPβ-IgG2a融合蛋白的RON激动剂活性，用融合蛋白、MSP或相同同种型的抗豚草对照抗体在一系列浓度刺激3T3-mRON细胞。这些细胞中丝氨酸473处Akt磷酸化的定量性MesoScale Discovery(MSD)分析显示，如同MSP，融合蛋白以剂量依赖性方式诱导Akt磷酸化。另外，在MSPβ和IgG2a之间较长的间隔与作为RON激动剂的更大效力相关(图10D)。在本测定中，抗豚草对照抗体无活性(图10D)。观察到的信号传导是RON依赖的，因为在RON阴性亲本3T3细胞中不诱导Akt磷酸化(图10E)。
实施例8 MSPβ-IgG2a蛋白在体内结合肠上皮
为了诱导肠上皮中的修复途径，MSPβ-IgG2a融合蛋白应当抵达该组织并结合该组织内的细胞。为了鉴定由全身性给药的MSPβ-IgG2a融合蛋白结合的细胞，将RAG2-/-小鼠用PBS、MSPβ-IgG2a融合物或相同同种型的抗豚草对照抗体静脉内注射。具体而言，向RAG-2缺陷小鼠施用PBS或5mg/kg m12m MSPβ-IgG2a激动剂或作为对照的抗豚草IgG2a。1小时后，处死动物(图11)。从全部小鼠收获结肠，用PBS冲洗，并在PLP缓冲液(含有0.1M L-赖氨酸[pH 7.4]、2mg/ml NaIO4和10mg/ml多聚甲醛的0.05M磷酸盐缓冲液)中固定过夜，随后在30％蔗糖中脱水，并包埋于OCT冷冻介质(Sakura Finetek)中。在CM3050S cryostat(Leica Microsystems)上切制12μm切片，并且贴至Superfrost Plus载玻片(VWR)。将切片在10％山羊血清(Jackson ImmunoResearch实验室)中封闭并且用缀合于Alexa Fluor 647的山羊抗小鼠抗体(Invitrogen)染色。使用Leica SPE共聚焦显微镜(Leica Microsystems)获得图像。
用抗小鼠IgG对冰冻切片的肠组织染色，显示MSPβ-IgG2a与结肠上皮特异性结合(图11，底部小图)，而同种型对照具有非特异性染色样式，局限于血管和组织实质(图11，中部小图)。用PBS注射的小鼠的结肠中观察到极少染色(图11，顶部小图)。这些数据显示，全身给药的MSPβ-IgG2a能够抵达肠道实质并结合上皮。另外，由于这是肠中RON表达的主要部位，融合蛋白已经抵达了应当响应于其活性的细胞类型。
实施例9 MSPβ-IgG2a蛋白作为RON激动剂在体内发挥作用
免疫组织化学数据显示，全身给药的MSPβ-IgG2a蛋白抵达肠上皮并且可以结合表达RON的细胞。为了确定MSPβ-IgG2a蛋白是否在体内诱导RON信号传导，将小鼠用融合蛋白静脉内注射(图12A)。蛋白质印迹分析显示，与相同同种型的抗豚草对照抗体相比，来自接受MSPβ-IgG2a的小鼠的结肠完整组织裂解物中Akt磷酸化增加(图12B)。该信号传导是RON依赖的，因为在缺少RON酪氨酸激酶结构域的RON.ko小鼠的结肠中未观察到Akt磷酸化增加(图12B)。通过定量性MSD分析如下小鼠结肠中的Akt磷酸化证实了结肠中的RON信号传导，其中所述小鼠用在MSPβ和IgG2之间间隔4、8、12或16个氨基酸的融合蛋白注射。这项分析分别检测到大约2.6倍、2倍、2.3倍和2.5倍Akt磷酸化增加(图12C)。不同于3T3-mRON细胞，在结肠中，MSPβ-IgG2a蛋白的激动剂活性与MSPβ和IgG2a之间间隔基团的尺寸不相关。这些数据显示MSPβ-IgG2a蛋白以有功能的状态抵达结肠并且在该组织中诱导RON依赖性信号传导。
小鼠结肠的蛋白质印迹和MSD分析显示，RON激动剂在该组织中诱导RON信号传导。结肠上皮将是在其中诱导RON信号传导并刺激修复途径的有关组织。为了鉴定是否在这些细胞中诱导信号传导，将小鼠用RON激动剂蛋白或相同同种型的抗豚草对照抗体静脉内注射(图13A)。随后对来自这些小鼠的结肠组织切片并对磷酸化Akt染色。在对照抗体处理的动物中，结肠在隐窝细胞中显示弱的、散在的细胞核磷酸化Akt染色(图13B)。与之相反，接受RON激动剂的小鼠的结肠显示更强的细胞核和胞质染色，该染色更优势地位于表面和上面的隐窝上皮细胞(图13C)。这些结果表明RON激动剂在诱导修复途径相关的细胞类型中诱导信号传导。
实施例10 RON激动剂抗体结合细胞表面上表达的RON
使用mRON作为抗原，产生抗mRON激动剂抗体。在筛选后，鉴定到并进一步分析了两个克隆。为了作为RON激动剂在体内发挥作用，RON激动剂抗体必须结合细胞表面上表达的全长RON。为了确定该情况是否发生，将3T3-mRON细胞与各个滴度的仓鼠抗RON抗体2E5.8.1-仓鼠IgG1或人抗RON抗体YW651.1-IgG1温育。该温育后对3T3-mRON细胞的流式细胞分析显示，两种激动剂抗体均在约2ng/ml至40μg/ml的宽浓度范围结合细胞表面上的RON(图14A和图14C)。与激动剂相同同种型的对照仓鼠抗体和人抗体并不结合3T3-mRON细胞(数据未显示)。激动剂抗体结合作用是RON特异，因为它们不结合RON阴性亲本3T3细胞(图14B和图14D)。
实施例11 RON激动剂抗体作为RON激动剂在体外发挥作用
为了评价抗RON抗体的激动剂活性，将2E5.8.1和YW651.1抗体克隆重整(reformat)以含有小鼠IgG2a Fc区。将3T3-mRON细胞用一系列浓度的2E5.8.1-IgG2a、YW651.1-IgG2a、MSP或相同同种型的抗豚草对照抗体刺激。这些细胞中丝氨酸473处Akt磷酸化的定量性Meso ScaleDiscovery(MSD)分析显示，如同MSP，激动剂抗体以剂量依赖性方式诱导Akt磷酸化(图15A)。在这个测定中，抗豚草对照抗体无活性(图15A)。在RON阴性亲本3T3细胞中不诱导Akt磷酸化(图15B)，表明观察到的信号传导是RON依赖的。
实施例12某些RON激动剂抗体不阻断MSP与RON结合
如同MSP，RON激动剂抗体结合RON。因此它们可能干扰MSP与RON结合并在一些情况下导致经MSP的RON信号传导减少。为了确定这类干扰是否发生，通过基于平板的结合测定法，测量MSP与RON结合(图16)。在该测定中，将Microtest ELISA平板(BD Falcon)在4℃用PBS中的2μg/ml mRON-hFc融合物(SEQ ID NO:50)包被过夜，将MSP与PBS预温育的孔的结合视为最大值。洗涤平板(具有0.05％Tween 20的PBS)并用1X试剂稀释液(R&D Systems)封闭1小时。洗涤平板，与稀释于1X试剂稀释液中的30μg/mLPBS、抗豚草IgG2a、Ph4抗RON IgG2a抗体或激动剂抗体2E5.8.1或YW651.1温育30分钟。将六组氨酸标签的鼠MSPβ加至终浓度0.1μg/mL，将平板温育1小时。将平板洗涤并与1X试剂稀释液中1:2000稀释的HRP缀合抗His抗体(Miltenyi Biotec)温育。洗涤平板，并且通过与TMB/H2O2底物(R&D Systems)温育15分钟、添加1M H3PO4和测量A450，读取结合作用。
如预期，与不结合RON的抗豚草抗体预温育不减少MSP结合。还如预期，与和MSP竞争结合RON的Ph4抗RON抗体预温育减少了MSP结合(图16)。RON激动剂抗体2E5.8.1不减少MSP结合，激动剂抗体YW651.1适当地减少MSP结合。这些结果表明，这两种激动剂抗体与RON的结合可能不同，其中一个与MSP竞争而另一个不与MSP竞争。
下表4中总结了重整的单克隆抗体2E5.8.1和YW651.1的特征。
nt-未测试
实施例13 RON激动剂抗体不诱导RON从细胞表面下调
接下来，检查了RON激活是否将诱导从细胞表面移除受体，导致对MSP或激动剂抗体的反应性降低。使用一种基于细胞的测定法来回答激动剂抗体是否诱导RON下调(图17和图18)。通过流式细胞术以确定，与在冰上实施温育的对照相比，在37℃与激动剂抗体的温育是否将减少细胞表面上RON的量(图17)。
将200,000个3T3-mRON细胞沉淀，并在37℃或在冰上与FACS缓冲液中稀释至20μg/mL的仓鼠IgG、赫赛汀(Herceptin)、MSP，m12mMSPβ-IgG2a、Ph4-IgG2a、YW651.1-人IgG1或2E5.8.1-仓鼠IgG1温育30分钟。将细胞在FACS缓冲液(PBS外加2％FBS)中洗涤2次。
为了借助激动剂试剂检测RON，将细胞在37℃或在冰上按以下进行温育30分钟：对于仓鼠IgG和2E5.8.1：FACS缓冲液中1:500稀释的R-藻红蛋白缀合的山羊抗仓鼠IgG(Jackson Immunoresearch)；对于赫赛汀和YW651.1：FACS缓冲液中1:250稀释的藻红蛋白缀合的山羊抗人IgG(BD Pharmingen)；对于Ph4和MSPβ-IgG2a：FACS缓冲液中1:500稀释的Alexa Fluor 647缀合的山羊抗小鼠IgG。通过计算37℃温育后的RON信号与冰上温育后的信号之比，确定RON下调，其中小于1的比率表示下调。
为了用替代性抗体检测RON，将细胞在37℃或在冰上按以下进行温育30分钟：对于用仓鼠IgG、赫赛汀和2E5.8.1处理的细胞，用FACS缓冲液中1:1000稀释的Alexa Fluor 647-缀合的Ph4抗体检测RON；对于用MSP、MSPβ-IgG2a、Ph4和YW651.1处理的细胞，2E5.8.1抗体以FACS缓冲液中1μg/ml浓度使用。随后用FACS缓冲液中1:500稀释的R-藻红蛋白缀合的山羊抗仓鼠IgG检测2E5.8.1。通过计算37℃温育后的RON信号与冰上温育后的信号之比，确定RON下调，其中小于1的比率表示下调。
使用测量细胞表面RON的不同方法，平行进行两个实验。在一个实验中，使用对激动剂特异的第二抗体，检测RON。在另一个实验中，使用不同的抗体检测RON。重要地，阻断数据用来选择不与激动剂竞争结合RON的检测抗体。如预期，不结合RON的仓鼠IgG和赫赛汀不诱导RON下调。使用两种RON检测方法的测定显示，在37℃与m12m MSPβ-IgG2a融合物、抗RON抗体Ph4或RON激动剂抗体YW651.1和2E5.8.1温育后，细胞表面RON水平相对未改变。未获得检测MSP与细胞表面结合的试剂，但是当与MSP温育后用2E5.8.1抗体来检测RON时，RON水平未改变。这些数据表明，就调节RON表面受体表达而言，RON抗体与MSP具有类似表现，不诱导RON从细胞表面的下调。
实施例14 RON激动剂抗体在体外划痕测定中诱导修复
如上文显示，在利用细胞单层的划痕实验中，MSP可以诱导模拟伤口愈合的修复反应。为了确定RON激动剂抗体是否在细胞中与MSP诱导相似的下游效应，在划痕测定中评价抗体诱导修复的能力。如上文显示，12小时的人MSP处理(MSP 689R或MSP 689C)在表达hRON的3T3细胞中引起划痕愈合，与抗豚草抗体对照相比划痕区域内可见更大细胞密度(图5C)。类似地，mMSP-Fc融合蛋白和RON激动剂抗体在使用表达mRON的3T3细胞的该体外系统中引起了相似的修复反应(图19A)。在32小时过程中对3T3-mRON细胞划痕中细胞密度的定量分析显示，RON激动剂抗体YW651.1和2E5.8.1诱导与MSP相似的划痕修复，比对照IgG抗体处理的细胞中观察到的划痕修复更大。该伤口修复刺激作用是RON依赖的，因为在RON阴性亲本3T3细胞中MSP和激动剂抗体均不诱导修复(图19B)。
实施例15 RON激动剂抗体诱导小鼠结肠和皮肤中的RON信号传导
为了确定RON激动剂抗体是否在体内诱导RON信号传导，将小鼠用YW651.1-IgG2a、2E5.8.1-IgG2a或相同同种型的抗豚草对照抗体静脉内或腹腔内注射。对结肠中Akt磷酸化的定量性MSD(Mesoscale Discovery)分析显示，YW651.1-IgG2a和2E5.8.1-IgG2a在结肠中作为RON激动剂发挥作用，分别诱导Akt磷酸化增加超过对照抗体大约7倍和5倍(图20A)。这些数据还显示RON激动剂抗体以有功能的状态抵达结肠并在该组织中诱导RON信号传导。
对皮肤中Akt磷酸化的定量性MSD分析显示，YW651.1-IgG2a在来自糖尿病小鼠(db/db)(图20B)和野生型对照(“WT”，即，RON TK-/-系同窝仔畜，RON TK+/+或RON阳性小鼠)(图20C)的未受伤皮肤中作为RON激动剂发挥作用，分别诱导超过对照抗体大约2倍和3倍的Akt磷酸化增加。YW651.1-IgG2a在RON TK-/-小鼠(RON的酪氨酸激酶结构域缺失的RON缺陷小鼠)中不诱导RON信号传导，表明该信号传导是RON依赖的(图20C)。
实施例16 RON激动剂抗体在糖尿病db/db小鼠中诱导伤口愈合并降低血糖
已经显示RON激动剂抗体在体外结合RON并且在鼠结肠中诱导信号传导，随后确定该信号传导是否可能在体内诱导受损上皮组织的修复。MSP已经在上皮损伤的皮肤创伤模型中显示诱导愈合(Santoro等人,2003,Dev Cell.5(2):257-71)，相似模型在这个实验中用于糖尿病小鼠(db/db小鼠)中以分析RON激动剂抗体YW651.1-IgG2a对修复的诱导(图21A-B)。
在本研究过程期间，对于接收RON激动剂抗体的小鼠，伤口尺寸缩减至几乎为零，这意味着伤口已经愈合到闭合点(图21A)。与之形成鲜明对比，对于接收相同同种型的对照抗体的小鼠，伤口不闭合。实际上，伤口尺寸仅缩减50％。这个结果表明全身给药的RON激动剂抗体诱导受损上皮修复。此外，在来自db/db小鼠的受伤皮肤中，YW651.1-IgG2a诱导超过对照抗体的Akt磷酸化(图21C)。因此，与上文描述的划痕测定的结果一致，对皮肤中Akt磷酸化的定量性MSD分析显示，YW651.1-IgG2a在来自糖尿病小鼠(db/db)(图20B)、野生型RON阳性小鼠(图20C)的未受伤皮肤中以及来自db/db小鼠的受伤皮肤(图21C)中作为RON激动剂发挥作用。
除受损的伤口愈合之外，db/db小鼠还具有与人类中糖尿病相似的其他表型，如升高的非空腹血糖水平。为了确立RON激动剂抗体是否调节其他db/db小鼠表型，确定YW651.1-IgG2a或2E5.8.1-IgG2a对非空腹血糖水平的影响。在多个时间点，与接受相同同种型的抗豚草对照抗体的小鼠相比，接受RON激动剂抗体YW651.1-IgG2a的小鼠具有显著更低的血糖水平(图22)。这些结果显示在代谢综合征模型中RON抗体有效调节多个表型。
已经详细地并且通过参考具体实施方案描述了本发明，显然不偏离所附权利要求中限定的本发明范围的修改和变型是可能的。更特别地，虽然本发明的某些方面在本文中被确定为特别有利，但是可以想到本发明不必限于本发明的这些具体方面。

Claims (88)

1.受体d’Origine Nantais(RON)激动剂，其包含抗RON激动剂抗体或其抗原结合片段、或者巨噬细胞刺激蛋白(MSP)融合蛋白或其功能性片段。
2.根据权利要求1所述的RON激动剂，其中RON激动剂包含MSP融合蛋白或其功能性片段。
3.根据权利要求1或2所述的RON激动剂，其中MSP融合蛋白包含MSPβ和融合结构部分。
4.根据权利要求3所述的RON激动剂，其中融合结构部分包含二聚化结构域。
5.根据权利要求4所述的RON激动剂，其中融合结构部分包含Fc结构域。
6.根据权利要求5所述的RON激动剂，其中Fc结构域是IgG Fc结构域。
7.根据权利要求6所述的RON激动剂，其中IgG是IgG1、IgG2或IgG4。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的RON激动剂，其中MSP融合蛋白还包含肽接头。
9.根据权利要求8所述的RON激动剂，其中肽接头具有2至20个氨基酸残基长度，优选地4-16个氨基酸残基长度。
10.根据权利要求9所述的RON激动剂，其中肽接头具有16个氨基酸残基长度。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的RON激动剂，其中RON激动剂是人MSP融合蛋白。
12.根据权利要求11所述的RON激动剂，其中RON激动剂包含人MSPβ和Fc结构域。
13.根据权利要求12所述的RON激动剂，其中Fc结构域是人IgG1Fc结构域。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的RON激动剂，其中RON激动剂包含SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
15.根据权利要求14所述的RON激动剂，其中RON激动剂包含SEQID NO:20的氨基酸序列。
16.根据权利要求1所述的RON激动剂，其中RON激动剂包含抗RON激动剂抗体或其抗原结合片段。
17.根据权利要求1或16所述的RON激动剂，其中抗RON激动剂抗体是抗人RON激动剂抗体。
18.药物组合物，包含根据权利要求1-17中任一项所述的RON激动剂和可药用载体、稀释剂或赋形剂。
19.治疗有需求的受试者中MSP相关的或受体d’Origine Nantais(RON)相关的疾病或病症的方法，包括步骤：向受试者施用根据权利要求1-17中任一项所述的RON激动剂或根据权利要求18所述的药物组合物。
20.根据权利要求19所述的方法，还包括步骤：检测受试者中的血清MSP水平，检测正常对照中的血清MSP水平，当受试者中的血清MSP水平与正常对照中的血清MSP水平相比较低时，向受试者施用RON激动剂。
21.根据权利要求19所述的方法，还包括步骤：检测受试者中rs3197999多态性的存在，并且当受试者中检出rs3197999多态性时，向受试者施用RON激动剂。
22.根据权利要求20所述的方法，还包括步骤：检测受试者中rs3197999多态性的存在，当受试者中检出rs3197999多态性且当受试者中的血清MSP水平比正常对照中的低时，向受试者施用RON激动剂。
23.根据权利要求19-22中任一项所述的方法，其中MSP相关的或RON相关的疾病或病症是炎性肠病(IBD)或伤口愈合缺陷。
24.根据权利要求23所述的方法，其中IBD是溃疡性结肠炎。
25.根据权利要求23所述的方法，其中IBD是克罗恩氏病。
26.根据权利要求23所述的方法，其中MSP相关的或RON相关的疾病或病症是上皮伤口愈合缺陷。
27.根据权利要求26所述的方法，其中上皮伤口愈合缺陷与糖尿病相关。
28.根据权利要求26所述的方法，其中受试者是糖尿病受试者。
29.增加上皮细胞增殖、存活和/或移行的方法，包括使上皮细胞与根据权利要求1-17中任一项所述的RON激动剂或根据权利要求18所述的药物组合物接触的步骤。
30.在有需求的受试者中增强上皮伤口愈合或增加上皮细胞增殖、存活和/或移行的方法，包括步骤：向受试者施用根据权利要求1-17中任一项所述的RON激动剂或根据权利要求18所述的药物组合物。
31.根据权利要求30所述的方法，还包括步骤：
(1)检测受试者的血清MSP水平；
(2)检测正常对照的血清MSP水平，和
(3)当受试者中的血清MSP水平比正常对照中的低时，向受试者施用RON激动剂。
32.根据权利要求30所述的方法，还包括步骤：检测受试者中的rs3197999多态性，并且当受试者中检出rs3197999多态性时，向受试者施用RON激动剂。
33.根据权利要求31所述的方法，还包括步骤：检测受试者中的rs3197999多态性，当受试者中检出rs3197999多态性且当受试者中的血清MSP水平比正常对照中的低时，向受试者施用RON激动剂。
34.根据权利要求30-33中任一项所述的方法，其中受试者是糖尿病受试者。
35.根据权利要求30-34中任一项所述的方法，其中受试者患有IBD。
36.根据权利要求35所述的方法，其中IBD是溃疡性结肠炎。
37.根据权利要求35所述的方法，其中IBD是克罗恩氏病。
38.治疗有需求的受试者中糖尿病的方法，包括步骤：向受试者施用根据权利要求1-17中任一项所述的RON激动剂或根据权利要求18所述的药物组合物。
39.在有需求的受试者中降低血糖的方法，包括步骤：向受试者施用根据权利要求1-17中任一项所述的RON激动剂或根据权利要求18所述的药物组合物。
40.治疗有需求的糖尿病受试者中伤口愈合的方法，包括步骤：向受试者施用根据权利要求1-17中任一项所述的RON激动剂或根据权利要求18所述的药物组合物。
41.根据权利要求38-40中任一项所述的方法，还包括步骤：检测受试者中rs3197999多态性的存在，并且当受试者中检出rs3197999多态性时，向受试者施用RON激动剂。
42.根据权利要求38-40中任一项所述的方法，还包括步骤：检测受试者中的血清MSP水平，检测正常对照中的血清MSP水平，当受试者中的血清MSP水平比正常对照中的低时，向受试者施用RON激动剂。
43.根据权利要求42所述的方法，还包括步骤：检测受试者中rs3197999多态性的存在，当受试者中检出rs3197999多态性且当受试者中的血清MSP水平比正常对照中的低时，向受试者施用RON激动剂。
44.根据权利要求19-43中任一项所述的方法，其中RON激动剂包含抗RON激动剂抗体或其抗原结合片段、或者MSP融合蛋白或其功能性片段。
45.根据权利要求44所述的方法，其中RON激动剂包含MSP融合蛋白或其功能性片段。
46.根据权利要求45所述的方法，其中MSP融合蛋白包含MSPβ和融合结构部分。
47.根据权利要求46所述的方法，其中RON激动剂包含MSPβ-Fc融合蛋白。
48.根据权利要求47所述的方法，其中MSP融合蛋白还包含肽接头。
49.根据权利要求48所述的方法，其中肽接头具有2至20个氨基酸残基长度、优选地4-16个氨基酸残基长度。
50.根据权利要求48或49所述的方法，其中肽接头具有16个氨基酸残基长度。
51.根据权利要求19-50中任一项所述的方法，其中RON激动剂是人MSP融合蛋白。
52.根据权利要求51所述的方法，其中RON激动剂包含人MSPβ和Fc结构域。
53.根据权利要求52所述的方法，其中Fc结构域是人IgG1Fc结构域。
54.根据权利要求19-53中任一项所述的方法，其中RON激动剂包含SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
55.根据权利要求54所述的方法，其中RON激动剂包含SEQ IDNO:20的氨基酸序列。
56.根据权利要求19-44中任一项所述的方法，其中MSP激动剂是抗RON激动剂抗体或其抗原结合片段。
57.根据权利要求56所述的方法，其中RON激动剂抗体是抗人RON激动剂抗体。
58.根据权利要求57所述的方法，其中RON激动剂抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体、双特异性抗体或人源化抗体。
59.根据权利要求19-58中任一项所述的方法，其中受试者是哺乳动物。
60.根据权利要求59所述的方法，其中受试者是人。
61.一种在疑似患有或有风险患有炎性肠病(IBD)的试验受试者中诊断IBD的方法，包括步骤：
a.检测受试者的血清MSP水平；
b.检测正常对照的血清MSP水平；和
c.如果受试者的血清MSP水平低于对照的血清MSP水平，则诊断受试者患有IBD或有风险患有IBD。
62.根据权利要求61所述的方法，还包括步骤：确定受试者中rs3197999多态性的存在，当受试者中检出rs3197999多态性时，诊断受试者患有IBD或有风险患有IBD。
63.一种在疑似患有或有风险患有IBD的试验受试者中诊断IBD的方法，包括步骤：
a.检测受试者中rs3197999多态性的存在；
b.检测受试者的血清MSP水平；
c.检测正常对照的血清MSP水平；和
d.当受试者的血清MSP水平低于对照的血清MSP水平且当受试者中检出rs3197999多态性时，诊断受试者患有IBD或有风险患有IBD。
64.根据权利要求61-63中任一项所述的方法，其中IBD是溃疡性结肠炎。
65.根据权利要求61-63中任一项所述的方法，其中IBD是克罗恩氏病。
66.一种诊断疑似患有或有风险患有伤口愈合缺陷的受试者的方法，包括步骤
a.检测受试者的血清MSP水平；
b.检测正常对照的血清MSP水平；和
c.如果受试者的血清MSP水平低于正常对照的血清MSP水平，则诊断受试者患有或有风险患有伤口愈合缺陷。
67.根据权利要求66所述的方法，还包括步骤：检测受试者中rs3197999多态性的存在，当受试者中检出rs3197999多态性且当受试者的血清MSP水平低于正常对照的血清MSP水平时，诊断受试者患有或有风险患有伤口愈合方面的病况或障碍。
68.一种诊断疑似患有或有风险患有伤口愈合缺陷的试验受试者的方法，包括步骤：
a.检测受试者中rs3197999多态性的存在；
b.当受试者中检出rs3197999多态性时，诊断受试者患有或有风险患有伤口愈合缺陷。
69.根据权利要求66-68中任一项所述的方法，其中伤口愈合是上皮伤口愈合。
70.根据权利要求66-68中任一项所述的方法，其中受试者是糖尿病受试者。
71.根据权利要求61-70中任一项所述的方法，其中受试者是哺乳动物。
72.根据权利要求71所述的方法，其中受试者是人。
73.根据权利要求1-15中任一项所述的MSP融合蛋白。
74.根据权利要求73所述的MSP融合蛋白，其中MSP融合蛋白是人MSP融合蛋白。
75.分离的核酸分子，包含编码根据权利要求73或74所述的MSP融合蛋白的多核苷酸序列。
76.根据权利要求75所述的分离核酸分子，包含SEQ ID NO:19、SEQID NO:21或SEQ ID NO:23的多核苷酸序列。
77.根据权利要求76所述的分离核酸分子，包含SEQ ID NO:19的多核苷酸序列。
78.载体，包含编码根据权利要求73或74所述的MSP融合蛋白的多核苷酸序列。
79.根据权利要求78所述的载体，包含SEQ ID NO:19的多核苷酸序列。
80.宿主细胞，包含根据权利要求75-77中任一项所述的核酸分子或根据权利要求78或79所述的载体。
81.一种产生MSP融合蛋白的方法，包括步骤：
a.在表达MSP融合蛋白的条件下培养根据权利要求80所述的宿主细胞；并且
b.回收MSP融合蛋白。
82.根据权利要求16或17任一项所述的分离抗体。
83.根据权利要求82所述的分离抗体，其中抗体是抗人RON激动剂抗体。
84.根据权利要求82或83所述的分离抗体，其中抗体是单克隆抗体，嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
85.分离的核酸分子，包含编码根据权利要求82-84中任一项所述的抗体的多核苷酸序列。
86.载体，包含编码根据权利要求82-84中任一项所述的分离抗体的多核苷酸序列。
87.宿主细胞，包含根据权利要求85所述的核酸分子或根据权利要求86所述的载体。
88.一种产生抗体的方法，包括步骤：
a.在表达抗体的条件下培养根据权利要求87所述的宿主细胞；并且
b.回收抗体。
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