KR102211378B1 - 인플루엔자 바이러스 백신 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인플루엔자 바이러스 백신 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌의 짧은 헬리컬 도메인(HA2SH) 및 M2 단백질의 엑토도메인(M2e)을 포함하는 융합단백질을 이용한 인플루엔자 바이러스 감염 예방용 백신 조성물에 관한 것이다. 상기 융합단백질은 대장균에서 대량 발현 및 정제가 가능하며, 여러 아형을 갖는 인플루엔자 바이러스들에 대한 중화항체를 효과적으로 생산할 수 있다. 또한, 상기 융합단백질은 우수한 항체 유도 효과를 나타내어 면역 유도를 효과적으로 수행할 수 있으며, 이를 통해 인플루엔자 바이러스 아형 및 신종 변이 인플루엔자 바이러스에 대한 방어 유도가 가능한 범용성 백신으로 활용될 수 있다.

Description

인플루엔자 바이러스 백신 조성물{INFLUENZA VIRUS VACCINE COMPOSITION}

본 발명은 인플루엔자 바이러스 백신 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌의 짧은 헬리컬 도메인(HA2SH) 및 M2 단백질의 엑토도메인(M2e)을 포함하는 융합단백질을 이용한 인플루엔자 바이러스 감염 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.

오한, 발열, 근육통 등이 동반되는 호흡기 질환을 일으키는 인플루엔자 바이러스는 다양한 아형이 존재하며, 이는 바이러스의 면역원성을 결정하는 단백질인 헤마글루티닌(Hemagglutinin; HA) 및 뉴라미니다아제(Neuraminidase; NA)의 다양성에서 기인한다. 예를 들어, A형 인플루엔자에 대해서는 HA 16종 및 NA 9종이 존재하며, 이들의 변이가 빈번히 발생한다. 따라서, 백신을 개발하기 위해서는 유행 균주를 미리 예측하고 백신을 제작해야 하는 부담감이 있으며, 유행 균주의 예측에도 불구하고 새로운 변이체의 발생으로 인해 백신 효능이 현저히 떨어지게 되는 등 여러 문제점이 있다.

이를 해결하기 위한 방법으로 인플루엔자 바이러스 표면 단백질에 존재하는 아미노산 잔기의 보존성이 높은 부위를 이용하는 인플루엔자 바이러스의 범용성 백신의 개발이 연구되고 있다. 예를 들어, 높은 보존성의 항원결정기를 갖는 헤마글루티닌 단백질을 이용한 “mini-HA"가 H1 아형 단백질을 항원으로 수행한 실험에서 바이러스 효능을 나타냄으로써 범용성을 증명하였다(Impagliazzo A et al., Science 349.6254 (2015): 1301-1306).

그럼에도 불구하고, 다양한 변이체에 대해서 광범위한 범용성 백신으로 활용될 수 있는 새로운 백신의 개발이 여전히 요구되고 있으며, 특히 대량생산이 가능하고 제조가 용이한 융합단백질을 이용한 범용성 인플루엔자 바이러스 백신 조성물의 개발이 절실하다.

Impagliazzo, Antonietta, et al. "A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen." Science 349.6254 (2015): 1301-1306.

이에 본 발명자들은 다양한 인플루엔자 바이러스간에 높은 보존성을 나타내는 HA2SH 및 M2e를 범용성 인플루엔자 바이러스 백신 개발을 위해 연구한 결과, HA2SH 및 M2e를 포함하는 융합단백질 삼량체가 다양한 인플루엔자 바이러스 아형에 대해 강력한 면역 반응을 유도한다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

이에 따라, 본 발명의 목적은 다양한 인플루엔자 바이러스 아형에 대해 효과를 나타내어 범용성 백신으로 활용될 수 있는 HA2SH 및 M2e를 포함하는 융합단백질 삼량체를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 융합단백질 삼량체를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 예방용 백신 조성물 및 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌의 짧은 헬리컬 도메인(HA2SH) 및 M2 단백질의 엑토도메인(M2e)을 포함하는 융합단백질 삼량체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 융합단백질 삼량체를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 융합단백질 삼량체를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 예방용 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 융합단백질 삼량체를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 융합단백질 삼량체는 대장균에서 대량 발현 및 정제가 가능하며, 여러 아형을 갖는 인플루엔자 바이러스에 대한 중화항체를 효과적으로 생산할 수 있다. 또한, 상기 융합단백질 삼량체는 우수한 항체 유도 효과를 나타내어 효과적으로 면역 유도를 할 수 있다. 따라서, 상기 융합단백질 삼량체는 인플루엔자 아형뿐 아니라, 신종 변이 인플루엔자에 대해서도 예방이 가능한 범용성 백신 및 인플루엔자 바이러스 감염 질환에 대한 우수한 치료 효과를 갖는 약학 조성물로 활용될 수 있다.

도 1은 인플루엔자 바이러스의 HA 전체 헤드 도메인 및 스템 도메인의 서열을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 인플루엔자 바이러스의 HA2 서열을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 인플루엔자 바이러스의 M2 단백질 서열을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 HA2SH 및 M2e를 포함하는 융합단백질 삼량체(3XHA2SH-M2e)의 모식도를 나타낸 것이다.
도 5는 대장균 발현 벡터 pET28a-3XHA2HS-M2e를 나타낸 것이다.
도 6은 제조한 3XH1SH-M2e, 3XH3SH-M2e, 3XH5SH-M2e 및 H135SH-M2e를 SDS-PAGE 상에서 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7a는 니켈-친화성 크로마토그래피로 정제된 3XH1SH-M2e를 나타낸 그래프이다.
도 7b는 니켈-친화성 크로마토그래피로 정제된 3XH3SH-M2e를 나타낸 그래프이다.
도 7c는 니켈-친화성 크로마토그래피로 정제된 3XH5SH-M2e를 나타낸 그래프이다.
도 7d는 니켈-친화성 크로마토그래피로 정제된 H135SH-M2e를 나타낸 그래프이다.
도 8은 3XH1SH-M2e, 3XH3SH-M2e, 3XH5SH-M2e 및 H135SH-M2e의 발현 결과를 확인한 것이다.
도 9는 ELISA 분석을 통한 3XH1SH-M2e, 3XH3SH-M2e, 3XH5SH-M2e 및 H135SH-M2e의 항체 유도 효과를 나타낸 것이다.
도 10a 내지 도 10h는 3XH1SH-M2e, 3XH3SH-M2e, 3XH5SH-M2e 및 H135SH-M2e를 주입한 마우스의 인플루엔자 A 바이러스(H1N1, H3N2, H5N1 및 H5N8) 감염 후 체중 변화 및 생존율을 나타낸 것이다.
도 11a 내지 도 11h는 3XHA2SH-M2e(3XH1SH-M2e, 3XH3SH-M2e, 3XH5SH-M2e 및 H135SH-M2e)를 주입한 마우스의 인플루엔자 A 바이러스(H1N1, H3N2, H5N1 및 H5N8) 감염 후 체중 변화 및 생존율을 나타낸 것이다(H1N1 및 H3N2 감염군 보정; n=8에서 dpi 7일차 체중 증가 최대 개체와 체중 감소 최대 개체를 배제(n=6) 후 체중 감소 20% cut-off).

본 발명의 일 측면은 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌의 짧은 헬리컬 도메인(HA2SH) 또는 이의 단편 및 M2 단백질의 엑토도메인(M2e) 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 삼량체를 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "헤마글루티닌의 짧은 헬리컬 도메인(HA2SH)"이란, 인플루엔자 바이러스의 표면 단백질인 헤마글루티닌(HA)의 스템 도메인(HA2) 중 짧은 헬리컬 부위를 의미하는 것으로, 구체적으로 인플루엔자 바이러스의 다양한 아형 간에 공통적으로 보존된 아미노산 서열을 갖는 부위를 의미한다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 융합단백질에 포함되는 HA2SH는 바람직하게 HA2SH 단편의 아미노산 잔기 373-404가 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "M2 단백질의 엑토도메인(M2e)"란, 인플루엔자 바이러스의 막단백질인 M2 단백질의 엑토도메인을 의미하는 것으로, 구체적으로 M2 단백질에서 인플루엔자 바이러스 아형 간의 보존적인 아미노산 서열을 갖는 부위를 의미한다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 융합단백질에 포함되는 M2e는 바람직하게 M2e 단편의 15개의 아미노산 잔기가 사용될 수 있다.

여기서, 상기 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 M2e는 구체적으로 인플루엔자 바이러스 A형에서 유래된 단백질을 의미하는 것으로, 구체적으로 상기 인플루엔자 바이러스 A형의 종류는 H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H5N1 또는 H5N8일 수 있으며, 구체적으로는 H1N1, H3N2 또는 H5N1일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 융합단백질 삼량체는 하기 구조식을 가질 수 있다:

A₁-(L₁)_n-A₂-(L₂)_m-A₃

여기서, 상기 A₁은 HA2SH₁-(l₁)_k-M2e₁로 표시되고, 상기 A₂는 HA2SH₂-(l₂)_i-M2e₂로 표시되며, 상기 A₃은 HA2SH₃-(l₃)_j-M2e₃으로 표시되고,

상기 HA2SH₁, HA2SH₂ 및 HA2SH₃은 각각 독립적으로 H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H5N1 및 H5N8로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌의 짧은 헬리컬 도메인 또는 이의 단편이며,

상기 M2e₁, M2e₂ 및 M2e₃은 각각 독립적으로 H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H5N1 및 H5N8로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 인플루엔자 바이러스의 M2 단백질의 엑토도메인 또는 이의 단편이며,

상기 L₁, L₂, l₁, l₂ 및 l₃은 각각 독립적으로 펩티드 결합에 의해 연결된 1 내지 8개 아미노산으로 이루어진 펩티드 링커이다. 또한, 상기 n, m, k, i, j는 각각 독립적으로 0 또는 1의 정수이다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 HA2SH₁, HA2SH₂ 및 HA2SH₃은 각각 독립적으로 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시될 수 있다. 또한, 상기 서열번호 7은 서열번호 10의 염기 서열로 코팅되며, 상기 서열번호 8은 서열번호 11의 염기 서열로 코팅되고, 상기 서열번호 9는 서열번호 12의 염기 서열로 코딩될 수 있다.

이때, 상기 HA2SH₁, HA2SH₂ 및 HA2SH₃은 서로 같거나, HA2SH₁, HA2SH₂ 및 HA2SH₃ 중 어느 하나 이상이 서로 상이하거나, 상기 HA2SH₁, HA2SH₂ 및 HA2SH₃이 모두 서로 상이할 수 있다. 예를 들어, 상기 HA2SH₁, HA2SH₂ 및 HA2SH₃은 모두 서열번호 7로 표시되거나, 모두 서열번호 8로 표시되거나, 모두 서열번호 9로 표시될 수 있다. 또한, 상기 HA2SH₁는 서열번호 7로 표시되고, 상기 HA2SH₂는 서열번호 8로 표시되며, 상기 HA2SH₃은 서열번호 8로 표시될 수 있다. 또한, 상기 HA2SH₁는 서열번호 7로 표시되고, 상기 HA2SH₂는 서열번호 8로 표시되며, 상기 HA2SH₃은 서열번호 9로 표시될 수 있다. 여기서, 서열번호 7은 H1N1의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 또는 이의 단편이고, 서열번호 8은 H3N2의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 또는 이의 단편이며, 서열번호 9는 H5N1의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 또는 이의 단편일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 M2e₁, M2e₂ 및 M2e₃은 각각 독립적으로 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시될 수 있다. 또한, 상기 서열번호 13은 서열번호 16의 염기 서열로 코팅되며, 상기 서열번호 14는 서열번호 17의 염기 서열로 코팅되고, 상기 서열번호 15는 서열번호 18의 염기 서열로 코딩될 수 있다.

이때, 상기 M2e₁, M2e₂ 및 M2e₃은 서로 같거나, M2e₁, M2e₂ 및 M2e₃ 중 어느 하나 이상이 서로 상이하거나, 상기 M2e₁, M2e₂ 및 M2e₃이 모두 서로 상이할 수 있다. 예를 들어, 상기 M2e₁, M2e₂ 및 M2e₃은 모두 서열번호 13으로 표시되거나, 모두 서열번호 14로 표시되거나, 모두 서열번호 15로 표시될 수 있다. 또한, 상기 M2e₁는 서열번호 13으로 표시되고, 상기 M2e₂는 서열번호 14로 표시되며, 상기 M2e₃은 서열번호 14로 표시될 수 있다. 또한, 상기 M2e₁는 서열번호 13으로 표시되고, 상기 M2e₂는 서열번호 14로 표시되며, 상기 M2e₃은 서열번호 15로 표시될 수 있다. 여기서, 서열번호 13은 H1N1의 인플루엔자 바이러스의 M2e 또는 이의 단편이고, 서열번호 14는 H3N2의 인플루엔자 바이러스의 M2e 또는 이의 단편이며, 서열번호 15는 H5N1의 인플루엔자 바이러스의 M2e 또는 이의 단편일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "융합단백질"이란, HA2SH 및 M2e를 포함하는 것으로, 구체적으로 상기 A₁, A₂ 및 A₃으로 표시되는 융합단백질 단량체를 의미한다. 구체적으로, 상기 A₁은 HA2SH₁-(l₁)_k-M2e₁로 표시되고, 상기 A₂는 HA2SH₂-(l₂)_i-M2e₂로 표시되며, 상기 A₃은 HA2SH₃-(l₃)_j-M2e₃으로 표시될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 융합단백질은 상기 k, i 및 j가 각각 0인 정수일 때, 상기 A₁은 HA2SH₁-M2e₁로 표시되고, 상기 A₂는 HA2SH₂-M2e₂로 표시되며, 상기 A₃은 HA2SH₃-M2e₃으로 표시될 수 있다. 또한, 상기 k, i 및 j가 각각 1인 정수일 때, 상기 A₁은 HA2SH₁-(l₁)₁-M2e₁로 표시되고, 상기 A₂는 HA2SH₂-(l₂)₁-M2e₂로 표시되며, 상기 A₃은 HA2SH₃-(l₃)₁-M2e₃으로 표시될 수 있다. 이때, 상기 k, i 및 j는 서로 같거나, k, i 및 j 중 어느 하나 이상이 서로 상이할 수 있다. 또한, 상기 A₁, A₂ 및 A₃은 HA2SH-M2e의 구조와 같이, HA2SH 및 M2e를 포함하는 융합단백질 단량체를 의미하는 것으로 표시될 수 있다.

이때, 상기 A₁의 HA2SH₁ 및 M2e₁는 서로 동일한 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편일 수 있다. 구체적으로, HA2SH₁ 및 M2e₁는 모두 H1N1의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편일 수 있다. 한편, 상기 A₁의 HA2SH₁ 및 M2e₁는 서로 상이한 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편일 수 있다. 구체적으로, 상기 HA2SH₁은 H1N1의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편이며, 상기 M2e₁는 H3N2의 인플루엔자 바이러스의 M2e 및 이의 단편일 수 있다.

또한, 상기 A₂의 HA2SH₂ 및 M2e₂는 서로 동일한 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편일 수 있다. 구체적으로, HA2SH₂ 및 M2e₂는 모두 H3N2의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편일 수 있다. 한편, 상기 A₂의 HA2SH₂ 및 M2e₂는 서로 상이한 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편일 수 있다. 구체적으로, 상기 HA2SH₂는 H3N2의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편이며, 상기 M2e₂는 H5N1의 인플루엔자 바이러스의 M2e 및 이의 단편일 수 있다.

또한, 상기 A₃의 HA2SH₃ 및 M2e₃은 서로 동일한 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편일 수 있다. 구체적으로, HA2SH₃ 및 M2e₃은 모두 H5N1의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편일 수 있다. 한편, 상기 A₃의 HA2SH₃ 및 M2e₃은 서로 상이한 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편일 수 있다. 구체적으로, 상기 HA2SH₃은 H5N1의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편이며, 상기 M2e₂는 H1N1의 인플루엔자 바이러스의 M2e 및 이의 단편일 수 있다.

이때, 상기 A₁, A₂ 및 A₃은 서로 같거나, A₁, A₂ 및 A₃ 중 어느 하나 이상이 서로 상이하거나, 상기 A₁, A₂ 및 A₃이 모두 서로 상이할 수 있다. 예를 들어, 상기 A₁, A₂ 및 A₃은 모두 서열번호 19로 표시되거나, 모두 서열번호 20로 표시되거나, 모두 서열번호 21로 표시될 수 있다. 또한, 상기 A₁는 서열번호 19로 표시되고, 상기 A₂는 서열번호 20으로 표시되며, 상기 A₃은 서열번호 20으로 표시될 수 있다. 또한, 상기 A₁는 서열번호 19로 표시되고, 상기 A₂는 서열번호 20으로 표시되며, 상기 A₃은 서열번호 21로 표시될 수 있다.

여기서, 서열번호 19는 H1N1의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편을 포함할 수 있고, 서열번호 20은 H3N2의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편을 포함할 수 있으며, 서열번호 21은 H5N1의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편을 포함할 수 있다. 또한, 상기 서열번호 19는 서열번호 22의 염기 서열로 코팅되며, 상기 서열번호 20은 서열번호 23의 염기 서열로 코팅되고, 상기 서열번호 21은 서열번호 24의 염기 서열로 코딩될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 융합단백질 A₁, A₂ 및 A₃은 각각 독립적으로 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열로 표시되는 단량체를 포함할 수 있다. 상기 융합단백질은 상기 아미노산 서열과 동일하거나, 이의 아미노산이 보존적 치환에 의해 치환되거나, 90 내지 99%의 서열상동성, 바람직하게는 95 내지 99%의 서열상동성, 더욱 바람직하게는 98 내지 99%의 서열상동성을 갖는 융합단백질을 모두 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "융합단백질 삼량체"란, HA2SH 및 M2e를 포함하는 융합단백질 단량체가 3번 반복적으로 결합된 형태를 의미하는 것으로, 구체적으로 상기 A₁-(L₁)_n-A₂-(L₂)_m-A₃의 구조를 갖는 융합단백질 삼량체를 의미한다. 인플루엔자 바이러스의 다양한 아형 간에 공통적으로 보존된 아미노산 서열을 갖는 HA2SH 및 M2e로부터 형성된 융합단백질 삼량체는 인플루엔자 바이러스의 다양한 아형에 대하여 효과적으로 중화항체를 형성할 수 있다. 상기 융합단백질 삼량체는 개체 내에서 항원으로 작용하여 항원-항체 반응을 유도함으로써 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다.

상기 융합단백질 삼량체는 A₁-(L₁)_n-A₂-(L₂)_m-A₃의 구조식(상기 A₁, A₂ 및 A₃은 상기 정의한 바와 같다)으로 표시될 수 있으며, 구체적으로, 상기 n 및 m가 각각 1인 정수일 때, 상기 융합단백질 삼량체는 A₁-A₂-A₃으로 표시될 수 있고, 상기 n 및 m가 각각 1인 정수일 때, 상기 융합단백질 삼량체는 A₁-(L₁)₁-A₂-(L₂)₁-A₃으로 표시될 수 있다. 또한, 상기 n이 0인 정수이고 m이 1인 정수일 때, 상기 융합단백질 삼량체는 A₁-A₂-(L₂)₁-A₃으로 표시될 수 있고, 상기 n이 1인 정수이고 m이 0인 정수일 때, 상기 융합단백질 삼량체는 A₁-(L₁)₁-A₂-A₃으로도 표시될 수 있다. 상술한 바와 같이, 상기 A₁, A₂ 및 A₃은 서로 같거나, A₁, A₂ 및 A₃ 중 어느 하나 이상이 서로 상이하거나, 상기 A₁, A₂ 및 A₃이 모두 서로 상이할 수 있다.

또한, 상기 융합단백질 삼량체는 3XHA2SH-M2e의 구조로도 표시될 수 있으며, 구체적으로 3XH1SH-M2e, 3XH3SH-M2e, 3XH5SH-M2e 및 H135SH-M2e로 표시될 수 있다. 여기서, 상기 3XH1SH-M2e(서열번호 25, 서열번호 33 또는 서열번호 41)는 A₁, A₂ 및 A₃ 모두가 H1N1의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편을 포함하는 융합단백질 삼량체를 의미하고, 상기 3XH3SH-M2e(서열번호 26, 서열번호 34 또는 서열번호 42)는 A₁, A₂ 및 A₃ 모두가 H3N2의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편을 포함하는 융합단백질 삼량체를 의미한다. 또한, 상기 3XH5SH-M2e(서열번호 27, 서열번호 35 또는 서열번호 43)는 A₁, A₂ 및 A₃ 모두가 H5N1의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편을 포함하는 융합단백질 삼량체를 의미한다. 한편, 상기 H135SH-M2e(서열번호 28, 서열번호 36 또는 서열번호 44)는 A₁이 H1N1의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편을 포함하고, A₂가 H3N2의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편을 포함하며, A₃이 H5N1의 인플루엔자 바이러스의 HA2SH 및 이의 단편, 또는 M2e 및 이의 단편을 포함하는 융합단백질 삼량체를 의미한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 융합단백질 삼량체는 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43 및 서열번호 44로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열로 표시될 수 있다. 상기 융합단백질 삼량체는 상기 아미노산 서열과 동일하거나, 이의 아미노산이 보존적 치환에 의해 치환되거나, 90 내지 99%의 서열상동성, 바람직하게는 95 내지 99%의 서열상동성, 더욱 바람직하게는 98 내지 99%의 서열상동성을 갖는 융합단백질 삼량체를 모두 포함할 수 있다.

이때, 상기 서열번호 25 내지 서열번호 28은 링커를 포함하지 않는(상기 n 및 m가 각각 0인 정수를 가짐) 융합단백질 삼량체를 표시하고, 상기 서열번호 23 내지 서열번호 36은 링커를 포함하는(상기 n 및 m가 각각 1인 정수를 가짐) 융합단백질 삼량체를 표시하며, 상기 서열번호 41 내지 서열번호 44는 His-tag를 포함하는 융합단백질 삼량체를 표시한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 서열번호 25는 서열번호 29의 염기 서열로, 상기 서열번호 26은 서열번호 30의 염기 서열로, 상기 서열번호 27은 서열번호 31의 염기 서열로, 상기 서열번호 28은 서열번호 32의 염기서열로, 서열번호 33은 서열번호 37의 염기 서열로, 상기 서열번호 34는 서열번호 38의 염기 서열로, 상기 서열번호 35는 서열번호 39의 염기 서열로, 상기 서열번호 36은 서열번호 40의 염기서열로, 서열번호 41은 서열번호 45의 염기 서열로, 상기 서열번호 42는 서열번호 46의 염기 서열로, 상기 서열번호 43은 서열번호 47의 염기 서열로, 상기 서열번호 44는 서열번호 48의 염기서열로 코딩될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "보존적 치환"이란, 한 부류의 아미노산이 동일한 부류의 다른 아미노산으로 대체되는 것을 의미한다. 보존적 치환은 폴리펩티드의 구조 또는 기능을 변경시키지 않는다. 보존적 치환의 목적을 위한 아미노산의 부류는 소수성(예를 들어, Met, Ala, Val, Leu), 중성 친수성(예를 들어, Cys, Ser, Thr), 산성(예를 들어, Asp, Glu), 염기성(예를 들어, Asn, Gln, His, Lys, Arg), 입체형태 파괴물질(disrupter)(예를 들어, Gly, Pro) 및 방향족(예를 들어, Trp, Tyr, Phe)을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "항원"이란, 바이러스의 구성성분 중 면역기능을 일으킬 수 있는 성분으로, 바람직하게는 바이러스가 발현하는 단백질을 의미한다. 구체적으로, 상기 융합단백질 삼량체가 개체에 투여되었을 때, 상기 융합단백질 삼량체는 면역 반응을 유도하는 항원으로 작용할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 HA2SH 및 M2e는 직접적으로 결합되거나, 링커를 통해 결합될 수 있으며, 상기 융합단백질은 서로 직접적으로 결합되거나, 링커를 통해 결합될 수 있다.

상기 링커는 HA2SH 및 M2e를 연결하거나, 융합단백질 단량체 사이를 인위적으로 연결하는 작용을 하는 일정 길이의 아미노산 서열을 의미한다. 구체적으로 상기 링커는 펩티드 결합에 의해 연결된 1 내지 8개 아미노산으로 이루어진 펩티드 링커를 사용할 수 있으며, 상기 아미노산은 글리신, 세린, 알라닌, 프롤린, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르트산 및 글루탐산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 링커는 글리신 및 세린, 라이신 및 류신 또는 류신 및 글루탐산으로 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명의 일 측면은 융합단백질 삼량체를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

상기 뉴클레오티드는 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47 및 서열번호 48로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 뉴클레오티드는 시그널 펩타이드 또는 His-tag를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 측면은 상기 융합단백질 삼량체를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 예방용 백신 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "백신"이란, 일반적인 인플루엔자 바이러스에 대한 예방 또는 치료를 목적으로 개체에서 항원-항체 반응을 유도하는 것을 의미한다.

상기 백신 조성물은 다양한 인플루엔자 바이러스 아형에 대하여 항체의 형성을 유도할 수 있다. 이와 같이 형성된 항체는 인플루엔자 바이러스의 다양한 아형, 바람직하게는 H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H5N1, H5N8 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아형에 결합할 수 있다. 더욱 바람직하게 상기와 같이 형성된 항체는 H1N1, H3N2, H5N1 또는 H5N8의 인플루엔자 바이러스 아형에 결합할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "인플루엔자 바이러스 아형"은 헤마글루티닌(H) 및 뉴라미다제(N) 바이러스 표면 단백질이 조합된 인플루엔자 A 바이러스 변이체를 의미한다. 상기 인플루엔자 바이러스 아형은 H 번호 및 N 번호의 조합(예를 들어, H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H5N1, H5N8 등)을 갖는 인플루엔자 바이러스 아형을 가질 수 있다.

상기 백신 조성물은 추가적으로 용매, 면역증강제(adjuvant) 및 부형제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 상기 용매로는 생리식염수 또는 증류수를 사용할 수 있으며, 상기 면역증강제로는 프로인트(Freund's) 불완전체 또는 완전체 어쥬번트, 알루미늄 하이드록사이드 겔, 및 식물성 및 광물성 오일 등을 사용할 수 있고, 상기 부형제로는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포타슘 설페이트를 사용할 수 있다. 또한, 백신 제조에 사용되는 공지의 물질을 더 포함할 수 있다.

상기 백신 조성물은 경구형 또는 비경구형 제제로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 비경구형 제제인 주사 액제로 제조하며, 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내, 비강 또는 경막외(eidural) 경로로 투여할 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 상기 융합단백질 삼량체를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 인플루엔자 바이러스 감염 질환은 부비강염, 발작성 천식, 중이염, 낭성 섬유종, 기관지염, 폐렴 및 설사로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

상기 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 융합단백질 삼량체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역유도 방법을 제공할 수 있다. 상기 융합단백질 삼량체가 개체에 투여되는 경우 개체 내에서 항체를 형성하여 면역 반응을 유도하므로, 인플루엔자 감염 질환을 예방하거나 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 인플루엔자 헤마글루티닌 HA2 및 M2e의 서열 동정

범용성 항원으로 사용될 수 있는 인플루엔자 헤마글루티닌(이하 'HA'로 표기)의 서열을 동정하기 위하여, 구조를 기반에 둔 단백질 서열분석 비교 프로그램(Clustal W & ESPript 3.0)을 이용하였다. 상기 프로그램을 이용하여 다양한 아형을 갖는 HA 단백질의 아미노산 서열 중 6종의 서열을 비교 분석하고, HA 전체 서열 중에서 아형 간의 보존된 서열을 가진 HA2의 짧은 헬리컬 도메인(HA2SH)을 결정하였다. 이와 같은 구조 기반 인플루엔자 HA의 전체 헤드 도메인 및 스템 도메인의 서열 분석 결과 및 HA2의 서열 분석 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.

동일한 방법으로 M2 단백질(matrix-2 protein)의 아미노산 서열 중 6종의 서열을 비교 분석하고, M2 단백질에서 아형 간의 보존적인 서열을 가진 M2 단백질의 엑토도메인(이하 'M2e'로 표기)을 결정하였다. 이와 같은 구조 기반 인플루엔자 M2 단백질의 서열 분석 결과를 도 3에 나타내었다. 상기와 같은 서열 분석을 통해 HA에 공통적으로 보존된 아미노산 서열을 갖는 HA2 짧은 헬리컬 도메인과 M2 단백질에 공통적으로 보존된 아미노산 서열을 갖는 M2e 도메인을 확인하였으며, 이를 하기 실시예 2에서와 같이 항원으로 제조하였다.

실시예 2. 인플루엔자 헤마글루티닌 HA2 짧은 헬리컬 도메인 및 M2e 융합단백질 삼량체(3XHA2SH-M2e)의 제조

실시예 2.1. HA 단백질 및 M2 단백질의 합성

실험에 사용된 인플루엔자 A 바이러스(A/California/04/2009(H1N1))의 HA 단백질(567개 아미노산), 인플루엔자 A 바이러스(A/canine/Korea/01/2007(H3N2))의 HA 단백질(588개 아미노산) 및 인플루엔자 A 바이러스(A/chiken/korea/es/2003(H5N1))의 HA 단백질(568개 아미노산) 유전자들을 ㈜바이오니아에서 합성하였다. 이들의 염기 서열은 각각 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3과 같다.

또한, 실험에 사용된 인플루엔자 A 바이러스(A/California/04/2009(H1N1))의 M2 단백질(97개 아미노산), 인플루엔자 A 바이러스(A/canine/Korea/01/2007(H3N2))의 M2 단백질(97개 아미노산) 및 인플루엔자 A 바이러스(A/chiken/korea/es/2003(H5N1))의 M2 단백질(97개 아미노산) 유전자들을 ㈜바이오니아에서 합성하였다. 이들의 염기 서열은 각각 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6과 같다.

실시예 2.2. 3XHA2SH-M2e의 제조

3XHA2SH-M2e(도 4)를 제조하기 위하여, 절편 1은 HA2 짧은 헬리컬 도메인의 아미노산 잔기 373-404 및 M2e 도메인의 15개의 아미노산 잔기, 절편 2는 HA2 짧은 헬리컬 도메인의 아미노산 잔기 373-404 및 M2e 도메인의 15개의 아미노산 잔기, 및 절편 3은 HA2 짧은 헬리컬 도메인의 아미노산 잔기 373-404 및 M2e 도메인의 15개의 아미노산 잔기를 각각 NdeI과 BamHI, BamHI과 HindIII, 및 HindIII과 XhoI을 사용하여 pET28a에 단백질의 양 말단(N-말단 및 C-말단)에 6개의 히스티딘이 붙도록 서브클론하고, 대장균(Escherichia coli) BL21(DE3) RIL 균주(strain)를 사용하여 과발현시켰다. 사용된 대장균 발현 벡터 pET28a-3XHA2HS-M2e를 도 5에 나타내었다. 또한, 사용된 HA2 짧은 헬리컬 도메인의 아미노산 잔기 373-404은 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되며, 사용된 M2e의 아미노산 잔기는 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시된다.

각각의 단백질을 대장균에 접종하고 OD600 nm에서 0.5 내지 0.6 사이에 0.2 mM IPTG를 넣고 18시간 동안 290K에서 배양하였다. His-태그된 3XHA2SH-M2e를 니켈-친화성 크로마토그래피로 정제하였고, 25 mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.2 M NaCl, 5%(v/v) 글리세롤을 포함하는 완충용액에서 투석하여, 정제된 3XHA2SH-M2e를 수득하였다. 3XHA2SH-M2e(3XH1SH-M2e, 3XH3SH-M2e, 3XH5SH-M2e 및 H135SH-M2e)를 SDS-PAGE 상에서 확인하였으며, 니켈-친화성 크로마토그래피에 의하여 순도 96%이상으로 정제된 것을 확인하였다(도 6 및 도 7). 또한, 3XHA2SH-M2e의 발현 테스트 결과를 도 8에 나타내었다.

실시예 3. 3XHA2SH-M2e의 항체 생성 효과 확인

상기 실시예 2에서 제조한 3XHA2SH-M2e(3XH1SH-M2e, 3XH3SH-M2e, 3XH5SH-M2e 및 H135SH-M2e)가 효과적으로 항체를 유도하는지 확인하기 위하여, 이들의 항체 생성 효과를 확인하였다.

항원을 마우스에 주사하기 전에 전-면역 혈청(pre-immune serum)을 채취하여 음성 대조군으로 사용하였다. 일차적 면역화(Primary immunize)를 위하여, 각각 정제된 3XHA2SH-M2e 항원 50 ug을 에멀젼 어쥬번트(ISA 71 VG)(montinide)와 혼합하여 근육 주사(IM)하고, 2주 후 1차 혈액을 채취하여 ELISA 분석을 수행하였다. 이어서, 단백질 항원 50 ug을 에멀젼 어쥬번트(ISA 71 VG)(montinide)와 혼합하여 부스팅 면역화(boosting immunize)를 진행하였고, 2주 후 최종 혈청을 분리하여 최종 ELISA 분석을 수행하였다.

ELISA 분석에서 항원은 웰 당 100 ng을 사용하였다. 또한, 면역 혈청은 1x PBS로 1 : 100 내지 1 : 100,000 비율로 희석하여 사용하였고, 2차 확인을 위해서는 항-마우스 IgG-HRP(ABC5001)를 1 : 5,000 희석하여 사용하였다. 광학 밀도 405 nm에서 발색을 검출하여 최종적으로 면역 항체의 생성 여부를 확인하였다. 그 결과, 마우스 내에서 3XHA2SH-M2e가 우수한 항체 생성 효과를 갖는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과를 통해 3XHA2SH-M2e가 항체를 효과적으로 유도할 수 있다는 것을 확인하였다(도 9).

실시예 4. 범용성 백신으로서 3XHA2SH-M2e의 이용성 확인

상기 실시예 3에서 3XHA2SH-M2e가 우수한 항체 유도 효과를 나타냄을 확인하였으며, 이를 통해 다양한 인플루엔자 바이러스에 대한 방어 유도가 가능한 범용성 백신으로 활용할 수 있는지 여부를 확인하였다.

일차적 면역화를 위하여, 각각 정제된 3XHA2SH-M2e 항원 50 ug을 에멀젼 어쥬번트(ISA 71 VG)(montinide)와 혼합하여 마우스에 근육 주사하고, 2주 후 항원 50ug을 에멀젼 어쥬번트(ISA 71 VG)(montinide)와 혼합하여 부스팅 면역화를 진행하였다. 2주 후 인플루엔자 A 바이러스 H1N1, H3N2, H5N1 및 H5N8을 각각 1x PBS에 희석하여 비강 접종(IN)을 통해 30 ul씩 마우스 감염을 진행하였다. 이후, 2주에 걸쳐 마우스의 체중 변화와 생존율을 측정하여 3XHA2SH-M2e 항원의 방어 면역 유도 효과를 확인하였다(도 10 및 도 11).

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> INFLUENZA VIRUS VACCINE COMPOSITION <130> FPD/201808-0053 <160> 48 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1701 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hemagglutinin gene of A/California/04/2009(H1N1) <400> 1 atgaaggcaa tactagtagt tctgctatat acatttgcaa ccgcaaatgc agacacatta 60 tgtataggtt atcatgcgaa caattcaaca gacactgtag acacagtact agaaaagaat 120 gtaacagtaa cacactctgt taaccttcta gaagacaagc ataacgggaa actatgcaaa 180 ctaagagggg tagccccatt gcatttgggt aaatgtaaca ttgctggctg gatcctggga 240 aatccagagt gtgaatcact ctccacagca agctcatggt cctacattgt ggaaacacct 300 agttcagaca atggaacgtg ttacccagga gatttcatcg attatgagga gctaagagag 360 caattgagct cagtgtcatc atttgaaagg tttgagatat tccccaagac aagttcatgg 420 cccaatcatg actcgaacaa aggtgtaacg gcagcatgtc ctcatgctgg agcaaaaagc 480 ttctacaaaa atttaatatg gctagttaaa aaaggaaatt catacccaaa gctcagcaaa 540 tcctacatta atgataaagg gaaagaagtc ctcgtgctat ggggcattca ccatccatct 600 actagtgctg 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aggtcgaaac gcctaccaga 120 agcgaatggg agagcagaag cggatccgag caggggtcag gatatgcagc cgacctgaag 180 agcacacaga atgccattga cgagattact aacaaagtaa attctgttat tgaaaagatg 240 aataccgagg tcgaaacgcc taccagaagc gaatgggaga gcagaagcaa gcttgagcag 300 gggtcaggat atgcagccga cctgaagagc acacagaatg ccattgacga gattactaac 360 aaagtaaatt ctgttattga aaagatgaat accgaggtcg aaacgcctac cagaagcgaa 420 tgggagagca gaagc 435 <210> 38 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3XH3SH-M2e <400> 38 tccgaaggta caggacaagc agcagacctt aaaagcactc aggcagccat tgaccagatt 60 aatgggaaat tgaacagagt gattgaaaaa acgaataccg aggtcgaaac gcctaccaga 120 aacggatggg agagcagaag cggatcctcc gaaggtacag gacaagcagc agaccttaaa 180 agcactcagg cagccattga ccagattaat gggaaattga acagagtgat tgaaaaaacg 240 aataccgagg tcgaaacgcc taccagaaac ggatgggaga gcagaagcaa gctttccgaa 300 ggtacaggac aagcagcaga ccttaaaagc actcaggcag ccattgacca gattaatggg 360 aaattgaaca gagtgattga aaaaacgaat accgaggtcg aaacgcctac cagaaacgga 420 tgggagagca gaagc 435 <210> 39 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3XH5SH-M2e <400> 39 gagcagggga gtgggtacgc tgcagacaaa gaatccactc aaaaggcaat agatggagtc 60 accaataagg tcaactcgat cattgacaaa atgaacaccg aggtcgaaac gcctaccaga 120 aacgaatggg agagcagaag cggatccgag caggggagtg ggtacgctgc agacaaagaa 180 tccactcaaa aggcaataga tggagtcacc aataaggtca actcgatcat tgacaaaatg 240 aacaccgagg tcgaaacgcc taccagaaac gaatgggaga gcagaagcaa gcttgagcag 300 gggagtgggt acgctgcaga caaagaatcc actcaaaagg caatagatgg agtcaccaat 360 aaggtcaact cgatcattga caaaatgaac accgaggtcg aaacgcctac cagaaacgaa 420 tgggagagca gaagc 435 <210> 40 <211> 507 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H135SH-M2e <400> 40 atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60 atggagcagg ggtcaggata tgcagccgac ctgaagagca cacagaatgc cattgacgag 120 attactaaca aagtaaattc tgttattgaa aagatgaata ccgaggtcga aacgcctacc 180 agaagcgaat gggagagcag aagcggatcc tccgaaggta caggacaagc agcagacctt 240 aaaagcactc aggcagccat tgaccagatt aatgggaaat tgaacagagt gattgaaaaa 300 acgaataccg aggtcgaaac gcctaccaga aacggatggg agagcagaag caagcttgag 360 caggggagtg ggtacgctgc agacaaagaa tccactcaaa aggcaataga tggagtcacc 420 aataaggtca actcgatcat tgacaaaatg aacaccgagg tcgaaacgcc taccagaaac 480 gaatgggaga gcagaagcct cgagtga 507 <210> 41 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3XH1SH-M2e <400> 41 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Leu Lys 20 25 30 Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asp Glu Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val 35 40 45 Ile Glu Lys Met Asn Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Ser Glu Trp 50 55 60 Glu Ser Arg Ser Gly Ser Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Leu 65 70 75 80 Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asp Glu Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser 85 90 95 Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Ser Glu 100 105 110 Trp Glu Ser Arg Ser Lys Leu Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp 115 120 125 Leu Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asp Glu Ile Thr Asn Lys Val Asn 130 135 140 Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Ser 145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Arg Ser Leu Glu 165 <210> 42 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3XH3SH-M2e <400> 42 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys 20 25 30 Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Val 35 40 45 Ile Glu Lys Thr Asn Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Gly Trp 50 55 60 Glu Ser Arg Ser Gly Ser Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Ala Asp Leu 65 70 75 80 Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg 85 90 95 Val Ile Glu Lys Thr Asn Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Gly 100 105 110 Trp Glu Ser Arg Ser Lys Leu Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Ala Asp 115 120 125 Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn 130 135 140 Arg Val Ile Glu Lys Thr Asn Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn 145 150 155 160 Gly Trp Glu Ser Arg Ser Leu Glu 165 <210> 43 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3XH5SH-M2e <400> 43 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu 20 25 30 Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile 35 40 45 Ile Asp Lys Met Asn Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp 50 55 60 Glu Ser Arg Ser Gly Ser Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys 65 70 75 80 Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser 85 90 95 Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu 100 105 110 Trp Glu Ser Arg Ser Lys Leu Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp 115 120 125 Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn 130 135 140 Ser Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn 145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Arg Ser Leu Glu 165 <210> 44 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H135SH-M2e <400> 44 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Leu Lys 20 25 30 Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asp Glu Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val 35 40 45 Ile Glu Lys Met Asn Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Ser Glu Trp 50 55 60 Glu Ser Arg Ser Gly Ser Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Ala Asp Leu 65 70 75 80 Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg 85 90 95 Val Ile Glu Lys Thr Asn Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Gly 100 105 110 Trp Glu Ser Arg Ser Lys Leu Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp 115 120 125 Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn 130 135 140 Ser Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn 145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Arg Ser Leu Glu 165 <210> 45 <211> 507 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3XH1SH-M2e gene <400> 45 atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60 atggagcagg ggtcaggata tgcagccgac ctgaagagca cacagaatgc cattgacgag 120 attactaaca aagtaaattc tgttattgaa aagatgaata ccgaggtcga aacgcctacc 180 agaagcgaat gggagagcag aagcggatcc gagcaggggt caggatatgc agccgacctg 240 aagagcacac agaatgccat tgacgagatt actaacaaag taaattctgt tattgaaaag 300 atgaataccg aggtcgaaac gcctaccaga agcgaatggg agagcagaag caagcttgag 360 caggggtcag gatatgcagc cgacctgaag agcacacaga atgccattga cgagattact 420 aacaaagtaa attctgttat tgaaaagatg aataccgagg tcgaaacgcc taccagaagc 480 gaatgggaga gcagaagcct cgagtga 507 <210> 46 <211> 507 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3XH3SH-M2e gene <400> 46 atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60 atgtccgaag gtacaggaca agcagcagac cttaaaagca ctcaggcagc cattgaccag 120 attaatggga aattgaacag agtgattgaa aaaacgaata ccgaggtcga aacgcctacc 180 agaaacggat gggagagcag aagcggatcc tccgaaggta caggacaagc agcagacctt 240 aaaagcactc aggcagccat tgaccagatt aatgggaaat tgaacagagt gattgaaaaa 300 acgaataccg aggtcgaaac gcctaccaga aacggatggg agagcagaag caagctttcc 360 gaaggtacag gacaagcagc agaccttaaa agcactcagg cagccattga ccagattaat 420 gggaaattga acagagtgat tgaaaaaacg aataccgagg tcgaaacgcc taccagaaac 480 ggatgggaga gcagaagcct cgagtga 507 <210> 47 <211> 507 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3XH5SH-M2e gene <400> 47 atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60 atggagcagg ggagtgggta cgctgcagac aaagaatcca ctcaaaaggc aatagatgga 120 gtcaccaata aggtcaactc gatcattgac aaaatgaaca ccgaggtcga aacgcctacc 180 agaaacgaat gggagagcag aagcggatcc gagcagggga gtgggtacgc tgcagacaaa 240 gaatccactc aaaaggcaat agatggagtc accaataagg tcaactcgat cattgacaaa 300 atgaacaccg aggtcgaaac gcctaccaga aacgaatggg agagcagaag caagcttgag 360 caggggagtg ggtacgctgc agacaaagaa tccactcaaa aggcaataga tggagtcacc 420 aataaggtca actcgatcat tgacaaaatg aacaccgagg tcgaaacgcc taccagaaac 480 gaatgggaga gcagaagcct cgagtga 507 <210> 48 <211> 507 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H135SH-M2e gene <400> 48 atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60 atggagcagg ggtcaggata tgcagccgac ctgaagagca cacagaatgc cattgacgag 120 attactaaca aagtaaattc tgttattgaa aagatgaata ccgaggtcga aacgcctacc 180 agaagcgaat gggagagcag aagcggatcc tccgaaggta caggacaagc agcagacctt 240 aaaagcactc aggcagccat tgaccagatt aatgggaaat tgaacagagt gattgaaaaa 300 acgaataccg aggtcgaaac gcctaccaga aacggatggg agagcagaag caagcttgag 360 caggggagtg ggtacgctgc agacaaagaa tccactcaaa aggcaataga tggagtcacc 420 aataaggtca actcgatcat tgacaaaatg aacaccgagg tcgaaacgcc taccagaaac 480 gaatgggaga gcagaagcct cgagtga 507

Claims (13)

1. 삭제
2. 하기 구조식을 갖는, 융합단백질 삼량체:
   A₁-(L₁)_n-A₂-(L₂)_m-A₃
   여기서, 상기 A₁은 HA2SH₁-(l₁)_k-M2e₁로 표시되고, 상기 A₂는 HA2SH₂-(l₂)_i-M2e₂로 표시되며, 상기 A₃은 HA2SH₃-(l₃)_j-M2e₃으로 표시되고,
   상기 HA2SH₁, HA2SH₂ 및 HA2SH₃은 각각 독립적으로 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌의 짧은 헬리컬 도메인이며,
   상기 M2e₁, M2e₂ 및 M2e₃은 각각 독립적으로 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 인플루엔자 바이러스의 M2 단백질의 엑토도메인이며,
   상기 L₁, L₂, l₁, l₂ 및 l₃은 각각 독립적으로 펩티드 결합에 의해 연결된 1 내지 8개 아미노산으로 이루어진 펩티드 링커이며,
   상기 n, m, k, i, j는 각각 독립적으로 0 또는 1의 정수이다.
3. 삭제
4. 삭제
5. 제2항에 있어서,
   상기 A₁, A₂ 및 A₃은 각각 독립적으로 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는, 융합단백질 삼량체.
6. 제2항에 있어서,
   상기 융합단백질 삼량체는 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43 및 서열번호 44로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는, 융합단백질 삼량체.
7. 제2항에 있어서,
   상기 펩티드 링커는 글리신, 세린, 알라닌, 프롤린, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르트산 및 글루탐산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 포함하는, 융합단백질 삼량체.
8. 제2항에 따른 융합단백질 삼량체를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
9. 제8항에 있어서,
   상기 뉴클레오티드는 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47 및 서열번호 48로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 발현 벡터.
10. 제2항에 따른 융합단백질 삼량체를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 예방용 백신 조성물.
11. 제10항에 있어서,
    상기 인플루엔자 바이러스는 H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H5N1 및 H5N8로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아형인, 백신 조성물.
12. 제2항에 따른 융합단백질 삼량체를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 치료용 약학 조성물.
13. 제12항에 있어서,
    상기 인플루엔자 바이러스 감염 질환은 부비강염, 발작성 천식, 중이염, 낭성 섬유종, 기관지염, 폐렴 및 설사로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.

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