CN104940924B - 一种球虫佐剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种球虫佐剂，所述球虫佐剂包括顶复门真球虫目原虫和/或其提取物。相比于传统的油乳佐剂，本发明的球虫佐剂可以使疫苗产生的免疫效果提高两个抗体滴度，而且能够诱导对预防病毒及其它胞内病原体感染更为有效的Th1型和CTL型细胞免疫应答。
Description
技术领域
本发明涉及免疫技术领域，具体的涉及一种球虫佐剂及其应用。
背景技术
佐剂不仅是弱毒疫苗的重要组成成分，对增强灭活疫苗与新型基因工程疫苗的免疫效果亦发挥着不可替代的作用。
随着人们对免疫反应尤其是先天性免疫的认识的加深，佐剂研究已从凭经验反复试验转向更为理性。如弗氏完全佐剂(CFA)含有灭活的分枝杆菌(卡介苗)成份，是典型的促进机体产生体液免疫和细胞免疫应答的佐剂，可诱导产生Th1型细胞因子，促进IgG的产生，抑制IgM的产生，从而抑制免疫耐受的产生，推迟超敏反应，增加移植排斥，促进抗肿瘤作用。MPL(单磷酸脂质A)是沙门氏菌(Salmonella Minnesote)LPS的衍生物，可激活TLR4受体，诱导Th1型细胞免疫应答，并且可以活化CTLs细胞。由MPL和铝构成的AS04佐剂已经被批准用于人HPV和HBV疫苗中。相比于铝佐剂，AS04能够诱导产生更早和更长久的体液免疫应答。目前还有很多Toll样受体激动剂被开发成佐剂，包括poly(I:C)、GLA、鞭毛蛋白、鸟苷类似物、CpG DNA等。
球虫含有6000余种蛋白质、多种脂类和糖类等大分子物质，其抗原组分是弗氏佐剂中卡介苗组分的几十倍，相比于细菌，球虫具有激发机体更多模式识别受体(PRRs)的潜能。有研究表明球虫可以通过调节先天性免疫和适应性免疫应答，增强机体对其他病原微生物的免疫应答。而且球虫的宿主具有专一性，不会跨种间传播，因而其生物安全性较高。
因此有必要开发一种基于球虫复杂的抗原组分的佐剂，从而为提升疫苗的免疫效果提供新的途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以诱导机体产生更有效的保护性体液免疫和细胞免疫应答的免疫佐剂。
为达到以上目的，本发明提供了一种球虫佐剂，所述球虫佐剂包括顶复门真球虫目原虫和/或其提取物。
可选的，所述顶复门真球虫目原虫选自艾美耳球虫、弓形虫、隐孢子虫和疟原虫中的至少一种。
可选的，所述提取物为顶复门球虫卵囊提取物。
可选的，所述提取物选自顶复门球虫的DNA、RNA、脂类、糖类及蛋白质中的至少一种。
本发明还提供了所述球虫佐剂在制备针对病原体的疫苗中的应用。
可选的，所述疫苗为禽用疫苗、至少两种禽用疫苗的联苗、牛用疫苗、至少两种牛用疫苗的联苗、猪用疫苗、至少两种猪用疫苗的联苗、羊用疫苗、至少两种羊用疫苗的联苗、人用疫苗或至少两种人用疫苗的联苗。
可选的，所述禽用疫苗包括禽流感酶活疫苗、鸡新城疫灭活疫苗、鸡减蛋综合症灭活疫苗和鸡传染性法氏囊活疫苗；
所述猪用疫苗包括猪蓝耳病弱毒活疫苗、猪口蹄疫灭活疫苗、猪伪狂犬灭活疫苗、猪喘气病弱毒菌苗、猪链球菌双价灭活菌苗、副猪嗜血杆菌灭活疫苗、牛传染性鼻气管炎灭活疫苗、支原体灭活疫苗；
所述牛用疫苗包括牛口蹄疫O型灭活疫苗、牛传染性胸膜肺炎弱毒苗、牛巴氏杆菌病油乳剂疫苗、牛传染性鼻气管炎弱毒疫苗、牛沙门氏菌灭活苗；
所述羊用疫苗包括羔羊大肠杆菌疫苗、羔羊大肠杆菌疫苗、氢氧化铝菌羔羊痢疾苗、羊痘鸡胚化弱毒疫苗、Ⅱ号炭疽菌苗、口疮弱毒细胞冻干苗；
所述人用疫苗包括乙肝疫苗、卡介苗、麻疹疫苗、脊髓灰质炎疫苗。
本发明还提供了所述球虫佐剂在制备抗肿瘤疫苗中的应用。
本发明还提供了所述球虫佐剂在制备免疫调节复合物中的应用。
相比于传统的油乳佐剂，本发明的球虫佐剂具有严格的宿主特异性(对非宿主动物的安全性)及激发宿主免疫应答的有效性，可以使疫苗产生的免疫效果提高两个抗体滴度，而且能够诱导对预防病毒及其它胞内病原体感染更为有效的Th1型和CTL型细胞免疫应答。
附图说明
图1为本发明球虫佐剂用于鸡重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗(Re-4株+Re-6株)后对禽流感病毒H5亚型Re-4株及Re-6株血凝抑制抗体效价的测试结果。
图2为本发明球虫佐剂用于鸡新支流三联灭活疫苗后,血清中ND、H9血凝抑制抗体效价的测试结果。
图3为本发明球虫佐剂添加于鸡新支流三联灭活疫苗(La Sota株+M41株+H9WD株)后，同时滴鼻免疫鸡传染性法氏囊病活疫苗(Gumboro D78)检测其对传染性法氏囊病活疫苗的免疫增强效果。
图4为本发明球虫佐剂用于鸡新支减流四联灭活疫苗免疫蛋鸡后产生的针对ND、IB、EDS及H9抗体效价的测试结果。
图5为本发明球虫卵囊提取物佐剂用于H7N9病毒灭活疫苗免疫小鼠后血清中的抗体效价测试结果。
图6为本发明球虫卵囊提取物佐剂用于H7N9病毒灭活疫苗免疫小鼠后对H7N9的保护效果。
图7为本发明球虫卵囊提取物佐剂用于H7N9病毒灭活疫苗免疫小鼠后激发机体产生的细胞免疫应答水平。
图8为本发明球虫卵囊提取物佐剂用于H7N9病毒灭活疫苗免疫小鼠后检测其对疫苗使用剂量的影响。
具体实施方式
下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
本发明提供了一种球虫佐剂，所述球虫佐剂包括顶复门真球虫目原虫和/或其提取物。
其中，所述顶复门真球虫目原虫(apicomplexan parasites)是一类专一性的细胞内寄生虫，包括隐孢子虫、艾美耳球虫、等孢球虫、弓形虫、疟原虫等。这类原虫具有相似的亚细胞结构和保守的入侵机制。
在本发明的一种具体实施方式中，所述顶复门真球虫目原虫选自艾美耳球虫(Eimeriaspp.)、弓形虫(Toxoplasma gondii)、隐孢子虫(Cryptosporidiumspp.)和疟原虫(Plasmodiumspp.)中的至少一种。
其中，艾美耳属球虫包括柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)、巨型艾美耳属球虫(Eimeria maxima)、和缓艾美耳球虫(Eimeriamitis)、堆型艾美耳球虫(Eimeriaacervulina)、斯氏艾美耳球虫(Eimeriastiedae)、肠艾美耳球虫(Eimeriaintestimalis)及无残艾美耳球虫(Eimeriairresidua)。优选的，当所述艾美耳球虫为柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫或巨型艾美耳球虫时，获得的免疫佐剂激发免疫应答的效果更好。
其中，弓形虫包括刚地弓形虫(T.gondii)。
其中，隐孢子虫包括微小隐孢子虫(C.parvum)。
其中，疟原虫包括恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)和卵形疟原虫(Plasmodiumovale)，优选的，所述疟原虫为恶性疟原虫。
在一个优选的实施方式中，所述佐剂包括柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)以及刚第弓形虫(T.gondii)成分。
在另一个优选的实施方式中，所述顶复门真球虫原虫选自由刚第弓形虫(T.gondii)、柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)、巨型艾美耳属球虫(E.maxima)、和缓艾美耳球虫(E.mitis)、堆型艾美耳球虫(E.acervulina)和斯氏艾美耳球虫(E.stiedae)所组成的组中的一种或几种。
在本发明中，所述提取物可以为顶复门球虫卵囊提取物。
在本发明的一种实施方式中，所述提取物选自顶复门球虫的DNA、RNA、脂类、糖类及蛋白质中的至少一种。
优选的，所述提取物来自柔嫩艾美耳球虫卵囊时，免疫增强效果最好。
本发明还提供了所述球虫佐剂的制备方法，在本发明的一种实施方式中，可以按照以下方式获得球虫佐剂：取孢子化完毕的球虫卵囊，3600rpm离心5分钟富集卵囊沉淀。向沉淀中加入少量饱和盐水，搅拌均匀后继续加饱和盐水至沉淀体积的三倍。3600rpm离心5分钟，上清倒至烧杯中。将上清分装至离心管中，各加3-5倍体积的清水，3600rpm离心5分钟收集卵囊沉淀。冰上向沉淀中加入3倍体积的次氯酸钠溶液(有效氯含量≥10％)，冰浴5分钟。3600rpm离心5分钟，将上清倒至离心管中。向上清中加入5倍体积的清水，3600rpm离心5分钟，弃上清。卵囊沉淀再用清水洗两遍以除去残留的次氯酸钠。卵囊沉淀用2.5％重铬酸钾重悬，计数后保存于4℃。纯化后的球虫卵囊作为佐剂添加于疫苗中：按每羽/头份添加1×104、1×105、1×106或1×107个球虫卵囊作为佐剂计算出所需卵囊的数量，离心收集卵囊沉淀，用去离子水或PBS洗去残留的重铬酸钾。以少量去离子水重悬卵囊沉淀获得作为佐剂的球虫卵囊。
本发明对于顶复门真球虫目原虫的DNA、RNA、脂类、糖类及蛋白质的提取方法没有特别的限制，可以按照本领域常规的方法进行。
本发明还提供了所述球虫佐剂在制备针对病原体疫苗中的应用。
可选的，所述疫苗为禽用疫苗、至少两种禽用疫苗的联苗、牛用疫苗、至少两种牛用疫苗的联苗、猪用疫苗、至少两种猪用疫苗的联苗、羊用疫苗、至少两种羊用疫苗的联苗、人用疫苗或至少两种人用疫苗的联苗。
可选的，所述禽用疫苗包括禽流感酶活疫苗、鸡新城疫灭活疫苗、鸡减蛋综合症灭活疫苗和鸡传染性法氏囊活疫苗。
在本发明的一种优选的实时方式中，所述疫苗为鸡重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗(Re-4株+Re-6株)、鸡新支流三联灭活疫苗、鸡传染性法氏囊病活疫苗或鸡新支减流四联灭活疫苗。
可选的，所述猪用疫苗包括猪蓝耳病弱毒活疫苗、猪口蹄疫灭活疫苗、猪伪狂犬灭活疫苗、猪喘气病弱毒菌苗、猪链球菌双价灭活菌苗、副猪嗜血杆菌灭活疫苗、牛传染性鼻气管炎灭活疫苗、支原体灭活疫苗。
可选的，所述牛用疫苗包括牛口蹄疫O型灭活疫苗、牛传染性胸膜肺炎弱毒苗、牛巴氏杆菌病油乳剂疫苗、牛传染性鼻气管炎弱毒疫苗、牛沙门氏菌灭活苗。
可选的，所述羊用疫苗包括羔羊大肠杆菌疫苗、羔羊大肠杆菌疫苗、氢氧化铝菌羔羊痢疾苗、羊痘鸡胚化弱毒疫苗、Ⅱ号炭疽菌苗、口疮弱毒细胞冻干苗。
可选的，所述人用疫苗包括乙肝疫苗、卡介苗、麻疹疫苗、脊髓灰质炎疫苗。
本发明还提供了所述球虫佐剂在制备抗肿瘤疫苗中的应用。本发明还提供了所述球虫佐剂在制备免疫调节复合物中的应用。
下面通过实施例对本发明进行进一步说明。以下实施例中所使用的原料、试剂和仪器均可以通过购买市售产品的方式获得。
实施例1
取孢子化完毕的柔嫩艾美耳球虫卵囊(保存于重铬酸钾中)，3600rpm离心5分钟富集卵囊沉淀。向沉淀中加入少量饱和盐水，搅拌均匀后继续加饱和盐水至沉淀体积的三倍。3600rpm离心5分钟，上清倒至烧杯中。将上清分装至离心管中，各加3-5倍体积的清水，3600rpm离心5分钟收集卵囊沉淀。冰上向沉淀中加入3倍体积的次氯酸钠溶液(有效氯含量≥10％)，冰浴5分钟。3600rpm离心5分钟，将上清倒至离心管中。向上清中加入5倍体积的清水，3600rpm离心5分钟，弃上清。卵囊沉淀再用清水洗两遍以除去残留的次氯酸钠。卵囊沉淀用2.5％重铬酸钾重悬，计数后按每羽/头份添加1×104、1×105、1×106或1×107个球虫卵囊作为佐剂计算出所需卵囊的数量，离心收集卵囊沉淀，用去离子水或PBS洗去残留的重铬酸钾。以少量去离子水重悬卵囊沉淀，获得球虫佐剂A1、A2和A3。按每羽/头份添加1×104、1×105、1×106或1×107个刚地弓形虫速殖子制备佐剂B1、B2和B3，具体为富集弓形虫速殖子沉淀后再以PBS或去离子水洗涤沉淀2次，以少量去离子水重悬后即可用作疫苗中的佐剂。
将球虫佐剂用于鸡重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗(Re-4株+Re-6株)(购自肇庆大华农生物药品有限公司)，检测其对禽流感灭活疫苗H5亚型的免疫增强效果。
球虫佐剂与灭活疫苗混匀后，Votex上再点混20s，混好后放在冰上，尽快使用。取10日龄无球虫AA肉鸡80只，随机分为8组，每组10只，分组情况见表1，全部颈部皮下注射，每只0.3ml免疫前及免疫后7天、14天、21天、28天采血测定血清中禽流感病毒H5亚型Re-4株和Re-6株血凝抑制抗体效价，结果见图1，其中，佐剂A1、A2、A3为不同剂量(A1为106个、A2为105个、A3为104个104-107)，佐剂B1、B2、B3为不同剂量(B1为106个、B2为105个、B3为104个104-107)。免疫28天后，球虫佐剂A可以使血清中禽流感病毒H5亚型Re-4株的抗体效价平均提高1.5个滴度，Re-6株的抗体效价平均提高2.3个滴度；球虫佐剂B可以使血清中Re-6株的抗体效价平均提高1.6个滴度。
表1球虫佐剂用于禽流感灭活疫苗的免疫效果试验
| 组 | 数量 | 剂量(ml/只) |
| PBS | 10 | 0.3 |
| 疫苗 | 10 | 0.3 |
| 佐剂A1+疫苗 | 10 | 0.3 |
| 佐剂A2+疫苗 | 10 | 0.3 |
| 佐剂A3+疫苗 | 10 | 0.3 |
| 佐剂B1+疫苗 | 10 | 0.3 |
| 佐剂B2+疫苗 | 10 | 0.3 |
| 佐剂B3+疫苗 | 10 | 0.3 |
实施例2
按照与实施例1相同的方法制备球虫佐剂，区别仅在于，分别使柔嫩艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、斯氏艾美耳球虫及刚地弓形虫制备球虫佐剂A、B、C、D、E。
将本实施例制备的球虫佐剂A-E用于鸡新支流三联灭活疫苗(La Sota株+M41株+H9WD株)后，检测其对鸡新支流三联灭活疫苗(购自乾元浩生物股份有限公司郑州生物药厂)的免疫增强效果。
球虫佐剂与灭活疫苗混匀后，Votex上再点混20s，混好后放在冰上，尽快使用。取14日龄蛋鸡90只，随机分为9组，分组情况见表2。
14日龄进行首免，首免5周后进行二免。首免后0、2、4、6、11周翅静脉采血，检测血清中的ND、H9抗体效价，结果见图2，其中，佐剂A、B、C、D、E为同一剂量的不同球虫佐剂。第3组及第4组一免及二免均添加了球虫佐剂A，第4组一免4周后血清中平均ND抗体滴度达比疫苗对照组平均提高3.4个滴度，第三组比对照组提高了2.4个滴度。二免1周后，第4组更是提高了接近4个滴度(第3组提高了3.4个滴度)，且二免5周后这两组均维持较高的抗体水平。
表2球虫佐剂用于新支流三联灭活疫苗的免疫效果试验
| 组(n＝10) | 一免 | 二免 |
| 组1 | 疫苗 | 疫苗 |
| 组2 | 球虫佐剂B+疫苗 | 球虫佐剂A+疫苗 |
| 组3 | 球虫佐剂A+疫苗 | 球虫佐剂A+疫苗 |
| 组4 | 球虫佐剂A+疫苗 | 球虫佐剂A+疫苗 |
| 组5 | 球虫佐剂C+疫苗 | 球虫佐剂A+疫苗 |
| 组6 | 球虫佐剂D+疫苗 | 球虫佐剂A+疫苗 |
| 组7 | 球虫佐剂D+疫苗 | 球虫佐剂D+疫苗 |
| 组8 | 球虫佐剂D+疫苗 | 球虫佐剂E+疫苗 |
| 组9 | 球虫佐剂D+疫苗 | 球虫佐剂A+疫苗 |
实施例3
按照与实施例1相同的方法制备球虫佐剂，区别仅在于，分别使用柔嫩艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、斯氏艾美耳球虫制备球虫佐剂A、B、C、D。
添加于鸡新支流三联灭活疫苗(La Sota株+M41株+H9WD株)后，同时滴鼻免疫鸡传染性法氏囊病活疫苗(Gumboro D78)检测其对传染性法氏囊病活疫苗的免疫增强效果。
球虫佐剂A-D与灭活疫苗混匀后，Votex上再点混20s，混好后放在冰上，尽快使用。取14日龄蛋鸡60只，随机分为6组，分组情况见表3。
免疫后四周翅静脉采血，检测血清中IBD的抗体效价，结果见图3，其中，佐剂A、B、C、D为同一剂量的不同球虫佐剂。结果表明本发明球虫佐剂不需与活疫苗混合，只需同时免疫即可达到免疫增强的效果。
表3球虫佐剂对鸡传染性法氏囊病活疫苗的免疫效果试验
| 组(n＝) | 免疫 |
| 组1(10) | 新支流灭活苗(皮下)Gumboro D78滴鼻 |
| 组2(10) | 球虫佐剂B-1+新支流灭活苗(皮下)Gumboro D78滴鼻 |
| 组3(10) | 球虫佐剂B-2+新支流灭活苗(皮下)Gumboro D78滴鼻 |
| 组4(10) | 球虫佐剂A+新支流灭活苗(皮下)Gumboro D78滴鼻 |
| 组5(10) | 球虫佐剂C-1+新支流灭活苗(皮下)Gumboro D78滴鼻 |
| 组6(10) | 球虫佐剂C-2+新支流灭活苗(皮下)Gumboro D78滴鼻 |
| 组7(20) | 球虫佐剂D+新支流灭活苗(皮下)Gumboro D78滴鼻 |
实施例4
按照与实施例1相同的方法制备球虫佐剂，区别仅在于，分别使柔嫩艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、斯氏艾美耳球虫及刚地弓形虫制备球虫佐剂A、B、C、D、E。
将上述佐剂A-E用于鸡新支减流四联灭活疫苗后，检测其对新支减流四联灭活疫苗(La Sota株+M41株+AV127株+H9S2株)的免疫增强效果。其中A-1、A-2均为佐剂A，B-1、B-2均为佐剂B，A、B、C、D、E为五种不同的球虫佐剂。
球虫佐剂与灭活疫苗混匀后，Votex上再点混20s，混好后放在冰上，尽快使用。取120日龄蛋鸡80只，随机分为8组，分组情况见表4，全部颈部皮下注射，每只0.5ml。
免疫后18天翅静脉采血测定血清中ND、IB、EDS、及禽流感H9亚型抗体效价，结果见图4，结果表明本发明球虫佐剂对四联苗中的EDS有着明显的免疫增强效果，可比疫苗对照组提高接近3个抗体滴度。
表4 球虫佐剂用于新支减流四联灭活疫苗的免疫效果试验
| 组 | 数量 | 剂量ml/只 |
| 疫苗 | 10 | 0.5 |
| A-1+疫苗 | 10 | 0.5 |
| A-2+疫苗 | 10 | 0.5 |
| B-1+疫苗 | 10 | 0.5 |
| B-2+疫苗 | 10 | 0.5 |
| C+疫苗 | 10 | 0.5 |
| D+疫苗 | 20 | 0.5 |
| E+疫苗 | 20 | 0.5 |
实施例5
按照以下方式获得卵囊提取物：
球虫卵囊提取物1的制备：
取1×107个柔嫩艾美耳球虫卵囊离心沉淀，加入1mL饱和盐水55℃水浴30min，期间混匀数次；加入4mL PBS，3600rpm离心5min，弃上清；加入1mL次氯酸钠溶液(有效氯含量≥4％)，冰浴30min，期间混匀数次；加入4mL PBS，3600rpm离心5min，弃上清，重复3次，至无明显“消毒液”气味，弃上清，保留沉淀；沉淀加入5mL TRIzol，用移液器反复吸打几次，室温(15-30℃)放置5min；加入1mL氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3min；4℃，12000rpm离心15min，混合物分为两层；上层水相转移至新管，体积补至5mL，记为卵囊提取物1，4℃保存备用。
球虫卵囊提取物2的制备：
取1×107个柔嫩艾美耳球虫卵囊离心沉淀，加入1mL铬硫酸，冰浴10min，加入10mLPBS，3600rpm，离心5min，弃上清，重复3次洗涤沉淀；沉淀加少量PBS，旋涡震荡5min，3600rpm，离心5min，弃上清；沉淀加入5mL TRIzol，用移液器反复吸打几次，室温(15-30℃)放置5min；加入1mL氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3min；4℃，12000rpm离心15min，混合物分为两层；下层有机相转移至新管，加入1.5mL无水乙醇，-20℃，15min后，4℃，12000rpm离心15min，沉淀加入5mL PBS，记为卵囊提取物2，4℃保存备用。
球虫卵囊提取物3的制备
取1×107个柔嫩艾美耳球虫卵囊离心沉淀，加入1mL PBS、100μl蛋白酶K(10mg/mL)、50μl SDS混匀，70℃水浴1h；3600rpm离心5min，弃上清，沉淀沉淀加入5mL TRIzol，用移液器反复吸打几次，室温(15-30℃)放置5min；加入1mL氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3min；4℃，12000rpm离心15min，混合物分为两层；下层有机相转移至新管，加入1.5mL无水乙醇，-20℃，15min后，4℃，12000rpm离心15min，上清转移至新管，加入7.5mL异丙醇，室温放置10min，4℃，12000rpm离心10min，弃上清；用含0.3M盐酸胍的95％乙醇洗涤沉淀，4℃，12000rpm离心10min，重复两次；加入1mL SDS(1％)，50℃水浴溶解沉淀，PBS补至5mL，记为卵囊提取物3，4℃保存备用
将以上制备的球虫卵囊提取物佐剂1-3用于H7N9病毒灭活疫苗免疫小鼠后检测其对H7N9灭活疫苗的免疫效果，结果见图5和见图6。
4-6周龄雌性BALB/c小鼠分为10组，每组10只。分别腹腔注射PBS，铝佐剂(AL)，H7N9病毒灭活疫苗+铝佐剂(AL+HA)，球虫佐剂1(Co1)，球虫佐剂1+H7N9病毒灭活疫苗(Co1+HA)，球虫佐剂2(Co2)，球虫佐剂2+H7N9病毒灭活疫苗(Co2+HA)，球虫佐剂3(Co3)，球虫佐剂3+H7N9病毒灭活疫苗(Co3+HA)。其中，灭活H7N9病毒100ug/只，铝佐剂(AL)60ug/只。共进行两次免疫，间隔14天。每次免疫14天后尾静脉采血，测定血清中H7N9血凝抑制抗体滴度，结果见图5，结果显示，一免后HA免疫组有30％小鼠产生抗体保护，几何均数为2.6；AL+HA组有3只产生抗体，几何均数为2.6；Co1+HA组10只小鼠都产生抗体，几何均数为26.4，Co2+HA组9只小鼠产生抗体，几何均数为22.5；Co3+HA组3只小鼠产生抗体，几何均数为2.5；其余组小鼠未产生HI抗体。二免后，HA免疫组、HA+AL组、HA+Co1组、HA+Co2组、HA+Co3组小鼠100％产生抗体，其余各组均未产生抗体。HA免疫组，HI抗体几何均数为140；AL+HA组HI抗体几何均数为242；C01+HA组HI抗体滴度几何均数为557，C02+HA组HI抗体滴度几何均数为735；C03+HA组HI抗体滴度几何均数为80。
一免后14天及二免后14天，小鼠轻度麻醉后，以50ul/只、107.5TCID50H7N9禽流感病毒滴入小鼠鼻腔。感染后第5天每组处死6只小鼠，取小鼠鼻洗液和肺组织测定病毒滴度，结果见图6，其中，图A与图B为一免后鼻洗液及肺组织中的病毒滴度；图C为二免后鼻洗液及肺组织中病毒滴度。一免后14天，10个组在感染后第5天鼻洗液中都检测到病毒复制，PBS组鼻洗液病毒滴度均值为log102.84TCID50，AL组鼻洗液病毒滴度高于PBS组为log103.44TCID50，Co1组、Co2组、Co3组、HA组、HA+AL组、HA+Co3组鼻洗液病毒滴度与PBS组接近没有统计学意义(P>0.05)。HA+Co1组和HA+Co2组鼻洗液病毒滴度显著低于PBS组，分别为log100.28TCID50和log101.35TCID50(P<0.01)。除HA+Co2组，其余9个组在感染后第5天肺组织中都检测到病毒复制，PBS组肺组织病毒滴度均值为log105.34TCID50，AL组为log104.66TCID50，Co1组、Co2组、Co3组肺组织病毒滴度与PBS组接近没有统计学意义(P>0.05)。HA组、HA+AL组、HA+Co3组的肺组织病毒滴度接近，低于PBS组。HA+Co1组和HA+Co2组肺组织病毒滴度显著低于PBS组，分别为log101.47TCID50和0(P<0.01)。二免后14天，PBS组、AL组、Co1组、Co2组和Co3组的鼻洗液平均病毒滴度高于log102.5TCID50，肺组织匀浆平均病毒滴度高于log105.2TCID50。HA组、HA+AL组、HA+Co1组、HA+Co2组和HA+Co3组鼻洗液病毒滴度均低于检测下限。HA组和HA+AL组，每组各有1只小鼠肺组织匀浆检测到病毒复制(n＝6)。HA组肺组织匀浆病毒滴度为log100.75TCID50、HA+AL组肺组织匀浆病毒滴度为log100.5TCID50。HA+Co1组、HA+Co2组和HA+Co3组鼻洗液和肺组织匀浆病毒滴度均低于检测下限。HA组和HA+AL组疫苗接种后对病毒的抑制率达83.3％，HA+Co1组、HA+Co2组和HA+Co3组接种疫苗后对病毒的抑制率达到100％。。
实施例6
本实施例以与实施例5相同的球虫卵囊提取物佐剂1-3用于H7N9病毒灭活疫苗免疫小鼠后检测其激发机体产生的细胞免疫应答水平。1.本发明佐剂对注射部位微环境有无影响。小鼠经背部皮下多点接种PBS，本发明卵囊提取物佐剂(Co)，铝佐剂(AL)，疫苗(HA)，本发明卵囊提取物佐剂+疫苗(Co+HA)，疫苗+铝佐剂(HA+AL)，先给予本发明卵囊提取物佐剂1天后给予HA疫苗(Co-HA)，先给予AL1d后给予HA疫苗(AL-HA)，14d后测定血清中HI抗体滴度。结果见图7A，结果显示Co1-HA(先给予Co1天后给予HA)组小鼠HI抗体滴度与HA+Co组比较没有显著性差异(P＞0.5)，AL-HA(先给予AL1d后给予HA)组小鼠HI抗体滴度与HA+AL组比较亦没有显著性差异(P＞0.05)。2.本发明佐剂对巨噬细胞吞噬功能的影响。收集小鼠腹腔巨噬细胞分别加入AL佐剂和Co佐剂。AL终浓度为40μg/mL，Co终浓度为3μg/mL、10μg/mL、30μg/mL、100μg/mL、300μg/mL，与Fluoresbrite YG微球共孵育24h。收集细胞流式检测腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球量。Fluoresbrite YG荧光微球可以被吞噬细胞吞噬，一个荧光微球足以使一个细胞发出荧光被流式细胞仪所捕捉，因此荧光强度用于量化吞噬细胞的吞噬功能。结果见图7B，结果显示本发明卵囊提取物佐剂能够显著提升巨噬细胞吞噬功能并存在剂量依存关系。3.本发明球虫卵囊提取物佐剂诱导机体产生的细胞因子及趋化因子的水平。分别在小鼠皮下注射5种不同免疫制剂后，按照不同时间点评估小鼠血清中细胞因子水平。结果见图7C。在球虫卵囊提取物佐剂注射后4h，收集注射部位肌肉，测定肌肉中细胞因子和趋化因子的浓度。结果见图7D。本发明球虫卵囊提取物佐剂能够不同程度地刺激细胞因子或趋化因子的释放。表现为该佐剂注射后3h至8h，G-SCF释放达到高峰，显著性更高于其他4组(P＜0.01)，在释放高峰期时血清中G-CSF浓度是其他4组的15至17倍。球虫卵囊提取物佐剂刺激IFN-γ高水平释放，在注射后3h持续至48h，高于其他4组40倍至17倍(P＜0.01)。球虫卵囊提取物佐剂促使在注射8h后浓度血清中IL-1α是其他4组的2倍(P＜0.01)。IL-6在注射球虫卵囊提取物佐剂后的3h至8h达峰值，其浓度是其他4组的20至7倍(P＜0.01)。其他几种趋化因子KC，MCP-1，MIG，MIP-1α,MIP-1β和RANTENS在球虫卵囊提取物佐剂注射后3h至8h在血清中保持较高水平，并远高于其他4组(P＜0.01)。其中血清中MCP-1，MIG和MIP-1α浓度在72h维持较高浓度，并远高于其他4组(P＜0.01)。TNF-α在注射球虫卵囊提取物佐剂后4h-48h维持较高浓度并高于其他4组(P＜0.01)。在注射球虫卵囊提取物佐剂后4h，收集注射部位肌肉，测定肌肉中细胞因子和趋化因子的浓度。发现肌肉中粒细胞、巨噬细胞和单核细胞集落刺激因子：G-CSF、KC，细胞趋化因子：KC，MCP-1，MIG，MIP-1α，MIP-1β，RANTENS，炎症因子和前炎症因子：IFN-γ、IL-1α、IL-6都显著升高，并显著高于其他4组(P＜0.01)。以上结果表明球虫卵囊提取物佐剂能够改变部位微环境，提升吞噬细胞的吞噬功能，刺激机体释放细胞集落刺激因子、趋化因子和前炎症因子，并在局部注射部位维持较高浓度，从而发挥免疫效应。
实施例7
本实施例以与实施例5相同的球虫卵囊提取物佐剂1-3用于H7N9病毒灭活疫苗免疫小鼠后检测其对疫苗使用剂量的影响。以Co佐剂与3组不同剂量疫苗组合免疫小鼠，免疫14d后感染H7N9病毒，观察小鼠的存活率及体重变化。结果见图8，结果显示，PBS组小鼠感染后10d全部死亡，25μgHA+AL组小鼠存活率50％，50μgHA+AL组小鼠存活率66.7％，100μgHA+AL组小鼠存活率100％。25μgHA+Co组小鼠存活率50％，50μgHA+Co组小鼠存活率83.3％，100μgHA+Co组小鼠存活率100％，结果见A图。各组小鼠从感染后1d体重开始下降，PBS组小鼠呈持续下降趋势直至实验结束。其余各组小鼠体重有不同程度的上升。100μgHA+AL组小鼠在感染后6d体重逐渐上升，100μgHA+Co组小鼠在感染后6d体重逐渐上升，2组间没有统计学差异(P＞0.05)，结果见B图。降低疫苗使用剂量，即接种50μg疫苗小鼠保护率达到83.3％，体重在感染7d开始恢复获得比较好的保护效果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (11)
1.顶复门真球虫目原虫卵囊和/或卵囊提取物在制备免疫佐剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述顶复门真球虫目原虫选自艾美耳球虫、弓形虫、隐孢子虫和疟原虫中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述卵囊提取物选自顶复门真球虫目原虫卵囊的DNA、RNA、脂类、糖类及蛋白质中的至少一种。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述免疫佐剂用于制备针对病原体的疫苗。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述免疫佐剂用于制备针对病原体的疫苗。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述疫苗选自禽用疫苗、牛用疫苗、猪用疫苗、羊用疫苗、人用疫苗。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述疫苗选自禽用疫苗、牛用疫苗、猪用疫苗、羊用疫苗、人用疫苗。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述禽用疫苗为至少两种禽用疫苗的联苗；所述牛用疫苗为至少两种牛用疫苗的联苗；所述猪用疫苗为至少两种猪用疫苗的联苗；所述羊用疫苗为至少两种羊用疫苗的联苗；所述人用疫苗为至少两种人用疫苗的联苗。
9.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，
所述禽用疫苗选自禽流感酶活疫苗、鸡新城疫灭活疫苗、鸡减蛋综合症灭活疫苗和鸡传染性法氏囊活疫苗；
所述猪用疫苗选自猪蓝耳病弱毒活疫苗、猪口蹄疫灭活疫苗、猪伪狂犬灭活疫苗、猪喘气病弱毒菌苗、猪链球菌双价灭活菌苗、副猪嗜血杆菌灭活疫苗、支原体灭活疫苗；
所述牛用疫苗选自牛口蹄疫O型灭活疫苗、牛传染性胸膜肺炎弱毒苗、牛巴氏杆菌病油乳剂疫苗、牛传染性鼻气管炎弱毒疫苗、牛传染性鼻气管炎灭活疫苗、牛沙门氏菌灭活苗；
所述羊用疫苗选自羔羊大肠杆菌疫苗、氢氧化铝菌羔羊痢疾苗、羊痘鸡胚化弱毒疫苗、Ⅱ号炭疽菌苗、口疮弱毒细胞冻干苗；
所述人用疫苗选自乙肝疫苗、卡介苗、麻疹疫苗、脊髓灰质炎疫苗。
10.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述免疫佐剂用于制备免疫调节复合物。
11.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述免疫佐剂用于制备免疫调节复合物。
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