CN115747375A - 一种新型冠状病毒环介导等温扩增试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种新型冠状病毒环介导等温扩增试剂盒，所述试剂盒包括引物组、DNA聚合酶、LAMP反应液、荧光染料；所述荧光染料为钙黄绿素－Mn²⁺染料。本发明设计的引物，灵敏度高，特异性强，速度快，20min即可获得结果。现有检测体系非常容易遭到污染，主要原因是开盖后终端产物造成的气溶胶污染，在上述反应体系中加入钙黄绿素和Mn²⁺，配合新型指示剂能够在反应结束后直接肉眼观察检测结果，显色结果区分明显，可以避免开盖污染。此外还提出了荧光量化的技术支持，通过酶标仪测反应后荧光值使得最终结果可以实现仪器化检测。

Description

一种新型冠状病毒环介导等温扩增试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明提供了一种新型冠状病毒环介导等温扩增试剂盒及其使用方法，属于病毒检测技术领域。

背景技术

受到新冠不同变异毒株的影响，全球新冠新增确诊病例数历经了数次起伏，一直未能得到完全控制。近期，随着奥密克戎新型变异毒株的出现，全球新增确诊数再次上扬，其中，欧美地区新增确诊病例数量明显上升。

新型冠状病毒具有极强的传染性、人群普遍易感、具有潜伏期，因此需要及时地发现感染者、控制传染源，切断传播途径，才能有效地控制疫情的蔓延。而采取一切阻断措施的前提是需要有快速、准确、灵敏的诊断。

目前，国内外市面上有很多新型冠状病毒检测的试剂盒，主要基于两种方法：免疫学方法和分子生物学方法。其中，基于免疫学的方法主要是采用胶体金方法、化学发光法和酶联免疫法，检测患者血清或血浆中的新型冠状病毒特异性IgM抗体、IgG抗体或抗原。但是，临床上一般不单独以血清学检测作为诊断依据，灵敏度和特异性有限，几乎无法检测潜伏期和感染初期的病人，难以作为新冠感染确诊和排除的准确依据，同时抗体检测容易受到血液标本中的一些干扰物质(如类风湿因子、非特异IgM、溶血所致的高浓度血红蛋白等)的存在而出现“假阳性”结果。而基于分子生物学的方法主要是采用实时荧光PCR技术，特异性检测患者咽拭子、痰和其他下呼吸道分泌物等标本中的新型冠状病毒核酸。临床上将核酸检测结果作为诊断的依据之一，但基于PCR技术的检测方法存在一定的漏检率，准确率不同公司差异较大，RT-PCR存在操作复杂，对设备依赖性高，需要专业的技术人员，检测时间长，目前市面上基本都是采用荧光定量PCR鉴定新型冠状病毒，从样本采集到得到检测结果，整个检测流程在4个小时以上。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是2000年由日本学者Notomi发明的一种核酸体外恒温扩增技术。其特点是针对靶基因的8个区域设计6种特异性引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60-65℃恒温扩增，15-60分钟左右即可实现109-1010倍的核酸扩增。具有灵敏度高、特异性强、反应时间短、操作简单、结果易于判读等特点。当前，中国博奥生物公司推出的六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒(恒温扩增芯片法)是目前少数采用恒温扩增技术检测SARS-CoV2的产品，但是该产品仍然需要配备相应的设备进行检测，且检测前需要进行病毒RNA的提取，很难做到真正意义上的现场检测。

发明内容

为解决上述问题，本发明提出提供一种环介导等温扩增新型冠状病毒核酸检测的方法及试剂盒，本发明能够检测出2019新型冠状病毒基因序列中的2019-nCoV N基因片段，具有操作简单、可重复性强、灵敏度高、特异性好、检测结果快速客观等优点，为新型冠状病毒确诊提供新的科学依据。本发明技术方案如下：

一种新型冠状病毒环介导等温扩增试剂盒，所述试剂盒包括引物组、DNA聚合酶、LAMP反应液、荧光染料；

所述荧光染料为钙黄绿素－Mn²⁺染料。

可选的，所述引物组包括一对外引物F3和B3、一对内引物FIP和BIP、一对环引物LoopF和LoopB，核苷酸序列分别如下所示：

F3:AGATCACATTGGCACCCG

B3:CCATTGCCAGCCATTCTAGC

FIP：GCTCCCTTCTGCGTAGAAGC-CAATGCTGCAATCGTGCTAC

BIP：GGCGGCAGTCAAGCCTCTTC-CCTACTGCTGCCTGGAGTT

LoopF:GCAATGTTGTTCCTTGAGGAAGTT

LoopB:TCGTTCCTCATCACGTAGTCG。

可选的，所述试剂盒检测新冠病毒SARS-CoV-2的N基因；

可选的，F3与FIP的摩尔比为1：6.4～10；

F3与Loop-F的摩尔比为1：1.6～2.5；

F3与B3的摩尔比为1：0.8～1.25；

FIP与BIP的摩尔比为1：0.8～1.25；

LoopF与LoopB的摩尔比为1：0.8～1.25。

可选的，所述型冠状病毒环介导等温扩增试剂盒还包含阴性对照物和阳性对照物；

可选的，所述LAMP反应缓冲液中包含2mmol的MgSO4，20mmol的Tris-HCl(pH8.8@25℃)，10mmol(NH4)₂SO₄，50mmol的KCl，0.1％的Tween-20。

本发明还提出了上述的试剂盒进行检测的方法，包括如下步骤：

步骤一)获取核酸检测样品；

步骤二)使用新型冠状病毒环介导等温扩增试剂盒配制反应体系溶液，并向反应溶液中加入检测样品，进行扩增反应；

步骤三)根据反应溶液的颜色变化判断检测结果。

可选的，所述步骤一)包括：将采集到的待检测样品在90℃下热裂解5min。

可选的，所述步骤二中)反应体系溶液内包含：

0.2～0.25μmol/L的F3

0.2～0.25μmol/L的B3

1.6～2μmol/L的FIP

1.6～2μmol/L的BIP

0.4～0.5μmol/L的LoopF

0.4～0.5μmol/L的LoopB

1.4～1.8mmol/L的dNTP

0.5～0.7mol/LM甜菜碱；

4～8mmol/L的MgSO4

160～320U/mL Bst3.0DNA/RNA聚合酶；

50～80μmol/L钙黄绿素

400～800mmol/L的Mn²⁺

体积分数为8～10％的10×Bst buffer；

体积分数为8～20％的检测样品溶液。

可选的，所述扩增反应温度为60～65℃，反应时间为20～60min。

可选的，钙黄绿素浓度为50μmol/L，钙黄绿素与Mn²⁺的摩尔比为1：8。

可选的，所述步骤三)中在自然光下根据反应溶液的颜色变化判断检测结果，阴性结果为橙色，阳性结果时反应液由橙色变绿色；

可选的，所述步骤三)中在紫外光下根据反应溶液的颜色变化判断检测结果，阴性结果为透明，阳性结果反应液发出绿色荧光；

可选的，所述步骤三中)使用酶标仪测反应前后荧光值变化，根据变化量判断检测结果：

荧光值检测的激发光波长Ex＝490nm，发射光波长Em＝515nm，反应前后的荧光值数据变化范围：

阳性质粒：1000以上

阳性病毒样本：400以上

阴性：0-200。

作为一个具体的实施方案，

所述试剂盒的恒温扩增检测体系包含表1所示组分：

表1

所述反应缓冲液，包括：2mmol的MgSO₄，20mmol的Tris-HCl(pH8.8@25℃)，10mmol(NH₄)₂SO₄，50mmol的KCl，0.1％的Tween-20。

所述新型冠状病毒核酸检测试剂盒的使用方法如下：

1)配置25μL反应体系：12μL反应液，4.6μL引物混合液，2μL模板RNA，6.4μL超纯水；

2)混匀后，在65℃反应20min，85℃酶失活5min，扩增结束后判读结果。

本申请的方法可获得如下的有益效果

(1)本发明设计的引物，灵敏度高，特异性强，速度快，20min即可获得结果。

(2)热裂解病毒样本的处理方法减少了样本核酸抽提，操作简单、速度快。

(3)现有检测体系非常容易遭到污染，主要原因是开盖后终端产物造成的气溶胶污染，在上述反应体系中加入钙黄绿素和Mn²⁺，配合新型指示剂能够在反应结束后直接肉眼观察检测结果，显色结果区分明显，可以避免开盖污染。此外还提出了荧光量化的技术支持，通过酶标仪测反应后荧光值使得最终结果可以实现仪器化检测。

附图说明

图1是本发明的实施例1的2019新型冠状病毒N基因不同片段引物组对照筛选结果图；图中标记①为第一套引物组阳性结果；②为第一套引物组阴性结果③为第二套引物组阳性结果；④为第二套引物组阴性结果；⑤为第三套引物组阳性结果；⑥为第三套引物组阴性结果；⑦为第四套引物组阳性结果；⑧为第四套引物组阴性结果；

图2是本发明的实施例1的2019新型冠状病毒检测试剂盒的灵敏度检测结果(应用第四组引物)；图中标记①为反应20min阳性结果；②为反应20min阴性结果③为反应25min阳性结果；④为反应25min阴性结果；⑤为反应30min阳性结果；⑥为反应30min阴性结果；⑦为反应35min阳性结果；⑧为反应35min阴性结果；

图3是本发明的实施例2的2019新型冠状病毒检测试剂盒的特异性检测结果；图中标记①为含阳性对照品(质粒)结果；②为含SARS-CoV-2假病毒样本结果③为含人冠状病毒HCoV-HKU1 RNA假病毒阳性样本结果；④为含人冠状病毒HCoV-229E RNA假病毒阳性样本结果；⑤为含新型冠状病毒SARS RNA假病毒阳性样本结果；⑥为含甲型流感病毒INFA RNA阳性样本结果；⑦为含乙型流感病毒INFB RNA阳性样本结果；⑧为含肺炎支原体阳性样本结果；⑨为阴性对照品(DEPC水)结果；

图4是本发明的实施例2的热裂解病毒方法为模板扩增的结果；

图5是本发明的实施例3的可视化检测新型冠状病毒反应前后的颜色变化结果图；

图6是本发明的实施例4的酶标仪测反应前后的荧光值数据。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。

以下实施例中，所用的材料，如无特殊说明，均为本领域常规生化试剂公司购买得到的。

实施例1新型冠状病毒检测试剂盒(LAMP恒温扩增法)引物组筛选

①根据文献报道选择新型冠状病毒特异性的N基因保守区域作为扩增的靶标基因(GenBank，NC_045512.2)，并确定基因序列的准确性；

②根据步骤①确定的序列，利用LAMP primer explorer在线网页(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)针对N基因的特异性保守区设计4组特异性引物，这些引物分别针对不同位置的N基因特异性保守区的6个区域，每组引物包括一对F3/B3外引物，一对FIP/BIP内引物和一对Loop F/Loop B环引物

表2新型冠状病毒靶标引物序列筛选

③优化后的LAMP体系为：

分别取N基因引物：10μmol/L的F3和B3引物各5μL、50μmol/L的FIP和BIP引物各8μL、10μmol/L的LoopF和LoopB引物各10μL，加灭菌双蒸水至46μL，混匀，此为10×引物，取4.6μL；10×Bst buffer 2.5μL；10mmol/L的dNTP 3.5μL；5M甜菜碱3.5μL；100mmol/L的MgSO41.5μL；8U的Bst3.0DNA/RNA聚合酶1μL；模板1μL；加灭菌双蒸水至25μL。

扩增反应程序：65℃反应30min，85℃酶失活5min。

阳性对照品为以pUC57为质粒载体的2019新型冠状病毒N基因的质粒溶液。

阴性对照品为DEPC水。

④结果判断：

扩增结束，用2％琼脂糖凝胶电泳检测180V跑30min，阳性结果能产生清晰的典型的梯形条带，图1是本发明的2019新型冠状病毒检测试剂盒引物组筛选结果。从图1中可以看出，引物组④扩增效果最好。

⑤灵敏度检测

制备例1中的阴阳性对照品分别扩增20、25、30、35min，以此扩增时间梯度进行灵敏度测试，扩增结果如图2所示。图2是本发明的2019新型冠状病毒检测试剂盒的灵敏度检测结果。从图2中可以看出，在低浓度模板时，本发明所述试剂盒仍能检出，扩增反应20min已有明显的清晰的典型梯形条带，表明该试剂盒具有很高的灵敏度。

实施例2免提取病毒核酸--热裂解病毒条件摸索

①优化病毒热裂解温度

分别取5管10μL SARS-CoV-2假病毒样本在60-100℃热裂解10min后马上放置于4℃冷却2min，从其中取2μL样本作模板，利用上述的检测引物组和反应体系进行RT-LAMP扩增，经多次重复试验，最终确定最佳热裂解温度为90℃。

②优化病毒热裂解时间

分别取3管10μL SARS-CoV-2假病毒样本在90℃温度下分别热裂解5-15min后作模板进行RT-LAMP扩增，经多次重复试验，最终确定最佳热裂解时间为5min。

③热裂解方法的重复性

吸取含新型冠状病毒假病毒20μL至PCR管中，在90℃下热裂解5min后作为模板进行RT-LAMP扩增。

阳性对照品为以pUC57为质粒载体的2019新型冠状病毒N基因的质粒溶液。

阴性对照品为DEPC水。

④结果判断：

扩增结束，用2％琼脂糖凝胶电泳检测180V跑30min，阳性结果能产生清晰的典型的梯形条带。结果如图4所示。图4是本发明的2019新型冠状病毒检测试剂盒的热裂解病毒方法可重复性的结果。从图4中可以看出，阳性结果都能产生清晰的典型的梯形条带，热裂解病毒方法可重复性好。

⑤特异性检测

选取与新型冠状病毒感染部位相同或感染症状相似的其他病原体：含人冠状病毒HCoV-HKU1 RNA假病毒阳性样本、含人冠状病毒HCoV-229E RNA假病毒阳性样本、含新型冠状病毒SARS RNA假病毒阳性样本、含甲型流感病毒INFA RNA阳性样本、含乙型流感病毒INFB RNA阳性样本、含肺炎支原体阳性样本，并同时制备阳性对照品(质粒)、阳性参照品(SARS-CoV-2假病毒样本)和阴性对照品(DEPC水)，通过已确定的检测方法和裂解方法，用热裂解的方法裂解上述病毒样本作为待检测核酸模板，分析本发明中的检测试剂盒的特异性。

所有待检测核酸样本、新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸参考品购自广州邦德盛生物科技有限公司(BDS)。

检测结果如图3所示，结果表明本发明的检测试剂盒对含人冠状病HCoV-HKU1、含人冠状病毒HCoV-229E、含新型冠状病毒SARS、含甲型流感病毒INFA、含乙型流感病毒INFB、含肺炎支原体样本的检测均为阴性，而对制备例2中制备的阳性参照品的检测结果为阳性，表明本发明试剂盒具有较高的特异性。

实施例3可视化结果判读条件

现有的检测体系非常容易遭到污染，主要原因是开盖后终端产物造成的气溶胶污染，在上述反应体系中加入1μL 625μmol钙黄绿素和2μL 10mmol MnCl₂，配合新型指示剂能够在反应结束后直接肉眼观察检测结果，显色结果区分明显，可以避免开盖污染。

①确定钙黄绿素最优显色浓度

在上述反应体系中加入适量625μmol钙黄绿素和10mmol MnCl₂，使结果易读判。将钙黄绿素与锰离子浓度比设定为1:8，改变钙黄绿素的浓度(0.01、0.03、0.05、0.08、0.1mmol)，反应结束后选取阴阳性颜色对比最为强烈的一组确定为钙黄绿素最优浓度，经多次重复试验，最终确定50μM为钙黄绿素的最优浓度。

②确定钙黄绿素与锰离子浓度比

确定钙黄绿素的浓度为50μM，改变钙黄绿素与锰离子的浓度比(1：2、1：5、1：8、1：10、1：12、1：25、1：50、1：100)，选取阴阳性颜色对比最为强烈的一组为钙黄绿素与锰离子的最佳浓度比，经多次重复试验，最终确定1:8为钙黄绿素与锰离子的最佳浓度比。

③建立荧光染料体系

在上述反应体系中加入1μL 625μmol钙黄绿素和2μL 10mmol MnCl₂，在反应结束后直接肉眼观察检测结果，显色结果区分明显。

如图5所示，在自然光下，阳性结果时反应液由橙色变绿色，阴性结果则为橙色。在紫外光下，阳性结果是反应液发出绿色荧光，阴性结果则接近透明。

实施例4反应前后荧光量化

在实际应用中考虑到这种结果判断方式容易受人为因素影响会出现一定的误差，尤其对于患有色盲、色弱的检验工作者来说，结果的判断就相对困难。为了方便现场实际检测，使用酶标仪测反应前后荧光值变化，在特定波长下，阳性、阴性扩增结果的吸收光度值存在于某些特定的区域，那么结合这种仪器既能够实现快速检测，也可以实现准确检测。

①配置反应体系

配置50μL反应体系：10μmol/L的F3和B3引物各1μL、50μmol/L的FIP和BIP引物各1.6μL、10μmol/L的LoopF和LoopB引物各2μL，混匀；10×Bst buffer 5μL；10mmol/L的dNTP7μL；5M甜菜碱7μL；100mmol/L的MgSO4 3μL；8U的Bst3.0DNA/RNA聚合酶2μL；模板4μL；2μL625μM钙黄绿素和4μL 10mmol MnCl2加灭菌双蒸水至50μL，阳性和阴性样本各3份

②酶标仪测反应前的荧光值

通过酶标仪测反应前的荧光值，将混合好的样本加到96孔酶标板上Gen5使用说明:

设定类型，选择Fluorescence，设置激发光波长和发射光波长，Ex＝490nm，Em＝515nm，记录阴阳性样本的反应前荧光值数据

③扩增反应

程序：65℃反应30min，85℃酶失活5min。

④酶标仪测反应后的荧光值

通过酶标仪测反应后的荧光值，记录阴阳性样本的反应后荧光值数据

①计算反应前后荧光值变化

如图所示，阳性质粒：1000以上

阳性病毒样本：400以上

阴性：0-200

以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims (10)

1.一种新型冠状病毒环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物组、DNA聚合酶、LAMP反应液、荧光染料；

所述荧光染料为钙黄绿素－Mn²⁺染料。

2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述引物组包括一对外引物F3和B3、一对内引物FIP和BIP、一对环引物LoopF和LoopB，核苷酸序列分别如下所示：

F3:AGATCACATTGGCACCCG

B3:CCATTGCCAGCCATTCTAGC

FIP：GCTCCCTTCTGCGTAGAAGC-CAATGCTGCAATCGTGCTAC

BIP：GGCGGCAGTCAAGCCTCTTC-CCTACTGCTGCCTGGAGTT

LoopF:GCAATGTTGTTCCTTGAGGAAGTT

LoopB:TCGTTCCTCATCACGTAGTCG。

3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测新冠病毒SARS-CoV-2的N基因；

优选的，F3与FIP的摩尔比为1：6.4～10；

F3与Loop-F的摩尔比为1：1.6～2.5；

F3与B3的摩尔比为1：0.8～1.25；

FIP与BIP的摩尔比为1：0.8～1.25；

LoopF与LoopB的摩尔比为1：0.8～1.25。

4.根据权利要求1所述的新型冠状病毒环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述型冠状病毒环介导等温扩增试剂盒还包含阴性对照物和阳性对照物；

优选的，所述LAMP反应液中含有dNTP、甜菜碱、MgSO₄、Bst3.0DNA/RNA聚合酶、LAMP缓冲液；

优选的，所述LAMP缓冲液中包含2mmol的MgSO₄，20mmol的Tris-HCl(pH8.8@25℃)，10mmol(NH₄)₂SO₄，50mmol的KCl，0.1％的Tween-20。

5.一种新型冠状病毒核酸检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一)获取核酸检测样品；

步骤二)使用新型冠状病毒环介导等温扩增试剂盒配制反应体系溶液，并向反应溶液中加入检测样品，进行扩增反应；所述新型冠状病毒环介导等温扩增试剂盒为权利要求1～4任一所述的新型冠状病毒环介导等温扩增试剂盒；

步骤三)根据反应溶液的颜色变化判断检测结果。

6.根据权利要求5所述的新型冠状病毒核酸检测方法，其特征在于，所述步骤一)包括：将采集到的待检测样品在85～90℃下热裂解5～10min。

7.根据权利要求5所述的新型冠状病毒核酸检测方法，其特征在于，所述步骤二中)反应体系溶液内包含：

0.2～0.25μmol/L的F3

0.2～0.25μmol/L的B3

1.6～2μmol/L的FIP

1.6～2μmol/L的BIP

0.4～0.5μmol/L的LoopF

0.4～0.5μmol/L的LoopB

1.4～1.8mmol/L的dNTP

0.5～0.7mol/LM甜菜碱

4～8mmol/L的MgSO₄

160～320U/mL Bst3.0 DNA/RNA聚合酶

50～80μmol/L钙黄绿素

400～800mmol/L的Mn²⁺

体积分数为8～10％的10×Bst buffer

体积分数为8～20％的检测样品溶液

优选的，钙黄绿素浓度为50μmol/L，钙黄绿素与Mn²⁺的摩尔比为1：8；

优选的，所述扩增反应温度为60～65℃，反应时间为20～60min。

8.根据权利要求5所述的新型冠状病毒核酸检测方法，其特征在于，所述步骤三)中在自然光下根据反应溶液的颜色变化判断检测结果，阴性结果为橙色，阳性结果时反应液由橙色变绿色。

9.根据权利要求5所述的新型冠状病毒核酸检测方法，其特征在于，所述步骤三)中在紫外光下根据反应溶液的颜色变化判断检测结果，阴性结果为透明，阳性结果反应液发出绿色荧光。

10.根据权利要求5所述的新型冠状病毒核酸检测方法，其特征在于，所述步骤三中)使用酶标仪测反应前后荧光值变化，根据变化量判断检测结果：

荧光值检测的激发光波长Ex＝490nm，发射光波长Em＝515nm，反应前后的荧光值数据变化范围：

阳性质粒：1000以上

阳性病毒样本：400以上

阴性：0-200。

Images