KR20140124752A - 단일-분자 혼성화 및 조작에 의한 dna 검출 및 정량화의 방법 - Google Patents

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Abstract

본원 발명은 핵산, DNA 또는 RNA의 검출 및 정량화를 위한 신속한 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 물리적 및 전자적 처리들을 기반으로 하여 특정한 핵산 분자의 존재를 검출하고 정량화하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명의 방법은 유전자 발현 분석 또는 비정상적인 염색체의 분포(chromosomal abnormal distributions)의 검출 등 다양한 적용들에 유용하다.

Description

단일-분자 혼성화 및 조작에 의한 DNA 검출 및 정량화의 방법{METHOD OF DNA DETECTION AND QUANTIFICATION BY SINGLE-MOLECULE HYBRIDIZATION AND MANIPULATION}
본원 발명은 핵산, DNA 또는 RNA의 검출 및 정량화(quantification)를 위한 신속한 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 물리적 및 전자적 처리들을 기반으로 하는 특정한 핵산 분자의 존재를 검출하고 정량화하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명의 방법은 유전자 발현 분석 또는 비정상적인 염색체 분포의 검출과 같은 다양한 적용들에 유용하다.
핵산 서열(nucleic acid sequences)의 검출 및 정량화는 광범위하게 흔히 이용되는 생물학적 적용들에 대하여 중요성을 갖는다. 적용들은 임상 진단을 포함하는 체외 진단(in vitro diagnostics) 분야들, 분자 생물학, 고속 처리 약물 스크리닝(high throughput drug screening), 수의학적 진단(veterinary diagnostics), 농업-유전자 검사(agricultural-genetics testing), 환경 검사(environmental testing), 식품 검사(food testing), 산업 공정 모니터링(industrial process monitoring) 및 안정성 검사(insurance testing)의 분야들에서의 연구를 포함한다. 특히, 생리학적 샘플 내 특정한 DNA 서열의 존재를 입증하는 것은 현재, 예를 들어 박테리아가 항생물질 내성을 발달시킬 확률, 유전적 기형, 유전자 변형과 관련된 암의 위험성, 및 바이러스 감염, 이를 테면 HIV 또는 간염 바이러스와 관련된 감염을 식별하기 위한 진단 방법들의 주요한 개발 라인을 구성한다[예를 들어 Zhang et al., Nature, 358: 591-593, 1992; Turner et al., J Bacteriol, 176(12):3708-3722, 1994; Weston et al., Infection and Immunity., 77(7):2840-2848, 2009 참조]. 또한, 특정한 핵산 서열의 검출 및/또는 정량화는 출산 전 진단(prenatal diagnostic), 유전자 발현 연구, 고대(ancient) DNA 획득, 유전병의 진단, 서열 다형성(sequence polymorphisms)의 검출, DNA 반복부(repeats)의 정량화, 병원균(pathogens)의 검출, 유전자-변형 생물체의 식별 등 다양한 적용들에 있어서 아주 중대하다[예를 들어, WO 02/31463; WO 2006/058395; US 5,705,365; US 5,840,487; US 5,858,658; US 6,453,245; US 7,919,247; Verjat et al., Biotechniques, 37(3): 476-481, 2004; Vural, Afr . J. Biotechnol., 8(20): 5163-5168, 2009; van der Meide et al., J. Clin . Microbiol., 43(11): 5560-5566; 2005; Fan et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 105(42): 16266-16271, 2008; Buehler et al., Methods, 50: S15-S18, 2010; Clark et al., Genome Res., 11: 1594-1602, 2001; Vernon et al., BMC Infect Dis, 3: 12, 2003; Piepenburg et al., PLoS Biol., 4(7): e204, 2006 참조].
몇몇 기술들이 수년 간 개발되었고, 이들 모두는 표적 핵산 분자와 특정한 표지된 탐침(labelled probe) 사이에서 혼성 분자(hybrid molecule)의 검출을 필요로 한다. 오늘날, 핵산들을 검출하는데 가장 널리 사용되는 방법들은 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 기반으로 한다. 예를 들어, 실시간(Real-time) PCR은 표적 DNA 분자를 증폭시키고 동시에 정량화하는데 사용된다.
핵산의 검출 및/또는 정량화를 위한 여하한 방법에 있어서 결정적인 측면은 감도이다. 개발된 첫번째 기술들은 크기가 큰 샘플을 필요로 한다. 이런 문제점은 PCR 방법에서의 증폭 단계에 의해 완화되었다. 따라서, PCR을 기반으로 하는 방법들은 표적 핵산을 증폭시킴으로써 매우 적은 양의 핵산들의 검출을 가능하게 한다(Haque et al., BMC Biotechnol., 3: 20, 2003). 생물학적 연구에서, 그러므로 PCR은 전염병들에 대한 검사의 연구를 가속화시킨다. PCR의 의학적 적용은 사람의 조직들 내의 바이러스, 박테리아 및 암세포들을 식별하는 단계를 포함한다. PCR은 특정한 세포 타입들을 식별하기 위하여, 단일 세포들 내에서, 동소[in situ(in-site)] PCR이라고 칭하는 절차 내에서도 사용될 수 있다. 또한, PCR은 역전사효소 PCR(reverse transcriptase PCR: RT-PCR)이라고 칭하는 공정, RNA의 증폭에 적용할 수 있다. RT-PCR은 통상적인 PCR과 유사하고, 역전사효소라고 칭하는 효소를 사용하여 RNA 표적으로부터 DNA가 합성되는 초기 단계가 추가된다. 리보솜 RNA, 메신저(messenger) RNA 및 게놈 바이러스(genomic viral) RNA를 포함하는, 매우 다양한 RNA 분자들이 RT-PCR에 사용된다.
그러나, 지금까지 개발된 모든 방법들은 심각한 결함들에 시달리고 있다. 특히, 이런 방법들 모두가 표지된 (예를 들어, 형광으로 표지된) 뉴클레오티드들을 사용하므로, 이는 전반적인 비용을 대단히 증가시키는데 기여한다. 게다가, 표적 서열의 증폭은 시간 소모가 크고, 오차 확률을 증가시키며, 매우 오염되기 쉽다.
본원 발명에 따른 방법은 물리적 기술들 및 전자적 처리들을 기반으로 하고, 화학적 또는 생화학적인 현재의 접근법들과 상이하다. 이점들은 하기와 같다:
1) 이는 검출 및 정량화 이전에 PCR 단계를 필요로 하지 않는다
2) [형광단(fluorophore)들 또는 몇몇 다른 기들을 갖는] 표지된 비싼 뉴클레오티드들을 사용하지 않는다.
또한, 헤어핀(hairpin)을 따라 폐색(obstruction) 위치의 전체적인 (전자적 또는 광학적) 검출과 본 발명의 방법과의 결합은 게놈 DNA의 신속한 대규모의 진단을 가능하게 하고, 현재의 DNA 칩 기술들에 대한 경쟁력 있는 대안책을 제공한다.
본원 발명은 핵산 서열의 검출 방법에 관한 것이고, 여기서 상기 핵산 서열에 대응하는 변성된 이중 가닥의 핵산의 복원(renaturation)이 차단된다.
'핵산 서열의 검출'이란, 본 명세서에서 특정한 핵산 서열의 존재(presence) 또는 부재(absence)에 대한 상당한 정보를 직접적으로 또는 간접적으로 획득하는(leading) 모든 활동들을 의미하고, 이러한 활동들은 핵산 분자 내의 특정한 서열의 검출 또는 두 개의 상이한 핵산 분자들의 서열들 간의 차이점 검출을 포함하나, 이로 제한되지는 않는다. 핵산 서열의 검출은 상기 핵산 서열의 실제 결정, 즉 상기 핵산 내 염기들의 실제 천이(succession)를 판독하는 것을 포함할 수 있으나; 대부분의 실시예들에서, 본 발명은 상기 핵산을 시퀀싱(sequencing)하는 단계를 수행하지 않을 수 있다.
본 발명은 변성된 이중 가닥의 핵산이 적절한 조건들 하에서 재혼성화(rehybridize)한다는 관측을 기반으로 한다. 일부 분자들이 복원 단계 중에 상기 변성된 이중 가닥의 핵산의 여하한 가닥들에 결합된다면, 재혼성화는 일부분에 지나지 않을 것이다. 현재, 본 발명자들은 어떤 조건들 하에서, 영구적인 또는 일시적인 재혼성화의 멈춤(pause)이 변성된 이중 가닥 핵산 분자 내에 함유된 서열을 검출하는데 사용될 수 있다는 것을 알아내었다. 본 발명에 의하면, 이중 가닥 핵산 분자의 재혼성화의 차단(blockage)을 검출할 수 있고; 이러한 차단과 관련된 물리적 파라미터(parameter)들(예를 들어, 차단의 지속 기간, 이중 가닥 핵산 분자 상의 차단 위치)에 의해, 핵산의 서열을 결정할 수 있다.
따라서, 본원 발명은 핵산 서열의 검출 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 상기 핵산 서열에 대응하는 변성된 이중 가닥의 핵산의 복원 차단을 검출하는 단계를 포함한다.
'변성'이란, 본 명세서에서 상기 가닥들 사이의 대부분의 수소 결합들이 끊어지는 경우에 발생하는 이중 가닥 핵산 분자의 두 개의 가닥들의 분리 과정을 의미한다. 변성 과정은 변성된 핵산 분자를 산출하고, 이는 본 명세서에서 이중 가닥 핵산 분자의 변성으로부터 발생하는 두 개의 분리된 상보적인 가닥들을 의미한다. '복원'이란, 본 명세서에서 두 개의 분리된 상보적인 가닥들이 혼성화를 통해 이중 나선으로 재형성되는 과정을 칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, '혼성화'는 단일 혼성체(single hybrid)로의 핵산들의 두 개 이상의 상보적인 가닥들 간의 비-공유(covalent) 서열-특이적 상호작용을 확립하는 과정이다.
핵산을 변성시킬 여러 가능성이 당업자에게 알려져 있다. 가장 바람직한 방식에서, 두 가닥들은 이들에 물리적 힘을 가함으로써 분리된다. 본 발명에 따른 "물리적 힘"은 대상(object)으로 하여금 대상의 움직임, 방향 또는 기하학적 구조 중 어느 하나에 관한 여하한 변화를 겪도록 하는 여하한 영향력이다. 본 발명에 따른 힘은, 예를 들어 온도(이는 이에 가해지는 영향력이라기보다는 물질의 직접적인 특성임)와 같은 다른 물리적 파라미터들과 상이하다는 것이 당업자에게 분명할 것이다. 본 발명에 따른 물리적 힘은 마찰력, 장력, 수직력, 공기 저항력, 인가된 힘(applied force), 및 탄성력과 같은 이러한 힘들을 포함한다. 가장 바람직하게, 본 발명에 따른 물리적 힘은 장력이다. 이 실시예에 의하면, 상기 이중 가닥 핵산의 자유 말단들이 당겨서 떨어질 수 있으며, 이에 따라 접합된 염기(paired base)들 간의 모든 결합이 깨지고 이중 가닥 핵산이 열린다(opening).
따라서, 일 실시예에서, 본 발명의 방법은 핵산 서열의 검출 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은:
ㆍ 상기 핵산 서열에 대응하는 이중 가닥 핵산 분자에 물리적 힘을 가함으로써 상기 분자를 변성시키는 단계; 및
ㆍ 이중 가닥 핵산의 복원 차단을 검출하는 단계를 포함한다.
이 형태의 서열 검출 방법에서는, 이중 가닥 DNA의 자유 말단들[즉, 운반체(support)들에 부착되지 않은 말단들]이 당겨서 떨어지기 전에 공유결합 또는 준(quasi)-공유결합으로 서로 연결되도록 배열되는 것이 리페어링(re-pairing)을 용이하게 하기 위해 유리할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 이중 가닥 핵산 분자는 헤어핀(hairpin)이다. 본원 발명과 관련하여 이중 가닥 핵산을 도표로 나타내는 것이 요구되는 경우, 이는 열려 있는(또는 닫혀 있는) "지퍼(zip fastener)"로 비유할 수 있다: 이중 가닥 핵산의 변성은 지퍼를 여는 것(unzipping)이고, 복원은 다시 지퍼를 닫는 것(rezipping)이다.
본 발명자들은 어떤 조건들 하에서, 분자가 변성된 이중 가닥 핵산 분자에 연결되는 경우, 상기 분자의 복원이 차단된다는 것을 알아내었다. 결합되는 분자는 상기 변성된 이중 가닥 핵산 분자 상의 특정한 서열에 대하여 친화력을 갖는 여하한 타입의 분자, 예를 들어 핵산, 단백질 또는 작은 분자일 수 있다. 그러나, 외가닥(single-stranded) 핵산을 사용하는 것이 바람직한데, 이는 상기 외가닥 핵산은 변성된 이중 가닥 핵산의 가닥들 중 하나 상의 상보적인 서열과 혼성화될 수 있기 때문이다. 이 외가닥 핵산은 복원 과정을 차단하기에 충분히 긴 길이면 무방하다. 바람직하게, 외가닥 핵산의 길이는 3 내지 50 개의 뉴클레오티드; 더욱 바람직하게는, 3 내지 45 개의 뉴클레오티드, 3 내지 40 개의 뉴클레오티드, 3 내지 35 개의 뉴클레오티드, 3 내지 30 개의 뉴클레오티드, 3 내지 25 개의 뉴클레오티드, 3 내지 20 개의 뉴클레오티드, 3 내지 15 개의 뉴클레오티드; 그리고 더욱더 바람직하게는 3 내지 12 개의 뉴클레오티드가 포함될 것이다. 본 발명의 외가닥 핵산은 특히, 천연 또는 수정된 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 또한, 상기 외가닥 핵산은 리보스 부분(ribose moiety)이 2' 산소 및 4' 탄소를 연결하는 추가 가교(extra bridge)로 수정되는 뉴클레오티드인 잠금 핵산(locked nucleic acid: LNA), 또는 백본(backbone)이 펩티드 결합들에 의해 링크된 반복적인 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위(unit)들로 구성되는 펩티드 핵산(PNA)과 같은 수정된 뉴클레오티드로 이루어질 수 있다.
외가닥 핵산 분자가 복원 이전에 변성된 이중 가닥의 핵산에 첨가되는 경우, 재혼성화의 차단은 외가닥 핵산 분자의 서열이 적어도 이중 가닥 핵산 분자의 서열의 일부분과 상보적이라는 것을 나타낸다.
따라서, 본 발명의 방법은 또한 핵산 서열의 검출 방법에 관한 것이며, 상기 방법은:
1) 이중 가닥 핵산 분자에 물리적 힘을 가함으로써 상기 분자를 변성시키는 단계;
2) 상기 핵산 서열에 대응하는 외가닥 핵산 분자를 제공하는 단계;
3) 상기 외가닥 핵산 분자의 존재 하에서 상기 이중 가닥 핵산 분자를 복원시키는 단계; 및
4) 상기 이중 가닥 핵산의 복원 차단을 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명은 여하한 타입의 이중 가닥 핵산에 적용된다. 주로 이중 가닥 핵산은 DNA일 것이지만, 본 발명은 완벽히 접합되거나 완벽히는 접합되지 않은 외가닥 DNA-외가닥 DNA 듀플렉스(duplex)들, 또는 대안적으로 완벽히 접합되거나 완벽히는 접합되지 않은 외가닥 DNA-외가닥 RNA 듀플렉스, 또는 완벽히 접합되거나 완벽히는 접합되지 않은 외가닥 RNA-외가닥 RNA 듀플렉스들에도 적용된다는 것을 이해되어야 한다. 더욱이, 듀플렉스는 상이한 기원의 샘플들로부터 얻어진 두 개의 외가닥들의 적어도 부분적인 리페어링으로 구성될 수 있다. 최종적으로, 본 발명은 단독 외가닥 DNA의 이차 구조 또는 단독 외가닥 RNA의 이차 구조에도 적용된다.
전형적인 구성에서, 이중 가닥 핵산 분자들은 특히 두 개의 고체 기판(예를 들어, 현미경 슬라이드, 마이크로피펫, 마이크로입자) 상에 고정될 수 있다. 말단들 중 하나는 표면에 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있는 한편, 다른 말단은 이동가능한 표면에 직접 또는 간접적으로 부착된다. 이 실시예에서, 운반체들이 멀리 이동되는 경우, 이중-가닥 핵산의 두 말단 모두에 장력이 가해진다. 장력이 임계값보다 높은 경우, 두 가닥들은 분리되고 핵산 분자는 변성된다. 가해지는 장력은 바람직하게는 15 pN 이상이고; 이는 더욱 바람직하게는 16 pN 이상이며; 이는 더욱더 바람직하게는 17 pN 이상이고; 매우 바람직한 실시형태에서, 이는 18 pN 이상이다. 이 힘은 온도, 뉴클레오티드 타입, 및 완충용액에 따라 변할 수 있는데, 당업자라면 두 가닥들의 분리를 얻기 위해 이 파라미터들에 따른 상기 힘을 쉽게 맞출 수 있을 것이다. 반면에, 장력이 최소값 정도까지 감소되는 경우, 변성된 이중 가닥 핵산의 두 가닥들은 재혼성화될 수 있다. 상기 두 가닥들의 재혼성화를 얻기 위하여는, 바람직하게 12 pN 이하의 장력이 가해지고; 더욱 바람직하게는, 이는 11 pN 이하이며; 더욱더 바람직하게는, 이는 10 pN 이하이다.
가장 바람직하게는, 이중 가닥 핵산은 헤어핀이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, '헤어핀'은 한 가닥의 5' 말단이 비접합 루프(unpaired loop)를 통해 다른 가닥의 3' 말단에 물리적으로 링크되는 이중 나선을 의미한다. 상기 물리적 링크는 공유결합이거나 공유결합이 아닐 수 있다. 바람직하게는, 상기 물리적 링크는 공유결합이다. 따라서, 헤어핀은 이중 가닥 줄기(stem) 및 비접합 외가닥 루프로 구성된다. 헤어핀에서, 루프에 관여하지 않은 두 가닥들의 말단들은 자유단이며, 따라서 당겨 떨어질 수 있다. 이는 이중 가닥 핵산의 비접합(unpairing)을 유도하고, 이에 따라 변성된 이중 가닥 핵산 분자를 산출한다. 임계값보다 높은 힘으로 상기 핵산 분자의 각 말단을 당김으로써, 헤어핀 이중 가닥 핵산 분자를 완전히 여는 것이 가능하다. 분자에 가해지는 장력이 최소값 미만으로 감소되면, 핵산 분자는 재혼성화하여 헤어핀을 재형성한다. 하나의 핵산 가닥으로 혼성화되는 외가닥 핵산 분자의 존재는 재혼성화의 멈춤을 야기한다. 그러므로, 이러한 멈춤의 검출은 외가닥 핵산 분자가 이중 가닥의 줄기 중 적어도 일부분과 상보적인 서열을 포함한다는 것을 나타낸다.
이 실시형태에서 짧은 순간 중지(short transient), 예를 들어 1초 후에 헤어핀이 다시 접히도록 루프 서열 및 길이를 디자인하는게 유리하다. 이를 수행하기 위한 방법들이 이전 기술분야, 예를 들어 Woodside et al., Proc . Natl . Acad . Sci. U.S.A., 103(16): 6190-6195, 2006에 기재되어 있다. 힘이 여는 값(opening)에서 시험값으로 감소되는 경우, 열린 헤어핀의 신장(extension)은 외가닥 DNA의 탄력성으로 인해 변화한다. 헤어핀이 다시 접히기 전의 짧은 지연(small delay)은 사용자에게 차단 상태를 검출하는데 사용된 힘과 동일한 힘으로 헤어핀 신장을 결정하도록 한다.
헤어핀을 이용하는 것은, 특히 접합 및 비접합의 사이클들을 수행하고, 이에 따라 신호/잡음 비를 개선할 수 있게 한다.
이중 가닥 핵산의 자유 말단들이 함께 연결되게 하는 기술들이 알려져 있으며, 일부는 아래에서 더 상세하게 설명될 것이다.
차단의 결정은, 본 명세서에서 차단과 연계된 물리적 파라미터들의 결정을 의미한다. 유용한 파라미터 하나는 이중 가닥 핵산 분자 상의 차단 위치이며, 상기 위치는 이중 가닥 핵산 분자 상의 외가닥 핵산의 혼성화 위치에 대응한다. 실제로, 본 발명자들은 복원 시 멈춤이 발생하는 이중 가닥 핵산 상의 위치가 정확하게 결정될 수 있다는 것을 알아내었다: 헤어핀의 사용은 당업자에게 변성/복원 과정 동안 언제라도 헤어핀의 두 자유 말단들 간의 물리적 간격을 결정하는 수단을 제공한다.
'자유 말단'이란, 본 명세서에서 다른 가닥의 맨 끝에 공유결합으로 링크되지 않은 한 가닥의 말단을 의미한다; 앞서 설명된 바와 같이, 이 자유 말단들은 각각 상이한 표면에 결합될 수 있다. 예를 들어, 이 표면들 중 하나는 이동가능할 수 있는 한편, 다른 표면은 움직이지 않을 수 있다. 따라서, 당업자라면 헤어핀 이중 가닥 핵산의 자유 말단들 간의 간격을 측정하기 위해, 단순히 두 표면들 간의 간격을 측정하면 된다는 것을 알아차릴 것이다.
이 간격은 헤어핀 분자가 완전히 변성되는 경우에 최대[zhigh(Fopen)]인데, 이는 이때 헤어핀 핵산이 완전히 신장되기 때문이고; 상기 헤어핀 분자가 완전히 복원되는 경우에는 최소[zlow(Ftest)]이다. 외가닥 핵산이 동일한 탄력 특성들을 갖도록 동일한 힘(Ftest)에서 모든 길이 비교를 수행하는 것이 유리하다. 당업자는 루프 연결(loop closing)의 지연을 이용하여 zhigh(Ftest)를 측정할 수 있다. 마찬가지로, 복원 과정이 일시적으로 멈추는 경우에 두 자유 말단들 간의 간격이 측정될 수 있다: 예상대로, 이 간격(z)은 zhigh 내지 zlow(z는 모두 F = Ftest로 측정됨)에 포함된다. 외가닥 핵산의 서열과 상보적인 서열의 헤어핀 분자 상의 배치에 따라 간격(z)이 변한다는 것이 바로 분명하다. 만약 상기 외가닥 핵산이 헤어핀의 자유 말단들 가까이에 위치되는 서열과 혼성화하면, 헤어핀이 재형성되기 직전에 자가-재혼성화(self-rehybridize) 과정이 차단되고; 이 경우, zpause는 최소이다. 반면에, 만약 상기 외가닥 핵산이 비접합 루프에 가까운 헤어핀의 일부분과 혼성화하면, 헤어핀이 완전히 또는 거의 완전히 변성된 상황에서 복원 과정은 저지될 것이며; 이 경우, zpause는 최대이다(도 1).
또 다른 실시예에서, 하나 이상의 기준(reference) 외가닥 핵산들이 DNA 헤어핀 상의 (예를 들어 이의 염기 근처 또는 이의 루프 근처에) 알려진 서열들에 혼성화되고, 탐침된 외가닥 핵산의 혼성화 위치는 상기 기준 외가닥 핵산들의 혼성화 위치에 대하여 측정된다.
이중 가닥 핵산 분자 상의 물리적 간격을 다수 염기들과 정확히 연관시키는 것이 가능하다. 예를 들어, 0.8 nm의 간격은 10 pN의 힘을 받는 핵산에서 두 개의 뉴클레오티드(1 bp)에 의해 이르는 간격에 대응한다.
힘에 대한 정확한 교정(calibration)은 외가닥 핵산의 탄성에 의해 주어진다. 그러므로, 단순히 이중 가닥 핵산 분자의 두 자유 말단들 (또는 분자 상의 여하한 두 기준 위치들) 간의 간격을 측정함으로써, 복원이 차단되는 곳을 정확히 결정하는 것이 가능하다.
따라서, 일 실시예에서, 본 발명은 핵산 서열을 검출하는 방법으로 구성되고, 이 방법에서는 검출되는 서열에 대응하는 이중 가닥 핵산 분자가 물리적 힘의 적용에 의해 첫번째로 변성되고, 이후에 외가닥 핵산의 존재 하에서 재혼성화되며, 그리고 재혼성화에 대한 차단의 존재를 검출한다. 일 실시형태에서, 이중 가닥 분자의 두 말단들 간의 간격은 복원 과정이 차단될 때 결정된다. 바람직하게는, 상기 분자의 두 말단들 간의 간격은 분자가 완전히 변성될 때 결정된다. 더욱 바람직하게, 두 간격들이 비교되어 차단의 위치가 결정된다. 더욱 바람직하게, 완전히 신장된 루프와 기준 혼성화 위치 간의 간격이 측정되어, 차단 위치를 결정하기 위하여 사용된다. 훨씬 더 바람직하게, 두 개의 기준 혼성화 위치들 간의 간격이 측정되어, 차단 위치를 결정하기 위하여 사용된다.
분자를 따른 차단 위치 외에, 복원에 있어서 차단과 관련된 가장 유용한 파라미터는 복원이 차단되는 기간(본 명세서에서는 복원의 멈춤 기간이라고 칭함)이다. 실제로, 재혼성화가 차단되는 기간을 측정할 수 있다. 예를 들어, 당업자는 이중 가닥 핵산의 두 말단들 간의 간격이 상기에 정의된 바와 같이 z, 즉 zhigh와 zlow 사이에 포함된 중간값인 동안의 기간을 결정할 수 있다.
차단 기단은 두 서열들 간의 상보성의 정도에 의존한다. 상보성이 클수록, 두 분자들 간에 확립된 결합 개수가 더 많으므로, 기간이 길어진다. 또한, 차단 시간은 두 서열들 간의 상보성 영역의 길이에 의존한다는 점이 분명하다. 영역이 길수록, 두 분자들 간에 확립된 결합 개수가 더 많으므로, 기간이 길어진다. 그러므로, 어떤 조건들 하에서는 복원 멈춤의 기간이 거의 영구적일 것이라는 것을 쉽게 생각할 수 있다. 특히, 외가닥 핵산이 변성된 이중 가닥의 핵산과 혼성화될 수 있는 20 개 초과, 바람직하게 25 개 초과, 훨씬 더 바람직하게 30 개 초과의 뉴클레오티드를 포함하는 경우, 외가닥 핵산은 상기 이중 가닥 핵산에 가해지는 힘이 Ftest로 감소하는 경우조차도 이중 가닥 헤어핀에 혼성화된 채로 (수 분간) 남아있으므로, 상기 이중 가닥 헤어핀의 자가-재혼성화를 방지한다. 이러한 경우, 외가닥 핵산 분자를 분출(eject)하도록 효소를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 상기 외가닥 핵산 분자의 분출은 접합 및 비접합의 사이클들을 수행하고, 이에 따라 신호/잡음 비를 개선할 수 있게 한다. 적절한 효소들의 예시로서, 예를 들어 UVrD 헬리카제, 대장균(E.coli) UvrD 헬리카제, Tte-UvrD 헬리카제, T7 Gp4 헬리카제, RecBCD 헬리카제, DnaB 헬리카제, MCM 헬리카제, Rep 헬리카제, RecQ 헬리카제, PcrA 헬리카제, T4 UvsW 헬리카제, SV40 거대 T 항원 헬리카제, 포진 바이러스(herpes virus) 헬리카제, 효모 Sgs1 헬리카제, DEAH_ATP-의존성 헬리카제, 및 유두종 바이러스(papilloma virus) 헬리카제 E1 단백질 그리고 이들의 동족체들을 포함하는 헬리카제를 들 수 있다. 바람직하게는, T4 UvsW 헬리카제가 사용된다.
또한, 멈춤 기간은 반응 조건들에 따라 변화할 수 있다. 상기 기간은 온도가 상승함에 따라 감소될 것이다. 마찬가지로, 완충용액의 조성(buffer conditions)도 멈춤 기간을 변화시킬 수 있다: 예를 들어, 마그네슘, 베타인 및 테트라메틸암모늄 클로라이드(몰 농도로 사용되는 TMAC)는 차단 시간을 증가시킨다. 이러한 화합물들은 GC보다는 AT 쌍(pair)들을 강화하므로, 이러한 쌍들 간의 세기 차이를 감소시킨다. 그러나, 온도와 완충용액이 확정된 경우, 멈춤 시간은 변성된 이중 가닥의 핵산 상에서 당기는 힘 및 외가닥 핵산과의 상보성에만 의존할 것이다.
따라서, 일 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은:
ㆍ 이중 가닥 핵산 분자에 물리적 힘을 가함으로써 상기 핵산 서열에 대응하는 상기 분자를 변성시키는 단계;
ㆍ 외가닥 핵산 분자를 제공하는 단계;
ㆍ 상기 외가닥 핵산 분자의 존재 하에서 상기 이중 가닥 핵산 분자를 복원시키는 단계;
ㆍ 상기 이중 가닥 핵산 분자의 복원 차단을 검출하는 단계; 및
ㆍ 멈춤 기간을 결정하는 단계를 포함한다.
이전 기술의 방법들 모두는 형광 뉴클레오티드를 사용하는 반면, 본 발명의 방법은 핵산 분자 신장의 기계적 검출만을 포함한다. 그러므로, 본 발명의 방법은 이전 기술의 방법들과 관련된 여하한 결함들을 겪지 않는다.
바람직한 실시형태에서, 상기 이중 가닥 핵산 분자의 복원 차단의 검출은 상기에 설명된 바와 같이, 이중 가닥 핵산 분자 상의 차단 위치를 결정하는 단계를 포함한다.
특정한 이 실시예에서, 본원 발명에 따른 방법은 특히 찾아낸 이상(abnormalities)에 대응하는 다양한 핵산 영역들의 시퀀싱을 가능하게 하는 진단 목적용으로 사용될 수 있다.
그러나, 올리고뉴클레오티드와 DNA 서열 간의 염기쌍 오류(mismatch)는 혼성화를 훨씬 짧게 존속시킨다는 관측을 기반으로 한, 간소화된 기술을 제공할 수 있다. 제 1 실시형태에서, 헤어핀의 이중 가닥 핵산 분자의 복원은 외가닥 핵산에 의해서 차단되고, 상기에 설명된 여하한 방법들에 의해, 차단 기간이 결정된다. 바람직한 실시형태에서, 이 값은 기준값과 비교된다. 더욱 바람직한 실시형태에서, 기준값은 상기의 여하한 방법들에 의해 결정되는 바와 같이, 기준 외가닥 핵산에 의해 관찰되는 멈춤의 길이에 대응한다.
진단 목적, 예를 들어 게놈 DNA 내의 돌연변이들을 찾아내기 위하여, 이 기술들은 두 가지 방식으로 시행될 수 있다:
1) 찾아낸 돌연변이들을 포함하는 게놈 DNA와 함께 형성된 헤어핀들이 용액 내에서 올리고뉴클레오티드로 탐침된다.
2) 찾아낸 돌연변이들을 포함하는 서열(들)을 함유하는 헤어핀은, 고정된 크기의 외가닥 DNA 단편(fragment)들로서 용액 내에 존재하는 게놈 DNA에 의해 탐침된다. 만약 어세이(assay)의 목적이 단지 특정 서열의 존재 또는 이러한 서열 내에 있을 수 있는 돌연변이를 찾아내는 것이라면, 헤어핀의 루프 내에 이 서열을 위치시키면 매우 간단한 검출 방식(scheme)이 제공된다는 것이 바로 분명할 것이다. 만약 올리고(oligo)가 루프 내에서 혼성화되면, 매우 큰 신장 변화를 야기하는 헤어핀의 재접힘(refolding)을 완전히 방지하므로, 이는 하기에 설명되는 바와 같이 쉽게 검출될 수 있다.
이전 기술의 방법들은 형광 또는 방사성 뉴클레오티드를 갖는 탐침들을 표지화하는 단계가 요구되는 반면, 본원 방법은 핵산 분자 신장의 기계적 검출에만 의존한다. 더욱이, 검출 이전에 증폭 단계가 필요하지 않다. 따라서, 본원 발명의 방법은 핵산 분자들의 전체 개체(whole population) 중 하나의 단일 분자 검출을 가능하게 한다. 본 발명의 방법으로 얻을 수 있는 단일 분자 분해능(resolution)으로 인하여, 특정한 서열을 갖고 있는 이러한 분자가 검출될 수 있다. 따라서, 본원 발명은 당업자가 상기 서열을 갖고 있는 핵산 분자들의 수를 셀 수 있게 한다. 본원 방법은 핵산 분자들의 전체 개체 중 특정한 핵산 서열의 쉽고 정확한 정량화를 가능하게 한다.
그러므로, 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 샘플 내에 특정한 서열을 포함하는 일종의 이중 가닥 핵산 분자들을 정량화하는 방법이 제공되고, 상기 방법은:
a) 상기 이중 가닥 핵산 분자에 물리적 힘을 가함으로써 샘플 내의 상기 분자를 변성시키는 단계;
b) 상기 서열에 대응하는 외가닥 핵산 분자를 제공하는 단계;
c) 상기 외가닥 핵산 분자의 존재 하에서 상기 a) 단계의 상기 변성된 이중 가닥의 핵산 분자를 복원시키는 단계;
d) 복원이 차단된 이중 가닥 핵산 분자들을 검출하는 단계; 및
e) 상기 d) 단계의 상기 이중 가닥 핵산 분자들을 세는 단계를 포함한다.
정량화되는 핵산 종들은 핵산 분자들의 개체이고, 이는 상기 특정한 서열을 포함한다. 따라서, 이들은 특정한 서열을 함유한다는 점에서 다른 핵산 분자들과 상이하다. 이러한 분자들 모두가 이 서열을 공유할지라도, 이들은 동일하거나 달리 동일하지 않을 수 있다. 여하한 실시예들에서, 바람직하게 당업자는 상기 특정한 서열 이외에 상이한 핵산 종들의 양을 측정할 수 있고; 예를 들어, 당업자는 출아 효모 세포들이 세포 주기를 시작함으로써 발현되는 G1 사이클린 전사물들(cyclins transcripts)인 CLN1 및 CLN2 둘 모두의 양을 측정하는 것에 흥미가 있을 수 있다. 일부 다른 실시예들에서, 동일한 핵산 분자들의 개체, 예를 들어 차등 스플라이싱(differential splicing)에서 기인하는 유전자의 상이한 아형(isoform)들을 정량화하는 것이 더욱 바람직할 수 있다. 이는 상기 특정한 서열을 조심스럽게 선택함으로써 쉽게 달성될 수 있다: 본 기술분야의 당업자는 공개 활용 서열 데이타베이스(publicly-available sequence databases)[예를 들어, Genbank]의 도움으로 상기의 상황들 또는 상기와 다른 상황들에 대응하는 서열들을 어떻게 디자인하는지 알 수 있어, 본 명세서에 더 상세하게 설명할 필요는 없다.
또한, 하나 이상의 외가닥 핵산들을 사용할 수도 있고, 상기 하나 이상의 외가닥 핵산들은 변성된 이중 가닥의 핵산 분자를 따라 하나 이상의 상이한 서열들에 혼성화될 수 있다.
하나 이상의 외가닥 핵산 분자들이 사용되는 경우, 상기 하나 이상의 외가닥 핵산들은 하나 이상의 별개의 서열들에 대응하는 것이 유리하다. 이러한 경우, 상기 외가닥 핵산 분자들은 변성된 이중 가닥의 핵산 분자에 동시에 또는 연속적으로 첨가될 수 있다. 상기의 다양한 외가닥 핵산들은 상이한 위치들에서 상기 변성된 이중 가닥의 핵산의 복원을 차단할 수 있다. 재혼성화 중의 차단의 위치 및 횟수는, 상기 이중 가닥 핵산의 서열과 각각의 외가닥 핵산 서열과의 유사성의 정도를 기반으로 하는, 독특한 지문(fingerprint)을 규정한다. 따라서, 지문은 상기 변성된 이중 가닥의 핵산 분자의 복원 단계 중에 하나 이상의 외가닥 핵산들이 이중 가닥 핵산 분자에 혼성화되는 결과로서 관찰되는 차단의 패턴이다. 이러한 지문은 DNA 샘플 내의 다양한 이중 가닥 분자들을 세고 식별하는데 사용될 수 있다.
제안된 방법론은 형광 표지된 탐침들의 사용을 필요로 하지 않고, (탐침들의 단순한 혼성화 이상으로) 추가적인 위치 정보를 제공한다. 예를 들어, 이 접근법을 사용하면, 수 십만의 개별적인 라이브러리 단편(library fragment)들이 비교적으로 조사(examine)될 수 있다. 유사한 지문들을 갖는 cDNA들은 클러스터(clusters)로 분류되고, 이는 발현되는 유전자들의 개수 및 이들의 상대적 발현 수준(level)에 대한 정보를 제공한다.
따라서, 일 특정 실시예에서, 본 발명의 방법은 샘플 내에 하나 이상의 특정한 서열을 포함하는 일종의 이중 가닥 핵산 분자들을 정량화하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은:
a) 상기 이중 가닥 핵산 분자들에 물리적 힘을 가함으로써 상기 샘플 내의 상기 분자들을 변성시키는 단계;
b) 상기 하나 이상의 서열들에 대응하는 하나 이상의 외가닥 핵산 분자를 제공하는 단계;
c) 상기 외가닥 핵산 분자의 존재 하에서 상기 a) 단계의 상기 변성된 이중 가닥의 핵산 분자들을 복원시키는 단계;
d) 상기 하나 이상의 외가닥 핵산 분자들에 의해 복원이 차단된 이중 가닥 핵산 분자들을 검출하는 단계; 및
e) 상기 d) 단계의 상기 분자들을 세는 단계를 포함한다.
바람직하게, 적어도 2개의 외가닥 분자들이 b) 단계에서 제공되고, 더욱 바람직하게는 적어도 3개, 더욱더 바람직하게는 적어도 5개, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 10개, 가장 바람직하게는 15개의 외가닥 분자들이 b) 단계에서 제공된다.
본 발명의 샘플은, 예를 들어 반응 혼합물과 같은 원하는 핵산 종들을 함유할 수 있는 여하한 타입의 샘플이다. 또한, 예를 들어 생물학적 샘플일 수 있다. "생물학적 샘플"은, 예를 들어 박테리아, 바이러스, 식물, 효모 등과 같은 생물학적 유기물을 함유할 수 있는 여하한 샘플일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 "생물학적 샘플"은 박테리아, 바이러스, 식물, 효모 등으로부터 얻어지는 세포 추출물과 같은 생물학적 유기체로부터 얻어질 수 있는 샘플을 칭하고, 특히 생물학적 샘플은 혈청 샘플, 혈장 샘플, 뇨 샘플, 혈액 샘플, 림프 샘플 또는 생검(biopsy)과 같은, 시험체(subject)로부터 취해지는 여하한 샘플일 수 있다. 이러한 샘플은 염색체 서열들의 정량화에 사용가능해야 한다. 게놈 서열들의 정량화를 위한 바람직한 생물학적 샘플들은 혈액 샘플, 혈장 샘플, 림프 샘플 또는 생검과 같은 샘플들을 포함한다. 바람직하게, 생물학적 샘플은 혈액 샘플이다. 실제로, 이러한 혈액 샘플은 임산부로부터 완전히 무해한 혈액 채취에 의해 얻어질 수 있으므로, 예를 들어 태아의 이수성(fetal aneuploidy)의 비-침습성 진단을 가능하게 한다. 또한, 혈액 샘플은 암 환자로부터 얻어진 것이 사용될 수 있고, 예를 들어 본 발명의 방법에 의해 액상 종양(liquid tumor)을 특징짓는데 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "생물학적 샘플"은 또한, 암이 고형암인 경우에는 검사되는 환자의 고형암 샘플을 포함한다. 이러한 고형암 샘플은 당업자에게 본 발명의 방법에 의해 원하는 핵산 수준의 측정을 실시가능하도록 한다. 일부 경우들에, 본 발명에 따른 방법들은 환자로부터 고형암 샘플을 취하는 예비 단계를 더 포함할 수 있다. "고형암 샘플"이란, 종양 조직 샘플을 칭한다. 암에 걸린 환자라도, 종양 부위인 조직은 여전히 종양이 아닌 건강한 조직을 포함한다. 따라서, "암 샘플"은 환자로부터 취해진 종양 조직으로 제한되어야 한다. 상기 "암 샘플"은 생검 샘플이거나 수술 절제술(surgical resection therapy)로부터 취해진 샘플일 수 있다. 일 실시형태에 따라서, 환자로부터 얻어진 샘플은 암 세포 또는 암 조직이다.
본 발명에 따른 샘플은 정량화될 핵산 종들만 함유할 수 있으나, 다른 분자들도 함유할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 샘플은 다른 종의 핵산 분자들을 함유한다. 이 실시예에 따라서, 본 발명은 또한 상이한 종의 핵산 분자들을 함유하는 샘플 내의 특정한 서열을 함유하는 일종의 핵산 분자들을 정량화하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은:
a) 상기 이중 가닥 핵산 분자들에 물리적 힘을 가함으로써 상기 샘플 내의 상기 분자들을 변성시키는 단계;
b) 상기 특정한 서열에 대응하는 외가닥 핵산 분자를 제공하는 단계;
c) 상기 외가닥 핵산 분자의 존재 하에서 상기 a) 단계의 상기 변성된 이중 가닥의 핵산 분자들을 복원시키는 단계;
d) 복원이 차단된 이중 가닥 핵산 분자들을 검출하는 단계; 및
e) 상기 d) 단계의 상기 이중 가닥 핵산 분자들을 세는 단계를 포함한다.
상기에 설명된 바와 같이, 하나 이상의 서열들에 대응하는 하나 이상의 외가닥 핵산 분자들도 사용할 수 있으므로, 특정한 지문을 결정할 수 있게 한다. 이 실시예에서, 본 발명의 방법은 이 지문을 나타내는 이중 가닥 분자들의 정량화를 기반으로 한다. 그러므로, 이 실시예에 따라서, 본 발명은 상이한 종의 핵산 분자들을 함유하는 샘플 내의 하나 이상의 특정한 서열들을 함유하는 일종의 핵산 분자들을 정량화하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은:
a) 상기 이중 가닥 핵산 분자들에 물리적 힘을 가함으로써 상기 샘플 내의 상기 분자들을 변성시키는 단계;
b) 상기 하나 이상의 서열들에 대응하는 하나 이상의 외가닥 핵산 분자들을 제공하는 단계;
c) 상기 외가닥 핵산 분자의 존재 하에서 상기 a) 단계의 상기 변성된 이중 가닥의 핵산 분자들을 복원시키는 단계; 및
d) 상기 하나 이상의 외가닥 핵산 분자들에 의해 복원이 차단된 이중 가닥 핵산 분자들을 검출하는 단계; 및
e) 상기 d) 단계의 상기 분자들을 세는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 적어도 2개의 외가닥 분자들이 b) 단계에서 제공되고, 더욱 바람직하게는 적어도 3개, 더욱더 바람직하게는 적어도 5개, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 10개, 가장 바람직하게는 15개의 외가닥 분자들이 b) 단계에서 제공된다.
따라서, 본원 발명은 핵산 서열들을 정량화하는 것이 필요하면 언제든지 사용될 수 있다. 임상 진단을 포함하는 체외 진단 분야들, 분자 생물학, 고속 처리 약물 스크리닝, 수의학적 진단, 농업-유전자 검사, 환경 검사, 식품 검사, 산업 공정 모니터링, 법의학(forensics) 및 안정성 검사(insurance testing)의 분야들에서의 연구를 포함하여 적용된다. 체외 진단 및 임상 진단은 질병 또는 질환의 존재, 이의 발병 단계 및/또는 중증도(severity), 및 환자의 치료 반응을 검사하기 위하여 신체에서 얻어진 핵산 샘플들의 분석에 관한 것이다. 고속 처리 약물 스크리닝 및 개발에서, 핵산들은 약물 리드(drug lead)들을 식별하도록 설정된 많은 수의 샘플 내에서 화합물들의 라이브러리에 노출됨에 의한 기관계의 반응을 분석하기 위하여, 항원, 항체, 수용체 등과 같은 다른 작용제(agent)들과 유사하게 사용된다. 수의학적 진단 및 농업 유전자 검사는 유전자 변형 농산물 및 유전자 변형 공정(agricultural genetic products and processes)에 대한 정도 관리(quality control)의 수단을 제공하기 위하여 그리고 체외 진단과 유사한 인간이 아닌 동물 또는 식물 종들로부터의 샘플들을 포함한다. 환경 검사에서, 환경과 관련된 매개물, 예를 들어 토양, 물, 공기 등의 오염을 나타내는 유기체들 및 이들의 독소들이 분석된다. 식품 검사는 정도 관리의 수단으로, 유기체들 예를 들어, 박테리아, 균류 등의 정량화를 포함한다. 산업 공정 모니터링에서, 핵산들은 이러한 공정들이 통제불능 상태면 신호를 발생시키기 위하여 및/또는 생산 공정의 적절한 통제를 나타내도록 검출 및/또는 정량화된다. 안정성 검사(insurance testing)에서, 유기체들 및/또는 이들의 독소들은 대상(client)의 위험도 범주를 결정하고 후보군(candidate)이 가치있음을 나타내기(approve) 위하여 스크리닝 검사에서 식별된다. 핵산들의 정량화 및/또는 검출의 다양한 다른 적용들이 존재하고, 새로운 적용들이 끊임없이 개발되고 있다.
이러한 적용들 중 하나는 유전자 발현의 분석이다. 유전자 발현을 분석하는 수많은 방법들이 본 기술분야에 개시되어 있다. 그러나, RT-PCR 및 DNA-마이크로어레이(microarrays)와 같이 가장 흔히 사용되는 방법들은 형광 뉴클레오티드를 사용하고, 이는 비용이 많이 들 수 있다. 게다가, 원하는 감도를 얻기 위해서는 사전 PCR 증폭이 필요하다. 그에 비해, 본원 발명은 요구되는 형광 뉴클레오티드 또는 증폭 없이, 단일 분자 수준으로 유전자 발현을 측정하는 방법을 제공한다.
따라서, 제 1 실시예에서, 본원 발명은 샘플 내 유전자 발현을 측정하는 방법에 관한 것이다. "유전자 발현"이란, 본 명세서에서 상기 유전자의 전사, 즉 유전자 DNA 주형(template)으로부터 RNA 중합효소에 의해 메신저 RNA(mRNA)의 합성을 칭하고; 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "유전자 발현을 측정"은 상기 유전자에 대응하는 특정한 mRNA 분자의 양을 측정하는 것을 의미한다.
이 실시예에 따라서, 상기 유전자에 대응하는 상기 mRNA의 양은 이와 같이 상기에 설명된 정량화 방법들 중 하나에 의해 측정된다.
당업자에게는 상기 정량화 방법이 이중 가닥 핵산 분자들 상에서 유리하게 실시된다는 것을 바로 알 것이다. 바람직하게는, 제 1 단계에서, 이중 가닥 핵산 분자는 RNA 전사물의 복제에 의해 얻어진다. 그러므로, 본 실시예에 따라서, 본원 발명은 샘플 내 유전자 발현을 측정하는 방법을 제공하고,
a) 샘플 내에 존재하는 RNA 분자들의 복제에 의해 이중 가닥 핵산 분자들을 합성하는 단계; 및
b) 상기에 설명된 방법들 중 하나에 의해 상기 유전자에 대응하는 mRNA 분자 종들을 정량화하는 단계를 포함한다.
이중 가닥 핵산을 만들기 위한 주형으로서 외가닥 RNA를 사용하는 수많은 효소들이 알려져 있다. 예를 들어, 이중 가닥 RNA 분자들은 RNA-의존성 RNA 중합효소의 작용에 의해 얻어질 수 있다. 바람직하게, 상기 전사물은 먼저 역전사 효소에 의해 cDNA 내로 역전사(retrotranscribed)된다. 당업자는 역전사가 몇 가지 이점들을 갖는다는 것을 깨달을 것이다. 예를 들어, 이미 고체 표면에 부착된 폴리-T 올리고뉴클레오티드로부터 개시될 수 있다. 더욱이, 결과적인 RNA/cDNA 혼성체는 처음에 RN아제(RNase)로, 이후에 DNA 중합효소로 처리될 수 있고, 이는 새로운 상보적인 DNA 가닥의 합성 및 RNA 부분(moiety)의 감성(degradation)으로 이어진다. 유리하게, 헤어핀 서열은 cDNA 가닥의 자유 말단에서 결찰되고, 새로운 DNA 가닥의 합성을 위하여 프라이머로서 사용될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 염색체 이상을 결정하는 방법에 관한 것이다. "염색체 이상"이란, 본 명세서에서 이례적인 수의 염색체들 또는 하나 이상의 염색체들 내에서의 구조적 이상을 칭한다. 이례적인 수의 염색체들은 "이수성"이라고 부른다: 이는 따라서 정상적인 이배수의 염색체들보다 더 많거나 더 적은 상태이다. 이수성은 개체가 한 쌍에서 염색체 하나를 빠뜨리거나[1염색체성(monosomy)] 또는 한 쌍인 두 개의 염색체들보다 더 많이 가지는 경우에 발생한다. "3염색체성(trisomy)"은 정상적인 두 개의 염색체 대신에, 세 개의 특정 염색체가 존재하는 경우의 이수성이다. "염색체의 구조적 이상"이란, 본 명세서에서 결실, 전좌(translocation), 중복(duplication), 고리화(ring) 등과 같은, 일부 염색체의 복제 수(copy number)에 영향을 미치는 현상(event)을 의미한다.
염색체의 전체 또는 일부분이 올바르게 분리되는데 실패하는 경우, 이러한 염색체 이상은 세포 분열 중 발생한다. 예를 들어, 암세포들이 종양 형성(oncogenesis)을 통해 발달하면서, 전체 염색체에 대한 손실(loss), 증가(gains), 전좌 또는 결실과 같은 염색체 이상들이 축적된다. 이러한 염색체 이상들은 암의 표현형(cancerous phenotype) 획득과 연관되는 것으로 생각되고, 각각의 암 타입에 대하여 특이적이다. 암이 진행될수록, 염색체 이상의 수가 늘어난다. 따라서, 이러한 염색체 이상을 검출하는 것은 보통 종양의 진행 정도(tumor aggressiveness) 및 환자의 예후에 대하여 매우 유용한 정보를 제공한다.
따라서, 이 실시예에서, 본 발명은 시험체로부터의 생물학적 샘플 내의 특정 염색체 부분의 비정상적인 분포를 검출하는 방법을 제공한다. 좀 더 자세하게, 상기 방법은:
a) 상기에 설명된 방법들 중 하나에 의해 상기 특정 염색체 부분의 레벨(level)을 정량화하는 단계;
b) 상기에 설명된 방법에 의해 또 다른 염색체 부분의 레벨을 정량화하는 단계;
c) 상기 a) 단계에서 얻어진 레벨과 상기 b) 단계에서 얻어진 레벨 간의 비율을 계산하는 단계; 및
d) 상기 특정 염색체 부분이 비정상적으로 분포되었는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
상기에 설명된 바와 같이, 암 세포들은 종양 형성의 상이한 단계들을 통하여 발달하면서, 암 세포들은 염색체 이상을 축적한다. 따라서, 종양 세포들 내의 염색체의 비정상적인 분포의 검출이 상기 종양의 진행 정도의 지표(indication)이다: 비정상적으로 분포되는 염색체 부분들이 많을수록, 종양이 더 많이 진행된 것이다.
그러므로, 바람직한 실시예에 따라서, 본 발명의 시험체는 암을 앓고 있는 환자이다. 이 실시예에서, 본 발명은 암을 앓고 있는 환자의 암 샘플에 대한 암의 진행 정도를 진단하는 방법을 제공하고, 상기 방법은:
a) 상기 환자의 암 샘플 내의 제 1 특정 염색체 부분의 레벨을 정량화하는 단계;
b) 상기 환자의 암 샘플 내의 제 2 특정 염색체 부분의 레벨을 정량화하는 단계;
c) 상기 a) 단계에서 얻어진 레벨과 상기 b) 단계에서 얻어진 레벨 간의 비율을 계산하는 단계;
d) 상기 특정 염색체 부분이 비정상적으로 분포되었는지 여부를 결정하는 단계; 및
e) 상기 염색체 부분이 비정상적으로 분포되었으면 진행 정도를 진단하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 "염색체 부분"은 염색체 전체 또는 염색체의 중요한 단편을 지칭한다. 예를 들어, 보통의 다운 증후군은 부분적인 3염색체성 21q22.2→qter과 관련되어 있다. 따라서, 본원 발명은 비정상적인 분포로 의심되는 염색체 부분(단계 a의 염색체 부분)을 정량화하고, 정량화된 것과 기준 염색체 부분 중 하나와 비교하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명에 따른 "기준 염색체 부분"은 비정상적으로 분포되지 않은 것으로 알려진 염색체 부분이다. 본 발명의 이들 실시예에서, 단계 b)의 염색체 부분은 기준 염색체 부분이다.
물론, a) 단계와 b) 단계의 염색체 부분들을 정량화하기 위한 서열들이 대응하는 염색체 부분들에 대하여 특이적이도록 선택되는 것이 중요하다. 당업자는 Genbank와 같은 공개 활용 서열 데이타베이스로부터 필요한 정보를 얻을 수 있다는 점을 쉽게 인식할 것이다.
이중 가닥 핵산 분자들의 분포는 먼저 드문-절단 제한효소(rare-cutter restriction enzyme)에 의해 염색체들을 분해(digesting)시킴으로써 유리하게 얻어진다. 당업자에 의해 알려진 바와 같이, 드문-절단 제한효소는 게놈 내에서 매우 드물게 발생하는 인식 서열(recognition sequence), 예를 들어 7 또는 8 개의 염기들을 포함하는 인식 서열을 갖는 제한 효소이다. 이러한 드문-절단 제한효소의 예시들은 Sfil, Xma I, Asc I, AsiS I[동일전달제한효소(isoschizomer) Sgf I], Not I(동일전달제한효소 CciN I), Sbf I(동일전달제한효소 Sse8387 I, Sda I), Fse I, Pac I 등을 포함한다. 이러한 모든 효소들은 상업적으로 구할 수 있다. 제 2 단계에서, 이와 같이 얻어진 제한 단편(restriction fragment)들은 EcoRI, BamHI, XhoI 등과 같은 흔한, 6 개의 염기로 된 제한 효소에 의해 분해된다. 결과적으로 얻어진 선형의 이중 가닥 단편들은 이후에 헤어핀으로 변형될 수 있다. 이중 가닥의 자유 말단들이 함께 연결되게 하는 기술들이 알려져 있고, 그 일부가 하기에 더욱 상세하게 설명된다.
태아의 이수성은 흔히 감수 분열 중에 부모의 생식세포 계열(germ line) 내에서 염색체 분리 결함의 결과이다. 태아 이수성이 1000명 중 9명꼴로 발생하여, 다른 선천성 결손증(birth defects)만큼 흔하지는 않지만, 이의 검출은 상당한 기술적 어려움을 나타낸다.
모체의 혈액(Maternal blood)은 자유 모체 DNA(free maternal DNA) 및 자유 태아의 DNA를 함유하고, 상기 태아의 DNA는 세포사, 전단(shear) 등의 결과로 혈액 내에서 죽는다(Herzenberg et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 76: 1453-1455, 1979; Bianchi et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 87: 3279-3283, 1990). 세포-유리 태아 DNA(cell-free fetal DNA)는 모체의 혈장 내에 존재하는 DNA의 오직 3 내지 6 %에 해당한다는 것이 알려져 있다(Lo et al., Am J Hum Genet, 62: 768-775, 1998). 모체의 혈액으로부터 태아의 이수성을 진단하는 방법들이 설명되었으나; 이런 방법들은 유전 물질의 증폭 단계, 샷건 시퀀싱(shotgun sequencing)의 사용 단계, 사전 PCR-기반 농축(prior PCR-based enrichment)을 포함하는 방법을 필요로 하며(Lo, BJOG, 116: 152-157, 2009; Fan et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 105(42): 16266-16271, 2008; Chiu et al., BMJ, 342: c7401, 2011 doi: 10.1136/bmj.c7401), 따라서 전위 바이어스(potential bias)에 민감하다.
따라서, 또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 시험체는 임산부이다. 이 실시예에 따라서, 본 발명은 상기 임산부의 혈액 샘플에서 태아의 이수성을 진단하는 방법을 제공하고, 상기 방법은:
a) 상기 혈액 샘플 내의 제 1 특정 염색체 부분의 레벨을 정량화하는 단계;
b) 상기 혈액 샘플 내의 제 2 특정 염색체 부분의 레벨을 정량화하는 단계;
c) 상기 a) 단계에서 얻어진 레벨과 상기 b) 단계에서 얻어진 레벨 간의 비율을 계산하는 단계;
d) 상기 특정 염색체 부분이 비정상적으로 분포되었는지 여부를 결정하는 단계; 및
e) 상기 염색체 부분이 비정상적으로 분포되었으면 태아의 이수성을 진단하는 단계를 포함한다.
바람직하게, 상기 특정 염색체 부분은 태아 내에 비정상적으로 분포하는 것으로 의심되는 염색체 부분이다. 유리하게, 제 2 염색체 부분은 기준 염색체 부분, 즉 비정상적으로 분포에 의해 영향을 받지 않은 염색체 부분이고; 상기 제 2 염색체 부분은 따라서 바람직하게 태아 세포들 내에 2염색체성 부분(disomic)이다.
본원 발명의 방법에 의해 결정될 수 있는 바람직한 태아의 염색체 이수성들 및 수반되는 질병들 또는 장애들은, 터너 증후군(성염색체의 1염색체성), 클라인펠터 증후군(XXY 성염색체), 삼중-X 증후군(triple-X syndrome)[XXX 성염색체], 다운 증후군(3염색체성 21), 에드워드 증후군(3염색체성 18) 또는 파타우 증후군(Patau syndrome)[3염색체성 13]을 포함한다. 단친 2염색체성(Uniparenteral disomy)은 프레더-윌리 증후군(Prader-Willi Syndrome)처럼 염색체 15에 대하여 알려져 있다. 만약 이러한 단친 2염색체성이 검출된다면, DNA가 모계 유전인지 부계 유전인지 구별하는 방식으로 DNA가 또한 분석되어야 한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 불균형한 전좌는 바람직하게 불균형한 로버트슨 3염색체성(unbalanced Robertson trisomy), rob(13q;14q)을 포괄한다. 본 발명의 방법에 의해 바람직하게 결정될 수 있는 다른 구조적 이상(structural aberration)들은, 4q-결실[울프-허쉬호른 증후군(Wolf-Hirschhorn syndrome)], 5q-결실[고양이울음 증후군(cri du chat syndrome)] 또는 미세결실 증후군들(microdeletion syndromes), 특히, 17q11.2 결실[스미스-마제니스 증후군(Smith-Magenis syndrome)] 또는 22q11.2 결실[디조지 증후군(DiGeorge syndrome)]을 포함한다.
바람직한 실시예에서, a) 단계 및 b) 단계에 사용된 서열은 태아의 DNA에 특이적인 서열들이다. 예를 들어, 상기 서열들은 부계 유전된 대립유전자들에 대응된다. 또 다른 실시예에서, 서열은 태아의 DNA 또는 모계 DNA 둘 중 어느 것에도 특이적이지 않다. 그러나, 혈액 내에 존재하는 DNA의 10 %는 태아에서 온 것(fetal origin)이므로, 3염색체성은 1.05의 c) 단계의 비율을 야기할 것이다. 각각의 염색체에 대하여 평균 2×104 개의 서열들에 대응하는 약 100만 개의 비드(bead)들이 (샘플을 스캐닝함으로써) 탐침되었다면, 이중 약 2×103 개의 서열들은 태아에서 유래한 것이다. 예상되는 통계적 (계수) 오차는 약 1 %일 것이고, 이는 진단에 충분히 큰 S/N으로 고려된다.
본 발명의 방법의 구현은, 특히 단일-분자 레벨에서 실시간 핵산 상호작용을 탐침하도록 설계된 디바이스들의 존재에 의해 가능해질 수 있었다. 이러한 디바이스는, 예를 들어 미국 특허 제 7,052,650호 및 제 7,244,391호에 기재되어 있다. 여기에 기재된 장치는 미크론-크기의 초상자성 비드(superparamagnetic bead)에 피코뉴턴 스케일의 힘을 가하도록 자기 트랩(magnetic traps)을 사용한다. 간단히 말해서, 상기 장치는 광학 현미경, 자석 및 PC를 포함한다. 이중-가닥 핵산 분자들은 한 말단에서의 다수 지점들에서 부동 요소(motionless element), 예를 들어 표면에 고정되고, 다른 말단에서는 이동가능한 표면, 이 경우에는 자기 비드에 고정된다. 자석들은 비드에 작용하기 위해 제공된다. 특히, 자석들은 표면으로부터 비드를 당기기 위해 사용될 수 있다. 하지만, 본 발명의 방법의 구현은 상기의 장치로 제한되지 않는다. 본 발명의 방법을 구현하기 위해, 이를 완전히 신장시킨 다음 이중 가닥 핵산의 분자를 다시 접고(refold), 이와 동시에 상기 분자의 신장을 모니터링할 수 있는 여하한의 디바이스가 사용될 수 있다. 예를 들어, 광학 족집게(optical tweezer)들이 사용될 수 있다; 하지만, 광학 족집게들은 사전 힘 교정을 필요로 하며, 높은 수율 측정들에 대해 쉽게 병렬화되지 않는다. 추가적인 단점들로는 핵산의 총 비틀림 제어의 부족, 및 혼성화 조건들을 변경시킬 수 있는 포커스된 레이저에 의해 발생할 수 있는 용액의 국부적 가열이 있다.
이중 가닥 핵산은 적당한 비드들(예를 들어, 스트렙타아비딘 코팅된 비드들)의 용액에서 수 분 동안 배양되며, 이는 그 표지된(예를 들어, 비오틴) 말단들 중 하나에 의해 비드들에 결합된다. 비드들은 광학 족집게들이 이후 조작을 위해 사용되는 경우 투명할 수 있으며, 또는 조작을 위해 자기 트랩 또는 족집게들을 이용하는 경우에는 자성을 띨 수 있다.
비드-핵산 조립체는 유체 챔버 내에 주입되며, 그 표면은 분자의 다른 표지된 말단을 결합시키도록 처리되었다[예를 들어, 안티-Dig(anti-Dig)로 코팅된 표면은 핵산의 Dig-표지된 말단(Dig-labeled end)을 결합시킴]. 따라서, 비드들은 핵산 헤어핀을 통해 표면에 고정되며, 도 1a를 참조한다. 그 후, 표면과 비드의 간격은 당업자에게 알려진 다양한 수단들에 의해 모니터링되며; 예를 들어, 이 간격을 추론하기 위해 카메라 상의 이들 이미지의 회절 링들이 사용될 수 있거나, 이 간격을 측정하기 위해 에바네센트 모드(evanescent mode)로 조명될 때 이들이 산란하는(또는 형광에 의해 방출하는) 광 세기가 사용될 수 있다. 대안적으로, 고정 표면 상의 센서에 대한 이 간격을 추론하기 위해, (GMR 또는 Hall 센서들과 같은 자기 센서를 이용하여) 이들이 생성하는 자기장이 측정될 수 있다.
표면에 비드들을 고정하는 핵산 분자를 당기기 위해 다양한 기술들이 개시되어 있다. 하나는 포커스된 레이저 빔의 광을 이용하여 초점 부근에 투명한 비드를 트랩(trap)시키는 기술이다. 고정 표면에 대한 빔의 상대적인 이동(relative translation)에 의하여, 테더링 분자(tethering molecule)에 힘을 가할 수 있다(통상적인 광학 족집게 어세이). 그 평형 위치로부터의 비드의 변위(displacement)에 비례하는 가해진 힘은, 테더링 분자에 일정한 힘을 가하기 위해 트랩핑 빔(trapping beam)에 대한 피드백 루프를 필요로 한다.
비드에 일정한 힘을 가하기 위해, 비드 주위의 유동에 의해 생성된 유체역학 항력(hydrodynamic drag)의 이용이 개시되었지만, 이는 통상적으로 낮은 공간 정확성(> 100 nm)을 산출한다. 바람직한 실시예는 상기에 설명된 바와 같이 핵산 헤어핀에 의해 표면에 고정된 초상자성 비드들을 당기기 위해 자기 트랩을 이용한다. 이 구성에서는, 샘플 위에 배치된 작은 자석들이 고정된 비드에 일정한 힘을 가하는데 사용되며, 그 위치는 [유체역학 항력으로 인한 소산(dissipation) 및 당기는 힘에 따라] < 1 nm 정확성으로 결정될 수 있다.
매 경우마다, 약 16 pN보다 큰 힘으로 비드들을 당김으로써 테더링 헤어핀이 기계적으로 완전히 열릴 수 있다는 것을 알 수 있다. 분자의 장력을 약 11 pN 아래로 감소시키면, 헤어핀이 자발적으로 다시 닫힐 수 있다[지퍼를 여는 전이(unzipping transition)는 이력현상(hysteretic)을 통해 가역적임]. 열리는(unzipped) 단계 동안 (단백질, 또는 DNA, RNA, LNA 또는 PNA의 상보적인 올리고뉴클레오티드들과 같은) 용액 내 몇몇 분자들이 신장된 외가닥 핵산과 결합한 경우, 이 분자들은 힘이 11 pN 아래로 낮춰질 때 헤어핀이 다시 닫히는 것을 차단할 것이다. 따라서, 어세이의 원리는 두 힘: 즉, 헤어핀을 여는 큰 힘(Fopen)과 다시 닫히는 것을 허용하고 일시적인 차단에서 분자의 신장을 측정하는데 사용되는 더 작은 힘(Ftest) 사이에서 전환하는 것이다. 차단 위치는 완전 신장과 차단된 것 사이의 선형 관계에 의한 서열과 관련된다. 최적의 정확성을 위해, 완전 신장은 테스트 힘(Ftest)에서 측정되는 것이 바람직하다. 이는 일단 힘이 Fopen으로부터 Ftest로 감소되면, 다시 접는데 몇 분의 1초(fraction of a second)를 필요로 하도록 헤어핀 루프를 설계함으로써 달성된다.
표면들 또는 운반체들에 핵산들을 부착하기 위해, 해당 기술분야에 알려진 기술들 중 어느 하나를 이용할 수 있다. 본질적으로, 핵산은 운반체, 예를 들어 마이크로-비드에 직접 고정되며, 이는 예를 들어 핵산의 기능화된 말단과 반응할 수 있는 스트렙타아비딘, COOH기 및 이와 유사한 것들로 이를 코팅함으로써 이 표면의 기능화(functionalization)에 관여한다.
이러한 방법들은 일반적으로 핵산, 특히 3' 및 5' 말단들을 기능화하는 것, 다시 말해 적절한 화학기(chemical group)들을 말단들에 접목하는 것을 필요로 한다. 게다가, 작업의 종료 시에 가닥들이 분리되는 것을 방지하기 위하여 루프에 의해 분자의 다른 2 개의 자유 말단들을 연결하는 것이 바람직할 수 있으며, 적절하다면 이러한 작업은 반복될 수 있다. 이를 위해, 상이한 절차들이 채택될 수 있다.
가장 간단하게는, 합성 올리고뉴클레오티드들을 이용하여, 두 개의 상이한 전-처리된 표면들에 고정을 허용하는 두 개의 상이한 기능(예를 들어, 비오틴 및 아민)을 갖는 이중 가닥 핵산의 말단들 중 하나를 기능화하는 것이다. 다른 말단에서의 두 개의 가닥은 루프의 형태로 부분적으로 접합된 합성 뉴클레오티드를 이용하여 연결될 수 있다. 이러한 방식으로, 접합된 외가닥 핵산, 즉 헤어핀이 이중 가닥 핵산으로부터 생성된다. 이 방법의 장점은 (유전자 또는 염색체의 분별에 의해 얻어지는 바와 같이) 큰 핵산 단편들의 이종 개체(heterogeneous population)를 기능화할 수 있는 능력을 갖는다는 점이며, 그 후 이는 동시에 분석될 수 있다. 이 경우, 핵산 샘플은 두 개(또는 그 이상)의 제한 효소들을 이용하여 분별되며, 이는 모든 단편들에 걸쳐 유사한 그 말단들에서 두 개의 상이한 제한 부위들로 하위개체(subpopulation)가 얻어질 수 있게 한다. 이는 두 개의 말단들이 (예를 들어, 그 말단에서 적절한 제한 부위를 점유한 루프의 형태로 올리고뉴클레오티드에 한 말단을 연결함으로써) 상이하게 처리될 수 있게 한다. 이 방법의 단점은 두 개의 인접한 작용기들 간에 입체 간섭(steric interference)이 있다는 것이며, 이는 표면들과의 결합을 어렵게 만들 수 있다. 이 문제를 해결하기 위해서는, 헤어핀 분자의 각 자유 말단에 염기들의 "스페이서(spacer)" 염기서열을 추가하는 것이 유리할 수 있으며, 그 후 그 말단에 작용기가 추가된다; 두 개의 스페이서 서열들은 비-상보적이며, 그 전용 표면(dedicated surface)에 결합하도록 충분한 공간을 각각의 작용기에 제공한다. 더 유리하게는, 각각의 스페이서 서열의 서열은 본 발명의 염기서열화 방법에서 알려진 서열의 외가닥 서열 프라이머들을 이용하기 위해 설계된다. 이중 가닥 핵산 분자들에 대한 루프 및/또는 스페이서들의 추가는 분자 생물학에서 보편적으로 사용되는 방법들 중 어느 하나에 따라 수행될 수 있다. 이 방법들은 당업자에게 잘 알려져 있으므로, 여기서 자세히 설명하지 않기로 한다.
실제 고정 기술들에 관해서는, 다수의 기술이 존재하며, 이들은 상업적으로 이용가능한 전처리된 표면들에 고분자(단백질, DNA 및 이와 유사한 것들)를 고정하기 위한 기술들로부터 도출된다. 이 기술들의 대부분은 단백질의 카르복실(--COOH) 또는 아민(--NH2) 말단들과 반응할 수 있는 표면 공여기들(surfaces carrying groups)(--COOH, --NH2, --OH 및 이와 유사한 것들)에 대한 링크 단백질(면역글로불린) 및 면역학 테스트에 대해 개발되었다.
핵산의 공유결합 고정(covalent anchoring)은 분자의 5' 말단의 유리된 포스페이트(free phosphate)를 통해 직접적으로 달성될 수 있으며, 이는 공유 결합을 형성하기 위해 이차 아민[스트라스부르(Strasbourg)에서 Polylabo사에 의해 판매되는 Covalink --NH 표면]과 반응한다. 또한, 아민기로 DNA를 기능화한 후, 단백질과 함께 진행하는 것도 가능하다.
또한, 스트렙타아비딘(Dynal 비드, 및 이와 유사한 것들)으로 코팅된 표면들이 존재하며, 이는 스트렙타아비딘과 비오틴화된 DNA 분자 사이에 준-공유결합 고정을 허용한다. 마지막으로, (상기에 언급된 방법들에 의해) 디곡시제닌(digoxigenin)에 대해 지향된 항체를 표면에 접목시킴으로써, 디곡시제닌으로 기능화된 핵산이 여기에 고정될 수 있다. 이는 단지 다수의 가능한 고정 기술들의 일례를 나타낸다.
부착 및 고정 기술들 중에서, 예를 들어 셀룰로오스와 같은 고체 운반체에 DNA를 부착하기 위해 효소 결합을 이용하는 유럽 특허 EP 152 886에 개시된 기술들도 언급된다.
유럽 특허 EP 146 815 또한 운반체에 DNA를 부착하는 다양한 방법들을 기재하고 있다.
이와 유사하게, 특허 출원 WO 92/16659는 중합체를 이용하여 DNA를 부착하는 방법을 제안한다.
당연히, 핵산은 운반체에 직접 부착될 수 있지만, 필요하다면 특히 표면들의 영향을 제한하는 견지에서, 핵산은 예를 들어 유럽 특허 EP 329 198에 개시된 바와 같이 펩티드 또는 다른 성질의 불활성 부문(inert arm)의 말단에 부착될 수 있다.
아래의 예시들은 본 발명의 다른 특징들 및 장점들이 쉽게 이해될 수 있도록 할 것이다.
도 1. 재혼성화 중 올리고뉴클레오티드-유도 차단의 검출. (a) 스템(stem) 내에 사전-이식된 표적을 갖는 헤어핀 구조 설계. (b) 83 bps 헤어핀 상의 두 개의 올리고뉴클레오티드들의 혼성화로 인한 장애(roadblocks)의 예시(방법들을 참조). 왼쪽 패널: Fopen = 17.8 pN(오렌지색) 및 Ftest = 11.4 pN[파란색; 맨 위에 힘의 자취(force trace)를 참조]에서 기록된 실험 결과들(Experimental traces). 다섯 개의 상이한 신장 수치들(extension levels)이 관찰되었고: 위에서 아래쪽으로 (i) Fopen에서 헤어핀의 열림, (ii) Ftest에서 헤어핀의 열림, (iii) 제 1 올리고에 의해 차단된 부분적으로 어닐링된(annealed) 헤어핀, (iv) 제 2 올리고에 의해 차단된 부분적으로 어닐링된 헤어핀 및 (v) 접힌 헤어핀에 대응된다. 검은색 곡선은 원 데이타(raw data)의 1 s 평균에 해당한다. 오른쪽 패널: 차단 (ii) 내지 (iv)의 히스토그램. 검은색 곡선은 Ftest에서 재혼성화에 의해 주어진 헤어핀의 신장에 있어서 사이클 당 차단 횟수에 대한 히스토그램을 나타낸다: 단일 헤어핀 상에서 ~23 힘 사이클(force cycles)로부터 얻어지는 염기쌍에서의 ΔΖ = Zblock - Zclose. 데이타에 피팅된(fit) 가우시안(Gaussian)은 빨간색으로 나타낸다. 이러한 피팅의 변화량(σ~1 nm)은 장치의 분해능을 정의한다. 장애(roadblocks) Zblock1 및 Zblock2는 헤어핀을 따라서 39.60 및 28.66 bps에서 관찰되고, (초록색으로 나타낸) 예상된 40 및 29 bps의 위치와 잘 일치한다.
도 2. 혼성화에 의한 서열 식별. (분자 1, 분자 2, 분자 3으로 표시된) 세 개의 상이한 헤어핀들이 (올리고 1 및 올리고 2로 표시된) 두 개의 상이한 올리고들에 의해 식별되었다. 왼쪽 패널: 헤어핀의 열림/닫힘 사이클 중에 기록된 실험 결과들. 대응하는 차단을 나타내기 위하여, 올리고 1 및 올리고 2가 순차적으로 용액 내로 첨가되었다: 올리고 1은 분자 2와 분자 3에 혼성화되었고, 동시에 올리고 2는 분자 1과 분자 2에 혼성화되었다. 오른쪽 패널: 분자의 완전 신장(full extension)을 회색 음영으로 나타내는 동시에, 각각의 분자에 대하여 올리고 1(오렌지색) 및 올리고 2(파판색)로부터의 차단의 히스토그램.
도 3. 단일 헤어핀에 의해 유리 표면에 부착된 많은 비드들을 나타내는 카메라 시야. 이들은 선홍색 LED로부터의 평행한 조명을 사용하여 현미경 관찰에 의해 시각화된다. 비드들을 둘러싼 작은 회절 고리들은 이들의 수직 위치를 측정하는데 사용된다.
도 4. 헤어핀 설계를 나타내는 도식.
도 5. mRNA로부터 cDNA 헤어핀 구조를 발생시키는 도식.
실시예들
방법
DNA 헤어핀 구성( construction )
짧은 DNA 헤어핀들(도 1 및 도 2에서 83 bps, 또는 도 2에서 179 bps)은 도 4에 나타낸 바와 같이 세 개의 개별적인 합성 올리고뉴클레오티드들(Eurogentec사 및 Integrated DNA technology사)을 결찰시킴으로써 구성되었다. 제 1 단계에서, 올리고 A-1(SEQ ID NO. 3: 5'-비오틴-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTG GAT TCG CGG GTC TCT-3') 및 올리고 A-2(SEQ ID NO. 4: 5'-AAC CGT CCT TTA CTT GTC ATG CGC TCT AAT CTC TGG GCA TCT GGC TAT GAT GTT GAT GGA ACT GAC CAA ACG TCG GTG GG-3')는 5분간 95 ℃까지 가열하고, 그 후에 80 ℃까지 급속히 냉각시키고, 이후에 4 ℃가 될 때까지 매 10 s마다 0.7 ℃씩 천천히 감소시킴으로써 dH20 내에서 상보적인 올리고 A-3(SEQ ID NO. 5: 5'-인산화된-AGG AAG AGA CCC GCG AAT CCC CCA CCG ACG TTT GGT CAG TT-3')로 어닐링되었다. part A로 표시된, 이러한 어닐링된 생성물들은 NucleoSpin Extract Ⅱ 키트(kits)[Clontech사]에 의해 세정되었다. 83 bps 헤어핀의 중간 부분에 대응하는, 올리고 B-1(SEQ ID NO. 6: 5'-인산화된-TCC TGA TTG TCA TCG GCT GGC TGT TCG GTT AGT TTC GAA GAC TT-3') 및 올리고 B-2(SEQ ID NO. 7: 5'-인산화된-GCG AAA GTC TTC GAA ACT AAC CGA ACA GCC AGC CGA TGA CAA TC-3')에 대한 어닐링 및 세정 과정, 또는 179 bps 헤어핀의 중간 부분에 대응하는, 올리고 B'-1(SEQ ID NO. 8: 5'-인산화된-TCC TCG TGC GTG AGC GAG CGC GGT CGG TCG GTC GGT AGC GAG CGC GTG CGT GCG TGC GTG GGC TGG CTG GCT GGC TCG GTC GGT CGT GCG TGC GGT CGG TGG CTG GCT AGC GAG CGA GCG AGC GGG CTG GCT GAA GAC TT-3') 및 올리고 B'-2(SEQ ID NO. 9: 5'-인산화된-GCG AAA GTC TTC AGC CAG CCC GCT CGC TCG CTC GCT AGC CAG CCA CCG ACC GCA CGC ACG ACC GAC CGA GCC AGC CAG CCA GCC CAC GCA CGC ACG CAC GCG CTC GCT ACC GAC CGA CCG ACC GCG CTC GCT CAC GCA CG-3')에 대한 어닐링 및 세정 과정을 반복하였다. 이러한 어닐링된 생성물은 part B 또는 B' 또는 B"로 표시되었다. part A, part B (또는 part B', B")를 25 ℃에서 1.5 시간 동안 1×T4 연결효소(ligase) 반응 완충용액 내에서 T4 연결효소(5 U/㎕, Fermentas사)를 사용하여, 헤어핀의 루프인 올리고 C(SEQ ID NO. 10: 5'-인산화된-TCG CGC CTG ATC GTC CAC TTT TTT TTT AGT GGA CGA TCA GGC-3')에 결찰하고, 그 후에 20분간 65 ℃까지 가열함으로써 반응을 멈추었다. 결찰 혼합물은 NucleoSpin Extract Ⅱ 키트로 세정되었다. 마지막으로, 디곡시제닌 표지(digoxigenin labels)는 37 ℃에서 15분간 1 mM 디곡시제닌-dUTP를 포함하는 1×NEB2 완충용액(Roche사) 내에서 클레노브 효소(Klenow)[3→5' exo-]를 사용하여 필-인 반응(fill-in reaction)에 의해 첨가되고, 20분간 75 ℃까지 가열함으로써 멈추었다. 헤어핀 생성물들은 NucleoSpin Extract Ⅱ 키트로 다시 세정되었다.
1241 bps 헤어핀에 대한 제조 방법(도 2)은 Manosas et al. (Nat . Chem . Biol. 5: 904-912, 2009)에 기재되어 있다.
단일-분자 어세이
한쪽 말단에 디곡시제닌으로 표지되고 다른 한쪽 말단에 비오틴으로 표지되어, 구성된 헤어핀은, 사전에 항-디곡시제닌으로 코팅되고 소 혈청 알부민(bovine serum albumin: BSA)으로 부동태화(passivated)된 현미경의 유체 챔버(microscope flow chamber)의 유리 표면, 및 스트렙타아비딘으로 코팅된 1 ㎛ 초-상자성 비드에 부착되었다. 비드들에 부착된 단일 DNA 분자들을 당기기 위해 작은 자석이 사용되었다. 분자의 신장[Z(t)]은 31 Hz에서 CCD 카메라에 의해 포착되었다. 원 데이타는 ~1 nm의 분해능을 얻기 위하여 1 s로 나누어 평균을 내었고, 동시에 신장력(stretching force) F은 10 % 정확성으로 측정되었다. 데이타를 수집하는 동안, 수직 위치 자취(vertical position traces)[Z(t)]에서 표면에 부착된 기준 비드들의 수직 위치(Zref)를 빼고, 이는 설정 드리프트(set-up drift)를 감소시키는데 도움을 준다. 모든 열림/닫힘 사이클에 대하여, Zclose(Ftest)에 피팅된 가우시안의 중심점(<Zclose>)을 닫힌 헤어핀의 기준 위치(신장 0 nm)로서 삼았다. 유사한 가우시안 피팅은 Zopen(Ftest) 및 Zblock(Ftest)의 한 사이클에서 평균적인 위치를 결정하는데 이용된다. 에러 바(error bars)는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 2에서 혼성화 식별을 위하여, 분자 1은 1214 bps 헤어핀이고, 분자 2는 83 bps 헤어핀이며, 그리고 분자 3은 179 bps 헤어핀인 동시에, 올리고 1은 SEQ ID NO. 11: 5'-GAAGAGACCC-3'이고, 올리고 2는 SEQ ID NO. 12: 5'-CAGCCGATGAC-3'이다.
결과들
헤어핀의 다시 지퍼를 닫는( rezipping ) 경로에 있어서의 장애 검출
본원 접근법에서, DNA 헤어핀은 한쪽 말단에서 디곡시게닌 (Dig)-안티-Dig 결합을 통하여 커버슬립(coverslip)에 부착되고, 그리고 다른 한쪽 말단에서 비오틴-스트렙타아비딘 결합을 통하여 자성 비드에 부착된다. 이런 DNA 헤어핀은 다양한 방식으로 만들어 낼 수 있다. 예를 들어, 한쪽 말단에서 게놈 DNA 단편을 DNA 루프에 결찰시키고, 다른 한쪽 말단에서 비오틴 및 Dig에 의해 표지된 DNA 포크 구조(fork structure)에 결찰시킴으로 형성될 수 있다(도 1a). 대안적으로, 이 헤어핀은 폴리-T 코팅된 비드들 상에 mRNAs을 트랩핑(trapping)하고 역전사한 후에 얻어지는 cDNA로부터 만들어 낼 수 있다.
샘플의 주변의 작은 자석들은 묶여진 비드들 상에 수직력을 가하는데 사용된다. 비드에서 표면까지의 거리(즉, 헤어핀의 끝과 끝의 거리)는 비드의 영상으로부터 실시간으로 추정될 수 있다(Gosse & Croquette, Biophys . J., 82: 3314-3329, 2002). 대안적으로, 비드에 의해 산란되는 빛의 세기로부터 에버네센트 필드 조명 (evanescent field illumination)을 이용하여 추정될 수 있다. 설정(set-up)은 광학 족집게로 실시되는 DNA 지퍼를 여는 실험과 유사한 동시에(Brower-Toland et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 99: 1960-1965, 2002), 자석 트랩(magnetic trap)의 사용은 많은 분자들 상에 동일한 힘의 동시 적용을 통해 고도의 유사성을 가질 수 있다(Gosse & Croquette, Biophys . J., 82: 3314-3329, 2002; Strick et al., Science, 271: 1835-1837, 1996).
헤어핀의 부분에 상보적인 올리고뉴클레오티드들을 함유하는 용액 내에서 DNA 헤어핀들을 주기적으로 열리고 닫히도록 힘을 조절한다(Essevaz-Roulet et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 94: 11935-11940, 1997). 도 1b에서, 83 bps 헤어핀은 힘 F open (> 15 pN)을 가함으로써 주기적으로 펴지고, 힘을 F test (~10 pN)로 감소시킴으로써 다시 지퍼를 닫는다(rezipped). 펼쳐진 상태 또는 열린 상태에서, 용액 내의 두 개의 상이한 올리고뉴클레오티드들은 헤어핀 상의 이들 각각의 상보적인 서열들과 혼성화될 수 있다. 이들은 작은 힘으로 헤어핀의 재접힘을 일시적으로 차단하고, 이는 헤어핀의 재접힘 중에 헤어핀의 신장에 있어서 두 번의 멈춤(two pauses)으로 쉽게 관찰할 수 있다.
이런 측정 방법(measurement scheme)은 두 가지 유익한 정보: 헤어핀을 따라서 차단의 위치 및 수명을 제공한다. 한 개의 염기쌍의 열림은 약 0.85 nm의 헤어핀 신장의 변화를 야기한다. 장치의 현 분해능(~1 nm)에 의해서, 따라서 약 하나의 뉴클레오티드의 정확도로 차단의 위치를 기록할 수 있다. 헤어핀의 열린 상태 및 닫힘 상태 사이의 전환은 느린 실험 드리프트(experimental drifts)에 영향을 받지 않는(insensitive) 상이한 신장 측정을 제공한다는 것에 주목한다. 게다가, 적용된 힘의 정확한 값은 일정하게 유지되는 한은 중요하지 않다.
혼성체의 안정성에 관련된 차단 수명에 관하여, 이는 적용되는 장력, 상보적인 올리고뉴클레오티드들의 크기, 및 올리고뉴클레오티드와 헤어핀 간의 염기쌍 오류(mismatches)의 존재 및 위치에 달려있다는 것을 알아냈다(데이타는 나타내지 않음).
단일 사이클 결찰 또는 혼성화 지문( hybridization fingerprinting )에 의한 서열 식별
주어진 샘플 내에서 원하는 DNA 식별은 유전적 돌연변이, 유전자 중복, mRNA 발현 패턴 등과 같은 다양한 상황들과 관련있는 사안이다. 본원의 방법에 의하면 이러한 식별 문제는 매우 쉽다. DNA 헤어핀 샘플 상에서 선택된 짧은(~10 nt) 올리고뉴클레오티드의 세트(set)에 의해 얻어지는 주어진 혼성화 지문의 검출을 필요로 한다. 이는 하나 또는 약간(a few)의 탐침 올리고뉴클레오티드(들)의 존재 하에서 헤어핀들의 재혼성화 동안 차단에 대하여 검사함으로써 달성될 수 있다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 세 개의 상이한 DNA 서열들의 식별은 두 개의 상이한 올리고뉴클레오티드들의 혼성화에 의해 달성될 수 있다. 혼성화의 정확한 위치를 검출할 수 있기 때문에, 일반적으로 실시되는 것처럼 연속적으로 각각의 탐침을 검사할 필요가 없다는 것에 주목한다. 오히려, 선택된 몇몇 탐침들의 헤어핀을 따라 차단 위치들을 식별할 수 있고, DNA 서열의 지문으로서, 혼성체들의 단순한 존재 대신에, 이런 혼성화 패턴을 이용할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS) ECOLE NORMALE SUPERIEURE UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE (PARIS 6) <120> METHOD OF DNA DETECTION AND QUANTIFICATION BY SINGLE-MOLECULE HYBRIDIZATION AND MANIPULATION <130> D29955 <140> PCT/EP2012/076644 <141> 2012-12-21 <150> EP 11306743.3 <151> 2011-12-22 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 1 acagccagc 9 <210> 2 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 2 atgacaatca g 11 <210> 3 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide A-1 <220> <221> misc_binding <222> (1)..(1) <223> 5'-Biotinylation <400> 3 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ggattcgcgg 60 gtctct 66 <210> 4 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide A-2 <400> 4 aaccgtcctt tacttgtcat gcgctctaat ctctgggcat ctggctatga tgttgatgga 60 actgaccaaa cgtcggtggg 80 <210> 5 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide A-3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5'-phosphorylated <400> 5 aggaagagac ccgcgaatcc cccaccgacg tttggtcagt t 41 <210> 6 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide B-1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5'- phosphorylated <400> 6 tcctgattgt catcggctgg ctgttcggtt agtttcgaag actt 44 <210> 7 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide B-2 <220> <221> misc_feature <223> 5'-phosphorylated <400> 7 gcgaaagtct tcgaaactaa ccgaacagcc agccgatgac aatc 44 <210> 8 <211> 140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide B'-1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5'-phosphorylated <400> 8 tcctcgtgcg tgagcgagcg cggtcggtcg gtcggtagcg agcgcgtgcg tgcgtgcgtg 60 ggctggctgg ctggctcggt cggtcgtgcg tgcggtcggt ggctggctag cgagcgagcg 120 agcgggctgg ctgaagactt 140 <210> 9 <211> 140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide B'-2 <220> <221> misc_feature <223> 5'-phosphorylated <400> 9 gcgaaagtct tcagccagcc cgctcgctcg ctcgctagcc agccaccgac cgcacgcacg 60 accgaccgag ccagccagcc agcccacgca cgcacgcacg cgctcgctac cgaccgaccg 120 accgcgctcg ctcacgcacg 140 <210> 10 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide C <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5'-phosphorylated <400> 10 tcgcgcctga tcgtccactt tttttttagt ggacgatcag gc 42 <210> 11 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 11 gaagagaccc 10 <210> 12 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 12 cagccgatga c 11

Claims (21)

  1. 샘플 내의 특정한 핵산 서열을 포함하는 일종의 이중 가닥 핵산 분자들을 정량화(quantifying)하는 방법에 있어서, 상기 방법은:
    a) 상기 이중 가닥 핵산 분자들에 물리적 힘을 가함으로써 상기 샘플 내의 상기 분자들을 변성시키는 단계;
    b) 상기 서열에 대응하는 외가닥 핵산 분자를 제공하는 단계;
    c) 상기 외가닥 핵산 분자의 존재 하에서 상기 a) 단계의 상기 변성된 이중 가닥의 핵산 분자를 복원시키는 단계;
    d) 복원이 차단된 이중 가닥 핵산 분자들을 검출하는 단계; 및
    e) 상기 d) 단계의 상기 이중 가닥 핵산 분자를 세는 단계를 포함하는 방법.
  2. 샘플 내의 하나 이상의 특정한 핵산 서열을 포함하는 일종의 이중 가닥 핵산 분자들을 정량화하는 방법에 있어서, 상기 방법은:
    a) 상기 이중 가닥 핵산 분자들에 물리적 힘을 가함으로써 상기 샘플 내의 상기 분자들을 변성시키는 단계;
    b) 상기 하나 이상의 서열에 대응하는 하나 이상의 외가닥 핵산 분자를 제공하는 단계;
    c) 상기 외가닥 핵산 분자의 존재 하에서 상기 a) 단계의 상기 변성된 이중 가닥 핵산 분자를 복원시키는 단계;
    d) 상기 하나 이상의 외가닥 핵산 분자들에 의해서 복원이 차단된 이중 가닥 핵산 분자들을 검출하는 단계; 및
    e) 상기 d) 단계의 상기 이중 가닥 핵산 분자들을 세는 단계를 포함하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 이중 가닥 핵산 분자가 헤어핀인 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이중 가닥 핵산의 가닥들의 하나 중 적어도 하나의 염기들은 표면에 직접 또는 간접적으로 부착되고, 상기 이중 가닥 핵산의 다른 가닥의 적어도 하나의 염기들은 이동가능한 표면에 부착되는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이중 가닥 핵산은 운반체(support)들을 멀리 이동시킴으로써 상기 a) 단계에서 변성되는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 운반체들을 멀리 이동시킴으로써 15 pN 이상, 바람직하게는 17 pN 이상, 더욱 바람직하게는 18 pN 이상인 물리적 힘이 상기 이중 가닥 분자에 적용되는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변성된 이중 가닥의 핵산이 상기 c) 단계에서 상기 운반체들을 접촉시킴으로써 복원되는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 운반체들을 접촉시킴으로써 상기 이중 가닥 분자에 가해진 힘이 12 pN 이하, 바람직하게 11 pN 이하, 더욱 바람직하게 10 pN 이하로 감소되는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    운반체에 부착되지 않은 상기 이중 가닥 핵산의 말단들이 서로 공유결합 또는 비-공유결합으로 연결되는 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 a) 단계 내지 d) 단계가 (신호/잡음 비를 증가시키고 측정들을 축적하기 위하여) 여러 번 반복되는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 d) 단계의 검출은 상기 운반체에 부착된 상기 이중 가닥 핵산 분자의 두 개의 말단들 사이에 거리(z)를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 이중 가닥 핵산 분자가 변성된 때, 상기 운반체에 부착된 상기 이중 가닥 핵산 분자의 두 개의 말단들 사이에 거리(Zhigh)를 측정하는 단계를 더 포함하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    a) z 및 zhigh를 비교하는 단계, 및
    b) 차단 위치를 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 차단의 지속 기간을 측정하는 단계를 더 포함하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 차단 지속 기간을 기준값과 비교하는 단계를 더 포함하는 방법.
  16. 샘플 내 유전자 발현을 측정하는 방법에 있어서, 상기 방법은:
    a) 상기 샘플 내에 존재하는 RNA 분자들의 복제에 의해 이중 가닥 핵산 분자들을 합성하는 단계; 및
    b) 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 상기 유전자에 대응하는 mRNA 분자 종들(species)을 정량화하는 단계를 포함하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 이중 가닥 핵산 분자들이 역전사에 의해 합성되는 방법.
  18. 제 16 항 또는 제 17 항에 있어서,
    상기 역전사가 고체 표면에 부착된 폴리-T 올리고뉴클레오티드로부터 개시되는 방법.
  19. 시험체로부터의 생물학적 샘플 내의 특정 염색체 부분의 비정상적인 분포를 검출하는 방법에 있어서, 상기 방법은:
    a) 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 상기 특정 염색체 부분의 레벨(level)을 정량화하는 단계;
    b) 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 또 다른 염색체 부분의 레벨을 정량화하는 단계;
    c) 상기 a) 단계에서 얻어진 레벨과 상기 b) 단계에서 얻어진 레벨 간의 비율을 계산하는 단계; 및
    d) 상기 특정 염색체 부분이 비정상적으로 분포되었는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  20. 암을 앓고 있는 환자의 암 샘플에 대한 암의 진행 정도를 진단하는 방법에 있어서, 상기 방법은:
    a) 제 19 항의 방법에 의하여 상기 환자의 암 샘플 내에 특정 염색체 부분이 비정상적으로 분포되었는지 여부를 결정하는 단계; 및
    b) 상기 염색체 부분이 비정상적으로 분포되었으면 진행 정도를 진단하는 단계를 포함하는 방법.
  21. 임산부의 혈액 샘플로부터 태아의 이수성을 진단하는 방법에 있어서, 상기 방법은:
    a) 제 19 항의 방법에 의하여 상기 혈액 샘플 내에 특정 염색체 부분이 비정상적으로 분포되었는지 여부를 결정하는 단계; 및
    b) 상기 염색체 부분이 비정상적으로 분포되었으면 태아의 이수성을 진단하는 단계를 포함하는 방법.
KR1020147019931A 2011-12-22 2012-12-21 단일-분자 혼성화 및 조작에 의한 dna 검출 및 정량화의 방법 KR101917272B1 (ko)

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