CN105408495B - 通过茎环结构阻断3’dna末端的聚合酶延伸的方法 - Google Patents

通过茎环结构阻断3’dna末端的聚合酶延伸的方法 Download PDF

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Abstract

提供了用于阻断扩增子3’末端的聚合酶延伸的方法和组合物。

Description

通过茎环结构阻断3’DNA末端的聚合酶延伸的方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2013年4月26日提交的美国临时申请号61/816,431的优先权，该申请通过引用纳入本文用于所有目的。
联邦资助的研究与开发下作出发明的权利声明
本发明部分得到NHGRI资助号：1R43HG005144-01的支持。联邦政府可享有本发明的某些权利。
背景技术
核酸试验通常采用DNA聚合酶，以及任选的具体DNA探针来生成试验信号。例如，试验可采用标记的DNA寡核苷酸作为DNA聚合酶的引物。在这类试验中，DNA引物的结合和延伸在试验结果的评估中起到作用。引物依赖性聚合酶试验的潜在失效模式的一个示例是在没有引物杂交的情况下DNA聚合酶延伸的启动。这种失效可源于DNA靶分子或扩增子的自启动或由混合物中其它模板分子的启动。
发明内容
本文提供了用于防止聚核酸的3’末端启动聚合酶依赖反应的方法和组合物。该方法包括向核酸的3’末端添加结构以防止聚合酶延伸。
在一些实施方式中，提供了一种引物延伸产物所致假启动减少的进行引物延伸的方法。在一些实施方式中，该方法包括：
提供包含以下组分的反应混合物：
包含5’末端和3’末端的单链多核苷酸模板，所述多核苷酸模板在3’末端的6个核苷酸内包含5-25个核苷酸的双链茎；
引物，当该多核苷酸模板中存在靶序列则该云雾与该靶序列退火结合；和
聚合酶；
将反应混合物暴露于这样的条件即该条件下，当该靶序列存在则该引物与该靶序列退火且该聚合酶以模板依赖的方式延伸引物；并且
检测引物延伸产物的存在或量。
在一些实施方式中，靶序列存在于多核苷酸模板中。
在一些实施方式中，双链茎是茎环的部分，双链茎的两条链由环连接。在一些实施方式中，环包含1-10个核苷酸。在一些实施方式中，双链茎包含3’端并且茎的3’端毗连多核苷酸模板的3’末端。在一些实施方式中，双链茎包含3’端并且连接到茎的3’端是1-5个核苷酸，这些核苷酸不构成茎的部分并且位于多核苷酸模板的3’末端。
在一些实施方式中，由多核苷酸模板中的核苷酸序列形成双链茎的第一条链，该茎的第二条链是与之区分的与该核苷酸序列互补的反义寡核苷酸。在一些实施方式中，反义寡核苷酸经阻断不被聚合酶延伸(例如，寡核苷酸不包含3’-OH部分)。在一些实施方式中，双链茎包含3’端并且茎的3’端毗连多核苷酸模板的3’末端。
在一些实施方式中，多核苷酸模板包含猝灭剂/荧光标签对中的一成员并且抑制剂寡核苷酸与引物下游的多核苷酸模板退火，其中抑制剂寡核苷酸包含猝灭剂/荧光标签对中的第二员，由此，当抑制剂寡核苷酸与多核苷酸模板退火时，来自标签的信号被猝灭。在一些实施方式中，暴露包括用聚合酶来延伸引物，从而置换抑制剂寡核苷酸并使得猝灭剂/荧光标签对不猝灭从而生成荧光信号；并且检测荧光信号并将信号的量与靶序列的存在或量相关联。
在一些实施方式中，该聚合酶是DNA聚合酶。在一些实施方式中，该聚合酶是RNA聚合酶。在一些实施方式中，反应混合物中的核苷酸三磷酸整合到引物延伸产物中并且所述核苷酸三磷酸中的至少一些包含标签。在一些实施方式中，核苷酸三磷酸包含荧光标签和猝灭剂对，这样，当核苷酸三磷酸完整时，荧光标签被猝灭剂猝灭，而当核苷酸整合到引物延伸产物时荧光标签不猝灭。
也提供了包含5’末端和3’末端的单链多核苷酸，所述多核苷酸模板在3’末端的6个核苷酸内包含5-25个核苷酸的双链茎。
在一些实施方式中，双链茎是茎环的部分，双链茎的两条链由环连接。在一些实施方式中，环包含1-10个核苷酸。
在一些实施方式中，双链茎包含3’端并且茎的3’端毗连多核苷酸模板的3’末端。
在一些实施方式中，双链茎包含3’端并且连接到茎的3’端是1-5个核苷酸，这些核苷酸不构成茎的部分并且位于多核苷酸模板的3’末端。
在一些实施方式中，由多核苷酸模板中的核苷酸序列形成双链茎的第一条链，所述茎的第二条链是与之区分的与核苷酸序列互补的反义寡核苷酸。在一些实施方式中，反义寡核苷酸不包含3’-OH部分或者经阻断而不被聚合酶延伸。
在一些实施方式中，双链茎包含3’端并且茎的3’端毗连多核苷酸模板的3’末端。
在一些实施方式中，多核苷酸模板包含猝灭剂/荧光标签对中的一成员。
在一些实施方式中，单链多核苷酸长10-5000个核苷酸。
还提供了包含上述或本文其它地方所述的单链多核苷酸的反应混合物。在一些实施方式中，多核苷酸包含猝灭剂/荧光标签对中的一成员并且反应混合物还包含抑制剂寡核苷酸，其中抑制剂寡核苷酸包含猝灭剂/荧光标签对中的第二员，由此，当抑制剂寡核苷酸与多核苷酸退火时，来自标签的信号被猝灭。在一些实施方式中，反应混合物还包含以下中的至少一种(或全部)：DNA或RNA聚合酶；核苷酸三磷酸或脱氧核苷酸三磷酸；与单链多核苷酸中的靶序列退火的引物；或抑制剂寡核苷酸，其中抑制剂寡核苷酸包含猝灭剂/荧光标签对中的第二成员，由此，当抑制剂寡核苷酸与多核苷酸退火时，来自标签的信号被猝灭。
还提供了包含上述或本文其它地方所述的单链多核苷酸的试剂盒。
还提供了制备上述或本文其它地方所述的单链多核苷酸的方法。在一些实施方式中，该方法包括将包含模板核酸的核酸样品与DNA聚合酶和至少第一寡核苷酸引物接触以形成混合物，所述第一寡核苷酸引物包含茎环，所述引物具有5’末端和3’末端并且从5’末端到3’末端包含：任选的5’末端处不形成茎环部分的1-6个核苷酸，之后是形成茎环的前一半茎的核苷酸，之后是形成茎环的环的核苷酸，之后是形成与前一半茎环杂交的后一半茎的核苷酸，之后是在3’末端处与模板核酸互补的序列；并且将混合物暴露于这样的条件，即所述条件下，使得第一寡核苷酸引物的3’末端与模板核酸退火并且DNA聚合酶以模板依赖的方式延伸第一寡核苷酸引物的3’末端以形成包含模板核酸的互补物和第一寡核苷酸引物的单链扩增子，从而扩增模板核酸。在一些实施方式中，混合物还包含含有与单链扩增子互补的序列的第二寡核苷酸引物，并且其中暴露导致第二寡核苷酸引物与单链扩增子退火并用DNA聚合酶延伸第二寡核苷酸引物以形成与单链扩增子互补并在多核苷酸的5’末端处有茎环的多核苷酸，从而形成双链扩增子。
在一些实施方式中，第二寡核苷酸引物具有3’和5’末端，并且第二寡核苷酸引物包含在第二寡核苷酸引物的5’末端的3个核苷酸内结束的茎环。
在一些实施方式中，暴露包括聚合酶链反应(PCR)。
在一些实施方式中，第一或第二寡核苷酸包含标签，使得双链扩增子中的至少一条链包含标签。在一些实施方式中，标签带荧光。
在一些实施方式中，第一或第二寡核苷酸引物包含猝灭剂，使得双链扩增子中的至少一条链包含猝灭剂。
在一些实施方式中，茎的前一半和后一半各自有5-15个核苷酸。在一些实施方式中，2-6个核苷酸形成茎环的环。在一些实施方式中，在第一寡核苷酸引物的5’末端处仅一个核苷酸不形成茎环的部分。在一些实施方式中，在第一寡核苷酸引物的5’末端处的2个核苷酸不形成茎环的部分。
在一些实施方式中，位于第一寡核苷酸引物的3’末端处并与模板核酸互补的序列至少6个核苷酸长。
还提供了包含茎环的寡核苷酸引物，所述引物具有5’末端和3’末端并且从5’末端到3’末端包含：任选的5’末端处不形成茎环部分的1-6个核苷酸，之后是形成茎环的前一半茎，之后是形成茎环的环的核苷酸，之后是与茎环的前一半反向互补的茎环的后一半茎，之后是在3’末端处的序列(例如，与模板核酸互补)。
在一些实施方式中，茎的前一半和后一半各自有5-15个核苷酸。在一些实施方式中，2-6个核苷酸形成茎环的环。在一些实施方式中，在第一寡核苷酸引物的5’末端处仅一个核苷酸不形成茎环的部分。在一些实施方式中，在第一寡核苷酸引物的5’末端处的2个核苷酸不形成茎环的部分。在一些实施方式中，位于第一寡核苷酸引物的3’末端处并与模板核酸互补的序列至少6个核苷酸长。
还提供了包含上述或本文其它地方所述的寡核苷酸的反应混合物。在一些实施方式中，反应混合物还包含以下的一种或多种：DNA聚合酶；或具有与所述寡核苷酸引物不同的序列的第二寡核苷酸。
还提供了包含上述或本文其它地方所述的寡核苷酸的试剂盒。
定义
除非另有说明，本文所用的所有科技术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义。通常，本文所用的命名和下述细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学以及杂交中的实验室步骤均为本领域熟知和常用的。使用标准技术进行核酸和肽合成。按照本领域和各种通用参考文献所述的常规方法进行这些技术和步骤(通常参见，Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL)，第2版(1989)冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，纽约冷泉港(Cold SpringHarbor，N.Y.)，其通过引用纳入本文)，将它们引入本文全文中。本文所用的命名以及下述分析化学和有机合成中的实验室步骤均为本领域熟知且常用。
术语“扩增反应”指用于倍增核酸靶序列拷贝的任何体外方法。这类方法包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、DNA连接酶链反应(参见美国专利号4,683,195和4,683,202；《PCR方案：方法和应用指南》(Innis等编，1990))、(LCR)、QBeta RNA复制酶、和基于RNA转录(如TAS和3SR)的扩增反应以及本领域技术人员已知的其它反应。
“扩增”是指将溶解置于足以进行多核苷酸扩增的条件下的步骤(如果反应的所有组分是完整的)。扩增反应的组分包括，例如，引物、多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸等。术语“扩增”一般是指靶核酸的“指数”增长。然而，本文所用的“扩增”也可指核酸的选择靶序列数量的线性增长，如由循环测序所得。
术语“扩增反应混合物”是指包含用于扩增靶核酸的各种试剂的水性溶液。这些试剂包括酶、各种缓冲剂、盐、扩增引物、靶核酸和三磷酸核苷。扩增反应混合物还可包含稳定剂和其它添加剂以优化效率和特异性。根据上下文，混合物还可以是完整或不完整的扩增反应混合物。
“聚合酶链反应”或“PCR”是指靶双链DNA的特定区段或子序列以等比级数扩增的一种方法。PCR是本领域技术人员所熟知的；参见例如，美国专利号4,683,195和4,683,202；和《PCR方案：方法和应用指南》，Innis等编，1990。示例性PCR反应条件一般包括两个或三个步骤循环。两步骤循环具有变性步骤，之后是杂交/延长步骤。三步骤循环包括变性步骤，之后是杂交步骤，之后是分开的延长步骤。
“引物”是指与靶核酸上的序列杂交并且用作核酸合成的起始点的多核苷酸序列。引物可以是各种长度的并且通常长度小于50个核苷酸，例如长度为12-30个核苷酸。可基于本领域技术人员已知的原理设计用于PCR的引物的长度和序列，参见例如Innis等(同上)。
“模板”是指包含待扩增的多核苷酸、侧接的多核苷酸或一对引物杂交位点的多核苷酸序列。因此，“靶模板”包含侧接“正向”引物和“反向”引物的杂交位点的靶多核苷酸序列。
本文所用的“核酸”表示DNA、RNA、单链、双链、或更高度聚集的杂交基序及其任意化学修饰。修饰包括但不限于，提供整合入其它电荷、极化性、氢键、静电相互作用、与核酸配体碱基或核酸配体整体的连接点和作用点的化学基团的那些修饰。这类修饰包括但不限于，肽核酸(PNA)、磷酸二酯基团修饰(例如，硫代磷酸酯、甲基膦酸酯)、2′-位糖修饰、5-位嘧啶修饰、8-位嘌呤修饰、环外胺处的修饰、4-硫尿核苷的取代、5-溴或5-碘-尿嘧啶的取代、骨架修饰、甲基化、不常见的碱基配对组合如异碱基(isobases)、异胞苷和异胍(isoguanidine)等。核酸也可包含非天然碱基，如硝基吲哚。修饰还可包括3′和5′修饰，包括但不限于用荧光团(例如，量子点)或其他部分加帽。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语可用于表示其中一个或多个氨基酸残基是相应天然产生氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然产生的氨基酸聚合物和非天然产生的氨基酸聚合物。
“聚合酶”是指进行模板引导的多核苷酸(例如，DNA和/或RNA)合成的酶。该术语同时包括全长多肽和具有聚合酶活性的结构域。DNA聚合酶是本领域技术人员熟知的，包括但不限于从激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、滨海嗜热球菌(Thermococcus litoralis)和海栖热袍菌(Thermotoga maritime)分离或衍生的DNA聚合酶或其修饰版本。市售的聚合酶的其它示例包括，但不限于：克列诺片段(新英格兰生物实验室公司(New EnglandInc.)、Taq DNA聚合酶(凯杰公司(QIAGEN))、9°NTM DNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司)、Deep VentTM DNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司)、Manta DNA聚合酶(Enzymatics公司)、Bst DNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司)、和phi29 DNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司)。聚合酶包括DNA-依赖聚合酶和RNA-依赖聚合酶，如逆转录酶。已知至少5个DNA-依赖DNA聚合酶家族，虽然大多数落入A、B和C家族。各家族之间很少或没有序列相似性。大多数A家族聚合酶是可含有多重酶促功能(包括聚合酶、3′到5′外切核酸酶活性和3′到5′外切核酸酶活性)的单链蛋白质。B家族聚合物通常有具有聚合酶和3′到5′外切核酸酶活性的单个催化结构域，以及辅助因子。C家族聚合酶通常是具有聚合和3′到5′外切核酸酶活性的多亚基蛋白质。在大肠杆菌中，已经发现了3种类型的DNA聚合酶，DNA聚合酶I(A家族)、DNA聚合酶II(B家族)和DNA聚合酶III(C家族)。在真核细胞中，核复制中涉及3种不同的B家族聚合酶，DNA聚合酶α、δ和ε，并且A家族聚合酶，聚合酶γ用于线粒体DNA复制。其它类型的DNA聚合酶包括噬菌体聚合酶。相似地，RNA聚合酶通常包括真核RNA聚合酶I、II和III，和细菌RNA聚合酶以及噬菌体和病毒聚合酶。RNA聚合酶可以是DNA-依赖的和RNA-依赖的。
术语“标签”、“可检测标签”、“可检测部分”等术语是指可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组合物。例如，可用的标签包括荧光染料(荧光团)、发光剂、高电子密度试剂、酶(例如，ELISA中常用)、生物素、地高辛、32P和其它同位素、半抗原、以及可被检测的蛋白质(例如通过将放射性标签整合至肽中或或用于检测与肽特异性反应的抗体)。该术语包括单一标记试剂的组合，例如，提供独特可检测特征(例如，特定波长或波长组合下)的荧光团的组合。可以采用本领域已知的用于将标签偶联到需要的试剂的任何方法，例如，使用如下文献中所述的方法：Hermanson，《生物偶联技术》(Bioconiugate Techniques)1996，圣迭戈的学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)。
“茎环”，也称为“发夹”或“发夹环”，是指当线性链的第一部分中的互补碱基与相同链的第二部分中的碱基杂交时由单链寡核苷酸形成的二级结构。序列的第二部分中的序列与第一部分序列反向互补，从而能够杂交。
本文所用术语“分配”或“分配的”指将样品分隔为多个部分，或“分区”。分区可以是固体或液体。在一些实施方式中，分区是固体分区，例如微通道。在一些实施方式中，分区是液体分区，例如液滴。在一些实施方式中，液体分区(如液滴)是不互溶的液体(如水和油)的混合物。在一些实施方式中，液体分区(如液滴)是水性液滴，其被不互溶的运载体液体(如油)包围。
附图说明
图1显示了阻断多核苷酸假启动的3种可能实施方式。在图的上部，多核苷酸具有茎环结构，3’末端的最后几个核苷酸不形成茎。在图的中部，多核苷酸具有茎环结构，3’末端的多核苷酸形成茎的最后部分(多核苷酸的3’末端毗连茎的3’末端)。在图的底部，双链茎出现在多核苷酸的3’末端，但是环并不连接两条链。
图2显示了将3’茎环DNA结构加入扩增子作为几种添加3’茎结构的方法之一。如A部分所示，用PCR引物导入茎环结构。任选地对引物的5’末端进行设计，使其不会与茎结构杂交。图2的B部分显示了茎环引物的模板依赖延伸以形成扩增子的一条链。图2的C部分显示了第二引物的延伸，其与单链扩增子互补。这种延伸沿着原始引物序列继续。图2的D部分显示了与单链扩增子互补的所得多核苷酸。这种所得的序列含有茎环封闭的3’末端。注意到在第二引物也含有5’茎环结构的实施方式(未在图中显示)中，所得扩增子的两条链将具有茎环封闭的3’末端。
图3显示了使用在3’端附近具有3’茎环的模板多核苷酸的示例性链置换试验。如本文其它地方所述，茎环可以存在于非常靠近3’末端处或者可在3’末端处具有不是茎的部分的一些核苷酸(例如，1-6个)。在其它实施方式中，模板可具有没有连接两条链的环的双链茎。在图的上部，模板多核苷酸在5’末端处用荧光标记(*)并且包含猝灭剂(0)的抑制剂寡核苷酸退火。在图的中部，引物与模板多核苷酸中若存在的靶序列退火。在图的底部，用聚合酶延伸引物，从而置换抑制剂分子并且使得猝灭荧光标签(*)不猝灭。
发明详述
DNA模板中存在的聚合酶可延伸的3’末端可增加依赖于DNA-聚合酶延伸的试验中的背景噪音。本文所述的方法和组合物在扩增模板DNA的3’末端处提供了非启动的稳定茎环DNA结构或双链茎结构，从而降低或消除来自3’末端的假启动。然后可在引物延伸反应中使用在3’末端处包含茎或茎环结构的模板多核苷酸，在该反应中，聚合酶延伸与模板多核苷酸退火的引物而没有由模板的3’末端产生的假启动事件。
还提供了在改善的引物延伸方法中优选使用模板多核苷酸的各种方法及其中使用的反应混合物和试剂盒。
3’茎环多核苷酸
如上所述，在一些实施方式中，提供了在多核苷酸的3’末端处或附近有茎环的模板多核苷酸。发明人已经测试了这类茎环多核苷酸的几种变体并且发现茎环可与多核苷酸的3’末端毗连，或者在3’末端处，即在茎环之后可存在一些不是茎的部分的核苷酸。在两个实施方式中，减少了多核苷酸的3’末端的假3’启动，当在3’末端处存在一些不是茎的部分的核苷酸时观察到更大的减少。
因此，在一些实施方式中，多核苷酸可由几个部分组成：
茎环部分将包含形成前一半茎的序列，之后是形成环的多个核苷酸，之后是前一半茎的反向互补物。前一半茎和后一半茎通常会有完全相同的长度，但在一些实施方式中，一半茎可比另一半茎多一个核苷酸，使得当两半退火时，一半茎的一个核苷酸不退火并形成凸起。各半的茎可以是所需的任意尺寸，例如，5-15个核苷酸长，例如，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。环将具有至少一个核苷酸，并且在一些实施方式中，换具有2-6个，例如，2、3、4、5或6个核苷酸。在一些实施方式中，茎将具有至少40℃、45℃、50℃、55℃、60℃或65℃的熔解温度(Tm)。在一些实施方式中，例如，Tm比引物延伸试验所采用的温度高至少5度或10度。可凭经验确定环的Tm，并且在一些实施方式中，例如，使用F.Baldino，Jr，M.-F.Chesselet和M.E.Lewis，Methods in Enzymology 168：766(1989)中所述的公式估计环的Tm。在一些实施方式中，茎在37℃下具有-8.5、-3或更低的最小自由能(delta-G)。理想地，多核苷酸3’末端序列将允许很少或没有替代性构造(例如，其它替代性二级结构)。可通过本领域普通技术人员已知的软件分析这些方面。这类软件的示例包括可从mfold.rna.albany.edu得到的UNAFold软件。或者，可形成更复杂的(锤头装)二级结构，只要该结构减弱了3’末端的可及性以降低假启动。
在一些实施方式中，多核苷酸的最后3’末端与茎的3’端(即，茎结构的最后核苷酸)一致。或者，在一些实施方式中，在3’末端处，1、2、3、4、5或6个不是茎环的部分的核苷酸可存在于5’末端处，由于在茎的5’方向上缺少与附近的核苷酸的互补性。该方面示于，例如，图1的上部。
包含3’末端处的茎环或茎的多核苷酸的长度可根据需要变化。在一些实施方式中，多核苷酸是10-5000、30-5000、30-100、50-1000、50-500或50-1000个核苷酸长。
3’茎(无环)多核苷酸
在其它实施方式中，与多核苷酸的3’部分(并且至多至3’末端)互补的反义寡核苷酸可与多肽退火。这一方面示于，例如，图1的下部。多核苷酸的反义寡核苷酸和互补部分形成与茎环的茎类似的双链体，但是没有连接两个核酸的核苷酸环。各半的茎可以是所需的任意尺寸，例如，5-30个核苷酸长，例如，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方式中，茎将具有至少40℃、45℃、50℃、55℃、60℃或65℃的熔解温度(Tm)。在一些实施方式中，例如，Tm比引物延伸试验所采用的温度高至少5度或10度。在一些实施方式中，茎在37℃下具有-8.5或更低的最小自由能(delta-G)。理想地，多核苷酸3’末端序列将允许很少或没有替代性构造(例如，其它替代性二级结构)。或者，可形成更复杂的(锤头装)二级结构，只要该结构减弱了3’末端的可及性以降低假启动。
使用3’茎环或茎多核苷酸的方法
上述的多核苷酸具有降低的从其3’末端启动聚合酶延伸的能力，并且因此理想地用于模板多核苷酸的启动干扰反应信号的任何方法。如以下实施例所示，具有整合的3’茎环结构的模板多核苷酸允许随后使用聚合酶并易受模板3’末端干扰的更精确和一致的试验。
因此，还提供了使用所得的多核苷酸的方法。例如，在一些实施方式中，在抑制剂置换反应中使用具有整合的3’茎环或茎结构的多核苷酸。该方法的一个示例描述于PCT公开号WO2012/078710。简而言之，这些方法可包括上述的具有3’茎或茎环结构并且包含猝灭剂/荧光标签对中的一个的模板多核苷酸。例如，模板多核苷酸可具有荧光标签，或者模板多核苷酸可具有猝灭剂。包含猝灭剂/荧光标签对中另一部分的抑制剂多核苷酸与模板杂交，导致由附近的猝灭剂猝灭荧光标签信号。靶向退火的抑制剂多核苷酸上游的引物可与聚合酶联用以检测模板多核苷酸内特定靶序列的存在与否。如果引物与模板杂交，所得的聚合酶反应置换抑制剂多核苷酸，产生来自荧光标签的信号。在一些实施方式中，引物在一定条件下与单核甘酸多态性(SNP)的位置杂交，在该条件下，如果引物与特定SNP等位基因互补，则引物退火并且不与其它SNP等位基因退火。该方法的一个方面如图3所示。令人惊讶地，如以下的实施例所示，在一些情况中，模板多核苷酸3’末端可自启动反应，导致抑制剂多核苷酸在没有上游引物的情况下置换。可通过在进行抑制剂多核苷酸置换试验之前将3’茎环结构加入模板多核苷酸中来显著降低这种不需要的自启动活性。
在另一个实施方式中，具有整合的3’茎环或茎结构的多核苷酸用作引物延伸反应的模板，其中标记核苷酸。例如，在一些实施方式中，核苷酸三磷酸连接到荧光标签和猝灭剂使得来自标签的信号猝灭。将核苷酸三磷酸结合到延伸产物中包括结合核苷酸单磷酸并释放二磷酸。在猝灭剂连接到核苷酸三磷酸的二磷酸部分的方面中，将核苷酸结合到延伸产物中导致猝灭剂的释放，从而生成来自荧光标签的信号。具有荧光标签和猝灭剂的核苷酸的示例描述于，例如，美国专利号7.118,871和D.A.Berry等，Tetrahedron Lett，45：2457-2461(2004)。可根据需要检测荧光并定量，并且任选地与原始模板或模板上的引物结合靶序列的量相关联。根据所采用的模板和标记的核苷酸，可使用DNA或RNA聚合酶。
本文所述的方法可用于检测任何类型样品中的核酸。在一些实施方式中，该样品是生物样品。生物样品可获自任何生物体，例如动物、植物、真菌、细菌或任何其他有机体。在一些实施方式中，该生物样品来自动物，例如哺乳动物(如人或非人灵长类动物、奶牛、马、猪、绵羊、猫、狗、小鼠或大鼠)、鸟(如鸡)或鱼。核酸模板可以是RNA或DNA。
生物样品可以是获自生物体的任何组织或体液，例如血液，血液成分或血液产品(如血清、血浆、血小板、血红细胞等)，痰液或唾液，组织(如肾、肺、肝、心、脑、神经组织、甲状腺、眼、骨骼肌、软骨或骨组织)；培养的细胞，粪便，尿液等。在一些实施方式中，样品包含一种或多种细胞。在一些实施方式中，细胞是动物细胞，包括但不限于人或非人哺乳动物细胞。非人哺乳动物细胞包括但不限于灵长类细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、猪细胞和牛细胞。在一些实施方式中，细胞是植物或真菌(包括但不限于酵母)细胞。细胞可以是，例如，培养的原代细胞、永生化培养细胞或者来自活检或组织样品的细胞，任选地经培养和刺激以在试验之前分裂。
在一些实施方式中，在环境条件(例如，低于45℃)下使用温度敏感的DNA聚合酶来扩增模板。在一些实施方式中，引物延伸反应包括在等温或热循环条件下扩增模板核酸。在一些实施方式中，扩增核酸分子或核酸分子的区域包括聚合酶链反应(PCR)、定量PCR或实时PCR。在例如《PCR引物：实验室手册》(PCR Primer：A Laboratory Manual)，Dieffenbach和Dveksler编，2003，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)；《定量PCR大全》(A-Z of Quantitative PCR)，Bustin编，2004，International UniversityLine；Edwards，《实时PCR：基本指南》(Real-Time PCR：An Essential Guide)，2004，Taylor& Francis；《实时PCR》(Real Time PCR)，Dorak编，2006，Taylor & Francis；《PCR方案：方法和应用指南》(PCR Protocols：AGuide to Methods and Applications)，Innis等编，1990，学术出版社(Academic Press)，圣迭戈(San Diego)；《PCR策略》(PCR Strategies)，Innis等编，1995，学术出版社，圣迭戈；和《PCR应用：功能基因组学的方案》(PCRApplications：Protocols for Functional Genomics)，Innis等编，1999，学术出版社，圣迭戈中描述了进行PCR的方案。
在一些实施方式中，使用定量扩增方法(包括但不限于实时PCR)来确定隔室中共定位的核酸分子区域或核酸分子的量，并且可与各种对照联用与确定感兴趣的样品中核酸分子区域或核酸分子的共定位的相对量，从而表明样品中的延伸核酸是否互相接近和互相接近的程度。
定量扩增方法(例如，定量PCR或定量线性扩增)涉及扩增核酸模板，直接或间接确定(例如，确定Ct值)扩增的DNA的量，然后基于扩增循环数计算初始模板的量。使用反应扩增DNA基因座是熟知的(参见美国专利号4,683,195和4,683,202；《PCR方案：方法和应用指南》(PCR PROTOCOLS：A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS)(Innis等编，1990))。通常，使用PCR来扩增DNA模板。然而，已经描述并也可采用扩增的替代性方法。定量扩增的方法公开于，例如，美国专利号6,180,349；6,033,854；和5,972,602，以及例如，Gibson等，GenomeResearch 6：995-1001(1996)；DeGraves等，Biotechniques 34(1)：106-10，112-5(2003)；Deiman B等，Mol Biotechnol.20(2)：163-79(2002)。可“实时”监测扩增。
在一些实施方式中，包含模板多核苷酸的样品或混合物分配到多个分区中。例如，可采用分配来限制每个分区中模板多核苷酸的拷贝数或其它限制性试剂。分区可包括多种类型的分区中的任一种，包括固体分区(如孔或管)和液体分区(如油相内的水性液滴)。在一些实施方式中，这些分区是液滴。在一些实施方式中，这些分区是微通道。分配样品的方法和组合物描述于，例如，公开的专利申请WO 2010/036352、US 2010/0173394、US 2011/0092373和US 2011/0092376，其全部内容各自通过引用纳入本文。
在一些实施方式中，将样品分配成多个液滴。在一些实施方式中，液滴包含乳液组合物，即不互溶的液体(如水和油)的混合物。在一些实施方式中，液滴是水性液滴，其被不互溶的运载体液体(如油)围绕。在一些实施方式中，液滴是油性液滴，其被不互溶的运载体液体(如水性溶液)围绕。在一些实施方式中，本文所述液滴是相对稳定的并在两种或更多种液滴之间具有最小聚结。在一些实施方式中，由样品生成的液滴中至少0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％与其他液滴聚结。这些乳液还可具有有限的絮凝，一种分散相从薄片中悬浮液产生的过程。
在一些实施方式中，使油相流过包含待检测目标分子的水性样品，从而形成液滴。在一些实施方式中，包含待检测目标分子的水性样品还包含用于检测目标分子的两种或更多种探针和经缓冲的溶液。
该油相可包含氟化基础油，其可通过与氟化表面活性剂(如全氟聚醚)联用而进一步稳定。在一些实施方式中，该基础油包括以下一种或多种：HFE7500、FC-40、FC-43、FC-70或另一种常见氟化油。在一些实施方式中，该油相包含阴离子含氟表面活性剂。在一些实施方式中，该阴离子含氟表面活性剂是Ammonium Krytox(Krytox-AS)、Krytox FSH的铵盐或Krytox FSH的吗啉基衍生物。Krytox-AS的浓度可以是约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％或4.0％(w/w)。在一些实施方式中，Krytox-AS的浓度是约1.8％。在一些实施方式中，Krytox-AS的浓度是约1.62％。KrytoxFSH的吗啉基衍生物的浓度可以是约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％或4.0％(w/w)。在一些实施方式中，Krytox FSH的吗啉基衍生物的浓度是约1.8％。在一些实施方式中，Krytox FSH的吗啉基衍生物的浓度是约1.62％。
在一些实施方式中，该油相还包含用于调节油性质(如蒸气压、粘性或表面张力)的添加剂。非限制性示例包括全氟辛醇和1H，1H，2H，2H-全氟癸醇。在一些实施方式中，1H，1H，2H，2H-全氟癸醇以约0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.25％、1.50％、1.75％、2.0％、2.25％、2.5％、2.75％或3.0％(w/w)的浓度添加。在一些实施方式中，1H，1H，2H，2H-全氟癸醇以约0.18％(w/w)的浓度添加。
在一些实施方式中，该乳液配制为生成具有类液界面膜的高度单分散液滴，其可通过加热转化为具有类固界面膜的微胶囊；这类微胶囊可作为生物反应器以通过一段时间的孵育保持其含量。转化为微胶囊可在一经加热后即发生。例如，这类转化可发生于大于约40°、50°、60°、70°、80°、90°或95℃的温度下。加热过程期间，液体或矿物油覆盖物可用于阻止蒸发。可在加热前除去或不除去过量的连续相油。这些生物相容性胶囊可在大范围的热和机械处理下抗聚结和/或絮凝。
转化后，这些微胶囊可储存于约-70°、-20°、0°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、15°、20°、25°、30°、35°或40℃下。在一些实施方式中，这些胶囊可用于生物医学应用，例如稳定、数字化的大分子包封，特别是包含目标分子(如核酸、蛋白质或上述两者)的混合物的水性生物液体；药物和疫苗递送；生物分子文库；临床成像应用；等。
这些微胶囊分区可含有一种或多种探针或标记的引物并可抗聚结，特别是在高温下。因此，这些胶囊可在非常高的密度(例如每单位体积的分区数)下孵育。在一些实施方式中，可每毫升孵育超过100,000、500,000、1,000,000、1,500,000、2,000,000、2,500,000、5,000,000或10,000,000个分区。在一些实施方式中，样品-探针孵育发生在单个孔中，例如微量滴定板的孔，此时各分区之间不具有内部混合。这些微胶囊还可含有孵育所需的其他组分。
在一些实施方式中，将样品分配成至少500个分区、至少1000个分区、至少2000个分区、至少3000个分区、至少4000个分区、至少5000个分区、至少6000个分区、至少7000个分区、至少8000个分区、至少10,000个分区、至少15,000个分区、至少20,000个分区、至少30,000个分区、至少40,000个分区、至少50,000个分区、至少60,000个分区、至少70,000个分区、至少80,000个分区、至少90,000个分区、至少100,000个分区、至少200,000个分区、至少300,000个分区、至少400,000个分区、至少500,000个分区、至少600,000个分区、至少700,000个分区、至少800,000个分区、至少900,000个分区、至少1,000,000个分区、至少2,000,000个分区、至少3,000,000个分区、至少4,000,000个分区、至少5,000,000个分区、至少10,000,000个分区、至少20,000,000个分区、至少30,000,000个分区、至少40,000,000个分区、至少50,000,000个分区、至少60,000,000个分区、至少70,000,000个分区、至少80,000,000个分区、至少90,000,000个分区、至少100,000,000个分区、至少150,000,000个分区或至少200,000,000个分区。
在一些实施方式中，将样品分配成足够数量的分区使得可从随机共定位中区分引物延伸。在一些实施方式中，该分配包括生成含有0个拷贝的模板分子的至少1个分区。在一些实施方式中，该分配包括生成至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1000或更多个含有0个拷贝的模板分子的分区。在一些实施方式中，该分配包括生成至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1000或更多个含有0个拷贝的模板分子的分区和至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1000或更多个含有1个或更多个拷贝(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个拷贝)的模板分子的分区。
在一些实施方式中，该样品被分配成足够数量的分区，使得至少大部分分区含有不超过5个拷贝的模板分子(例如约0.5、1、2、3、4或5个拷贝的靶分子)。在一些实施方式中，大部分分区含有不超过5个拷贝的一种或多种待检测模板分子。在一些实施方式中，各分区中存在平均不超过5个拷贝的一种或多种目标分子。在一些实施方式中，各分区中存在平均约0.5、1、2、3、4或5个拷贝的模板分子。在一些实施方式中，各分区中存在平均约0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4或5个探针。
在一些实施方式中，生成的液滴在形状和/或尺寸方面基本均匀。例如，在一些实施方式中，这些液滴在平均直径方面基本均匀。在一些实施方式中，生成的液滴的平均直径为约0.001微米、约0.005微米、约0.01微米、约0.05微米、约0.1微米、约0.5微米、约1微米、约5微米、约10微米、约20微米、约30微米、约40微米、约50微米、约60微米、约70微米、约80微米、约90微米、约100微米、约150微米、约200微米、约300微米、约400微米、约500微米、约600微米、约700微米、约800微米、约900微米或约1000微米。在一些实施方式中，生成的液滴的平均直径为小于约1000微米、小于约900微米、小于约800微米、小于约700微米、小于约600微米、小于约500微米、小于约400微米、小于约300微米、小于约200微米、小于约100微米、小于约50微米，或小于约25微米。在一些实施方式中，生成的液滴在形状和/或尺寸方面是不均匀的。
在一些实施方式中，生成的液滴在体积上基本均匀。例如，在一些实施方式中，生成的液滴的平均体积为约0.001nL、约0.005nL、约0.01nL、约0.02nL、约0.03nL、约0.04nL、约0.05nL、约0.06nL、约0.07nL、约0.08nL、约0.09nL、约0.1nL、约0.2nL、约0.3nL、约0.4nL、约0.5nL、约0.6nL、约0.7nL、约0.8nL、约0.9nL、约1nL、约1.5nL、约2nL、约2.5nL、约3nL、约3.5nL、约4nL、约4.5nL、约5nL、约5.5nL、约6nL、约6.5nL、约7nL、约7.5nL、约8nL、约8.5nL、约9nL、约9.5nL、约10nL、约11nL、约12nL、约13nL、约14nL、约15nL、约16nL、约17nL、约18nL、约19nL、约20nL、约25nL、约30nL、约35nL、约40nL、约45nL或约50nL。
进行上述方法的系统可包括，但不限于，PCT公开号2014/043388中所述的那些。
可以使用数字读取试验(例如数字分析)通过分配引物延伸反应分子并鉴定含有引物衍生生成的信号的分区对生成引物延伸的模板分子的数目进行计数。通常，数字分析的过程涉及：针对待检测目标分子、模板分子或引物延伸产物的存在，确定样品的各分区是阳性还是阴性。对于定量样品中目标分子的含量(例如定量样品中目标分子的浓度或拷贝数)，就各分区是否存在与引物延伸相关的信号对分区进行检验。
在一些实施方式中，能够检测单个信号或多个信号的检测器被用于分析各分区中是否存在目标分子。例如，在一些实施方式中，使用双色读取器(荧光检测器)。阳性计数分区的分数可用于测定待测量目标分子的绝对浓度。
一旦确定各样品分区的二态“是-否”结果，即可使用基于泊松统计的算法分析各分区的数据以定量样品中的目标分子含量。定量目标分子的浓度或含量的统计学方法描述于例如WO 2010/036352，其通过引用全文纳入本文。
具有3’茎环或茎的多核苷酸的生成
也提供了生成3’末端处包含茎或茎环结构的多核苷酸的方法。在一些实施方式中，可将茎环结构直接连接(例如，用DNA连接酶)到感兴趣的DNA多核苷酸的3’末端上。在一些实施方式中，可使用转座元件(如DNA转座子或反转录转座子)以将茎环结构整合到多核苷酸的3’末端上。
在其它实施方式中，采用扩增来将引物序列整合到感兴趣的多核苷酸中。简而言之，茎环寡核苷酸可用作引物来复制DNA模板，将寡核苷酸纳入DNA分子的5’末端然后拷贝回第二寡核苷酸引物。然后去除原始链，留下具有3’末端处茎环的单链DNA分子。下文中更详细地描述了后一种方法。
在一个实施方式中，用含有不可延伸的茎环结构的反向互补(RC)的5’区的PCR引物来导入结构。所述另一种方式，具有由聚合酶启动DNA延伸的3’末端并在5’末端处具有茎环的引物将生成单链扩增子，其互补序列将是具有3’末端处的反向互补茎环的单链DNA分子。在一些实施方式中，PCR引物对将用于扩增模板。在一些实施方式中，引物对的两个引物将具有5’茎环，从而将3’茎环导入PCR扩增子的两条链中。
图2的A部分显示了一个方面，其中具有5’茎环和能够与模板DNA退火的3’序列的茎环引物与模板序列退火。茎环引物通过引物的3’末端与模板多核苷酸退火，其与模板多核苷酸充分互补以允许DNA聚合酶的模板依赖延伸，从而生成包含与模板多核苷酸的互补区连接的茎环引物序列的单链扩增子。然后可使用第二引物来生成单链扩增子的互补区，其中互补区将在3’末端处包含茎环引物的互补区。然而，茎环的互补区还将形成茎环，从而产生3’末端处具有茎环结构的扩增子。双链扩增子可通过例如以下所述的方法转化成单链核酸：Mitsis等，Nucleic Acids Res(1999)，第27卷，第15期，第3057-3063页；Sanchez等，PNAS(2004)，第101卷，第7期，第1933-1938页；Chen等，“异步PCR(Asynchronous PCR)”，In：D.Park编，2011.PCR方案(《分子生物学方法》Methods in Molecular Biology)，第687卷)，新泽西州：胡马纳出版公司(Humana Press Inc.)，第231-243页。
茎环引物有以下几个部分组成：
在5’末端，可直接开始茎环，或任选地，在5’末端处存在1、2、3、4、5或6个不是茎环部分的核苷酸。
茎环部分将包含形成前一半茎的序列，之后是形成环的多个核苷酸，之后是前一半茎的反向互补物。前一半茎和后一半茎通常会有完全相同的长度，但在一些实施方式中，一半茎可比另一半茎多一个核苷酸，使得当两半退火时，一半茎的一个核苷酸不退火并形成凸起。各半的茎可以是所需的任意尺寸，例如，5-15个核苷酸常，例如，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。环将具有至少一个核苷酸，并且在一些实施方式中，换具有2-6个，例如，2、3、4、5或6个核苷酸。茎可具有上述的其他标准。或者，可形成更复杂的二级结构，只要该结构减弱了3’末端的可及性以降低假启动。
最终，茎环引物的3’末端处，将会有与靶序列充分互补的序列，其允许引物在所用的条件下与模板退火。例如，在一些实施方式中，引物的模板退火序列是至少6个核苷酸长，并且在一些实施方式中，是10-30个核苷酸，例如，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方式中，整个模板退火区域与模板序列完全互补。在其他实施方式中，在不与模板互补的退火部分中存在例如1、2、3或更多个核苷酸。
在本发明的实践方面中，可任选地采用分子生物学和重组DNA中的许多常规技术。这些技术已知并且描述于，例如，《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols inMolecular Biology)，1997-2007(F.M.Ausubel编)，威利科学公司(Wiley Interscience)；Sambrook等，2001，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第三版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，纽约冷泉港；Berger和Kimmel，《酶学中分子克隆技术方法指南》(Guide to Molecular CloningTechniques Methods in Enzymology)，第152卷，学术出版社，加利福尼亚州圣迭戈(Berger)，《DNA克隆：实践指南》(DNA Cloning：A Practical Approach)，卷I和卷II，1985(D.N.Glover编)；《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis)，1984(M.L.Gait编)；《核酸杂交》(Nucleic Acid Hybridization)，1985，(Hames和Higgins)；《转录和翻译》(Transcription and Translation)，1984(Hames和Higgins编)；《动物细胞培养》(AnimalCell Culture)，1986(R.I.Freshney编)；《固定细胞和酶》(Immobilized CellsandEnzymes)，1986(IRL出版)；Perbal，1984，《分子克隆实践指南》(A Practical Guide toMolecular Cloning)；丛书，《酶学方法》(Methods in Enzymology)(学术出版社)；《哺乳动物细胞的基因转移载体》(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)，1987(J.H.Miller和M.P.Calos编，冷泉港实验室)；《酶学方法》(Methods in Enzymology)，第154卷和第155卷(分别有Wu和Grossman，和Wu编)。
除了使用茎环引物生成具有至少一个包含茎环的3’末端的扩增子的方法外，也提供了用于进行方法的反应混合物。反应混合物可含有生成具有一个或两个具有茎环的双链扩增子3’末端的扩增子所需的所有成份，或者可省略完成反应所需的一种或多种成份。例如，在一些实施方式中，除了模板DNA样品以外，方法所需的所有成份包含于反应混合物中。因此，在一些实施方式中，可预包装反应，使得终端用户可添加核酸样品，然后将反应混合物置于条件下以进行引物延伸。在一些实施方式中，也省略聚合物并可由用户在进行反应方法时分开加入。
本发明还提供了用于本发明的方法的试剂盒。通常，该试剂盒分隔以易于使用，并且含有提供用于进行本发明的方法的组分的容器。
还提供了在一个或两个3’末端上包含茎环的双链DNA扩增子，如本文所述。可从其它扩增反应材料中分离扩增子(例如，通过凝胶电泳或其它方法)或者扩增子可以是上述反应混合物的一部分。
实施例
实施例1
使用人基因组DNA作为23个PCR反应的模板。所有的PCR反应含有荧光标记的正向引物和以下反向引物之一：A.5’-磷酸标准反向引物，或B.如图1所述添加到反向引物的5’末端的5’-磷酸茎环。在PCR扩增之后，使用标准方法扩增2个扩增子。然后通过加入去除5’-磷酸标记链的λ外切核酸酶将荧光标记的双链扩增子转化成荧光标记的单链DNA。接着，加入猝灭剂标记的反义寡核苷酸。猝灭剂-寡核苷酸经设计与模板的荧光5’-末端杂交并猝灭荧光信号。然后用BST聚合酶和反应缓冲液，或者等量的无聚合酶对照混合荧光单链DNA和反义猝灭剂的混合物。DNA的BST聚合物延伸的3’启动导致反义猝灭剂-寡核苷酸的链置换和高荧光信号。相反，如果启动受到抑制，(猝灭的)荧光信号保持低水平。在6个测试的样品中的1个中，用标准反向引物扩增的样品中的荧光低(不超过无BST对照的20％)。相反，在17个测试的样品中的13个中，用茎环引物扩增的样品的荧光低。这表示从使用标准引物的76.5％的失败率改善到使用茎环引物的仅17％的失败率。
实施例2
在本发明的方法的一个示例中，使用标准PCR反应在KRAS基因外显子2上进行PCR反应。使用的反向和正向引物的序列分别是/5Phos/AAT TTA TAT TAA TTT ATT TAT TATAAG GCC TGC TGA AAA TGA CTG AA(SEQ ID NO：1)和/56FAM/AGA TGC AGC AAT AAC ATGTGA ATG GTC CTG CAC CAG TAA TAT GCA TAT(SEQ ID NO：2)。/5Phos/和/56FAM/分别对应于5’末端磷酸和FAM修饰。在PCR扩增之后，使用凯杰纯化试剂盒或Agencourt AMPure XP珠来洗去过量的试剂。DNA与λ外切核酸酶、缓冲剂、dNTP和寡核苷酸0混合，序列为CACTGCCCACATGTTATTGCTGCATC/3IABkFQ/(SEQ ID NO：3)。/3IABkFQ/修饰对应于3’末端加入黑洞猝灭剂。使用λ外切核酸酶来将双链DNA转变成单链DNA，0经设计与扩增子的5’末端互补并且猝灭FAM的荧光。将混合物分成两管并且向一管中加入BST聚合酶。在37℃下孵育30分钟之后，测量并比较溶液的荧光。在没有反义寡核苷酸的情况下，含BST的管具有比未含BST的管更高的荧光。这表示当加入BST时猝灭剂寡核苷酸并不猝灭或部分猝灭扩增子；这一人为现象可通过模板的3’末端背向成环并进一步由BST延伸(其从模板上置换0)来解释。在与靶标的3’末端互补的反义寡核苷酸存在下，对于序列TCT ATA TAT TAA TTTATTTA/3Phos/(SEQ ID NO：4)，两管的荧光相同；反义寡核苷酸与模板的自启动竞争，防止DNA模板的3’末端延伸。
本文所述的实施例和实施方式仅用于说明目的，本领域技术人员应了解据此作出的各种修饰或改变，且它们包括在本申请的主旨和权益以及所附权利要求书的范围内。本文引用的所有发表物、专利和专利申请通过引用全文纳入本文以用于所有目的。

Claims (26)

1.一种引物延伸产物所致假启动减少的进行引物延伸的方法，所述方法包括
提供包含以下组分的反应混合物：
包含5’末端和3’末端的单链多核苷酸模板，所述多核苷酸模板在3’末端的6个核苷酸内包含5-25个核苷酸的双链茎，其中：
所述双链茎包含3’端并且连接到所述茎的3’端是1-5个核苷酸，这些核苷酸不构成所述茎的部分并且位于所述多核苷酸模板的3’末端，或
由多核苷酸模板中的核苷酸序列形成所述双链茎的第一条链，所述茎的第二条链是与之区分的与所述核苷酸序列互补的反义寡核苷酸，并且所述反义寡核苷酸不包含3’OH部分或者经阻断而不被聚合酶延伸；
引物，当所述多核苷酸模板中存在靶序列则所述引物与所述靶系列退火结合；和
聚合酶；
将所述反应混合物暴露于这样的条件即所述条件下，当所述靶序列存在则所述引物与所述靶序列退火且所述聚合酶以模板依赖的方式延伸所述引物；并且
检测引物延伸产物的存在或量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶序列存在于所述多核苷酸模板中。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双链茎是茎环的部分，所述双链茎的两条链由环连接。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述环包含1-10个核苷酸。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述双链茎包含3’端并且连接到所述茎的3’端是1-5个核苷酸，这些核苷酸不构成所述茎的部分并且位于所述多核苷酸模板的3’末端。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，由多核苷酸模板中的核苷酸序列形成所述双链茎的第一条链，所述茎的第二条链是与之区分的与所述核苷酸序列互补的反义寡核苷酸，并且所述反义寡核苷酸不包含3’OH部分或者经阻断而不被聚合酶延伸。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述双链茎包含3’端并且所述茎的3’端毗连所述多核苷酸模板的3’末端。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸模板包含猝灭剂/荧光标签对中的一成员并且抑制剂寡核苷酸与所述引物下游的多核苷酸模板退火，其中所述抑制剂寡核苷酸包含猝灭剂/荧光标签对中的第二成员，由此，当所述抑制剂寡核苷酸与所述多核苷酸模板退火时来自标签的信号被猝灭。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述暴露包括用所述聚合酶延伸所述引物，从而置换所述抑制剂寡核苷酸并且使得所述猝灭剂/荧光标签对不猝灭从而生成荧光信号；并且
检测所述荧光信号并将所述信号的量与所述靶序列的存在或量相关联。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚合酶是DNA聚合酶。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚合酶是RNA聚合酶。
12.如权利要求10或11所述的方法，其特征在于，所述反应混合物中的核苷酸三磷酸整合到引物延伸产物中，并且所述核苷酸三磷酸中的至少一些包含标签。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，核苷酸三磷酸包含荧光标签和猝灭剂对，这样，当核苷酸三磷酸完整时，所述荧光标签被所述猝灭剂猝灭，而当核苷酸整合到所述引物延伸产物时所述荧光标签不猝灭。
14.一种包含5’末端和3’末端的单链多核苷酸，所述单链多核苷酸在3’末端的6个核苷酸内包含5-25个核苷酸的双链茎，其中：
所述双链茎包含3’端并且连接到所述茎的3’端是1-5个核苷酸，这些核苷酸不构成所述茎的部分并且位于所述单链多核苷酸的3’末端，或
由单链多核苷酸中的核苷酸序列形成所述双链茎的第一条链，所述茎的第二条链是与之区分的与所述核苷酸序列互补的反义寡核苷酸，并且所述反义寡核苷酸不包含3’OH部分或者经阻断而不被聚合酶延伸。
15.如权利要求14所述的单链多核苷酸，其特征在于，所述双链茎是茎环的部分，所述双链茎的两条链由环连接。
16.如权利要求15所述的单链多核苷酸，其特征在于，所述环包含1-10个核苷酸。
17.如权利要求15或16所述的单链多核苷酸，其特征在于，所述双链茎包含3’端并且连接到所述茎的3’端是1-5个核苷酸，这些核苷酸不构成所述茎的部分并且位于所述单链多核苷酸的3’末端。
18.如权利要求14所述的单链多核苷酸，其特征在于，由所述单链多核苷酸中的核苷酸序列形成所述双链茎的第一条链，所述茎的第二条链是与之区分的与所述核苷酸序列互补的反义寡核苷酸，并且所述反义寡核苷酸不包含3’OH部分或者经阻断而不被聚合酶延伸。
19.如权利要求18所述的单链多核苷酸，其特征在于，所述双链茎包含3’端并且所述茎的3’端毗连所述单链多核苷酸的3’末端。
20.如权利要求14所述的单链多核苷酸，其特征在于，所述单链多核苷酸包含猝灭剂/荧光标签对中的一成员。
21.如权利要求14所述的单链多核苷酸，其特征在于，所述单链多核苷酸长10-5000个核苷酸。
22.一种包含权利要求14-20中任一项所述的单链多核苷酸的反应混合物。
23.如权利要求22所述的反应混合物，其特征在于，所述多核苷酸包含猝灭剂/荧光标签对中的一成员，并且所述反应混合物还包含抑制剂寡核苷酸，所述抑制剂寡核苷酸包含所述猝灭剂/荧光标签对中的第二成员，由此，当所述抑制剂寡核苷酸与所述多核苷酸退火时，来自所述标签的信号被猝灭。
24.如权利要求22或23所述的反应混合物，其特征在于，所述反应混合物还包含以下的至少一种：
DNA或RNA聚合酶；
核苷酸三磷酸或脱氧核苷酸三磷酸；
与所述单链多核苷酸中的靶序列退火的引物；和
抑制剂寡核苷酸，所述抑制剂寡核苷酸包含所述猝灭剂/荧光标签对中的第二成员，由此，当所述抑制剂寡核苷酸与所述多核苷酸退火时，来自所述标签的信号被猝灭。
25.一种包含权利要求14-21中任一项所述的单链多核苷酸的试剂盒。
26.如权利要求22所述的反应混合物，其中：
所述双链茎包含3’端并且连接到所述茎的3’端是1-5个核苷酸，这些核苷酸不构成所述茎的部分并且位于所述单链多核苷酸的3’末端，或
由单链多核苷酸中的核苷酸序列形成所述双链茎的第一条链，所述茎的第二条链是与之区分的与所述核苷酸序列互补的反义寡核苷酸，并且所述反义寡核苷酸不包含3’OH部分或者经阻断而不被聚合酶延伸。
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