CN105765055A - 微流体装置和其使用方法 - Google Patents

Abstract

提供用于操纵微流体通道中的液滴的方法和系统。在一些实施方案中，提供用于使两种或更多种先前形成的不同标记的微滴群体交替流动的系统。在一些实施方案中，所述系统包括微流体装置，所述微流体装置具有用于不同标记的微滴的两个或更多个入口，和与联合微流体通道形成连接点的至少两个微流体通道，其中所述系统被配置以允许所述微滴以交替方式从所述两个或更多个入口通过所述微流体通道流向所述联合微流体通道。

Description

微流体装置和其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求以下美国临时专利申请各自的优先权，所述临时专利申请各自以全文引用的方式并入：2013年8月27日提交的61/870,336；2013年9月9日提交的61/875,312；2013年10月29日提交的61/896,766；2013年11月19日提交的61/905,914；2013年9月23日提交的61/881,040；2013年11月19日提交的61/905,927；和2014年2月3日提交的61/934,889。

背景技术

微流体方法通常利用乳液的使用，所述乳液含有分散液相被不混溶连续液相包围的液滴。液滴可用作化学或生物反应的反应容器，用作储存容器，和/或用作分离和隔开分子如化学或生物要素的方法。利用在乳液表面上的适当化学剂如表面活性剂，可使液滴“稳定”，这意味着它们当彼此接触时基本上避免混合和合并。这种稳定性允许创建由不同化学或生物组分构成的液滴的群体或库，所述液滴可储存在大致相同体积的空间中而在一个液滴与另一个液滴的组分之间和/或其中无混合或污染。

目前，液滴在微流体装置中流动，其中许多液滴被注入来自单个大液滴(在本文可互换地称为“大液滴”或“汽泡(slug)”)的样品或另一种离散的在线样品。通常创建液滴的时间“组”，这意味着多个依序编号的液滴将被注入相同类型的较大液滴，从而产生一组基本上相似的液滴。在给定样品中可能具有许多组液滴。随着新注入的液滴在微流体装置内的整个微流体通道中流动，所述液滴通常自身混合并重新排列，导致限定组液滴的损失，从而在检测和数据分析下游造成问题。

在一些情况下，以交替方式用所关注的样品标记微流体网络中的乳液液滴可能是有利的。这样做可确保液滴当它们进行后续检测过程时可区分，而在相邻液滴之间无检测重叠。例如，如上文所讨论的液滴组可通过具有不同标记或通过一组具有标记而另一组缺乏所述标记来区分。

微流体装置可使用由连续相和分散相构成的液体乳液，其中所述分散相可包括充当容器的微滴，在所述微滴中可进行化学或生物反应。为了执行这些反应，可在微滴上执行不同功能，例如将试剂和反应组分(例如，细胞、蛋白质和核酸)装载到微滴中，接着对所述微滴进行温育、分选和/或光学检测。例如，当将多种试剂引入一个或多个微滴中时，微滴之间的连续相的体积可能使得试剂被依序注入任何给定微滴中，即，一次一个而不是一次一个以上以避免交叉污染。反之，当将微滴储存在温育腔室中或使微滴通过温育通道时，连续相的体积分数必须降低以使得所述微滴被紧密堆积并以恒定速度一致地移动，以及最小化微流体装置内所需的空间量。

本文解决了这些和其他问题。

发明内容

在一些实施方案中，提供用于使两种或更多种先前形成的不同标记的微滴群体交替流动的系统。在一些实施方案中，所述系统包括：微流体装置，其具有用于不同标记的微滴的两个或更多个入口，和与联合微流体通道形成连接点的至少两个微流体通道，其中所述系统被配置为允许所述微滴以交替方式从所述两个或更多个入口通过所述微流体通道流向所述联合微流体通道。

在一些实施方案中，所述系统还包括与两个微流体通道流体连通和在两个微流体通道之间流体连通的连接通道，所述连接通道被配置为允许连续相流体而非微滴在所述微流体通道之间流动。

此外提供使两种或更多种先前形成的不同标记的微滴群体交替流动的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：提供如权利要求1或2所述的微流体装置，其中在两个或更多个入口的第一入口中的第一微滴和在两个或更多个入口的第二入口中的第二微滴被不同标记；和造成所述第一微滴和所述第二微滴以交替方式流入联合微流体通道中。

此外提供用于标记微滴和使不同标记的微滴交替流动的系统。在一些实施方案中，所述系统包括：用于连续相内的微滴的至少一个入口，在一端连接至所述至少一个入口并且在另一端与联合微流体通道形成连接点的至少两个微流体通道，和被配置以标记所述微流体通道之一中的微滴的标记装置；其中当所述微滴通过所述至少两个微流体通道流向所述联合微流体通道时，所述标记装置对在所述微流体通道之一中流动的微滴进行标记。

在一些实施方案中，所述标记是不混溶标记。

在一些实施方案中，所述标记装置通过破坏不混溶标记与连续相之间的界面来标记微滴。在一些实施方案中，所述标记装置使用电场来破坏不混溶标记与连续相之间的界面。在一些实施方案中，所述标记装置包括一个或多个电极，其产生电场以破坏不混溶标记与连续相之间的界面。在一些实施方案中，微流体通道中的微滴被间隔以使得相邻微滴由于电场的存在而不聚结。在一些实施方案中，所述系统还包括允许连续相流体而非微滴在微流体通道之间流动的连接通道。

此外提供用于标记微滴并使不同标记的微滴交替流动的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：将连续相内的多个微滴注入与至少两个微流体通道连接的至少一个入口中，其中所述微流体通道在一端连接至所述至少一个入口并且在另一端与联合微流体通道形成连接点，并且利用标记装置用标记对微流体通道之一中的微滴进行标记，其中被标记的微滴和未被标记的微滴以基本上交替的方式进入所述联合微流体通道。

在一些实施方案中，所述标记是不混溶标记。

在一些实施方案中，所述微滴含有所需PCR反应所必需的引物和试剂。在一些实施方案中，所述系统还包括允许连续相流体而非微滴在微流体通道之间流动的连接通道。在一些实施方案中，所述标记装置通过破坏不混溶标记与连续相之间的界面来标记微滴。在一些实施方案中，所述标记装置包括一个或多个电极，其产生电场以破坏不混溶标记与连续相之间的界面。在一些实施方案中，微流体通道中的微滴被间隔以使得相邻微滴由于电场的存在而不聚结。

此外提供分离包含微流体通道中的乳液内的至少第一组液滴和第二组液滴的多个液滴的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在微流体通道中的乳液中的第一组液滴与第二组液滴之间的位置处产生间隔液滴，其中所述第一组液滴和所述第二组液滴具有基本上相同的体积并且所述间隔液滴具有比第一或第二组液滴的平均体积更大的体积，从而分离微流体通道中的所述多个液滴。

在一些实施方案中，将多组液滴引入微流体通道中并且将多个间隔液滴引入微流体通道中以使得间隔液滴分隔不同组的液滴。在一些实施方案中，所述乳液包含在不混溶流体中所含的液滴，并且在引入间隔液滴之后，乳液连续相中的不混溶流体量减少，从而相比于在引入之前不久将多个液滴压缩成更小的空间。在一些实施方案中，所述产生包括在微流体通道中的所述位置从侧通道引入间隔液滴。在一些实施方案中，所述间隔液滴不含蛋白质或核酸。

在一些实施方案中，所述产生包括将来自一个或多个相邻组的两个或更多个液滴合并以在两组之间产生间隔液滴。

在一些实施方案中，所述方法还包括对侧通道上游的微流体通道中的液滴组进行光学监测，和基于所述光学检测结果触发一个或多个间隔液滴的产生，从而基于液滴组的身份引入间隔液滴。

在一些实施方案中，所述产生以固定速率发生。

在一些实施方案中，在微流体通道中所述位置的上游，将来自上游侧通道的液滴的部分注入来自微流体通道中的更上游的液滴，以使得液滴组被定义为含有来自上游侧通道的相同液滴的一部分的所有液滴。在一些实施方案中，所述上游侧通道中的液滴包含扩增的DNA。在一些实施方案中，所述上游侧通道中的不同液滴包含不同的扩增子。在一些实施方案中，来自微流体通道中的更上游的所述液滴包含一个或多个多聚核苷酸杂交探针。

此外提供包含微流体通道的装置，所述微流体通道包含乳液内的至少第一组和第二组液滴，其中所述第一组和第二组液滴具有基本上相同的体积并且所述第一组和所述第二组被间隔液滴隔开，所述间隔液滴具有比第一组或第二组液滴的平均体积更大的体积。在一些实施方案中，所述间隔液滴不含蛋白质或核酸。

此外提供用于执行来自乳液的连续相体积分数的受控变化的系统，其中所述系统包括微流体装置，所述微流体装置包括一个或多个微流体通道和与所述微流体通道中的至少一个流体连通的一个或多个相对较小的通道或膜。在一些实施方案中，所述一个或多个微流体通道呈同心管形式，其沿着所述管的内侧包含小孔或膜表面。在一些实施方案中，一个或多个提取通道或膜以除了基本上垂直于一个或多个微流体通道之外的角度被布置。在一些实施方案中，所述系统还包括以除了基本上彼此平行之外的角度或位置布置的两个或更多个微流体通道。

在一些实施方案中，所述微流体装置包括第一微流体通道和第二微流体通道，其中所述第二微流体通道被受控加压以使得当乳液被引入微流体装置中时，乳液的连续相的受控体积分数从第一微流体通道流出，通过一个或多个提取通道或膜并进入第二微流体通道，并且其中乳液的分散相保留在第一微流体通道中。

在一些实施方案中，所述分散相包含多个水性微滴。在一些实施方案中，所述微滴各自包含直径为约0.5至约5000微米的尺寸范围。在一些实施方案中，所述连续相包含不混溶油。在一些实施方案中，所述不混溶油选自氟碳油、硅油和烃油。在一些实施方案中，所述烃油选自石油和矿物油。

此外提供使用如上文或本文其他地方所述的系统执行来自乳液的连续相体积分数的受控变化的方法，其中所述乳液包含包括水性液滴的不混溶流体连续相。在一些实施方案中，所述方法包括将包含液滴的乳液引入微流体通道中并使所述微流体通道暴露于第一压力；和移动所述乳液通过与一个或多个相对较小的通道连通的流体，其中所述相对较小的通道暴露于第二压力并且其中所述第二压力低于所述第一压力以使得乳液中的不混溶流体连续相从所述微流体通道移动至所述相对较小的通道，从而将微流体通道中的剩余乳液中的液滴浓度浓缩。

在一些实施方案中，所述方法包括将包含液滴的乳液引入微流体通道中并且使所述微流体通道暴露于第一压力；和移动所述乳液通过与一个或多个相对较小的通道连通的流体，其中所述相对较小的通道包含不混溶流体连续相并且暴露于第二压力，并且其中所述第二压力高于所述第一压力以使得不混溶流体连续相相对较小的通道从相对较小的通道移动至微流体通道，从而降低微流体通道中的乳液中的液滴浓度。

此外提供包含至少一个微流体通道的装置，所述通道包含通道的第一窄部分和通道的第二较宽部分，其中所述第二较宽部分包含较宽部分内的一系列柱和用于从微流体通道中的乳液去除不混溶流体连续相的一个或多个出口，其中所述系列的柱被布置以基本上保持乳液内的液滴沿着微流体通道的次序。在一些实施方案中，所述第二较宽部分包含与所述第二较宽部分流体连通的一个或多个侧通道。在一些实施方案中，所述侧通道的宽度小于所述第二较宽部分的宽度。

此外提供从包含水性液滴的乳液去除不混溶流体连续相的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将乳液引入如权利要求45所述的微流体通道中以使得所述乳液从具有特定次序的液滴的第一部分移动到第二较宽部分，其中当乳液进入第二部分时，来自乳液的一些不混溶流体连续相从第二较宽部分去除，同时液滴基本上保持来自通道的第一部分的液滴的次序。在一些实施方案中，所述第二较宽部分包含与第二较宽部分流体连通的一个或多个侧通道并且经由所述侧通道去除不混溶流体连续相。

此外提供一种装置，其包括：乳液微流体通道和在所述乳液微流体通道中的连接点连接至所述乳液微流体通道的连续相微流体通道，其中所述乳液微流体通道包含如下通道部分，(i)其具有相比于乳液中液滴的直径不大于0.8、0.9、1.0、1.2、1.5、2、3、4、5、6倍的宽度，和(ii)其在连接点之前不久逐渐加宽，和(iii)在与相比于液滴的直径不大于0.8、0.9、1.0、1.2、1.5、2、3、4、5、6倍的宽度的连接点之后不久逐渐缩窄。

在一些实施方案中，所述连续相微流体通道与连续相储集器流体连通。在一些实施方案中，所述乳液微流体通道包含乳液并且所述连续相微流体通道包含连续相不混溶流体。在一些实施方案中，所述通道部分与液滴直径基本上相同。

此外提供将不混溶连续流体引入乳液中以间隔所述乳液内的液滴的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：将所述乳液引入如上文或本文其他地方所述的装置中以使得乳液中的液滴以单个列队形式出现于乳液微流体通道中；将另外的不混溶连续相流体引入来自连续相微流体通道的乳液中以使得流过乳液微流体通道与连续相微流体通道的连接点的液滴相比于连接点上游乳液中的液滴彼此间隔更远。

此外提供一种装置，其包括：用于容纳包含液滴的乳液的腔室；与所述腔室连接的两个或更多个平行微流体腔室，其具有与液滴直径基本上相同的宽度。在一些实施方案中，光学检测器被配置为检测一个或多个平行微流体腔室中的液滴。

在一些实施方案中，将两个或更多个平行微流体通道合并到单一通道或腔室中。在一些实施方案中，两个或更多个平行微流体通道与用于递送另外的不混溶流体连续相的一个或多个储集器流体连通以进一步间隔平行微流体通道中的乳液内的液滴。

此外提供将液滴均匀分配到两个或更多个平行微流体通道中的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在如上文或本文其他地方所述的装置的腔室中提供乳液，其中所述乳液包含不混溶流体连续相中的液滴，并且在腔室中的乳液上提供压力以将乳液推入两个或更多个平行微流体通道中，从而将来自腔室的液滴均匀分配到两个或更多个平行微流体通道中。

在一些实施方案中，所述方法还包括当液滴在微流体通道中时检测所述液滴的一种或多种特性。

在一些实施方案中，所述方法还包括将两个或更多个平行微流体通道中的乳液合并到第二腔室或通道中。

此外提供包括一系列微流体通道的装置，其中所述系列的通道包含在连接点分成两个下游微流体通道的至少一个通道，其中一个或多个分流通道连接所述两个下游微流体通道。在一些实施方案中，两个下游微流体通道中的每个进一步分成两个另外的下游微流体通道，其中一个或多个分流通道连接所述两个另外的下游微流体通道。在一些实施方案中，所述微流体通道包含含有液滴的乳液并且下游微流体通道合并形成一个或多个合并通道。

此外提供将液滴均匀分配到两个或更多个微流体通道中的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将包含液滴的乳液引入如上文或本文其他地方所述的装置的通道中，并且施加压力以使得所述乳液进入两个下游微流体通道，其中所述分流通道使两个微流体通道之间的压力均衡，从而导致来自乳液的液滴在两个微流体通道之间的平均分配。

定义

“样品”、“一个或多个样品”或“所关注的样品”是以单数或复数形式可互换使用的术语并且不旨在限于任何特定数量，并且如本文所用，可能是使用者希望从其收集信息的任何分子或物质。在测定法执行期间，样品的大小、体积或含量可变得更大或更小(例如，分别通过膨胀或分割的方式)。因此，在测定法执行期间，样品可被放大和/或细分一次或多次。在一些实施方案中，所述样品包含核酸。

如本文所用的“流体”是能够自由流动的任何水性或亲脂相。两种或更多种流体可以被称为“共流”的方式流动以使得每种流体的流动在系统操作的范围或时间尺度内是相同方向的层流，但使得它们基本上不混合。注入微滴中或离开微滴的流体和/或乳液还可包含一种或多种试剂、反应组分或所关注的样品，其选自细胞(包括任何真核或原核细胞，包括(但不限于)选自人类、动物、植物、真菌、细菌、病毒、原生动物、酵母、霉菌、藻类、立克次体和朊病毒的细胞)；蛋白质、肽、核酸序列、寡核苷酸探针、聚合酶、缓冲液、dNTP、有机和无机化学品，和荧光染料。

如本文所用的“乳液”是至少两种不混溶或部分不混溶的液体的稳定混合物。一般来说，不混溶液体倾向于分成两个不同的相。因此，可添加表面活性剂以通过降低至少两种不混溶或部分不混溶的液体之间的表面张力来稳定化乳液和/或稳定化界面。例如，根据本发明的系统、方法和试剂盒的乳液可包含在不混溶油如氟碳油、硅油或烃油(包括但不限于石油和矿物油)中的多个水性液滴，其中液滴尺寸的直径范围为约0.5至约5000微米。

附图说明

图1是执行级联测定法的微流体系统的一个实施方案的实施例的图示。

图2示出包含以基本上一个接一个的交替方式使两种先前形成的乳液交错的微流体装置的一个实施方案的实施例。

图3示出包含用于选择性标记先前形成的液滴的部分并且然后以基本上一个接一个的交替方式使被标记液滴与群体的未被标记部分交错的微流体装置的根据本发明的一个实施方案的实施例。

图4示出用于执行来自合并使用小通道的微流体装置中的乳液的连续相体积分数的受控变化的系统的一个实施方案的单侧视图。

图5示出用于执行来自微流体装置中的乳液的连续相体积分数的受控变化的系统的一个实施方案的三维视图。

图6示出用于执行来自合并使用膜的微流体装置中的乳液的连续相体积分数的受控变化的系统的一个实施方案的单侧视图。

图7示出用于执行来自合并使用宽低轮廓通道的微流体装置中的乳液的连续相体积分数的受控变化的系统的一个实施方案的单侧视图。

图8是明场显微照片，其示出用于执行来自微流体装置中的乳液的连续相体积分数的受控变化的系统的单侧实施例的一个实施方案的实施例。

图9是明场显微照片，其示出在通过用于执行微流体装置中的乳液的连续相体积分数的受控变化的系统之后，在微流体通道中的紧密堆积乳液的实施例。

图10中的微滴分配器示出其中进料通道远大于离开通道的装置。因此，通过装置的大多数压降源自离开通道，进料通道中的压力基本上恒定，并且液滴均匀分配通过离开通道。

图11中的分配器使用不同的方法来均匀分配液滴，其中分流分支允许压力波动以反馈，并导致液滴以交替模式流过通道。

图12示出微流体装置内的通道。除了在所述通道内并入小柱之外，所述通道逐渐加宽并引入除油姐妹通道，从而提供容易的油分离并允许接近的液滴在通道内维持其次序。

图13从一个视图描绘整体微滴过滤架构的一个实施方案，例如，40μm液滴。

图14A、图14B和图14C示出从三个不同有利位置检视的不同截面视图以说明微滴流动。图14A示出来自地形方向的一个实施方案视图。图14B示出来自侧视图的一个实施方案视图。图14C示出来自正视图的一个实施方案视图。

图15描述高速微滴间隔物的一个实施方案。

图16是系统和方法的一个实施方案的实施例的图示，其中注射位点下游的液滴组在通道内混合，从而在检测和数据分析中产生问题。

图17是系统和方法的一个实施方案的实施例的图示，其中通过同步引入大的隔离液滴而防止注射位点下游的液滴组在通道内混合，从而防止在检测和数据分析中的问题。

图18是系统和方法的一个实施方案的实施例的图示，其中通过系统性引入大的隔离液滴而防止注射位点下游的液滴组在通道内基本上混合，从而防止在检测和数据分析中的问题。

图19是系统和方法的一个实施方案的实施例的图示，其中通过使用循环电场将液滴组系统性合并成大的隔离液滴而防止注射位点下游的液滴组在通道内基本上混合，从而防止在检测和数据分析中的问题。

具体实施方式

本文提供用于微流体系统中的多个方面，包括(但不限于)使微滴交错的方法、增加和降低乳液中不混溶流体的体积(从而分别降低或增加微滴密度)的方法、过滤乳液的方法，和跟踪和/或分离微滴组的方法。本文所述的方法、装置和系统可用于分离或适于任何数目的不同微流体系统配置。一种这样的系统描绘于图1中。应认识到，图1的系统并不旨在限制本发明。例如，当使用本文所述的发明配置时，图1的系统的方面可与所述系统的其他方面分离使用。

在一个或多个实施方案中，所述系统包括一个或多个注射入口。所述注射入口可具有任何形状，包括(但不限于)圆形、椭圆形、三角形、矩形等。所述注射入口可具有小于约1mm、小于约100μm、小于约10μm、小于约1μm、小于约100nm等的平均横截面尺寸。所述注射入口可与微流体通道齐平，或者可选地可突出到微流体通道中。

所述系统还可包括用于破坏在微流体通道中流动的液滴与注射通道中的流体和/或乳液之间的界面的至少一部分的机构，从而导致相对受控体积被注入液滴或离开液滴，并且因此，液滴体积相对于在注射之前分别增加或降低。如本文当提及液滴与流体和/或乳液之间的界面时所用的“界面”是其中两个不混溶或部分不混溶的相(例如，液滴和流体或乳液)能够彼此相互作用的一个或多个区域。在界面破坏后，存在从注射通道并进入液滴或离开液滴并进入注射通道的相对体积流动，全部都是经由与特定注射通道相关的注射入口。随着液滴持续流过注射入口，存在破坏液滴与流体和/或乳液之间的接触的剪切力，接着界面恢复和液滴与流体和/或乳液之间的体积流动结束。微滴注射器(也称为“显微注射器(picoinjector)”)，即例如从一个液滴的一部分到另一个液滴中的少量流体的注射器，描述于例如US2012/0132288和WO2012/135259中。

在一个或多个实施方案中，注射进入或离开每个液滴的体积可为取决于实施方案的任何合适的量，如本领域技术人员将理解和了解。例如，注射进入或离开每个液滴的体积可能小于约10μL、小于约1μL、小于约100nL、小于约10nL、小于约1nL、小于约100pL、小于约10pL、小于约1pL等。

示例性系统组分描述于例如US2011/0267457、US2011/0151578、US2011/0218123、US2012/0222748、US2011/0218123、2012/0222748、WO2012/135201、WO2012/135259、WO2014/043388、WO2012/135327中。

可通过控制液滴、流体、乳液和/或系统组分的各种因子来控制体积的方向和速率，包括(但不限于)破坏液滴与流体和/或乳液之间的界面的机构(下文进一步讨论)；液滴的曲率和/或速度；注射通道和/或微流体通道中相对于彼此的压力；液滴的表面张力；流体和/或乳液的表面张力；注射入口的几何形状等，如本领域技术人员所知和理解。在一些情况下，上述因子可导致作用在如下所述的系统上的力。

例如，注射入口应构造为使得系统的压力可被平衡以基本上防止注射通道中的流体和/或乳液流入微流体通道中，除非在微流体通道中存在压降并且与注射界面直接接触，并且存在足够的活化能以促进微流体通道中的液滴与注射通道中的流体和/或乳液之间的体积的注射。因此，当不存在与注射界面直接接触的液滴时，或者在存在与注射界面直接接触的液滴但不存在用于破坏液滴与流体和/或乳液之间的界面的机构的情况下，基本上不存在进入或离开液滴或者进入或离开注射通道的净正或净负体积流动，这是因为推动体积离开注射通道并进入液滴的力基本上被推动体积离开液滴并进入注射通道的力平衡。因此，在一些实施方案中，当不存在与注射界面直接接触的液滴时，或者在存在与注射界面直接接触的液滴但不存在用于破坏液滴与流体和/或乳液之间的界面的机构的情况下，系统可被构造以基本上防止来自注射通道的流体和/或乳液滴入微流体通道中。

用于破坏液滴与流体和/或乳液之间的界面的机制可选自本领域技术人员已知和理解的任何被动或主动方法或其组合。Xu等,“微流体系统中的液滴聚结(DropCoalescenceinMicrofluidicSystems)”,MicroandNanosystems(2011)第3卷,第2期,第131-136页，其全部内容以引用的方式并入本文中，它描述了在液滴聚结情形中的许多界面破坏机制，但同样适用于多个基本上受控体积注射进入或离开液滴，如本领域技术人员将知道、了解和理解。

用于破坏界面的被动方法不需要外部能量并且可能主要依赖于微流体通道和相关联的注射通道和相应的注射入口的结构和表面特性。用于破坏界面的被动方法包括(但不限于)流动俘获和表面改性，其由Xu等进一步描述并且将为本领域技术人员所知和理解。

如本文所用的“膨胀”是指通过注射或将流体或其他组分转移到运载体中的其他方式如通过扩散或渗透控制扩散来增加运载体的体积或含量，或者在样品的情况下，是指增加允许扩增(例如，PCR、细胞分裂或用于增加样品的含量或体积的其他机制)的样品的体积或含量以使得样品或运载体的大小、体积和/或含量相比于在膨胀之前变得相对更大。如本文所用的“分割”是指样品或运载体的划分、细分和/或分割以使得样品或运载体的大小、体积和/或含量相比于在分割之前变得相对更小。

因此，在一个实施例中，运载体(例如，微滴)内的样品可扩增(例如，通过PCR、细胞分裂或用于增加样品含量的其他机制)一次、两次或多次(包含多个样品)和/或在级联测定法中分割一次、两次或多次以形成多个单独的样品。同样，在另一个实施例中，含有样品的运载体可膨胀一次、两次或多次和/或分割一次、两次或多次以形成多个运载体，其中每个运载体可在级联测定法内包含一个或多个样品。此外，在另一个实施例中，可将第一运载体中存在的样品注入第二运载体中，其中所述第二运载体在级联测定法内可能包含或可能不包含一个或多个另外的样品。此外，在另一个实施例中，样品可在载体(例如，珠粒)表面上扩增。在这个实施例中，所述载体还可存在于包含多个载体的运载体内，其中每个载体在其表面上包含至少一个样品，并且其中每个样品随后与其相应的载体分离，接着随着运载体在级联测定法内分割一次或多次，一个或多个样品与一个或多个其他样品选择性分割。在这个实施例中，在样品与其相应载体分离后，随着运载体被分割一次或多次，所述载体可能或可能不从运载体去除。

在一个实施方案中，所述系统是集成的微流体装置。如本文所用的“微流体装置”是能够在通常以例如毫升(mL)、微升(μL)、纳升(nL)、皮升(pL)或飞升(fL)体积的体积测量的小规模和/或通过例如毫米(mm)、微米(μm)(也称为“微米(micron)”)、纳米(nm)等的物理规模下在液态或气态流体上实现决定性作用的方法的装置。功能可包括混合、分裂、分选、加热等。微流体装置可包含作为用于从一个点转移流体或样品到另一个点的手段的微流体通道并且通常具有在mm、μm或nm尺度上的均匀横截面。

存在多种方法和材料并且将为本领域技术人员已知和理解用于构建微流体通道和其网络，例如在美国专利No.8,047,829和美国专利申请公开No.20080014589中所述的那些，所述文献各自以全文引用的方式并入本文中。例如，可使用简单的管材构建微流体通道，但还可涉及将一个包含开放通道的平板的表面密封到第二平板。可形成微流体通道的材料包括硅、玻璃、硅酮如聚二甲基硅氧烷(PDMS)，和塑料如聚(甲基丙烯酸甲酯)(称为PMMA或“丙烯酸树脂”)、环烯烃聚合物(COP)和环烯烃共聚物(COC)。相同的材料也可用于第二密封平板。用于两个平板的材料的相容性组合取决于用于将它们密封在一起的方法。微流体通道可在需要时封闭在光学透明材料中以在需要时允许样品的光激发(产生例如荧光)或照明(导致例如选择性吸收)，并且随着样品流过微流体通道而允许来自样品的光的光谱特性的光检测。展现高光学透明性和低自发荧光的这种光学透明材料的优选实例包括(但不限于)硼硅酸盐玻璃(例如SCHOTT玻璃(SchottNorthAmerica,ElmsfordNY))和环烯烃聚合物(COP)(例如，(ZeonChemicalsLP,LouisvilleKY))。

图1是用于执行级联测定法的系统的一个实施方案的实施例的图示。在这个实施例中，示出基于两阶段集成乳液的微流体系统，其中所述系统可用于执行如下文更详细地讨论的包含第一阶段和第二阶段的级联测定法。这个实施例中的系统140提供各种功能的执行，包括(但不限于)目标核酸选择和扩增、测定法、检测和数据分析。然而，所述系统、样品和试剂可相应地修改以执行任何类型的测定法。

在通过图1中所描绘的系统执行的级联测定法的第一阶段中，将样品DNA引入样品容器148中。将被独特标记(例如，用独特荧光团标记)并包含在呈乳液形式的液滴(例如，引物液滴，即，包含一个或多个不同序列的寡核苷酸引物的液滴)内的PCR引物引入试剂容器141和142中。试剂容器141中的引物液滴在引物通道144中流动并且试剂容器142中的引物液滴在引物通道143中流动。引物通道143与引物通道144在微流体通道145处相交。引物液滴以使得所述引物液滴以交替方式进入微流体通道145的方式在引物通道143和144中流动。将DNA聚合酶引入试剂容器149中。样品容器148和试剂容器149各自进一步包含选择和扩增试剂和组分，例如(但不限于)PCR引物、缓冲液、dNTP和BSA(牛血清白蛋白)。

在这个实施例中，试剂容器141中的引物液滴相比于试剂容器142中的引物液滴被不同地标记(例如，荧光标记)以使得所述标记可在最终检测阶段被监测到。在进入微流体通道145后，引物液滴被来自容器146的油(或者可选地，能够维持液滴分离的任何流体)相对均匀地间隔。这产生相对均匀间隔的引物液滴147，其中所述引物液滴147在特定流速下以相对均匀距离间隔。首先通过样品容器注射器150向各个均匀间隔的引物液滴147中注入来自样品容器148的样品，接着通过试剂注射器151注入来自试剂容器149的DNA聚合酶。

这种方法导致形成相对较大的液滴152，其中每个液滴包含在微流体通道145内流动的样品DNA、引物和PCR试剂。所述液滴152接着流过蜿蜒状微流体通道155，同时反复地通过两个温度区，分别为第一温度区153和第二温度区154，作为进行样品DNA的PCR扩增的方法的一部分。第一温度区(变性温度区)153允许样品DNA的变性。可选地，所述系统可被修改以允许三步PCR方法，由此样品DNA通过经受系统内的多个受控温度区而进行PCR扩增，如本领域技术人员将了解和理解。随着液滴152流过蜿蜒状微流体通道155，它们通过交替的温度区153和154作为PCR方法的一部分，产生包含PCR扩增的样品DNA的PCR产物液滴156。

图1中示出的系统还包括包含液滴内所含的DNA探针库的DNA探针液滴容器157。通过DNA探针液滴注射器171从DNA探针液滴容器157注入包含DNA探针的液滴(探针液滴)160，所述DNA探针液滴注射器171与微流体通道159相交。随着探针液滴160被注入微流体通道159中，它们被通过油注射器172从油容器158注入的油相对均匀地间隔。

在通过图1中描绘的系统执行的级联测定法的第二阶段中，随着PCR产物液滴156流过蜿蜒状微流体通道155，在蜿蜒状微流体通道155与微流体通道159相交处，各单独的PCR产物液滴156的一部分或全部可通过注射器161注入在微流体通道159中流动的一个或多个探针液滴160中。接着，通过试剂容器注射器162向探针液滴160注入来自试剂容器163的检测测定试剂(例如，用于测序反应的试剂，包括(但不限于)基于杂交的测序反应)。可选地，这个实施例中的系统140可被修改以使得注射次序可逆转，即，在注射PCR产物液滴156之前将检测测定试剂注入探针液滴160中。在这个实施例中，电极(未示出)提供用于破坏探针液滴160与包含被注入探针液滴160中的物质(在这个实施例中是PCR产物液滴和检测测定试剂)的流体和/或乳液之间的界面的机制。不管注入顺序如何，结果是包含探针加扩增样品的液滴，本文称为预温育液滴173。

在一个实施方案中，如WO2012/078710中所述检测杂交，所述文献以全文引用的方式并入本文中。简言之，这种方法可涉及产生包含荧光标记或其他可检测物质的目标核酸扩增子，例如，共价连接至荧光标记并与包含淬灭剂的抑制剂多聚核苷酸退火的核酸序列，以使得抑制剂多聚核苷酸与目标核酸的杂交导致荧光标记信号的淬灭。检测核酸(即，与抑制剂多聚核苷酸杂交的靶标相关的序列)可为目标序列扩增子的一部分或者可添加至目标核酸序列。探针液滴(160)内的测试引物(即，反应分区中的一个或多个引物)可与来自PCR产物液滴(156)的目标核酸/抑制剂多聚核苷酸双链体和链置换聚合酶(例如，来自163)组合，以使得如果引物与目标核酸退火，则聚合酶延伸引物并置换抑制剂多聚核苷酸，从而产生荧光信号，指示引物已杂交。如果引物不杂交，则淬灭剂未被置换并且未检测到(或检测到减弱的)信号。注意，在替代性配置中，淬灭剂和荧光标记也可分别连接至目标核酸和抑制剂多聚核苷酸。链置换测定法可等温发生并且因此不需要热循环。在一些实施方案中，目标核酸将作为扩增子产生，其具有5'荧光标记和任选地3'茎(即，通过寡核苷酸与3'端的杂交形成的双链端)或茎环。

可通过除油剂164从微流体通道159去除过量的油并收集在废物容器165中。去除过量油允许紧密堆积为预温育液滴173，接着通过温育温度区166，同时以相对均匀的方式流动，允许每个液滴经历相对相同量的温育时间并保持为预温育液滴173的收集装置的成员，这与接受可变的温育时间或与其他预温育液滴偏离相反。温育温度区166的温度可包含一个、两个或多个温度；一个、两个或多个温度梯度；一个、两个或多个温度循环，或上述的任何组合。在温育后，将液滴称为温育后液滴174，其然后通过经由油注射器168用来自油容器167的油间隔而以相对均匀的方式通过温度区166。探针液滴160的相对均匀间隔必须足以分隔温育后液滴174以通过检测器169和使用者进行单独的检测和分析。在检测后，将温育后液滴174收集在废物池170中。

在一些实施方案中，微滴是被不混溶载体流体(例如，油)包围的水性微滴。在一些实施方案中，微滴是被不混溶载体流体(例如，水溶液)包围的油微滴。在一些实施方案中，本文所述的微滴是相对稳定的并且在两个或更多个微滴之间具有最小程度的聚结。在一些实施方案中，从样品产生的微滴的小于0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％与其他微滴聚结。

用于分割样品(例如，从样品形成微滴)的方法和组合物描述于例如已公开专利申请WO2010/036352、US2010/0173394、US2011/0092373、US2011/0092376、US2012/0222748、WO2013/09573和US2011/0218123中，所述专利申请各自的全部内容以引用的方式并入本文中。

在一些实施方案中，通过使油相流过包含待检测标记的水溶液来形成微滴。在一些实施方案中，包含待检测标记的水性样品包含用于检测标记的缓冲溶液和试剂。关于油相的油可为合成或天然存在的。在一些实施方案中，所述油包含碳和/或硅。在一些实施方案中，所述油包含氢和/或氟。示例性油包括(但不限于)硅油、矿物油、氟碳油、植物油或其组合。

所述油相可包含氟化基油，其可另外通过与氟化表面活性剂如全氟聚醚组合来稳定化。在一些实施方案中，所述基油包含HFE7500、FC-40、FC-43、FC-70或另一种常见氟化油中的一种或多种。在一些实施方案中，所述油相包含阴离子含氟表面活性剂。在一些实施方案中，所述阴离子含氟表面活性剂是Krytox铵(Krytox-AS)、KrytoxFSH的铵盐或KrytoxFSH的吗啉衍生物。Krytox-AS可以约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％或4.0％(w/w)的浓度存在。在一些实施方案中，Krytox-AS的浓度是约1.8％。在一些实施方案中，Krytox-AS的浓度是约1.62％。KrytoxFSH的吗啉衍生物可以约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％或4.0％(w/w)的浓度存在。在一些实施方案中，KrytoxFSH的吗啉衍生物的浓度是约1.8％。在一些实施方案中，KrytoxFSH的吗啉衍生物的浓度是约1.62％。

在一些实施方案中，所述油相还包含用于调节油特性如蒸气压、粘度或表面张力的添加剂。非限制性实例包括全氟辛醇和1H,1H,2H,2H-全氟癸醇。在一些实施方案中，1H,1H,2H,2H-全氟癸醇以约0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.25％、1.50％、1.75％、2.0％、2.25％、2.5％、2.75％或3.0％(w/w)的浓度添加。在一些实施方案中，1H,1H,2H,2H-全氟癸醇以约0.18％(w/w)的浓度添加。

在一些实施方案中，所产生的微滴的形状和/或尺寸是基本上均一的。例如，在一些实施方案中，所述微滴的平均直径是基本上均一的。在一些实施方案中，所产生的微滴具有约0.001微米、约0.005微米、约0.01微米、约0.05微米、约0.1微米、约0.5微米、约1微米、约5微米、约10微米、约20微米、约30微米、约40微米、约50微米、约60微米、约70微米、约80微米、约90微米、约100微米、约150微米、约200微米、约300微米、约400微米、约500微米、约600微米、约700微米、约800微米、约900微米或约1000微米的平均直径。在一些实施方案中，所产生的微滴具有小于约1000微米、小于约900微米、小于约800微米、小于约700微米、小于约600微米、小于约500微米、小于约400微米、小于约300微米、小于约200微米、小于约100微米、小于约50微米或小于约25微米的平均直径。在一些实施方案中，所产生的微滴的形状和/或尺寸是不均一的。

在一些实施方案中，所产生的微滴的体积是基本上均一的。例如，在一些实施方案中，所产生的微滴具有约0.001nL、约0.005nL、约0.01nL、约0.02nL、约0.03nL、约0.04nL、约0.05nL、约0.06nL、约0.07nL、约0.08nL、约0.09nL、约0.1nL、约0.2nL、约0.3nL、约0.4nL、约0.5nL、约0.6nL、约0.7nL、约0.8nL、约0.9nL、约1nL、约1.5nL、约2nL、约2.5nL、约3nL、约3.5nL、约4nL、约4.5nL、约5nL、约5.5nL、约6nL、约6.5nL、约7nL、约7.5nL、约8nL、约8.5nL、约9nL、约9.5nL、约10nL、约11nL、约12nL、约13nL、约14nL、约15nL、约16nL、约17nL、约18nL、约19nL、约20nL、约25nL、约30nL、约35nL、约40nL、约45nL或约50nL的平均体积。

使微滴交错的系统、装置和方法

在一些方面，提供用于执行使两种先前形成的含有所关注样品的液滴群体以基本上交替方式交错(以交替次序添加)的方法的系统和试剂。在一些实施方案中，提供用于标记先前形成的液滴群体的一部分并且然后使被标记液滴和未被标记液滴以基本上交替方式交错的方法和系统。在一些实施方案中，系统包括能够产生一系列或一连串的交替液滴的微流体装置。在一些方面，所述系统和方法通过被动流体动力学力而无需计算机、光检测器或其他主动控制机构来提供不同标记的液滴的交替流动，因此提供已知技术的更简单和有效的替代技术。

本文所述的系统和方法产生在两种不同可检测状态的微滴之间交替的一系列微滴，其中所述可检测状态是指例如微滴颜色的差异或一个微滴与下一个微滴之间的特定颜色强度的差异。图2是系统(2120)的实施例的图示，其中所述系统由具有用于不同标记的微滴的两个入口(2121和2124)的微流体装置构成。两种不同标记的液滴群体(2123和2122)沿着通道(2126和2125)流向连接点(2128)。这个连接点(2128)上游是任选的连接通道(2127)，其允许连续相流体在通道(2125和2126)之间流动，并且定尺寸以使得所述微滴过大以致于不能进入所述连接通道。在连接点(2128)之后，在联合微流体通道(2112)中，两种不同标记的微滴群体以基本上一个接一个的交替方式交错。图2中的实施方案发生在例如图1的项目141-145中。

参看图3，它是根据本发明的系统(3150)的实施例的图示，其中所述系统包含微流体装置，其中入口(3151)中初始均质微滴群体的一半在连接点(3156)被标记(3157)标明。这种标记是通过破坏不混溶标记(3157)与连续相之间的界面的方法进行的，例如通过使用经由电极(3155)施加的电场。对于在连接点(3156)处不混溶标记(3157)与微滴之间的界面被电场中断的情况，接近连接点(3156)的微滴可被间隔以使得邻近的微滴由于电场的存在而不聚结。被标记的微滴(3158)和未被标记的微滴流向下游连接点(3128)，在这里它们以一个接一个的交替方式在联合微流体通道(3112)中交错。

适当时可使用任何种类的标记。标记可包括例如散射光、以化学发光形式发光(例如，通过化学方法)、选择性吸收光或以荧光形式发光(例如，在激发后)的分子。可通过在标记存在下破坏连续相(例如，油)/微滴界面，从而将所述标记插入微滴中，而将标记插入微滴中。用于破坏连续相/微滴界面的机制可能选自本领域技术人员已知和理解的任何被动或主动方法或其组合。Xu等,“微流体装置中的微滴聚结(DropletCoalescenceinMicrofluidicdevices)”,MicroandNanomicrofluidicdevices(2011)第3卷,第2期,第131-136页，其全部内容以引用的方式并入本文中，它描述了在微滴聚结情形中的许多界面破坏机制，但同样适用于具有多个基本上受控体积的流体的微滴的膨胀，如本领域技术人员所知、了解和理解。

用于破坏连续相/微滴界面的被动方法不需要外部能量并且可能主要依赖于微流体通道和相关联的增压泵和相应的增压泵喷嘴的结构和表面特性。用于破坏界面的被动方法包括(但不限于)流动俘获和表面改性，其由Xu等进一步描述并且将为本领域技术人员所知和理解。

用于破坏连续相/微滴界面的被动方法的实例包括(但不限于)在微流体通道中使用局部化亲水区域，其中所述微流体通道包括疏水性壁并在流过其中的连续油相中含有水性微滴。所述微流体通道的疏水性壁防止微滴的润湿并促进微滴与微流体通道表面之间的连续相的薄层的存在。然而，当微流体还包含相对亲水性的局部化区域时，随着微滴流过这个局部化区域，发生微滴的润湿，从而导致先前稳定的界面的破坏和流体膨胀到微滴中。一旦微滴流过这个局部化区域，连续相将自然地再润湿微流体通道壁并且因此促进微滴的再形成和稳定化。可通过本领域技术人员已知和理解的各种方法在疏水性微流体通道中产生局部化亲水性区域，所述方法包括(但不限于)用具有可用紫外(UV)光起始的表面化学的材料构建微流体通道，以使得用UV光照耀局部化区域将诱发所述表面化学，从而导致所述区域的材料表面特性从相对疏水性变成相对亲水性。

用于破坏连续相/微滴界面的被动方法的其他实例包括随着微滴通过微流体通道的特定区域在微滴路径中创建旨在增加微滴上的剪切力的柱或其他破坏，或者可选地，在微流体通道的壁中并入阀门或变形以物理收集微滴来促进界面的至少一部分的失稳。这些方法各自产生相对不稳定的界面，如上所述，所述相对不稳定的界面在微滴通过破坏区域时再形成并稳定化。

用于破坏连续相/微滴界面的主动方法需要由外部场产生的能量。用于破坏界面的主动方法包括(但不限于)电聚结(即，通过使用例如与流体接触或在流体外部的一对或多对电极来施加电场)和介电电泳(DEP)、温度和气动致动方法，包括使用激光器和声压方法，其中许多由Xu等描述并且将为本领域技术人员已知和理解。

用于破坏连续相/微滴界面的主动方法的实例包括(但不限于)改变微流体装置的局部化区域中的温度，导致温度依赖性粘度和表面张力变化，从而影响微滴与流体和/或乳液之间的界面的破坏。例如，激光器可聚焦(呈“激光点”形式)在涵盖膨胀界面的微流体通道的区域上。激光点周围的这种温度的空间变化将促进微滴表面张力的空间不平衡，从而导致界面上的热毛细管作用并因此使界面失稳。在另一个实施例中，可使用声压波来破坏微滴的表面，改变微滴的润湿性或操纵微滴的位置。关于先前所讨论的方法，这些方法各自产生相对不稳定的界面，如上所述，一旦微滴通过破坏区域，所述相对不稳定的界面就再形成并稳定化。

在一个或多个实施方案中，用于破坏连续相/微滴界面的机构选自至少一对电极。在这些实施方案中，所述至少一对电极可基本上垂直于微流体通道定位。在一个或多个实施方案的一些方面，所述至少一对电极可基本上相对于一个或多个增压泵定位。所述至少一对电极向一个或多个膨胀界面施加电场。在一些实施例中，所述至少一对电极可定位以使得所述电极产生最大限度地定位于一个或多个膨胀界面内或至少接近于膨胀界面的电场。

在其中利用至少一对电极作为用于破坏如上所述的连续相/微滴界面之间的界面的结构的实施方案中，所述电极可相对于微流体装置的其他组件以多种配置定位。例如，至少一对电极的第一电极和第二电极可定位于微流体通道上方或下方。在一些情况下，至少一对电极的第一电极和第二电极可基本上定位在微流体通道的相对侧。在其他情况下，至少一对电极的第一电极和第二电极可基本上定位在微流体通道和一个或多个增压泵的相对侧。在其他情况下，至少一对电极的第一电极和第二电极可定位以使得平面与两种电极相交。在其他情况下，至少一对电极的第一电极和第二电极可定位为与微流体通道共面和/或与一个或多个增压泵共面和/或与一个或多个增压泵喷嘴共面，以使得所述电极被定位以使得平面与这些电极各自相交。在这个实施方案的另一个方面，特定一对电极中仅一个电极需要被局部化。例如，大的接地平面可充当许多单独的局部化电极。在另一个实施例中，连续相流体(其可能是或可能不是膨胀通道中的流体)可充当一对电极中的一个。

所述电极可由将为本领域技术人员所了解和理解的任何合适的材料制造。例如，所述电极可由如下材料制造，所述材料包括(但不限于)金属、准金属、半导体、石墨、导电聚合物和液体，包括(但不限于)离子溶液、导电悬浮液、液体金属等。所述电极可具有适于施加电场的任何形状，如本领域技术人员所了解和理解。例如，电极可具有基本上矩形形状。在这个实施例中，所述电极可以是细长的并具有定义为最接近于膨胀界面的电极区域的尖端。所述电极尖端被构造为使得在所述相交中或基本上接近如先前所述的膨胀界面产生足够的电场。

在使用一对以上电极的一些实施例中，所述电极可被构造以最小化一个或多个电极与一个或多个增压泵之间的干扰，其例如通过最小化第一界面对电场的非预期暴露来实现，所述电场是通过旨在使相比于第一界面在不同位置定位的第二界面暴露于电场的电极施加的。在一些方面，这可通过降低电极尖端的尺寸以允许电极尖端的电场施加更为聚焦来实现，以使得一个或多个界面并非故意暴露于电场，和/或暴露于相对较低的电场强度。在其他方面，可例如通过添加呈小凸块形式的尺寸或出于定位和加强膨胀界面周围的电场目的的其他修改来修改包含增压泵和相应的增压泵喷嘴的区域。本发明的这些方面可能是有利的，例如，在希望降低多个微流体通道之间的距离的情况下，各自与多个增压泵和相应的增压泵喷嘴相联作为微流体装置的一部分。

微滴的微流体操纵的方面描述于美国专利公开No.2011/0264757和PCT公开No.WO2014/043388中，和其中引用的参考文献中，其各自以引用的方式并入。可供本发明使用的微流体系统的非限制性实例公开于：2005年10月7日提交的美国专利申请序列号11/246,911，名称为“流体物质的形成和控制(FormationandControlofFluidicSpecies)”，在2006年7月27日以美国专利申请公开No.2006/0163385公开；2004年12月28日提交的美国专利申请序列号11/024,228，名称为“用于流体分散的方法和装置(MethodandApparatusforFluidDispersion)”，在2005年8月11日以美国专利申请公开No.2005/0172476公开；2006年2月23日提交的美国专利申请序列号11/360,845，名称为“流体物质的电子控制(ElectronicControlofFluidicSpecies)”，在2007年1月4日以美国专利申请公开No.2007/000342公开；2006年3月3日提交的国际专利申请No.PCT/US2006/007772，名称为“用于形成多种乳液的方法和装置(MethodandApparatusforFormingMultipleEmulsions)”，在2006年9月14日以WO2006/096571公开；2006年3月3日提交的美国专利申请序列号11/368,263，名称为“形成粒子的系统和方法(SystemsandMethodsofFormingParticles)”，在2007年3月8日以美国专利申请公开No.2007/0054119公开；2007年3月28日提交的美国临时专利申请序列号60/920,574，名称为“多种乳液和形成技术(MultipleEmulsionsandTechniquesforFormation)”；和2006年1月20日提交的国际专利申请No.PCT/US2006/001938，名称为“用于形成囊封在粒子如胶状粒子中的流体微滴的系统和方法(SystemsandMethodsforFormingFluidicdropletsEncapsulatedinParticlesSuchasColloidalParticles)”，在2006年7月27日以WO2006/078841公开，所述文献各自以全文引用的方式并入本文中。

乳液的连续相中的受控变化

在一些方面，提供用于执行来自微流体装置中的乳液的连续相体积分数的受控变化的系统、方法和试剂盒。所述系统的一个实施方案涉及用于执行来自乳液的连续相体积分数的受控变化的微流体装置。所述微流体装置可包括一个或多个微流体通道作为将微滴、流体和/或乳液从一个点转移到另一个点的方式和连接至一个或多个微流体通道并与其连通的一个或多个相对较小的(例如，小于微流体通道中的微滴的平均直径)提取通道或膜。例如，微流体通道可运载直径为约10-30μm的微滴并包含1-10μm宽横截面、例如2-6μm的较小提取通道。在这个实施方案的一个方面，一个或多个提取通道或油渗透性膜是用于从一个或多个微流体通道提取连续相体积分数并将所述连续相体积分数转移到一个或多个微流体通道的另一个中的方式。在一些方面，提供用于执行来自如先前和本文进一步描述的微流体装置中的乳液的连续相体积分数的受控变化的方法。这个章节中所述的方面可以包括在例如图1中在项目146-147或164-165所描绘的系统中。

这些方面的微流体装置可包括用于将微滴、流体和/或乳液从一点转移到另一个点的一个或多个微流体通道和连接至一个或多个微流体通道并与其连通的一个或多个相对较小的提取通道，并且其中所述一个或多个提取通道是用于从一个或多个微流体通道提取乳液并将所述乳液转移到一个或多个微流体通道中的另一个中的方式。

所述乳液(包括其中所包含的连续相和分散相，其中所述分散相可包含一个或多个微滴)可以通过被正或负压力源、例如加压或抽空空气储集器、注射泵、重力或向心力作用而流过微流体通道，其中所述压力源包含任何流体或流体组合，包括(但不限于)任何气体或气体组合(例如，空气、氮气、二氧化碳、氩气等)或任何液体或液体组合(例如，水、缓冲液、油等)，以使得所述乳液和微滴流动或流注通过微流体通道并且在本文中称为“流动乳液(或微滴)”或“流注乳液(或微滴)”。在一些实施方案中，微流体通道的尺寸(或直径)足够窄以使得微滴以基本上单个列队形式流过微流体通道。

在一些实施方案中，所述系统包括微流体装置。在这个实施方案的一个方面，所述微流体装置包括相对于一个或多个另外的微流体通道以任意角度布置的第一微流体通道。在一个实施例中，第一微流体通道基本上平行于第二微流体通道布置。在一些实施方案中，其可用于一个或多个微流体通道以封闭在光学透明材料中。在一个实施方案中，一个或多个微流体通道各包含乳液进入所通过的一个或多个入口和连续相离开所通过的一个或多个出口。

在所述系统的一个实施方案中，所述系统包括包含第一微流体通道和第二微流体通道的微流体装置，所述微流体通道各自通过基本上垂直于所述第一微流体通道和所述第二微流体通道布置的一个或多个提取通道或膜连接并与其连通。在这个实施方案的一个方面，所述第二微流体通道可受控加压以使得当乳液被引入微流体装置中时，连续相的受控体积分数流出第一微流体通道，通过一个或多个提取通道或膜并进入第二微流体通道，而乳液(例如，微滴和一些连续相(例如，油))的分散相保留在第一微流体通道中。

在另一个实施方案中，所述微流体装置包括通过一组以上的提取通道或膜连接的多个(即，三个或更多个)微流体通道。在另一个实施方案中，所述提取通道或膜在除了基本上垂直于一个或多个微流体通道之外的角度下布置。在另一个实施方案中，两个或更多个微流体通道在除了基本上彼此平行之外的角度或位置下布置。在另一个实施方案中，一个或多个微流体通道呈同心管形式，所述同心管沿着所述管的内侧包含小孔或膜表面。

在所述系统的一个实施方案中，将包含分散于其中的微滴的乳液引入第一微流体通道中并通过被如上所述的压力源泵送或推动而流过第一微流体通道。第二微流体通道的压力允许连续相通过相对较小的提取通道或膜从第一微流体通道流入第二微流体通道中，而基本上没有从第一微流体通道去除连续相微滴。在一个实施例中，第二微流体通道中的压力降至低于第一微流体通道的压力，以使得产生连续相流入第二微流体通道中。然而，在这个实施例中，微滴留在第一微流体通道中，因为第一微流体通道与第二微流体通道之间的压力差不够大以致于不能迫使分散相微滴通过相对较小的提取通道或膜。结果是相对于在被引入微流体装置中之前的乳液具有较低体积分数的连续相的乳液。

各微流体通道、提取通道或膜的入口和出口可具有任何形状，包括(但不限于)圆形、椭圆形、三角形、矩形等。所述出口可具有例如小于约1mm、小于约100μm、小于约10μm、小于约1μm、小于约100nm、小于约10nm等的平均横截面尺寸。

在一个或多个实施方案中，来自乳液的连续相体积分数的受控变化的特定体积是任何合适的量，取决于实施方案。例如，来自乳液的连续相体积分数的受控变化的体积可能是油/液滴相的大约或小于0.1％、1％、5％、10％。

图4是用于执行来自乳液的连续相体积分数的受控变化的微流体装置的一个实施方案的实施例的图示。更具体地，图4示出微流体装置4100，其中分散相微滴(4101，统称)以基本上单个列队形式在第一微流体通道4104中流动，其在流动方向4110上被连续相4111隔开。在这个实施例中，第一微流体通道4104与第二微流体通道4103相对平行定向。然而，如先前所讨论，一个或多个微流体通道可以彼此任何定向使用。第一微流体通道4104和第二微流体通道4103在这个实施例中连接至一系列提取通道(4102，统称)(其在替代实施例中可取代膜)并与其连通，所述提取通道连接至第一微流体通道4104和第二微流体通道4103各自的一侧。在这个实施例中，所述系列的提取通道4102基本上彼此平行并且基本上垂直于第一微流体通道4104和第二微流体通道4103布置。然而，如先前所讨论，一个或多个提取通道可以彼此和相对于一个或多个微流体通道的任何定向使用。在图4中示出的实施例中，提取通道4102以彼此相对平行定向和关于第一微流体通道4104和第二微流体通道4103各自的相对垂直定向出现。

微流体装置4100是通过设置第二微流体通道4103的出口4106处的压力(并因此控制流速)以使得出口4106的压力低于第一微流体通道4104的出口4107的压力来操作的。因此，连续相4111可流过提取通道4102和第二微流体通道4103而不剪切分散相微滴4101或使其变形。

提取通道4102的宽度经过选择以充分小于分散相微滴4101的直径。例如，在一些实施方案中，提取通道的宽度或横截面比液滴直径小0.5、0.25、0.2、0.1、0.01或更小。第一微流体通道4104与第二微流体通道4103之间的压力差经过选择以防止分散相微滴4101流过提取通道4102。第二微流体通道4103的宽度被选择为相对较大以避免高流体动力学阻力和因此在第二微流体通道4103的出口4106处的高压力。当分散相微滴4101流过提取通道4102时，连续相4111的一部分通过提取通道4102，从而降低第一微流体通道4104中的连续相的分数并降低分隔微滴的距离。这导致在第一微流体通道4104中形成相对堆积的乳液4105，从而能够实现微流体装置中的特定连续相体积分数的选择和维持。

图5是用于执行来自根据本发明的微流体装置中的乳液的连续相体积分数的受控变化的系统的另一个实施例的三维图示。更具体地，图5示出微流体装置5130的一个实施方案的三维视图，其中从第一微流体通道5104的基本上相对侧提取连续相。在这个实施例中，连续相5111是通过两组提取通道(对于微流体装置5130内的第一微流体通道5104的各自的相应侧，共同示为5102A和5102B)从乳液提取的，然而，分散相微滴5101未被提取到通道5102A或5102B中的任一组中。相反，分散相微滴5101在流动方向5110上持续流动通过第一微流体通道5104以形成相对堆积的乳液5105，由此随着连续相逐步地通过微流体装置5130提取而发生更紧密地堆积。随着第一微流体通道5104与提取通道组5102A和5102B内的连续提取通道相交，第一微流体通道5104逐渐地加宽，导致由于泊肃叶流(Poiseuilleflow)的存在而以可变微滴速度堆积乳液。经由提取通道组5102A和5102B对连续相5111的进行性提取降低了在第一微流体通道5104中流动的乳液中的连续相体积分数，产生相对堆积的乳液5105，相比于横截面5108所占据的部分，所述乳液5105占据横截面5109的较大部分。

图6是用于执行来自根据本发明的乳液的连续相体积分数的受控变化的微流体装置的一个实施方案的实施例的图示。更具体地，图6示出微流体装置6140，其中分散相微滴(6101，统称)在如图示的流动方向6110上以基本上单个列队形式在第一微流体通道6104中流动。在这个实施例中，第一微流体通道6104与第二微流体通道6103相对平行定向。第一微流体通道6104和第二微流体通道6103在这个实施例中连接至膜6112(如上文所讨论，其在替代实施例中可取代提取通道)并与其连通，所述膜连接至第一微流体通道6104和第二微流体通道6103各自的一侧或多侧。在这个实施例中，膜6112基本上垂直于第一微流体通道6104和第二微流体通道6103。

图7是用于执行来自根据本发明的乳液的连续相体积分数的受控变化的微流体装置的一个实施方案的实施例的图示。更具体地，图7示出微流体装置7140，其中分散相微滴(7101，统称)在如图示的流动方向7110上以基本上单个列队形式在第一微流体通道7104中流动。在这个实施例中，第一微流体通道7104与第二微流体通道7103平行或相对(例如，小于20°，其中0°是平行)平行定向。第一微流体通道7104和第二微流体通道7103在这个实施例中连接至宽低轮廓通道7112(如上文所讨论，其在替代实施例中可取代提取通道)并与其连通，所述宽低轮廓通道连接至第一微流体通道7104和第二微流体通道7103各自的一侧或多侧。在这个实施例中，宽低轮廓通道7112的高度基本上小于(例如，0.5、0.25、0.2、0.1、0.05、0.01或更小)液滴7101直径以使得所述液滴不被提取到通道7112中。

图8是示出用于执行来自根据本发明的微流体装置中的乳液的连续相体积分数的受控变化的系统的实施方案的实施例的明场显微照片。更具体地，图8是使用如“软光刻(SoftLithography)”,Xia,Y.和Whitesides,G.M.,德国应用化学杂志(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.),1998,37,550-575中所述的标准多层软光刻技术，在聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)中制造的微流体装置8160的明场显微照片。简言之，SU8负环氧光阻剂(MicroChem公司)层旋涂在硅晶圆上并通过mylar光掩模暴露于UV，产生图案化原版。针对原版浇注PDMS，然后粘合到载玻片上。

微流体装置8160的操作与图4中所示的微流体装置4100的操作基本上相同。随着分散相微滴8101如流动方向8110所示在第一微流体通道8104中从右向左流动时，它们通过一系列提取通道8102，所述提取通道连接至第一微流体通道8104和第二微流体通道8103并与其连通。每次每个分散相微滴8101通过一系列提取通道8102中的后续提取通道，从第一微流体通道8104去除连续相。在多次这种连续相提取情况后，产生相对堆积的乳液8105并且每个微滴在大致相同的速度下流动。

图9是示出根据本发明在例如在先前所讨论的微流体装置中进行提取过程之后在微流体通道中的紧密堆积乳液的实施例的明场显微照片。更具体地，图9是示出在连续相提取后在微流体通道9105中流动的紧密堆积的分散相微滴9101的明场显微照片。

用于使微滴均匀分布在用于平行检测的通道中的方法和装置

在微流体反应中，一些方面涉及高流速(例如，1-1000滴/秒)，而系统的其他部分可能涉及较缓慢的流速。例如，利用光学检测，微滴以单个列队形式流过光学检测点。这些微滴在所述点可花费小于一微秒，从而降低在检测窗上收集的光子数，因此导致小的信噪比。增加信号的一种方式是减慢液滴，从而允许在检测窗上收集更多的光子；然而，这也导致较缓慢的检测速率。相反，这个过程中的其他步骤可能更快或具有完全不同的流速，并且因此不同的通道可能需要流速的不同的向上或向下变化以实现适当的检测。

在一些实施方案中，提供使微滴均匀分配在平行微通道中以减慢微滴的方式，以使得它们可快速地通过光学检测器处理。这种过程是可逆的，因此平行的均匀流动的通道可以整合到较小数目的更快流动的通道中。例如，平行通道可用于图1的位置169-170以进行多次平行检测。

存在两种本文所述的一般策略以将微滴均匀分配在平行通道的网络中。第一种策略示于图10中，并且用微滴(10103)简单地填充非常大的腔室(10100)，其中所述腔室与离开通道(10101)相邻并流体连通，所述离开通道的直径相当于微滴的尺寸。由于腔室(10100)相比于离开通道(10101)的大尺寸(例如，至少2倍、3倍、5倍、10倍、20倍或更大)，进料通道中的压降将较小，以使得所述液滴将均匀分配在离开通道中。一旦在离开通道中，就可以直接地检测液滴，或通过在检测前添加油来间隔。任选地具有比离开通道(10101)更大的直径的另一个分流通道(10102)可连接至每个离开通道(10101)并提供连续相流体的流动。

第二种方法描绘于图11中并使用被动反馈效应来将微滴均匀分配在通道的分支网络中。这通过使用分支几次的单一狭窄通道来实现。在每个分支的分流通道(11101)(分别具有与图2-3中的通道2127和3127相同的功能)确保微滴均匀地流入下游通道中。发生此举的原因是，当液滴流入一个分支时，液滴增加所述分支的阻力，以使得分支的另一侧具有更直接的流动，被证明是更希望使后续液滴流动。因此，下个液滴将趋向于流入另一侧。考虑到液滴所产生的行为在分支之间合理地具周期性，这将导致液滴交替流过分支，和在平行通道中的均匀分配。这种方法优于第一种方法的优点在于，液滴将保持均匀流动和间隔到所有分支中，例如在一些实施方案中，因此额外的间隔步骤是不必要的。

使用上文指定的或在图10或图11中相反的系统将允许较大数目的均匀流动的输入通道整合成较小数目的较快速移动的均匀流动的通道。

在最小化液滴分散的同时将油与液滴分离

此外提供用于将油与微流体装置内的液滴分离的方法和装置，从而最小化液滴分散，即，液滴混合。这个章节的方面可包括在例如图1中在数字146-147或164-165下所描绘的系统中。最小化液滴分散可用于提高微流体装置中的精确度。本方法在不破坏液滴本身的情况下去除油并最小化分散。本发明提供将油与液滴分离的方法并且这样做也会降低液滴中的分散量。本发明还涉及在从通道去除油期间最小化液滴分散程度的系统。

在一些方面，在通道位置中，通常在接近油出口处包括成排的/与流动方向平行布置的柱行。通道内的柱防止液滴除了沿着预期流动方向之外移动。这种限制降低了液滴在它们进入通道时的随机重新排序，从而允许它们保持其原始时间或次序关联。通道内的柱而非额外的较小通道的使用将驱动流体通过这个区域所需的增压降至最小。如果需要的话，所述柱还允许油从大通道中部流向油出口(图12中的12103)。在一些实施方案中，柱行包括每行至少2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个柱。在一些实施方案中，存在至少2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个各自基本上平行的柱行。如本文所用，“柱”是指微通道内的固体材料，其可能与或可能不与通道的底部和顶部接触(但与底部或通道中的至少一个接触)并具有不大于通道中的微滴平均直径的0.7、0.5、0.3倍的直径或最大横截面。所述柱本身不产生物理通道，但在一行内间隔以基本上防止微滴在行之间移动。例如，在一些实施方案中，一行内的柱之间的距离不大于通道中的微滴的平均直径的1.5、1.2、1.0、0.9倍。行之间的距离将至少为微滴的平均直径，例如，平均微滴直径的0.9至1.5倍。

在一些实施方案中，在通道的两侧或更多侧存在出口，而非单一出口或一组出口，以产生更均匀的外流。

在一些实施方案中，柱定位于逐渐加宽的通道区域内。例如，加宽可以0.1-60度的倾角实现。

参看图12，在狭窄通道[12101]内以特定次序流动的液滴[12100]逐渐流入逐渐加宽的通道[12102]中。在一些实施方案中，随着液滴[12100]在现在较宽的通道内彼此分离，通过穿过小端口[12103]从通道的主要区域中抽吸出来去除浸没液滴的油，其然后流入平行姐妹通道[12104]中。剩余液滴[12100]被迫流入通过柱[12106]在通道本身内的布置而产生的小行[12107]中。

微粒过滤器

当使用基于微滴的微流体用于生物测定法时的一种功能可能是预先形成的液滴再次注入微流体装置中以进行另外的处理。预先形成的乳液可以是由标称相同尺寸、但含有不同试剂的液滴组成的库。例如，如图1中所示，141和142中的微滴可以预先形成并且然后分别引入通道144和143中。当再次注射时的挑战是以使得液滴不分裂或合并的方式引入液滴，同时防止灰尘或其他污染物进入装置。

为了防止灰尘进入，可以使用过滤器。在一些实施方案中，所述过滤器由具有能够截留微粒的狭窄间隙的结构阵列构成。然而，普通的微流体过滤器可以将重新注入的液滴撕成小块。截留在过滤器中的少量灰尘也可能会导致多个液滴合并。

因此，在一些实施方案中，提供过滤器，其不仅将在微流体装置内产生清洁的环境，而且也不会干扰在装置内存在的液滴。在一些实施方案中，提供在本文被称为“微滴过滤器”的装置，其从预先形成的乳液过滤灰尘，同时允许液滴在不会分裂开的情况下通过或通过已经聚结在灰尘粒子上的液滴。在一些实施方案中，微滴过滤器具有可有效地过滤乳液的几何结构，将微滴内含物保持在乳液中，同时基本上过滤灰尘或微粒。此外，在一些实施方案中，这种几何结构不具有高纵横比特征(厚度:宽度)，通常在1:1下，以使得它可以被注塑成型以用于热塑性微流体装置。

在一些实施方案中，微滴过滤器由柱阵列构成，但是还包含如下文段落中所述的一种或多种特征。

在一些实施方案中，在柱阵列之前，在流动路径中添加层梯级，其充当大多数疏水性微粒的保持点。这个层代表厚度差异，以使得液滴被约束并且必须压缩才能流过。

在一些实施方案中，当孔被定尺寸以达到适当过滤程度时，在过滤器上的流体动力学阻力可能非常高。降低阻力的一种选择是使孔非常高并且宽度很窄。不幸的是，这可允许微粒通过并产生难以制造的几何结构。因此，在一些实施方案中，通过将孔安置在不同层厚度上来降低流体动力学阻力，以使得高阻力区域被最小化，并且特征不是高纵横比(1:1/厚度:宽度)。这导致适当的过滤以及可通过常规热塑性注塑成型方法制造的过滤器。

在降低厚度区域内的过滤器的柱可被间隔以使得液滴倾向于流过而不分裂成更小的液滴。微滴界面处于通过空间限制施加的不同方向的剪切应力所造成的应变下。孔宽度、限制层厚度和甚至其他液滴的作用都可以影响微滴破裂和聚结。现有的布局确保对于所需的过滤程度将剪切应力最小化。

在一些实施方案中，过滤器的连续行之间的间隔远远大于液滴，从而允许液滴通过并且不会同时被多个限制孔压迫。在一些实施方案中，形成阵列的过滤器柱远远大于过滤器区域内的液滴或液滴的扁平突起。这确保液滴在通过柱时不变形，并提高了过滤器的稳定性。它还建立了固持模式，以使得液滴相对于柱上的张力在孔之间定向。

通过将相邻的柱或过滤孔彼此成排交错或安置，可以防止微粒造成微滴破裂或聚结的方式实现过滤，这可产生流体动力学阻力和潜在地微滴破坏性区域。在一些实施方案中，微滴过滤器包含三行圆形柱，以使得柱阵列在例如9μm厚度区域中，并且周围区域是例如20μm厚度。因此随着微滴进入9μm区域将它们压缩。

然后通过流过(例如，9μm)孔，在区域内的柱之间移动，将液滴进一步压缩。连续行有助于捕获非刚性微粒，使其通过前行。柱的对准在图13中描绘为线性，但可以降低阻力或更好地辅助捕捉微粒的任何方式成角度或定向。

以下描述在图13、图14A、图14B和图14C内所述的特征：入口端口(13101)、流动方向(13102、14102)、过滤柱(13103、14103A、14103B)、出口端口(13104)、过滤器前的液滴(14110)、过滤器内的液滴(14111)、过滤器后的液滴(14112)、通道高度变化(14113)。

高速间隔

基于微滴的微流体装置通过在液滴上执行一系列功能而执行在微滴内的生物测定法。例如，为了执行测序反应，可向微滴装载目标DNA，然后与含有探针或引物、酶和其他测序试剂的微滴合并。在这些反应中，能够精确地操纵单独的微滴是非常有帮助的。

确保一对一相互作用的一种方法是通过向乳液添加连续相来间隔微滴。这例如是通过使液滴以单个列队形式向下流过狭窄通道(例如，大致为微滴宽度)并且然后使用第二通道来添加额外的连续相来实现。然而，随着流速增加，为了使微滴流动更快或为添加更大量的连续相，施加至液滴的粘性力可变得显著，从而造成微滴分裂成较小的液滴。因此，本文所述的方法和装置提供微流体微滴间隔物，其能够可控地和在非常快的速率下间隔微滴，而不造成它们分裂成较小的液滴。

微滴间隔物的一种用途是可控地间隔液滴而不打破它们。在一些实施方案中，微滴被间隔以使得它们在微滴离开间隔物时具规律周期性，在微滴通过间隔物时不聚结，并且不分裂开。为了确保周期性间隔，液滴可在它们进入间隔物时被紧密地堆积，并且间隔物入口可足够窄以使得液滴仅能以单个列队形式进入，即，入口宽度例如小于平均微滴直径的两倍，并且在一些实施方案中小于平均微滴直径的1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2或1.1倍。然而，为了防止液滴破裂，通道可为初始宽度，然后逐滴缩窄，以使得在添加连续相时，施加至液滴的粘性力较小。

但是，一个挑战在于，由于通道最初狭窄以使液滴呈单个列队形式，因此通道突然扩大以使得可平缓地添加连续相，可以向液滴施加大的拉伸力，这可能会造成它们破裂或甚至聚结。因此，在目前所述的间隔物中，使用平缓分级15007(例如，在0.01-60度的斜率下)，其在添加连续相之前向液滴施加最小的拉伸剪切。也平缓地实现缩窄15008(例如，在0.01-60度的斜率下)，以使得在间隔期间向液滴施加最小的纵向剪切。可例如通过包括弯曲角部15009而非形成直角的角部和构建连接点来实现平缓作用，以使得微滴通道的宽度在连接点逐渐加宽，然后在通过连接点后逐渐变窄回原始的通道宽度。

在一些实施方案中，微滴间隔物由T连接几何结构构成，其中从一个通道引入微滴并且从入口引入间隔流体。参见例如图15。在入口与通道相交处，所述通道逐渐加宽；从而允许液滴以单个列队形式进入并且通过添加油间隔，同时降低施加至液滴的粘性力。即使在通常产生大量破裂的流速下，这也允许液滴被间隔并移动到装置中而不分裂成较小的液滴。膨胀和收缩壁在间隔物处的斜率应该被选择以向液滴施加最小剪切，同时仍允许有效间隔。在另一个可能的实施方案中，可使用弯曲壁，来调节在液滴通过时的力。

用于间隔通道中的微滴组的系统和方法

在一些实施方案中，提供用于间隔微流体通道内的液滴组的系统和方法。更具体地，本系统提供三种间隔通道内的液滴组的替代方法，以提供更精确的数据收集和分析。在本发明的一个实施方案中，使用如图1中所示或如PCT/US2013/5917中所述的微流体系统。

第一种可能的方法描述在精确时刻被注入通道中的“间隔”液滴(相对于通道本身的尺寸和相比于含有待分析样品材料的通道内的液滴的大液滴)，所述精确时刻由检测液滴组何时转变的监测系统来确定(图17)。此处，“间隔”液滴可由在乳液的载体流体中不混溶的流体构成；因此，间隔液滴不打算用于分析或系统内任何种类的反应，而是仅分隔其他液滴组。

第二种可能的实施方案描述与上述方法类似的方法，其中例外为这种实施方案不需要使用监测器系统来对间隔液滴的注入进行精确计时。此处，将产生间隔液滴的不混溶载体流体在规律的连续流速下引入通道中。这种流速被设定以在能够实现间隔液滴数与最初注入或需要分隔的最小液滴数(液滴组)大致相同或更小的频率下产生后续间隔液滴。在这种情况下，间隔物之间的液滴收集最多来自两种不同群体(图18)。这种方法导致将任意两对群体彼此分隔的二元方法，相比于液滴完全无间隔，更希望的是数据收集。

另一种可能的实施方案描述与上述方法类似的方法，其中例外为在这个实施方案中，堆积液滴暴露于电场，所述电场通过预定间隔在“开”与“关”之间转换(图19)。当电场被设定为“开”时，液滴合并在一起，在通道内产生较大的“间隔”液滴，除去如在前两个实施方案中对于另一个注射位点的需要并且从而在通道内产生两组可能的液滴组，使得检测和分析显著更容易。

在一些实施方案中，提供用于间隔微流体通道内的液滴组的系统和方法。更具体地，在一些实施方案中，本系统提供间隔通道内的液滴组的替代方法以提供更精确的数据收集和分析。在一个实施方案中，样品存在于微流体装置中的运载体(例如，乳液中的微滴)内。在这个实施方案的一个方面，多个样品(即，一个以上)可一起存在于相同运载体中和/或可在测定法期间的任何时间在单独的运载体内分成单独的样品。作为实例，图1描绘了其中两种不同标记的液滴交替(来自141和142)的系统，包括扩增的样品和形成交替标记的扩增微滴156。将膨胀微滴156的部分注入探针微滴160中以使得来自第一微滴156的部分合并成微滴160，形成第一组；和使得来自第二膨胀微滴156的微滴合并成探针微滴160，形成第二组，等等，以使得组被定义为包含来自相同膨胀微滴156的部分。另外，在测定法的执行期间，包含一个或多个样品的运载体(例如，微滴)的尺寸、体积或含量可变得更大或更小(例如，分别通过膨胀或分割)。在测定法的执行期间，运载体可被放大和/或细分一次或多次。所述系统还可执行“级联测定法”，其为一系列多个(即，一个以上)测定法，其中每个测定法可能相同或不同，并且其中系列中的每个测定法还可包含一个或多个工艺或步骤。在这个实施方案的一个方面，样品存在于微流体装置中的运载体内的载体上。

图16示出微流体通道的一个实施方案，所述微流体通道包含将两种不同样品16163和16156注入探针液滴16160中的两个显微注射器。随着液滴16160通过第一注射位点16162，液滴16160被注入样品16163，产生液滴16180。液滴16180然后在通道中持续向下直到它到达注射位点16161，其中16180然后被注入来自汽泡的样品(此处，由数字“5”描绘)，产生液滴16173。液滴16173然后在通道中持续向下直到所述通道出于温育目而加宽，如由16183所描绘。图示示出，在无任何额外机构添加至通道16170的情况下，注射位点16162和16161下游的液滴失去注射定向，从而导致液滴16183、16184和16185的混合(即如图中所示，液滴5、4、3、2的混合)。

另外，图16示出，因为含有不同样品(分别为数字“5”、“6”和“7”)的一个特定汽泡被依序分割成流动的液滴，因此随着一种特定材料在通过液滴中用完，含有不同样品的下一个汽泡开始进入液滴，产生在通道(16183、16184和16185)内含有不同但依序样品的分区的液滴“组”。

图17示出本发明的一种可能的实施方案。微流体通道包含将两种不同样品18163和18156注入探针液滴18160中的两个显微注射器。随着液滴18160通过第一注射位点18162，液滴18160被注入样品18163，产生液滴18180。液滴18180然后在通道中持续向下直至它到达注射位点18161，其中18180然后被注入来自汽泡(此处，由数字“5”描绘)的材料，产生液滴18173。液滴18173然后在通道中持续向下直至通道出于温育目的而加宽，如由18183所示。举例来说，来自电极18181和18182的电场促进材料转移，但是其他破坏微滴界面以实现注射的机制也是可能的，例如上述那些方法。液滴18180在通道18170中持续向下直至它到达第二注射位点18161。此处，经由如上所述的类似装置18182将交替汽泡18186(5、6和7是具有不同材料组分的汽泡的示例)类似地并入液滴18180中。这产生液滴18173，其现在含有来自18163和18186的材料。随着液滴18173在通道中持续向下，在通道因温育18185而加宽之前将端口18187并入通道中。端口18187产生不混溶流体的大液滴18188进入通道中，分隔含有来自注射端口18186的不同材料的液滴18173(分别是样品5、6和7)。注射计时是基于汽泡18186之间的转换的闭环观测。观测机构18190可能是离散的光学系统，例如光电检测器即PMT、光电二极管或光电晶体管；成像系统，例如CCD或CMOS相机；电容；压力；或电场。这产生大液滴18189(相对于通道的直径和相应的材料填充液滴)，分隔含有类似材料18184和18183的液滴组，当组含有最大已知数目的物质如一种、两种、三种、四种、五种等，有效地抑制液滴在通道内的混合。

图18示出本发明的另一种可能的实施方案。微流体通道包含将两种不同的样品19163和19156注入探针液滴19160中的两个显微注射器。随着液滴19160通过第一注射位点19162，液滴19160被注入样品19163，产生液滴19180。液滴19180然后在通道中持续向下直到它到达注射位点19161，其中19180然后被注入来自汽泡(此处，由数字“5”描绘)的材料，产生液滴19173。液滴19173然后在通道中持续向下直到所述通道出于温育目的而加宽，如由19183所示。随着液滴19173在通道中持续向下，端口19187在有利位置并入通道中以进行温育19185。19187中的不混溶流体在固定速率或压力下连续地流入通道中，膨胀到通道19188中并破裂而以自然周期性方式制造间隔液滴19188。间隔液滴19188分隔含有材料19183和19184的那些液滴。例如，此处液滴19184群组由含有材料3和4的液滴构成，并且液滴19183群组由含有样品4和5的液滴构成。群组可由含有材料2、3、4、5等的液滴构成。

图19示出本发明的另一个可能的实施方案：微流体通道包含将两种不同样品20163和20156注入探针液滴20160中的两个显微注射器。随着液滴20160通过第一注射位点20162，液滴20160被注入样品20163，产生液滴20180。液滴20180然后在通道中持续向下直到它到达注射位点20161，其中20180然后被注入来自汽泡(此处，由数字“5”描绘)的材料，产生液滴20173。液滴20173然后在通道中持续向下直到所述通道出于温育目的而加宽，如由183所示。此处，通过经由电场或任何其他破坏装置20182来破坏液滴的界面而将交替汽泡20186(5、6和7是含有不同材料的汽泡的示例)并入液滴20180中。这产生液滴20173，其现在含有来自20163和汽泡20186的材料。随着液滴20173在通道中持续向下，将来自电极20190和20191的第二电场引入通道，所述电场以周期性方式打开和关闭，如20193所示。当20190和20191处的电场被打开时，接近电场的液滴将合并，产生含有多个不同液滴20192(此处，例如，现在合并含有材料4和5的液滴)的内含物的大液滴。电场保持打开足够时间以合并足够的液滴以产生足够大的间隔液滴20189，其将完全分隔液滴物质群组。在通道20185的加宽部分内，组合液滴20192显示为下游液滴20189并有效地分隔液滴群组，如图18中；因此，群组183是液滴物质例如与样品4和5的组合，并且群组184含有液滴与样品3和4的组合。群组可由含有材料2、3、4、5等的液滴构成。

实施例

虽然已经详细描述了本发明和其优点，但是，应理解，可在不偏离如所附权利要求中所限定的本发明的精神和范围的情况下在其中作出各种变化、取代和变更。

本发明将在以下实施例中进一步说明，所述实施例仅出于说明目的给出，而不旨在以任何方式限制本发明。

在一个实施例中，本发明可用于作为系统的一部分(例如，如图1中所描绘)以执行用于检测样品中的特定核酸序列的存在或不存在的方法。使用者可将核酸样品(148)注入系统中。所述系统然后将这种样品注入乳液内存在的大量微滴(150)中，所述乳液含有聚合酶链反应(PCR)扩增反应所必需的试剂。这些微滴含有适当的寡核苷酸引物，其中微滴被称为“PCR微滴”。所述PCR微滴可具有允许其与相邻的PCR微滴之间相区分的标记。换句话说，交替标记，以确保源自单一PCR微滴的信号不归属于多个微滴并且源自多个微滴的信号不归属于单一微滴。接着，将PCR微滴进行热循环以进行PCR扩增。使用油包水乳液的PCR可使用如本领域技术人员所知和理解的标准PCR条件进行，并且由例如以下描述：Williams等,“通过乳液PCR进行复杂基因库的扩增(AmplificationofComplexGeneLibrariesbyEmulsionPCR)”,NatureMethods(2006),第7卷,第545-50页；Diehl等,“聚束：油包水乳液中的微粒上的单分子PCR(BEAMing:Single-MoleculePCRonMicroparticlesinWaterin-OilEmulsions)”,NatureMethods(2006),第7卷,第551-59页；和Porreca等,“PolonyDNA测序(PolonyDNASequencing)”,F.Ausubel编,2006.CurrProtocMolBiol.,第7章,第7.8单元。在PCR后，将每个PCR微滴(156)注入大量探针微滴(160)中。例如，探针微滴可含有核酸探针和探针杂交测定法所必需的化学试剂。在这个实施例中，仅在探针与注入核酸样品杂交时，测定法可产生荧光信号，如WO2012/078710中所述。处理所获得的数据并通过本发明的系统进行分析。因此，如果来自多个探针液滴的数据可指定为源自单个PCR液滴，则如WO2012/078710中所述，来自多个探针微滴的数据可用于核酸样品的DNA测序。

如果相邻的PCR微滴具有可区分标记并且如果在网络中流动的微滴的次序得以维持，则来自多个探针微滴的数据可指定为源自单个PCR微滴。

应理解，本文所述的实施例和实施方案仅出于说明目的并且本领域技术人员将想到鉴于其的各种修改或变化，并且其应包括在本申请的精神和范围内和所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请特此出于所有目的以全文引用的方式并入。

Claims (65)

1.一种用于使两种或更多种先前形成的不同标记的微滴群体交替流动的系统，所述系统包括：

具有用于不同标记的微滴的两个或更多个入口的微流体装置，和

与联合微流体通道形成连接点的至少两个微流体通道，

其中所述系统被配置以允许所述微滴以交替方式从所述两个或更多个入口通过所述微流体通道流向所述联合微流体通道。

2.如权利要求1所述的系统，其中所述系统还包括与所述两个微流体通道流体连通并且在所述两个微流体通道之间流体连通的连接通道，所述连接通道被配置以允许连续相流体而非所述微滴在所述微流体通道之间流动。

3.一种使两种或更多种先前形成的不同标记的微滴群体交替流动的方法，所述方法包括

提供如权利要求1或2所述的微流体装置，其中所述两个或更多个入口的第一入口中的第一微滴和所述两个或更多个入口的第二入口中的第二微滴被不同标记；

造成所述第一微滴和所述第二微滴以交替方式流入所述联合微流体通道中。

4.一种用于标记微滴和使所述不同标记的微滴交替流动的系统，所述系统包括：

用于连续相内的微滴的至少一个入口，

至少两个微流体通道，其在一端连接至所述至少一个入口并且在另一端与联合微流体通道形成连接点，和

标记装置，其被配置以对所述微流体通道之一中的微滴进行标记；

其中当所述微滴通过所述至少两个微流体通道流向所述联合微流体通道时，所述标记装置对在所述微流体通道之一中流动的微滴进行标记。

5.如权利要求4所述的系统，其中所述标记是不混溶标记。

6.如权利要求4所述的系统，其中所述标记装置通过破坏所述不混溶标记与所述连续相之间的界面来标记所述微滴。

7.如权利要求6所述的系统，其中所述标记装置使用电场来破坏所述不混溶标记与所述连续相之间的界面。

8.如权利要求6所述的系统，其中所述标记装置包括一个或多个电极，其产生电场以破坏所述不混溶标记与所述连续相之间的界面。

9.如权利要求6所述的系统，其中所述微流体通道中的所述微滴被间隔以使得相邻的微滴由于所述电场的存在而不聚结。

10.如权利要求6所述的系统，其中所述系统还包括允许所述连续相流体而非所述微滴在所述微流体通道之间流动的连接通道。

11.一种用于标记微滴并且使不同标记的微滴交替流动的方法，其包括以下步骤：

将连续相内的多个微滴注入连接到至少两个微流体通道的至少一个入口中，其中所述微流体通道在一端连接至所述至少一个入口并且在另一端与联合微流体通道形成连接点，和

利用标记装置用标记对所述微流体通道之一中的微滴进行标记，其中被标记的微滴和未被标记的微滴以基本上交替的方式进入所述联合微流体通道。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述标记是不混溶标记。

13.如权利要求11所述的方法，其中所述微滴含有所希望的PCR反应所必需的引物和试剂。

14.如权利要求11所述的方法，其中所述系统还包括连接通道，其允许连续相流体而非所述微滴在所述微流体通道之间流动。

15.如权利要求11所述的方法，其中所述标记装置通过破坏所述不混溶标记与所述连续相之间的界面来标记所述微滴。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述标记装置包括一个或多个电极，其产生电场来破坏所述不混溶标记与所述连续相之间的界面。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述微流体通道中的所述微滴被间隔以使得相邻的微滴由于所述电场的存在而不聚结。

18.一种对微流体通道中的乳液内的包含至少第一组液滴和第二组液滴的多个液滴进行分隔的方法，所述方法包括

在所述微流体通道中的乳液中的第一组液滴与第二组液滴之间的位置处产生间隔液滴，其中所述第一组液滴和所述第二组液滴基本上具有相同体积并且所述间隔液滴相比于所述第一组液滴或所述第二组液滴的平均体积具有更大的体积，从而分隔所述微流体通道中的所述多个液滴。

19.如权利要求18所述的方法，其中将多组液滴引入所述微流体通道中并且将多个间隔液滴引入所述微流体通道中以使得间隔液滴分隔不同组的液滴。

20.如权利要求18所述的方法，其中所述乳液包含在不混溶流体中所含的液滴，并且在引入所述间隔液滴之后，所述乳液的连续相中的不混溶流体量减少，从而相比于所述引入之前不久将所述多个液滴压缩成更小的空间。

21.如权利要求18所述的方法，其中所述产生包括在微流体通道中的所述位置从侧通道引入所述间隔液滴。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述间隔液滴不含蛋白质或核酸。

23.如权利要求18所述的方法，其中所述产生包括合并来自一个或多个相邻组的两个或更多个液滴以在两组之间产生间隔液滴。

24.如权利要求18至23中的任一项所述的方法，其还包括对所述侧通道上游的微流体通道中的所述液滴组进行光学监测，并基于所述光学监测的结果触发所述间隔液滴的产生，从而基于所述液滴组的身份引入间隔液滴。

25.如权利要求18至23中的任一项所述的方法，其中所述产生以固定速率发生。

26.如权利要求18至25中的任一项所述的方法，其中在所述微流体通道中所述位置的上游，将来自上游侧通道的液滴的部分注入来自所述微流体通道中更上游的液滴中，以使得液滴组定义为含有来自所述上游侧通道的相同液滴的一部分的所有液滴。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述上游侧通道中的所述液滴包含扩增的DNA。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述上游侧通道中的不同液滴包含不同的扩增子。

29.如权利要求26至28中的任一项所述的方法，其中来自所述微流体通道中更上游的所述液滴包含一个或多个多聚核苷酸杂交探针。

30.一种装置，其包括微流体通道，所述微流体通道包含乳液内的至少第一组液滴和第二组液滴，其中所述第一组液滴和所述第二组液滴具有基本上相同的体积并且所述第一组与所述第二组被间隔液滴隔开，所述间隔液滴相比于所述第一组液滴或所述第二组液滴的平均体积具有更大的体积。

31.如权利要求30所述的装置，其中所述间隔液滴不含蛋白质或核酸。

32.一种用于执行来自乳液的连续相体积分数的受控变化的系统，其中所述系统包括微流体装置，所述微流体装置包含一个或多个微流体通道和与所述微流体通道中的至少一个流体连通的一个或多个相对较小的通道或膜。

33.如权利要求32所述的系统，其中所述一个或多个微流体通道呈同心管形式，所述同心管沿着所述管的内侧包含小孔或膜表面。

34.如权利要求32所述的系统，其中一个或多个提取通道或膜以除了基本上垂直于一个或多个微流体通道之外的角度被布置。

35.如权利要求32所述的系统，其还包括在除了基本上彼此平行之外的角度或位置下布置的两个或更多个微流体通道。

36.如权利要求35所述的系统，其中所述微流体技术包含第一微流体通道和第二微流体通道，其中所述第二微流体通道被可控加压以使得当乳液被引入所述微流体装置中时，所述乳液的连续相的受控体积分数从所述第一微流体通道流出，通过所述一个或多个提取通道或膜并进入所述第二微流体通道，并且其中所述乳液的分散相保留在所述第一微流体通道中。

37.如权利要求36所述的系统，其中所述分散相包含多个水性微滴。

38.如权利要求37所述的系统，其中所述微滴各自包含直径为约0.5至约5000微米的尺寸范围。

39.如权利要求36所述的系统，其中所述连续相包含不混溶油。

40.如权利要求39所述的系统，其中所述不混溶油选自氟碳油、硅油和烃油。

41.如权利要求40所述的系统，其中所述烃油选自石油和矿物油。

42.一种用于执行来自乳液的连续相体积分数的受控变化的方法，其包括如权利要求32至41中的任一项所述的系统，其中所述乳液包含包括水性液滴的不混溶流体连续相。

43.如权利要求42所述的方法，其包括将包含液滴的乳液引入微流体通道中并且使所述微流体通道暴露于第一压力；和

移动所述乳液通过与一个或多个相对较小的通道连通的流体，其中所述相对较小的通道暴露于第二压力并且其中所述第二压力低于所述第一压力以使得所述乳液中的所述不混溶流体连续相从所述微流体通道移动到所述相对较小的通道，从而将所述微流体通道中的剩余乳液的液滴浓度浓缩。

44.如权利要求42所述的方法，其包括将包含液滴的乳液引入所述微流体通道中并且使所述微流体通道暴露于第一压力；和

移动所述乳液通过与一个或多个相对较小的通道连通的流体，其中所述相对较小的通道包含不混溶流体连续相并且暴露于第二压力并且其中所述第二压力高于所述第一压力以使得所述不混溶流体连续相相对较小的通道从所述相对较小的通道移动至所述微流体通道，从而降低所述微流体通道中的所述乳液的液滴浓度。

45.一种装置，其包括至少一个微流体通道，所述通道包含所述通道的第一窄部分和所述通道的第二较宽部分，其中所述第二较宽部分包含所述较宽部分内的一系列柱和用于从所述微流体通道中的乳液中去除不混溶流体连续相的一个或多个出口，其中所述系列的柱被布置以沿着所述微流体通道基本上维持所述乳液内的液滴次序。

46.如权利要求45所述的装置，其中所述第二较宽部分包含与所述第二较宽部分流体连通的一个或多个侧通道。

47.如权利要求48所述的装置，其中所述侧通道的宽度小于所述第二较宽部分的宽度。

48.一种从包含水性液滴的乳液去除不混溶流体连续相的方法，所述方法包括

将所述乳液引入如权利要求45所述的微流体通道中以使得所述乳液从具有特定次序的液滴的第一部分移动到第二较宽部分，其中当所述乳液进入所述第二部分时，从所述第二较宽部分去除来自所述乳液的一些不混溶流体连续相，同时所述液滴基本上保持来自所述通道的所述第一部分的液滴次序。

49.如权利要求48所述的方法，其中所述第二较宽部分包含与所述第二较宽部分流体连通的一个或多个侧通道并且经由所述侧通道去除所述不混溶流体连续相。

50.一种装置，其包括：

乳液微流体通道，和

在所述乳液微流体通道中的连接点处与所述乳液微流体通道连接的连续相微流体通道，

其中所述乳液微流体通道包含如下通道部分，(i)其具有相比于所述乳液中的液滴直径不大于1.5倍的宽度，和(ii)其在所述连接点之前不久逐渐加宽，和(iii)在与不大于所述液滴直径1.5倍的宽度连接之后不久逐渐缩窄。

51.如权利要求50所述的装置，其中所述连续相微流体通道与连续相储集器流体连通。

52.如权利要求50所述的装置，其中所述乳液微流体通道包含乳液并且所述连续相微流体通道包含连续相不混溶流体。

53.如权利要求50所述的装置，其中所述通道部分与所述液滴直径基本上相同。

54.一种将不混溶连续流体引入乳液中以间隔所述乳液内的液滴的方法，所述方法包括：

将所述乳液引入如权利要求51至52中的任一项所述的装置中以使得所述乳液中的液滴以单个列队形式出现于乳液微流体通道中；

将另外的不混溶连续相流体引入来自连续相微流体通道的乳液中以使得流过所述乳液微流体通道与所述连续相微流体通道的连接点的液滴相比于所述连接点上游乳液中的液滴彼此间隔更远。

55.一种装置，其包括：

用于容纳包含液滴的乳液的腔室；

与所述腔室连接的两个或更多个平行微流体腔室，其具有与所述液滴的直径基本上相同的宽度。

56.如权利要求55所述的装置，其中光学检测器被配置以检测所述平行微流体腔室中的一个或多个中的液滴。

57.如权利要求55或56所述的装置，其中所述两个或更多个平行微流体通道合并成单一通道或腔室。

58.如权利要求55或56所述的装置，其中所述两个或更多个平行微流体通道与用于递送另外的不混溶流体连续相的一个或多个储集器流体连通以进一步间隔所述平行微流体通道中的乳液内的液滴。

59.一种将液滴均匀分配到两个或更多个平行微流体通道中的方法，所述方法包括

在如权利要求55至58中的任一项所述的装置的腔室中提供乳液，其中所述乳液包含不混溶流体连续相中的液滴，

在所述腔室中的乳液上提供压力以将所述乳液推入两个或更多个平行微流体通道中，从而将来自所述腔室的液滴均匀分配到所述两个或更多个平行微流体通道中。

60.如权利要求59所述的方法，其还包括当所述液滴在所述微流体通道中时检测所述液滴的一种或多种特性。

61.如权利要求59至60中的任一项所述的方法，其还包括将所述两个或更多个平行微流体通道中的乳液合并到第二腔室或通道中。

62.一种包含一系列微流体通道的装置，其中所述系列的通道包含在连接点分成两个下游微流体通道的至少一个通道，其中一个或多个分流通道连接所述两个下游微流体通道。

63.如权利要求62所述的装置，其中所述两个下游微流体通道中的每个进一步分成两个另外的下游微流体通道，其中一个或多个分流通道连接所述两个另外的下游微流体通道。

64.如权利要求62至63中的任一项所述的装置，其中所述微流体通道包含含有液滴的乳液并且下游微流体通道合并形成一个或多个合并通道。

65.一种将液滴均匀分配到两个或更多个微流体通道中的方法，所述方法包括

将包含液滴的乳液引入如权利要求62至64中的任一项所述的装置的通道中，和

施加压力以使得所述乳液进入两个下游微流体通道，其中所述分流通道使所述两个微流体通道之间的压力均衡，从而导致来自所述乳液的液滴在所述两个微流体通道之间平均分配。