JP2002153280A - Ｄｎａとｄｎａ結合因子との結合を促進するタンパク質およびそのタンパク質をコードする遺伝子 - Google Patents
Ｄｎａとｄｎａ結合因子との結合を促進するタンパク質およびそのタンパク質をコードする遺伝子Info
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 種々の特異的なＤＮＡ−タンパク質相互作用
を非特異的に促進できるタンパク質およびその遺伝子の
提供。 【解決手段】 本発明によるタンパク質は下記アミノ酸
配列の少なくとも一つを含んでなるタンパク質である：
（ａ）カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）由来の特定
配列の１７０〜１８３番のアミノ酸配列または１個以上
の改変を有し、かつＤＮＡとＤＮＡ結合因子との結合を
促進する活性を有するその改変アミノ酸配列および
（ｂ）（ａ）の配列の１９９〜２０７番のアミノ酸配列
又は１個以上の改変を有し、かつＤＮＡとＤＮＡ結合因
子との結合を促進する活性を有するその改変アミノ酸配
列。本発明による遺伝子は本発明によるタンパク質をコ
ードするポリヌクレオチドからなるものである。
を非特異的に促進できるタンパク質およびその遺伝子の
提供。 【解決手段】 本発明によるタンパク質は下記アミノ酸
配列の少なくとも一つを含んでなるタンパク質である：
（ａ）カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）由来の特定
配列の１７０〜１８３番のアミノ酸配列または１個以上
の改変を有し、かつＤＮＡとＤＮＡ結合因子との結合を
促進する活性を有するその改変アミノ酸配列および
（ｂ）（ａ）の配列の１９９〜２０７番のアミノ酸配列
又は１個以上の改変を有し、かつＤＮＡとＤＮＡ結合因
子との結合を促進する活性を有するその改変アミノ酸配
列。本発明による遺伝子は本発明によるタンパク質をコ
ードするポリヌクレオチドからなるものである。
Description
【０００１】
【発明の背景】発明の分野 本発明は、ＤＮＡとＤＮＡ結合因子との特異的結合を非
特異的に促進する新規タンパク質およびその遺伝子に関
する。本発明はまた、このタンパク質および遺伝子を用
いた生化学および分子生物学用研究試薬並びに有用タン
パク質の生産技術にも関する。
特異的に促進する新規タンパク質およびその遺伝子に関
する。本発明はまた、このタンパク質および遺伝子を用
いた生化学および分子生物学用研究試薬並びに有用タン
パク質の生産技術にも関する。
【０００２】背景技術 ＤＮＡ結合性タンパク質は、遺伝情報が記録されている
ＤＮＡの維持、合成、修復等に関与している。また、遺
伝情報を基に生命活動を維持するための転写にも多種の
ＤＮＡ結合性タンパク質が関与している。具体的には、
高等真核生物のＤＮＡ結合性タンパク質には、ゲノムの
クロマチン構造を維持するヌクレオソーム構成タンパク
質群、ゲノムＤＮＡ上の遺伝子の発現調節領域に結合す
る転写因子群やその補助因子群、ＤＮＡの複製や組換
え、構造変換および転写等に関わる各種酵素などが知ら
れている。具体的には、ヒストンタンパク質、ヌクレア
ーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ等が挙
げられる。
ＤＮＡの維持、合成、修復等に関与している。また、遺
伝情報を基に生命活動を維持するための転写にも多種の
ＤＮＡ結合性タンパク質が関与している。具体的には、
高等真核生物のＤＮＡ結合性タンパク質には、ゲノムの
クロマチン構造を維持するヌクレオソーム構成タンパク
質群、ゲノムＤＮＡ上の遺伝子の発現調節領域に結合す
る転写因子群やその補助因子群、ＤＮＡの複製や組換
え、構造変換および転写等に関わる各種酵素などが知ら
れている。具体的には、ヒストンタンパク質、ヌクレア
ーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ等が挙
げられる。
【０００３】ゲノムＤＮＡ上に存在する遺伝子発現制御
領域は、遺伝子の種類に関わらず共通して存在する領域
と、遺伝子特異的な領域の２種類に分類できる。共通領
域には基本転写因子と呼ばれるグループのタンパク質が
結合し、特異的領域には、基本転写因子に作用し特定の
遺伝子の発現調節に関わるその他の転写因子等が結合す
ることが知られている。具体的には、ＴＢＰ、ＴＦII
Ｂ、ＴＦIIＦ等の基本転写因子や、ＮＦκＢ、Ｏｃｔ−
２、ＡＰ−１、ＳＰ−１、ＳＲＥＢＰ、ＰＰＡＲなどの
遺伝子特異的な転写因子がある。これらの大部分はＤＮ
Ａ配列特異的に結合する因子である。また、これら転写
因子とＤＮＡとの結合を安定化したり、酵素を活性化さ
せる因子も標的特異的であることが多い。例えば、ＴＡ
ＦやＴＦIIＡ、Ｅ、Ｈ等がそれに相当する。
領域は、遺伝子の種類に関わらず共通して存在する領域
と、遺伝子特異的な領域の２種類に分類できる。共通領
域には基本転写因子と呼ばれるグループのタンパク質が
結合し、特異的領域には、基本転写因子に作用し特定の
遺伝子の発現調節に関わるその他の転写因子等が結合す
ることが知られている。具体的には、ＴＢＰ、ＴＦII
Ｂ、ＴＦIIＦ等の基本転写因子や、ＮＦκＢ、Ｏｃｔ−
２、ＡＰ−１、ＳＰ−１、ＳＲＥＢＰ、ＰＰＡＲなどの
遺伝子特異的な転写因子がある。これらの大部分はＤＮ
Ａ配列特異的に結合する因子である。また、これら転写
因子とＤＮＡとの結合を安定化したり、酵素を活性化さ
せる因子も標的特異的であることが多い。例えば、ＴＡ
ＦやＴＦIIＡ、Ｅ、Ｈ等がそれに相当する。
【０００４】また、タンパク質とＤＮＡとの特異的結合
に関連して、Ｙ−Ｂｏｘ結合性タンパク質ファミリーが
知られている。Ｙ−Ｂｏｘ結合性タンパク質ファミリー
に属するタンパク質は、Ｎ末端側にＣＳＤ（cold shock
domain）と呼ばれる細菌のコールドショックタンパク
質（Ｃｓｐ）と高い相同性(＞40% homology, ＞60% ide
ntity)を示す核酸結合ドメインを持つ因子群であり（Wo
lffe, P. A. et al (1992) New Biol. 4, 290-298、Wol
ffe, A. P. (1994) BioEssays 16, 245-251）、その名
前は、最初に発見されたタンパク質であるYB-1が、ヒト
主要組織適合性抗原クラスII遺伝子の転写制御エレメン
トの一つ、Ｙ−Ｂｏｘ配列（ＣＴＧＡＴＴＧＧＹＹＡ
Ａ）に結合する因子として分離されたことに由来する
（Didier, D.K. et al (1988) PNAS 85, 7322-7326）。
に関連して、Ｙ−Ｂｏｘ結合性タンパク質ファミリーが
知られている。Ｙ−Ｂｏｘ結合性タンパク質ファミリー
に属するタンパク質は、Ｎ末端側にＣＳＤ（cold shock
domain）と呼ばれる細菌のコールドショックタンパク
質（Ｃｓｐ）と高い相同性(＞40% homology, ＞60% ide
ntity)を示す核酸結合ドメインを持つ因子群であり（Wo
lffe, P. A. et al (1992) New Biol. 4, 290-298、Wol
ffe, A. P. (1994) BioEssays 16, 245-251）、その名
前は、最初に発見されたタンパク質であるYB-1が、ヒト
主要組織適合性抗原クラスII遺伝子の転写制御エレメン
トの一つ、Ｙ−Ｂｏｘ配列（ＣＴＧＡＴＴＧＧＹＹＡ
Ａ）に結合する因子として分離されたことに由来する
（Didier, D.K. et al (1988) PNAS 85, 7322-7326）。
【０００５】ＣＳＤ中にはＲＮＡ結合タンパク質にしば
しば見られるＲＮＡ結合ドメインＲＮＰ−１（Ｋ／Ｎ，
Ｇ，Ｙ／Ｆ，ＧＦＩ，Ｅ／Ｔ／Ｎ，Ｖ／Ｐ／Ｋ）および
ＲＮＰ−２（ＶＦＶＨＦ）配列があり、ＲＮＡと特異的
に結合する事が知られている（Graumann, P. L. and Ma
rahiel M. A. (1998) Trends Biol. Sci. 23, 286-29
0、Bouvet, P. at al (1995) J. Biol. Chem. 270, 282
97-28303、Landsman, D.(1992) Nucl. Acids Res. 20,
2861-2864）。また、ＣＳＤばかりでなくＣ末端側にも
核酸と結合する領域があり、この領域により緩やかな特
異的結合がなされる（Ladomery, M. and Sommerville,
J. (1994) Nucl. Acids Res. 22, 5582-5589）。さら
に、Ｙ−Ｂｏｘ結合性タンパク質は、Ｙ−Ｂｏｘ配列や
ＲＮＡばかりでなく、一本鎖ＤＮＡの特にピリミジンに
富む領域等に結合することが示されているが、これらの
結合も、厳密ではないが配列特異性を持っている（Koll
uri, R. et al (1992) Nucl. Acids Res. 20, 111-11
6、Hasegawa, S. L. et al (1991) Nucl. Acids Res. 1
9, 4915-4920）。
しば見られるＲＮＡ結合ドメインＲＮＰ−１（Ｋ／Ｎ，
Ｇ，Ｙ／Ｆ，ＧＦＩ，Ｅ／Ｔ／Ｎ，Ｖ／Ｐ／Ｋ）および
ＲＮＰ−２（ＶＦＶＨＦ）配列があり、ＲＮＡと特異的
に結合する事が知られている（Graumann, P. L. and Ma
rahiel M. A. (1998) Trends Biol. Sci. 23, 286-29
0、Bouvet, P. at al (1995) J. Biol. Chem. 270, 282
97-28303、Landsman, D.(1992) Nucl. Acids Res. 20,
2861-2864）。また、ＣＳＤばかりでなくＣ末端側にも
核酸と結合する領域があり、この領域により緩やかな特
異的結合がなされる（Ladomery, M. and Sommerville,
J. (1994) Nucl. Acids Res. 22, 5582-5589）。さら
に、Ｙ−Ｂｏｘ結合性タンパク質は、Ｙ−Ｂｏｘ配列や
ＲＮＡばかりでなく、一本鎖ＤＮＡの特にピリミジンに
富む領域等に結合することが示されているが、これらの
結合も、厳密ではないが配列特異性を持っている（Koll
uri, R. et al (1992) Nucl. Acids Res. 20, 111-11
6、Hasegawa, S. L. et al (1991) Nucl. Acids Res. 1
9, 4915-4920）。
【０００６】現在、Ｙ−Ｂｏｘ結合性タンパク質の機能
については不明な点が多いが、転写（活性化と抑制）お
よび翻訳（抑制、ｍＲＮＡの保存）の制御に広く関与し
ている可能性がある（Wolffe, A. P. (1994) BioEssays
16, 245-251）。具体的には、ｈｓｐ７０遺伝子、ＨＴ
ＬＶ−１およびＲｏｕｓ Ｓａｒｃｏｍａ Ｖｉｒｕｓ
のプロモータからの転写を活性化する（Tafuri, S. R.
and Wolffe, A. P. (1992) New Biol. 4, 349-359、Kas
hanchi, F. et al (1994) J. Virol. 68, 561-565、Swa
mynathan, S. K. et al (1997) J. Virol. 71, 2873-28
80）。また、Ｙ−Ｂｏｘ結合性タンパク質遺伝子の発現
は組織や発生過程などで変化し、細胞増殖との相関が確
認されている。具体的にはニワトリやラットの肝臓にお
いて、胚発生期や再生肝では高くなるのに対し、成人や
再生の終了した肝臓では発現が低下する事も知られてい
る（Grant, C. E. and Deeley, R. G. (1993) Mol. Cel
l.Biol. 13, 4186-4196、Ito, K. et al (1994) Nucl.
Acids Res. 22, 2036-2041、Landomery, M. and Sommer
ville, J. (1995) BioEssays 17, 9-11）。
については不明な点が多いが、転写（活性化と抑制）お
よび翻訳（抑制、ｍＲＮＡの保存）の制御に広く関与し
ている可能性がある（Wolffe, A. P. (1994) BioEssays
16, 245-251）。具体的には、ｈｓｐ７０遺伝子、ＨＴ
ＬＶ−１およびＲｏｕｓ Ｓａｒｃｏｍａ Ｖｉｒｕｓ
のプロモータからの転写を活性化する（Tafuri, S. R.
and Wolffe, A. P. (1992) New Biol. 4, 349-359、Kas
hanchi, F. et al (1994) J. Virol. 68, 561-565、Swa
mynathan, S. K. et al (1997) J. Virol. 71, 2873-28
80）。また、Ｙ−Ｂｏｘ結合性タンパク質遺伝子の発現
は組織や発生過程などで変化し、細胞増殖との相関が確
認されている。具体的にはニワトリやラットの肝臓にお
いて、胚発生期や再生肝では高くなるのに対し、成人や
再生の終了した肝臓では発現が低下する事も知られてい
る（Grant, C. E. and Deeley, R. G. (1993) Mol. Cel
l.Biol. 13, 4186-4196、Ito, K. et al (1994) Nucl.
Acids Res. 22, 2036-2041、Landomery, M. and Sommer
ville, J. (1995) BioEssays 17, 9-11）。
【０００７】しかし、以上に述べた様々なＤＮＡ（ある
いはＲＮＡ）−タンパク質相互作用に関係するタンパク
質（相互作用を促進する因子も含まれる）は、いずれも
標的（塩基配列）に対する特異性を持つものである。従
ってこれらのタンパク質の用途は限定されたものとな
る。
いはＲＮＡ）−タンパク質相互作用に関係するタンパク
質（相互作用を促進する因子も含まれる）は、いずれも
標的（塩基配列）に対する特異性を持つものである。従
ってこれらのタンパク質の用途は限定されたものとな
る。
【０００８】例えば、現在の生化学実験では、生体由来
の機能性タンパク質が利用されている。なかでも遺伝子
工学の分野では、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレア
ーゼ、メチラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガー
ゼ、ＲＮＡポリメラーゼ等様々な酵素類が汎用されてい
る。また、生化学的研究の一分野として、ＤＮＡ−タン
パク質間相互作用の解析が広く行われている。具体的に
はゲルシフトアッセイ法やサウスウエスタン法などがあ
る。これらの反応や解析においては、通常ＤＮＡ−タン
パク質間の相互作用が十分起こるような条件に最適化さ
れている。この最適化は反応溶液中での塩濃度やｐＨ、
金属イオン類の添加量、反応温度などで行われている。
また、タンパク質が反応系に添加される場合は、タンパ
ク質は機能性タンパク質の安定化（失活防止）剤として
用いられるに過ぎない事が多い。
の機能性タンパク質が利用されている。なかでも遺伝子
工学の分野では、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレア
ーゼ、メチラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガー
ゼ、ＲＮＡポリメラーゼ等様々な酵素類が汎用されてい
る。また、生化学的研究の一分野として、ＤＮＡ−タン
パク質間相互作用の解析が広く行われている。具体的に
はゲルシフトアッセイ法やサウスウエスタン法などがあ
る。これらの反応や解析においては、通常ＤＮＡ−タン
パク質間の相互作用が十分起こるような条件に最適化さ
れている。この最適化は反応溶液中での塩濃度やｐＨ、
金属イオン類の添加量、反応温度などで行われている。
また、タンパク質が反応系に添加される場合は、タンパ
ク質は機能性タンパク質の安定化（失活防止）剤として
用いられるに過ぎない事が多い。
【０００９】このようにＤＮＡ−タンパク質相互作用を
特異的に促進できる因子はこれまで知られてきたが、種
々の特異的なＤＮＡ−タンパク質相互作用を非特異的に
促進できる因子はこれまで報告されていない。
特異的に促進できる因子はこれまで知られてきたが、種
々の特異的なＤＮＡ−タンパク質相互作用を非特異的に
促進できる因子はこれまで報告されていない。
【００１０】
【発明の概要】本発明は、種々の特異的なＤＮＡ−タン
パク質相互作用を非特異的に促進できる因子およびその
遺伝子を提供することをその目的とする。
パク質相互作用を非特異的に促進できる因子およびその
遺伝子を提供することをその目的とする。
【００１１】本発明者らは、後部絹糸腺において時期特
異的に発現することが知られているカイコフィブロイン
遺伝子の転写制御領域に特異的に結合し、この遺伝子発
現の制御に関与するＤＮＡ結合性の転写因子としてＦＭ
ＢＰ−１タンパク質を同定しているが（滝谷等；Takiya
et al 1997 Biochem. J.）、このＦＭＢＰ−１の精製
過程の画分に、ＦＭＢＰ−１とＤＮＡの結合を促進する
因子が存在することを新たに見いだした。このタンパク
質は、アミノ酸配列上の特徴からＹ−Ｂｏｘ結合性タン
パク質ファミリーに属すると考えられることから「ＢＹ
Ｂタンパク質」と命名した。
異的に発現することが知られているカイコフィブロイン
遺伝子の転写制御領域に特異的に結合し、この遺伝子発
現の制御に関与するＤＮＡ結合性の転写因子としてＦＭ
ＢＰ−１タンパク質を同定しているが（滝谷等；Takiya
et al 1997 Biochem. J.）、このＦＭＢＰ−１の精製
過程の画分に、ＦＭＢＰ−１とＤＮＡの結合を促進する
因子が存在することを新たに見いだした。このタンパク
質は、アミノ酸配列上の特徴からＹ−Ｂｏｘ結合性タン
パク質ファミリーに属すると考えられることから「ＢＹ
Ｂタンパク質」と命名した。
【００１２】本発明者らはまた、このタンパク質がＤＮ
Ａ結合性タンパク質のＤＮＡに対する結合を非特異的に
促進し、安定化し、更に転写を促進するとともに制限酵
素反応も促進することを見いだした。
Ａ結合性タンパク質のＤＮＡに対する結合を非特異的に
促進し、安定化し、更に転写を促進するとともに制限酵
素反応も促進することを見いだした。
【００１３】本発明者らは更に、このタンパク質をコー
ドする遺伝子が他の遺伝子の発現量を増大させることを
確認し、このタンパク質の活性がＹ−Ｂｏｘタンパク質
に高度に保存されているＣＳＤ領域ではなくＢＹＢタン
パク質に特有な構造が多いＣ末端側に存在することを見
いだした。
ドする遺伝子が他の遺伝子の発現量を増大させることを
確認し、このタンパク質の活性がＹ−Ｂｏｘタンパク質
に高度に保存されているＣＳＤ領域ではなくＢＹＢタン
パク質に特有な構造が多いＣ末端側に存在することを見
いだした。
【００１４】本発明者らは更にまた、活性領域がＣ末端
側のＧ１領域からＢ／Ａ３領域（アミノ酸１３４‐２０
７）にかけて存在し、その活性はその一部の領域を欠失
しても保持されること、特にＢａｓｉｃ／Ａｒｏｍａｔ
ｉｃ ｄｏｍａｉｎ２および３（図１中、Ｂ／Ａ２およ
びＢ／Ａ３）が活性には必須であること、Ｂ／Ａ２およ
びＢ／Ａ３のうち最低１つのドメインと、Ｇｌｙｃｉｎ
ｅ ｒｉｃｈ−ｄｏｍａｉｎ １および２（図１中、Ｇ
１およびＧ２）の少なくとも１つ以上のドメインとを有
することが十分な促進活性に重要であることを見いだし
た。
側のＧ１領域からＢ／Ａ３領域（アミノ酸１３４‐２０
７）にかけて存在し、その活性はその一部の領域を欠失
しても保持されること、特にＢａｓｉｃ／Ａｒｏｍａｔ
ｉｃ ｄｏｍａｉｎ２および３（図１中、Ｂ／Ａ２およ
びＢ／Ａ３）が活性には必須であること、Ｂ／Ａ２およ
びＢ／Ａ３のうち最低１つのドメインと、Ｇｌｙｃｉｎ
ｅ ｒｉｃｈ−ｄｏｍａｉｎ １および２（図１中、Ｇ
１およびＧ２）の少なくとも１つ以上のドメインとを有
することが十分な促進活性に重要であることを見いだし
た。
【００１５】本発明によるタンパク質は、下記アミノ酸
配列を少なくとも一つ含んでなるものである： （ａ）配列番号２の１７０〜１８３番のアミノ酸配列ま
たは１個以上の改変を有し、かつＤＮＡとＤＮＡ結合因
子との結合を促進する活性を有するその改変アミノ酸配
列および （ｂ）配列番号２の１９９〜２０７番のアミノ酸配列ま
たは１個以上の改変を有し、かつＤＮＡとＤＮＡ結合因
子との結合を促進する活性を有するその改変アミノ酸配
列。
配列を少なくとも一つ含んでなるものである： （ａ）配列番号２の１７０〜１８３番のアミノ酸配列ま
たは１個以上の改変を有し、かつＤＮＡとＤＮＡ結合因
子との結合を促進する活性を有するその改変アミノ酸配
列および （ｂ）配列番号２の１９９〜２０７番のアミノ酸配列ま
たは１個以上の改変を有し、かつＤＮＡとＤＮＡ結合因
子との結合を促進する活性を有するその改変アミノ酸配
列。
【００１６】本発明による遺伝子は、本発明によるタン
パク質をコードするポリヌクレオチドからなるものであ
る。
パク質をコードするポリヌクレオチドからなるものであ
る。
【００１７】本発明によるタンパク質は、種々のＤＮＡ
−タンパク質間の特異的相互作用を非特異的に促進でき
る。従って、本発明によるタンパク質は、エンドヌクレ
アーゼ、エキソヌクレアーゼ、メチラーゼ、ＤＮＡポリ
メラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ等の酵
素類を用いた酵素反応、核酸とタンパク質の特異的な反
応を検出するゲルシフトアッセイ法やサウスウエスタン
法などの解析法、ＤＮＡチップ技術を用いた核酸−タン
パク質間相互作用の網羅的解析法を高効率化、高感度化
することができる。
−タンパク質間の特異的相互作用を非特異的に促進でき
る。従って、本発明によるタンパク質は、エンドヌクレ
アーゼ、エキソヌクレアーゼ、メチラーゼ、ＤＮＡポリ
メラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ等の酵
素類を用いた酵素反応、核酸とタンパク質の特異的な反
応を検出するゲルシフトアッセイ法やサウスウエスタン
法などの解析法、ＤＮＡチップ技術を用いた核酸−タン
パク質間相互作用の網羅的解析法を高効率化、高感度化
することができる。
【００１８】また、遺伝子の発現はＤＮＡと転写（およ
び／または翻訳）の段階で種々のＤＮＡ（あるいはＲＮ
Ａ）−タンパク質相互作用が関わっている。従って、本
発明による遺伝子を所望の異種遺伝子とともに発現させ
れば、異種遺伝子の発現量を増大させることもできる。
び／または翻訳）の段階で種々のＤＮＡ（あるいはＲＮ
Ａ）−タンパク質相互作用が関わっている。従って、本
発明による遺伝子を所望の異種遺伝子とともに発現させ
れば、異種遺伝子の発現量を増大させることもできる。
【００１９】
【発明の具体的説明】タンパク質 本明細書において「改変」とは、置換、欠失、挿入、お
よび付加を意味する。
よび付加を意味する。
【００２０】改変が複数個存在する場合、改変の種類は
同一であっても、異なっていてもよい。
同一であっても、異なっていてもよい。
【００２１】「改変」は好ましくは「保存的置換」であ
ることができる。
ることができる。
【００２２】「保存的置換」とはあるタンパク質中のあ
るアミノ酸を化学的に類似する別のアミノ酸で置換する
ことを意味し、例えば、非極性アミノ酸あるいは極性ア
ミノ酸の間での置換を意味する。より具体的には下記群
における置換が挙げられる： 非極性アミノ酸：Ala、Val、Leu、Ile、Met、Trp、Ph
e、およびPro、 極性アミノ酸（無電荷）：Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、A
sn、およびGln、 極性アミノ酸（正電荷）：Lys、His、およびArg、 極性アミノ酸（負電荷）：AspおよびGlu。
るアミノ酸を化学的に類似する別のアミノ酸で置換する
ことを意味し、例えば、非極性アミノ酸あるいは極性ア
ミノ酸の間での置換を意味する。より具体的には下記群
における置換が挙げられる： 非極性アミノ酸：Ala、Val、Leu、Ile、Met、Trp、Ph
e、およびPro、 極性アミノ酸（無電荷）：Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、A
sn、およびGln、 極性アミノ酸（正電荷）：Lys、His、およびArg、 極性アミノ酸（負電荷）：AspおよびGlu。
【００２３】本明細書において「ＤＮＡとＤＮＡ結合因
子との結合を促進する活性を有する」か否かは、例え
ば、ＤＮＡとＤＮＡ結合因子とを準備し、これらに被験
タンパク質を作用させ、ＤＮＡとＤＮＡ結合因子との相
互作用を、例えば、ゲルシフトアッセイ（実施例２参
照）、インビトロ転写反応（実施例９参照）、または制
限酵素反応（実施例１０参照）によって確認することに
より評価することができる。ゲルシフトアッセイを用い
る場合、被験タンパク質の結合促進活性の相対活性が
２．５より大きい場合、好ましくは３．０より大きい場
合に「ＤＮＡとＤＮＡ結合因子との結合を促進する活性
を有する」と評価することができる。
子との結合を促進する活性を有する」か否かは、例え
ば、ＤＮＡとＤＮＡ結合因子とを準備し、これらに被験
タンパク質を作用させ、ＤＮＡとＤＮＡ結合因子との相
互作用を、例えば、ゲルシフトアッセイ（実施例２参
照）、インビトロ転写反応（実施例９参照）、または制
限酵素反応（実施例１０参照）によって確認することに
より評価することができる。ゲルシフトアッセイを用い
る場合、被験タンパク質の結合促進活性の相対活性が
２．５より大きい場合、好ましくは３．０より大きい場
合に「ＤＮＡとＤＮＡ結合因子との結合を促進する活性
を有する」と評価することができる。
【００２４】配列番号２の１７０〜１８３番の領域およ
び１９９〜２０７番の領域はそれ自体で結合促進活性を
有するが、この領域とともに１３４〜１６９番の領域お
よび／または１８４〜１９８番の領域を保持することに
より、より高い相対結合促進活性を実現することができ
る。従って本発明によるタンパク質は、配列（ａ）およ
び／または配列（ｂ）に加えて、配列番号２の１３４〜
１６９番のアミノ酸配列または１個以上の改変（好まし
くは保存的置換）を有するその改変アミノ酸配列および
／または１８４〜１９８番のアミノ酸配列または１個以
上の改変（好ましくは保存的置換）を有するその改変ア
ミノ酸配列を更に含むことができる。
び１９９〜２０７番の領域はそれ自体で結合促進活性を
有するが、この領域とともに１３４〜１６９番の領域お
よび／または１８４〜１９８番の領域を保持することに
より、より高い相対結合促進活性を実現することができ
る。従って本発明によるタンパク質は、配列（ａ）およ
び／または配列（ｂ）に加えて、配列番号２の１３４〜
１６９番のアミノ酸配列または１個以上の改変（好まし
くは保存的置換）を有するその改変アミノ酸配列および
／または１８４〜１９８番のアミノ酸配列または１個以
上の改変（好ましくは保存的置換）を有するその改変ア
ミノ酸配列を更に含むことができる。
【００２５】配列番号２の１３４〜１６９番のアミノ酸
配列またはその改変アミノ酸配列は、配列（ａ）および
／または配列（ｂ）のＮ末端側に付加することができ
る。
配列またはその改変アミノ酸配列は、配列（ａ）および
／または配列（ｂ）のＮ末端側に付加することができ
る。
【００２６】配列番号２の１８４〜１９８番のアミノ酸
配列またはその改変アミノ酸配列は、配列（ａ）のＣ末
端側、かつ配列（ｂ）のＮ末端側の位置に付加すること
ができる。
配列またはその改変アミノ酸配列は、配列（ａ）のＣ末
端側、かつ配列（ｂ）のＮ末端側の位置に付加すること
ができる。
【００２７】本発明によるタンパク質は、配列番号２の
１〜１３３番のアミノ酸配列または１個以上の改変（好
ましくは保存的置換）を有するその改変アミノ酸配列お
よび／または配列番号２の２０８〜２５９番のアミノ酸
配列または１個以上の改変（好ましくは保存的置換）を
有するその改変アミノ酸配列を更に含んでいてもよい。
１〜１３３番のアミノ酸配列または１個以上の改変（好
ましくは保存的置換）を有するその改変アミノ酸配列お
よび／または配列番号２の２０８〜２５９番のアミノ酸
配列または１個以上の改変（好ましくは保存的置換）を
有するその改変アミノ酸配列を更に含んでいてもよい。
【００２８】配列番号２の１〜１３３番のアミノ酸配列
またはその改変アミノ酸配列は、Ｎ末端に位置するよう
に付加することができる。
またはその改変アミノ酸配列は、Ｎ末端に位置するよう
に付加することができる。
【００２９】配列番号２の２０８〜２５９番のアミノ酸
配列またはその改変アミノ酸配列は、Ｃ末端に位置する
ように付加することができる。
配列またはその改変アミノ酸配列は、Ｃ末端に位置する
ように付加することができる。
【００３０】本発明によるタンパク質の具体例として
は、配列番号２の１２０〜２５９番、１３４〜２０７
番、１７０〜１８３番、１３４〜１８３番、１７０〜１
９８番、１３４〜１９８番、１９９〜２０７番、１８４
〜２０７番、１９９〜２２３番、もしくは１８４〜２２
３番のアミノ酸配列、または１個以上の改変（好ましく
は保存的置換）がなされたその改変アミノ酸配列が挙げ
られる。
は、配列番号２の１２０〜２５９番、１３４〜２０７
番、１７０〜１８３番、１３４〜１８３番、１７０〜１
９８番、１３４〜１９８番、１９９〜２０７番、１８４
〜２０７番、１９９〜２２３番、もしくは１８４〜２２
３番のアミノ酸配列、または１個以上の改変（好ましく
は保存的置換）がなされたその改変アミノ酸配列が挙げ
られる。
【００３１】本発明によるタンパク質は、下記からなる
群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるものである
ことができる： （ｃ）配列番号２のアミノ酸配列および （ｄ）置換、欠失、付加、および挿入から選択される１
以上の改変を有し、かつＤＮＡとＤＮＡ結合因子との結
合を促進する活性を有する配列番号２のアミノ酸配列の
改変アミノ酸配列。
群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるものである
ことができる： （ｃ）配列番号２のアミノ酸配列および （ｄ）置換、欠失、付加、および挿入から選択される１
以上の改変を有し、かつＤＮＡとＤＮＡ結合因子との結
合を促進する活性を有する配列番号２のアミノ酸配列の
改変アミノ酸配列。
【００３２】配列（ｄ）は、好ましくは下記アミノ酸配
列からなることができる：１〜１６９番および１８４〜
２５９番の領域において１個以上の改変（好ましくは保
存的置換）を有する配列番号２の改変アミノ酸配列、１
〜１９８番および２０８〜２５９番の領域において１個
以上の改変（好ましくは保存的置換）を有する配列番号
２の改変アミノ酸配列、１〜１６９番、１８４〜１９８
番、および２０８〜２５９番の領域において１個以上の
改変（好ましくは保存的置換）を有する配列番号２の改
変アミノ酸配列、１〜１１９番の領域において１個以上
の改変（好ましくは保存的置換）を有する配列番号２の
改変アミノ酸配列、１〜１３３番および２０８〜２５９
番の領域において１個以上の改変（好ましくは保存的置
換）を有する配列番号２の改変アミノ酸配列。
列からなることができる：１〜１６９番および１８４〜
２５９番の領域において１個以上の改変（好ましくは保
存的置換）を有する配列番号２の改変アミノ酸配列、１
〜１９８番および２０８〜２５９番の領域において１個
以上の改変（好ましくは保存的置換）を有する配列番号
２の改変アミノ酸配列、１〜１６９番、１８４〜１９８
番、および２０８〜２５９番の領域において１個以上の
改変（好ましくは保存的置換）を有する配列番号２の改
変アミノ酸配列、１〜１１９番の領域において１個以上
の改変（好ましくは保存的置換）を有する配列番号２の
改変アミノ酸配列、１〜１３３番および２０８〜２５９
番の領域において１個以上の改変（好ましくは保存的置
換）を有する配列番号２の改変アミノ酸配列。
【００３３】配列（ｄ）は、好ましくは下記アミノ酸配
列からなることができる：１〜１１９番の領域において
改変を有し、かつ１２０〜２５９番の領域において保存
的置換を有する配列番号２の改変アミノ酸配列、１〜１
３３番および２０８〜２５９番の領域において改変を有
し、かつ１３４〜２０７番の領域において保存的置換を
有する配列番号２の改変アミノ酸配列、１〜１６９番お
よび１８４〜２５９番の領域において改変を有し、かつ
１７０〜１８３番の領域において保存的置換を有する配
列番号２の改変アミノ酸配列、または１〜１９８番およ
び２０８〜２５９番の領域において改変を有し、かつ１
９９〜２０７番の領域において保存的置換を有する配列
番号２の改変アミノ酸配列。
列からなることができる：１〜１１９番の領域において
改変を有し、かつ１２０〜２５９番の領域において保存
的置換を有する配列番号２の改変アミノ酸配列、１〜１
３３番および２０８〜２５９番の領域において改変を有
し、かつ１３４〜２０７番の領域において保存的置換を
有する配列番号２の改変アミノ酸配列、１〜１６９番お
よび１８４〜２５９番の領域において改変を有し、かつ
１７０〜１８３番の領域において保存的置換を有する配
列番号２の改変アミノ酸配列、または１〜１９８番およ
び２０８〜２５９番の領域において改変を有し、かつ１
９９〜２０７番の領域において保存的置換を有する配列
番号２の改変アミノ酸配列。
【００３４】本発明によるタンパク質はそのＮ末端に核
移行シグナルペプチドを更に含んでいてもよい。
移行シグナルペプチドを更に含んでいてもよい。
【００３５】核移行シグナルペプチドはＳＶ４０ラージ
Ｔ抗原由来であることができ、例えば、配列番号１８の
アミノ酸配列からなることができる。
Ｔ抗原由来であることができ、例えば、配列番号１８の
アミノ酸配列からなることができる。
【００３６】本発明によるタンパク質は他のタンパク質
と融合させ、融合タンパク質とすることができる。
と融合させ、融合タンパク質とすることができる。
【００３７】他のタンパク質としては、グルタチオンＳ
トランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼが挙げ
られる。
トランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼが挙げ
られる。
【００３８】本発明によるタンパク質は、実施例にて開
示したようにカイコ後部絹糸腺から単離精製してもよい
し、後述するように、本発明による遺伝子を発現するよ
うに遺伝子工学的方法により改変された形質転換体を培
養することによって、調製することもできる。またポリ
ヌクレオチドがＲＮＡである場合には、例えば周知のin
vitro翻訳系を用いてタンパク質を生産させることがで
きる。
示したようにカイコ後部絹糸腺から単離精製してもよい
し、後述するように、本発明による遺伝子を発現するよ
うに遺伝子工学的方法により改変された形質転換体を培
養することによって、調製することもできる。またポリ
ヌクレオチドがＲＮＡである場合には、例えば周知のin
vitro翻訳系を用いてタンパク質を生産させることがで
きる。
【００３９】形質転換細胞の培養により産生された本発
明によるタンパク質の精製は、それが細胞内に産生され
る場合は、例えば、培養終了後、形質転換細胞の細胞を
遠心分離等で集め、細胞を通常のバッファー、例えば、
20mMHEPES pH7,1mM EDTA,1mMDTT,0.5mM PMSFからなるバ
ッファー等に懸濁した後、ポリトロン、超音波、ダウン
スホモジナイザー等を用いて細胞を破砕し、破砕液を数
万×ｇで数十分から１時間程度超遠心分離し、上清画分
を回収することにより、本発明によるタンパク質を含む
画分を得ることができる。
明によるタンパク質の精製は、それが細胞内に産生され
る場合は、例えば、培養終了後、形質転換細胞の細胞を
遠心分離等で集め、細胞を通常のバッファー、例えば、
20mMHEPES pH7,1mM EDTA,1mMDTT,0.5mM PMSFからなるバ
ッファー等に懸濁した後、ポリトロン、超音波、ダウン
スホモジナイザー等を用いて細胞を破砕し、破砕液を数
万×ｇで数十分から１時間程度超遠心分離し、上清画分
を回収することにより、本発明によるタンパク質を含む
画分を得ることができる。
【００４０】また、本発明タンパク質を培地中に分泌生
産させる場合には、培養終了後遠心分離により上清画分
として本発明によるタンパク質を含む画分を得ることが
できる。これら上清画分を、塩析法、溶媒沈殿法、透析
法、限外ろ過法、ゲル電気泳動法、あるいはイオン交換
クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆
相クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィ
ー等の精製手段を適宜組み合わせることにより、精製さ
れた本発明タンパク質を回収することができる。
産させる場合には、培養終了後遠心分離により上清画分
として本発明によるタンパク質を含む画分を得ることが
できる。これら上清画分を、塩析法、溶媒沈殿法、透析
法、限外ろ過法、ゲル電気泳動法、あるいはイオン交換
クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆
相クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィ
ー等の精製手段を適宜組み合わせることにより、精製さ
れた本発明タンパク質を回収することができる。
【００４１】本発明によるタンパク質を特定のプロテア
ーゼによる切断部位を介して他のタンパク質と融合した
形で発現させた場合には、例えば実施例７に開示したよ
うに精製工程の適切な段階で切断部位に特異的なプロテ
アーゼ処理を行うことにより、他のタンパク質を削除
し、非融合型のタンパク質を得ることができる。
ーゼによる切断部位を介して他のタンパク質と融合した
形で発現させた場合には、例えば実施例７に開示したよ
うに精製工程の適切な段階で切断部位に特異的なプロテ
アーゼ処理を行うことにより、他のタンパク質を削除
し、非融合型のタンパク質を得ることができる。
【００４２】遺伝子 本発明による遺伝子は、本発明によるタンパク質をコー
ドするポリヌクレオチドであることができる。
ドするポリヌクレオチドであることができる。
【００４３】本発明によるタンパク質のアミノ酸配列が
与えられれば、それをコードするヌクレオチド配列は容
易に定まり、配列番号２に記載されるアミノ酸配列をコ
ードする種々のヌクレオチド配列を選択することができ
る。従って、本発明によるタンパク質をコードするヌク
レオチド配列とは、配列番号１に記載のＤＮＡ配列の一
部または全部に加え、同一のアミノ酸をコードするＤＮ
Ａ配列であって縮重関係にあるコドンをＤＮＡ配列とし
て有する配列をも意味するものとし、更にこれらに対応
するＲＮＡ配列も含まれる。
与えられれば、それをコードするヌクレオチド配列は容
易に定まり、配列番号２に記載されるアミノ酸配列をコ
ードする種々のヌクレオチド配列を選択することができ
る。従って、本発明によるタンパク質をコードするヌク
レオチド配列とは、配列番号１に記載のＤＮＡ配列の一
部または全部に加え、同一のアミノ酸をコードするＤＮ
Ａ配列であって縮重関係にあるコドンをＤＮＡ配列とし
て有する配列をも意味するものとし、更にこれらに対応
するＲＮＡ配列も含まれる。
【００４４】本発明による遺伝子は、シグナルペプチド
（例えば、核移行シグナルペプチド）をコードするヌク
レオチド配列を有していてもよい。本発明による遺伝子
はまた、本発明によるタンパク質を融合タンパク質とし
て発現させるための他のタンパク質をコードするヌクレ
オチド配列を有していてもよい。
（例えば、核移行シグナルペプチド）をコードするヌク
レオチド配列を有していてもよい。本発明による遺伝子
はまた、本発明によるタンパク質を融合タンパク質とし
て発現させるための他のタンパク質をコードするヌクレ
オチド配列を有していてもよい。
【００４５】本明細書において「ポリヌクレオチド」と
はＤＮＡおよびＲＮＡを含む意味で用いられる。ポリヌ
クレオチドの由来は特に限定されるものではなく、染色
体由来であっても、化学合成したものであってもよい。
ＤＮＡは、染色体ＤＮＡであっても、化学合成ＤＮＡや
ｃＤＮＡ等であってもよい。
はＤＮＡおよびＲＮＡを含む意味で用いられる。ポリヌ
クレオチドの由来は特に限定されるものではなく、染色
体由来であっても、化学合成したものであってもよい。
ＤＮＡは、染色体ＤＮＡであっても、化学合成ＤＮＡや
ｃＤＮＡ等であってもよい。
【００４６】本発明による遺伝子は例えば下記のように
して得ることができる。
して得ることができる。
【００４７】本発明による遺伝子のうち、配列番号１の
ヌクレオチド配列を有するＢＹＢタンパク質をコードす
るＤＮＡは、例えば、“錦秋ｘ鐘和”等のカイコから、
J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis著；モレキュラー
クローニング第２版（Molecular Cloning 2nd editio
n）、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー（Col
dSpring Harbor Laboratory）発行、１９８９年等に記
載の遺伝子工学的方法に準じて得ることができる。具体
的には、まず、カイコの後部絹糸腺から全ＲＮＡを調製
し、得られた全ＲＮＡを鋳型として使用し、ＲＮＡにオ
リゴｄＴプライマーをアニールさせた後に逆転写酵素を
作用させることにより一本鎖ｃＤＮＡを合成する。次い
で、一本鎖ｃＤＮＡに大腸菌ＲＮａｓｅＨおよび大腸菌
のＤＮＡポリメラーゼＩを作用させて二本鎖のｃＤＮＡ
を合成する。ｃＤＮＡの両末端をＴ４ＤＮＡポリメラー
ゼにより平滑化し、得られたｃＤＮＡをフェノール−ク
ロロホルム抽出、エタノール沈殿等の通常の方法により
精製し、回収する。このようにして得られたｃＤＮＡを
ベクターにリガーゼを用いて挿入することによりｃＤＮ
Ａライブラリーを作製する。次に、このようなｃＤＮＡ
ライブラリーから、例えば、J.Sambrook,E.F.Frisch,T.
Maniatis著；モレキュラー クローニング第２版（Molec
ular Cloning 2nd edition）、コールドスプリング ハ
ーバー ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laborator
y）発行、１９８９年等に記載の遺伝子工学的方法に準
じて、配列番号１のヌクレオチド配列の部分塩基配列を
有するＤＮＡ断片をプローブとして用いるハイブリダイ
ゼーション法により、本発明による遺伝子を取得するこ
とができる。
ヌクレオチド配列を有するＢＹＢタンパク質をコードす
るＤＮＡは、例えば、“錦秋ｘ鐘和”等のカイコから、
J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis著；モレキュラー
クローニング第２版（Molecular Cloning 2nd editio
n）、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー（Col
dSpring Harbor Laboratory）発行、１９８９年等に記
載の遺伝子工学的方法に準じて得ることができる。具体
的には、まず、カイコの後部絹糸腺から全ＲＮＡを調製
し、得られた全ＲＮＡを鋳型として使用し、ＲＮＡにオ
リゴｄＴプライマーをアニールさせた後に逆転写酵素を
作用させることにより一本鎖ｃＤＮＡを合成する。次い
で、一本鎖ｃＤＮＡに大腸菌ＲＮａｓｅＨおよび大腸菌
のＤＮＡポリメラーゼＩを作用させて二本鎖のｃＤＮＡ
を合成する。ｃＤＮＡの両末端をＴ４ＤＮＡポリメラー
ゼにより平滑化し、得られたｃＤＮＡをフェノール−ク
ロロホルム抽出、エタノール沈殿等の通常の方法により
精製し、回収する。このようにして得られたｃＤＮＡを
ベクターにリガーゼを用いて挿入することによりｃＤＮ
Ａライブラリーを作製する。次に、このようなｃＤＮＡ
ライブラリーから、例えば、J.Sambrook,E.F.Frisch,T.
Maniatis著；モレキュラー クローニング第２版（Molec
ular Cloning 2nd edition）、コールドスプリング ハ
ーバー ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laborator
y）発行、１９８９年等に記載の遺伝子工学的方法に準
じて、配列番号１のヌクレオチド配列の部分塩基配列を
有するＤＮＡ断片をプローブとして用いるハイブリダイ
ゼーション法により、本発明による遺伝子を取得するこ
とができる。
【００４８】また、配列番号１のヌクレオチド配列の部
分配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして
用いるＰＣＲ法により、本発明による遺伝子を取得する
こともできる。
分配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして
用いるＰＣＲ法により、本発明による遺伝子を取得する
こともできる。
【００４９】更に、調製された全ＲＮＡを鋳型に使用し
て逆転写反応を行なった後、得られたＤＮＡを鋳型にし
てＰＣＲを行なうことにより（ＲＴ−ＰＣＲ法）、本発
明による遺伝子を取得することもできる。
て逆転写反応を行なった後、得られたＤＮＡを鋳型にし
てＰＣＲを行なうことにより（ＲＴ−ＰＣＲ法）、本発
明による遺伝子を取得することもできる。
【００５０】ＰＣＲ法およびＲＴ−ＰＣＲ法において本
発明による遺伝子を増幅する際に用いるプライマーとし
ては、例えば、約２０ｂｐ〜約４０ｂｐの長さでかつG
またはC塩基の割合が約４０％〜約７０％の塩基配列
を、配列番号１のヌクレオチド配列の５’末端領域およ
び３’末端領域からそれぞれ選択し、この配列を有する
オリゴヌクレオチドを合成するとよい。具体的には、例
えば、フォワードプライマーとしては5'-ATG GCT GAT A
CC GAA AAG GCG C -3'（配列番号１８）や5'-TACACC AT
G GCT GAT ACC GAA AAG GCG C -3'（配列番号１９）が
あげられ、リバースプライマーとしては5'-AGG CCT GGC
TCT CAT TGG TAG T-3'（配列番号２０）があげられ
る。
発明による遺伝子を増幅する際に用いるプライマーとし
ては、例えば、約２０ｂｐ〜約４０ｂｐの長さでかつG
またはC塩基の割合が約４０％〜約７０％の塩基配列
を、配列番号１のヌクレオチド配列の５’末端領域およ
び３’末端領域からそれぞれ選択し、この配列を有する
オリゴヌクレオチドを合成するとよい。具体的には、例
えば、フォワードプライマーとしては5'-ATG GCT GAT A
CC GAA AAG GCG C -3'（配列番号１８）や5'-TACACC AT
G GCT GAT ACC GAA AAG GCG C -3'（配列番号１９）が
あげられ、リバースプライマーとしては5'-AGG CCT GGC
TCT CAT TGG TAG T-3'（配列番号２０）があげられ
る。
【００５１】ＰＣＲ法により増幅された本発明による遺
伝子は、例えば、J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis
著；モレキュラー クローニング第２版（Molecular Clo
ning 2nd edition）、コールドスプリング ハーバー ラ
ボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）発行、
１９８９年等に記載の遺伝子工学的方法に準じてベクタ
ーにクローニングすることができる。例えば、ＴＡクロ
ーニングキット（Invitrogen社）やpBluescriptII（Str
atagene社）などの市販のプラスミドベクターを用いて
クローニングすることができる。
伝子は、例えば、J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis
著；モレキュラー クローニング第２版（Molecular Clo
ning 2nd edition）、コールドスプリング ハーバー ラ
ボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）発行、
１９８９年等に記載の遺伝子工学的方法に準じてベクタ
ーにクローニングすることができる。例えば、ＴＡクロ
ーニングキット（Invitrogen社）やpBluescriptII（Str
atagene社）などの市販のプラスミドベクターを用いて
クローニングすることができる。
【００５２】本発明による遺伝子は、そのヌクレオチド
配列に基づき、核酸の化学合成法、例えばホスファイト
・トリエステル法（Hunkapiller,M.et al., Nature, 31
0,105, 1984）、により調製することもできる。
配列に基づき、核酸の化学合成法、例えばホスファイト
・トリエステル法（Hunkapiller,M.et al., Nature, 31
0,105, 1984）、により調製することもできる。
【００５３】また、配列番号２の改変アミノ酸配列をコ
ードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡは、前記方法
で取得した配列番号１のヌクレオチド配列あるいは配列
番号２のアミノ酸配列をコードする任意の縮重関係のヌ
クレオチド配列を有するＤＮＡに基づき、適宜任意の制
限酵素と必要に応じてリンカーを用いることによって、
あるいは部位特異的突然変異誘発法やPCR法（Nucleic A
cid Res., Vol.10, pp.6487 (1982)、Methods in Enzym
ology, 100, pp448 (1983)、Molecular Cloning 2ndEd
t., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989）、P
CR A PracticalApproach IRL Press pp200 (1991))に
よって、容易に作成することができる。
ードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡは、前記方法
で取得した配列番号１のヌクレオチド配列あるいは配列
番号２のアミノ酸配列をコードする任意の縮重関係のヌ
クレオチド配列を有するＤＮＡに基づき、適宜任意の制
限酵素と必要に応じてリンカーを用いることによって、
あるいは部位特異的突然変異誘発法やPCR法（Nucleic A
cid Res., Vol.10, pp.6487 (1982)、Methods in Enzym
ology, 100, pp448 (1983)、Molecular Cloning 2ndEd
t., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989）、P
CR A PracticalApproach IRL Press pp200 (1991))に
よって、容易に作成することができる。
【００５４】得られたＤＮＡの配列は、Maxam Gilbert
法 (例えば、Maxam,A.M &W.Gilbert,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA, 74, 560, 1977 等に記載される)やSanger法（例
えばSanger,F. & A.R.Coulson, J.Mol.Biol., 94, 441,
1975、Sanger,F, & Nicklenand A.R.Coulson., Proc.N
atl.Acad.Sci.USA, 74, 5463, 1977等に記載される）に
準じて解析することにより確認できる。
法 (例えば、Maxam,A.M &W.Gilbert,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA, 74, 560, 1977 等に記載される)やSanger法（例
えばSanger,F. & A.R.Coulson, J.Mol.Biol., 94, 441,
1975、Sanger,F, & Nicklenand A.R.Coulson., Proc.N
atl.Acad.Sci.USA, 74, 5463, 1977等に記載される）に
準じて解析することにより確認できる。
【００５５】ベクターおよび形質転換体 本発明による組換えベクターは、宿主内で複製可能なベ
クターであって、宿主からの単離、精製が可能であり、
検出可能なマーカー遺伝子をもつベクターに、本発明に
よる遺伝子を通常の遺伝子工学的手法を用いて組込むこ
とにより構築することができる。
クターであって、宿主からの単離、精製が可能であり、
検出可能なマーカー遺伝子をもつベクターに、本発明に
よる遺伝子を通常の遺伝子工学的手法を用いて組込むこ
とにより構築することができる。
【００５６】本発明によるベクターの構築に用いること
ができるベクターとしては、大腸菌を宿主とする場合、
例えば、プラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造（株）製）
や、ファージミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ストラ
タジーン社製）であることができ、酵母を宿主とする場
合は、プラスミドｐＹＥＳ２（インビトロジェン社製）
であることができ、哺乳類動物細胞を宿主細胞とする場
合は、ｐＲＣ／ＲＳＶ、ｐＲＣ／ＣＭＶ（インビトロジ
ェン社製）等のプラスミド、ＥＢウイルスプラスミドｐ
ＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（インビトロジェン社製）等のウ
イルス由来の自律複製起点を含むベクターであることが
でき、昆虫類動物細胞（以下、昆虫細胞と記す。）を宿
主とする場合は、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスで
あることができる。バキュロウイルス等のウイルスにＤ
ＮＡを組込むには、使用しようとするウイルスのゲノム
と相同なヌクレオチド配列を含有するトランスファーベ
クターを用いることができる。このようなトランスファ
ーベクターとしては、クローンテック社から市販されて
いるｐＢａｃＰＡＫ８、ｐＡｃＵＷ３１などのプラスミ
ドがあげられる。本発明による遺伝子をトランスファー
ベクターに挿入し、トランスファーベクターとウイルス
ゲノムとを同時に宿主に導入すると、トランスファーベ
クターとウイルスゲノムとの間で相同組換えが起こり、
本発明による遺伝子がゲノム上に組み込まれたバキュロ
ウイルスを得ることができる。
ができるベクターとしては、大腸菌を宿主とする場合、
例えば、プラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造（株）製）
や、ファージミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ストラ
タジーン社製）であることができ、酵母を宿主とする場
合は、プラスミドｐＹＥＳ２（インビトロジェン社製）
であることができ、哺乳類動物細胞を宿主細胞とする場
合は、ｐＲＣ／ＲＳＶ、ｐＲＣ／ＣＭＶ（インビトロジ
ェン社製）等のプラスミド、ＥＢウイルスプラスミドｐ
ＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（インビトロジェン社製）等のウ
イルス由来の自律複製起点を含むベクターであることが
でき、昆虫類動物細胞（以下、昆虫細胞と記す。）を宿
主とする場合は、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスで
あることができる。バキュロウイルス等のウイルスにＤ
ＮＡを組込むには、使用しようとするウイルスのゲノム
と相同なヌクレオチド配列を含有するトランスファーベ
クターを用いることができる。このようなトランスファ
ーベクターとしては、クローンテック社から市販されて
いるｐＢａｃＰＡＫ８、ｐＡｃＵＷ３１などのプラスミ
ドがあげられる。本発明による遺伝子をトランスファー
ベクターに挿入し、トランスファーベクターとウイルス
ゲノムとを同時に宿主に導入すると、トランスファーベ
クターとウイルスゲノムとの間で相同組換えが起こり、
本発明による遺伝子がゲノム上に組み込まれたバキュロ
ウイルスを得ることができる。
【００５７】本発明による遺伝子と、宿主で作動可能な
制御配列（例えば、プロモーター配列およびターミネー
ター配列）とを作動可能に連結させ、これをベクターに
組み込むことにより、本発明による遺伝子を宿主で発現
させることができるベクターを構築することができる。
制御配列（例えば、プロモーター配列およびターミネー
ター配列）とを作動可能に連結させ、これをベクターに
組み込むことにより、本発明による遺伝子を宿主で発現
させることができるベクターを構築することができる。
【００５８】ここで、「作動可能に連結する」とは、本
発明による遺伝子が導入される宿主において、制御配列
のコントロール下で遺伝子が発現するように、制御配列
と本発明による遺伝子とを結合させることを意味する。
通常は、プロモーターを遺伝子の上流に、ターミネータ
ーを遺伝子の下流に連結することができる。
発明による遺伝子が導入される宿主において、制御配列
のコントロール下で遺伝子が発現するように、制御配列
と本発明による遺伝子とを結合させることを意味する。
通常は、プロモーターを遺伝子の上流に、ターミネータ
ーを遺伝子の下流に連結することができる。
【００５９】使用できるプロモーターは、形質転換する
宿主内でプロモーター活性を示すものであれば特に制限
はなく、例えば、宿主が動物細胞や分裂酵母である場合
は、例えば、アデノウイルス（Ａｄ）の初期もしくは後
期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモ
ーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ
ー、シミアンウイルス（ＳＶ４０）の初期もしくは後期
プロモーター、マウス乳頭腫ウイルス（ＭＭＴＶ）プロ
モーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のチミジン
キナーゼ（ｔｋ）遺伝子プロモーターであることがで
き、宿主が昆虫細胞である場合はバキュロウイルスのポ
リヘドリンプロモーターやショウジョウバエのメタロチ
オネインプロモーターであることができ、宿主が出芽酵
母である場合はＡＤＨ１、ＧＡＬ１プロモーターである
ことができる。
宿主内でプロモーター活性を示すものであれば特に制限
はなく、例えば、宿主が動物細胞や分裂酵母である場合
は、例えば、アデノウイルス（Ａｄ）の初期もしくは後
期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモ
ーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ
ー、シミアンウイルス（ＳＶ４０）の初期もしくは後期
プロモーター、マウス乳頭腫ウイルス（ＭＭＴＶ）プロ
モーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のチミジン
キナーゼ（ｔｋ）遺伝子プロモーターであることがで
き、宿主が昆虫細胞である場合はバキュロウイルスのポ
リヘドリンプロモーターやショウジョウバエのメタロチ
オネインプロモーターであることができ、宿主が出芽酵
母である場合はＡＤＨ１、ＧＡＬ１プロモーターである
ことができる。
【００６０】宿主において機能するプロモーターをあら
かじめ保有するベクターを使用する場合は、ベクター保
有のプロモーターと本発明による遺伝子とを作動可能に
連結することができる。
かじめ保有するベクターを使用する場合は、ベクター保
有のプロモーターと本発明による遺伝子とを作動可能に
連結することができる。
【００６１】例えば、プラスミドｐＲＣ／ＲＳＶ、ｐＲ
Ｃ／ＣＭＶ等は、動物細胞で作動可能なプロモーターの
下流にクローニング部位が設けられており、クローニン
グ部位に本発明による遺伝子を挿入し、動物細胞へ導入
すれば、本発明に遺伝子を発現させることができる。こ
れらのプラスミドにはあらかじめＳＶ４０の自律複製起
点（ｏｒｉ）が組み込まれているため、ｏｒｉ（−）の
ＳＶ４０ゲノムで形質転換された培養細胞、例えばＣＯ
Ｓ細胞等にこのプラスミドを導入すると、細胞内でプラ
スミドのコピー数が非常に増大し、結果としてプラスミ
ドに組み込まれた本発明による遺伝子を大量に発現させ
ることもできる。
Ｃ／ＣＭＶ等は、動物細胞で作動可能なプロモーターの
下流にクローニング部位が設けられており、クローニン
グ部位に本発明による遺伝子を挿入し、動物細胞へ導入
すれば、本発明に遺伝子を発現させることができる。こ
れらのプラスミドにはあらかじめＳＶ４０の自律複製起
点（ｏｒｉ）が組み込まれているため、ｏｒｉ（−）の
ＳＶ４０ゲノムで形質転換された培養細胞、例えばＣＯ
Ｓ細胞等にこのプラスミドを導入すると、細胞内でプラ
スミドのコピー数が非常に増大し、結果としてプラスミ
ドに組み込まれた本発明による遺伝子を大量に発現させ
ることもできる。
【００６２】また、酵母用プラスミドｐＹＥＳ２はＧＡ
Ｌ１プロモーターを有しており、このプラスミドまたは
その誘導体のＧＡＬ１プロモーターの下流に本発明によ
る遺伝子を挿入すれば、本発明による遺伝子を例えばＩ
ＮＶＳｃ１（インビトロジェン社製）等の出芽酵母内で
大量に発現させることが可能なベクターを構築できる。
Ｌ１プロモーターを有しており、このプラスミドまたは
その誘導体のＧＡＬ１プロモーターの下流に本発明によ
る遺伝子を挿入すれば、本発明による遺伝子を例えばＩ
ＮＶＳｃ１（インビトロジェン社製）等の出芽酵母内で
大量に発現させることが可能なベクターを構築できる。
【００６３】本発明によるベクターは、形質転換体を選
択するためのマーカー遺伝子が更に連結されていてもよ
い。
択するためのマーカー遺伝子が更に連結されていてもよ
い。
【００６４】本発明による遺伝子を真核細胞で発現させ
る場合には、発現したタンパク質の核へ移行を促進する
ために、遺伝子の上流に核移行シグナル配列を付加する
ことができる。核移行シグナルとしては、真核細胞で発
現させる場合にはＳＶ４０のラージＴ抗原のシグナル配
列が、また出芽酵母で発現させる場合にはＧＡＬ４タン
パク質のシグナル配列を利用することができる。
る場合には、発現したタンパク質の核へ移行を促進する
ために、遺伝子の上流に核移行シグナル配列を付加する
ことができる。核移行シグナルとしては、真核細胞で発
現させる場合にはＳＶ４０のラージＴ抗原のシグナル配
列が、また出芽酵母で発現させる場合にはＧＡＬ４タン
パク質のシグナル配列を利用することができる。
【００６５】このように構築された本発明によるベクタ
ーを宿主に導入することにより、本発明による形質転換
体を得ることができる。
ーを宿主に導入することにより、本発明による形質転換
体を得ることができる。
【００６６】本発明によるベクターを宿主へ導入する方
法は、形質転換される宿主に応じて通常用いられる方法
に従うことができる。
法は、形質転換される宿主に応じて通常用いられる方法
に従うことができる。
【００６７】例えば、大腸菌を宿主細胞とする場合は、
「モレキュラー・クローニング」（J.Sambrookら、コー
ルド・スプリング・ハーバー、１９８９年）等に記載さ
れる塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法等を
用いることができる。酵母菌を宿主とする場合は、例え
ばリチウム法に基づくYeast transformation kit(イン
ビトロジェン社製)などを用いてベクターを導入するこ
とができる。哺乳類動物細胞や昆虫細胞等の動物細胞を
宿主とする場合は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAE
デキストラン法、エレクトロポレーション法、またはリ
ポフェクション法を用いることができる。ウイルスをベ
クターに用いる場合は、上述のような一般的な遺伝子導
入法によりウイルスゲノムを宿主に導入できるほか、ウ
イルスゲノムを含有するウイルス粒子を宿主へ感染させ
ることによってもウイルスゲノムを宿主に導入すること
ができる。
「モレキュラー・クローニング」（J.Sambrookら、コー
ルド・スプリング・ハーバー、１９８９年）等に記載さ
れる塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法等を
用いることができる。酵母菌を宿主とする場合は、例え
ばリチウム法に基づくYeast transformation kit(イン
ビトロジェン社製)などを用いてベクターを導入するこ
とができる。哺乳類動物細胞や昆虫細胞等の動物細胞を
宿主とする場合は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAE
デキストラン法、エレクトロポレーション法、またはリ
ポフェクション法を用いることができる。ウイルスをベ
クターに用いる場合は、上述のような一般的な遺伝子導
入法によりウイルスゲノムを宿主に導入できるほか、ウ
イルスゲノムを含有するウイルス粒子を宿主へ感染させ
ることによってもウイルスゲノムを宿主に導入すること
ができる。
【００６８】本発明による形質転換体の選抜は、導入さ
れた本発明によるベクターが有するマーカー遺伝子の性
質に応じた方法を用いればよい。
れた本発明によるベクターが有するマーカー遺伝子の性
質に応じた方法を用いればよい。
【００６９】例えば、マーカー遺伝子が細胞致死活性を
示す薬剤に対する耐性遺伝子である場合には、この薬剤
を添加した培地を用いて本発明によるベクターを導入し
た細胞を培養すればよい。薬剤耐性遺伝子と選抜薬剤と
の組み合わせとしては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝
子とネオマイシン、ハイグロマイシン耐性遺伝子とハイ
グロマイシン、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子とブラス
トサイジンＳが挙げられる。また、マーカー遺伝子が、
宿主の栄養要求性を相補する遺伝子である場合には、こ
の栄養素を含まない最少培地を用いて本発明によるベク
ターを導入した細胞を培養すればよい。本発明による遺
伝子が宿主の染色体に導入されてなる形質転換体を取得
するには、例えば、本発明によるベクターを制限酵素等
で消化することにより直鎖状にした後、これを前述の方
法で宿主へ導入して該細胞を通常数週間培養し、導入さ
れた検出マーカーを指標にして目的とする形質転換細胞
を選抜すればよい。例えば、上記のような選択薬剤に対
する耐性遺伝子をマーカー遺伝子として持つ本発明によ
るベクターを前述の方法で宿主に導入し、選択薬剤を添
加した培地で数週間以上を継代培養し、コロニー状に生
き残った選択薬剤耐性クローンをピペットで吸い上げ純
化することにより、本発明による遺伝子が宿主の染色体
に導入されてなる形質転換体を取得することができる。
このような形質転換体は、凍結保存が可能であり、必要
に応じて起眠させて使用することできるので、一過性の
遺伝子導入株と比較して形質転換体作製の手間を省くこ
とができ、形質転換細胞の性能を一定に保つこともでき
る点で有利である。
示す薬剤に対する耐性遺伝子である場合には、この薬剤
を添加した培地を用いて本発明によるベクターを導入し
た細胞を培養すればよい。薬剤耐性遺伝子と選抜薬剤と
の組み合わせとしては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝
子とネオマイシン、ハイグロマイシン耐性遺伝子とハイ
グロマイシン、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子とブラス
トサイジンＳが挙げられる。また、マーカー遺伝子が、
宿主の栄養要求性を相補する遺伝子である場合には、こ
の栄養素を含まない最少培地を用いて本発明によるベク
ターを導入した細胞を培養すればよい。本発明による遺
伝子が宿主の染色体に導入されてなる形質転換体を取得
するには、例えば、本発明によるベクターを制限酵素等
で消化することにより直鎖状にした後、これを前述の方
法で宿主へ導入して該細胞を通常数週間培養し、導入さ
れた検出マーカーを指標にして目的とする形質転換細胞
を選抜すればよい。例えば、上記のような選択薬剤に対
する耐性遺伝子をマーカー遺伝子として持つ本発明によ
るベクターを前述の方法で宿主に導入し、選択薬剤を添
加した培地で数週間以上を継代培養し、コロニー状に生
き残った選択薬剤耐性クローンをピペットで吸い上げ純
化することにより、本発明による遺伝子が宿主の染色体
に導入されてなる形質転換体を取得することができる。
このような形質転換体は、凍結保存が可能であり、必要
に応じて起眠させて使用することできるので、一過性の
遺伝子導入株と比較して形質転換体作製の手間を省くこ
とができ、形質転換細胞の性能を一定に保つこともでき
る点で有利である。
【００７０】本発明によるタンパク質は、形質転換体を
培養し、本発明によるタンパク質を採取することにより
製造することができる。
培養し、本発明によるタンパク質を採取することにより
製造することができる。
【００７１】形質転換体が微生物である場合、この形質
転換体は微生物の通常の培養に使用される炭素源、窒素
源、有機塩類、および無機塩類等を適宜含む各種の培地
を用いて培養できる。培養は、微生物の通常の培養方法
に準じて行うことができ、例えば、固体培養、液体培養
（攪拌培養（試験管振とう式培養、往復式振とう培養、
ジャーファーメンター（Jar Fermenter）培養等）、静
置培養（タンク培養等）を含む）により培養できる。培
養温度は、微生物が生育する範囲で適宜変更でき、例え
ば、約１５℃〜約４０℃の培養温度、ｐＨ約６〜ｐＨ約
８の培地で培養するとよい。培養時間は、培養条件に従
って決定できるが、通常は約１日〜約５日間であること
ができる。形質転換体が動物細胞である場合、この形質
転換体は動物細胞の通常の培養に使用される培地を用い
て培養できる。
転換体は微生物の通常の培養に使用される炭素源、窒素
源、有機塩類、および無機塩類等を適宜含む各種の培地
を用いて培養できる。培養は、微生物の通常の培養方法
に準じて行うことができ、例えば、固体培養、液体培養
（攪拌培養（試験管振とう式培養、往復式振とう培養、
ジャーファーメンター（Jar Fermenter）培養等）、静
置培養（タンク培養等）を含む）により培養できる。培
養温度は、微生物が生育する範囲で適宜変更でき、例え
ば、約１５℃〜約４０℃の培養温度、ｐＨ約６〜ｐＨ約
８の培地で培養するとよい。培養時間は、培養条件に従
って決定できるが、通常は約１日〜約５日間であること
ができる。形質転換体が動物細胞である場合、この形質
転換体は動物細胞の通常の培養に使用される培地を用い
て培養できる。
【００７２】形質転換体が哺乳類動物細胞の場合、例え
ば１０ｖ／ｖ％となるようＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培
地等の培地を用いて、３７℃、５ｖ／ｖ％ＣＯ２存在下
にて、培地を数日ごとに交換しながら培養することがで
きる。細胞がコンフルエントになるまで増殖したら、
０．２５ｗ／ｖ％程度のトリプシンＰＢＳ溶液を用いて
個々の細胞に分散させ、数倍に希釈して新しい培養容器
に播種し培養を続け、目的とする量まで細胞が増殖した
ら細胞を集める。このように継代培養を行うことにより
培養スケールを任意のサイズまで拡大できる。形質転換
体が昆虫細胞の場合も同様に、10v/v%FBSおよび2w/v%Ye
astlateを含むGrace's medium等の昆虫細胞用培地を用
いて２５℃〜３５℃で継代培養することにより得ること
ができる。ただし、Sf21細胞などの培養容器からはがれ
やすい細胞の場合は、トリプシン液ではなくピペッテイ
ングにより細胞を分散させ継代を行なうのが好ましい。
また、Baculovirus等のウイルスベクターを含む形質転
換細胞の場合は、細胞質効果により細胞が死滅する前、
例えば培養開始から７２時間目までに培養を終了するこ
とが好ましい。
ば１０ｖ／ｖ％となるようＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培
地等の培地を用いて、３７℃、５ｖ／ｖ％ＣＯ２存在下
にて、培地を数日ごとに交換しながら培養することがで
きる。細胞がコンフルエントになるまで増殖したら、
０．２５ｗ／ｖ％程度のトリプシンＰＢＳ溶液を用いて
個々の細胞に分散させ、数倍に希釈して新しい培養容器
に播種し培養を続け、目的とする量まで細胞が増殖した
ら細胞を集める。このように継代培養を行うことにより
培養スケールを任意のサイズまで拡大できる。形質転換
体が昆虫細胞の場合も同様に、10v/v%FBSおよび2w/v%Ye
astlateを含むGrace's medium等の昆虫細胞用培地を用
いて２５℃〜３５℃で継代培養することにより得ること
ができる。ただし、Sf21細胞などの培養容器からはがれ
やすい細胞の場合は、トリプシン液ではなくピペッテイ
ングにより細胞を分散させ継代を行なうのが好ましい。
また、Baculovirus等のウイルスベクターを含む形質転
換細胞の場合は、細胞質効果により細胞が死滅する前、
例えば培養開始から７２時間目までに培養を終了するこ
とが好ましい。
【００７３】培養の後、公知の単離、精製手段を用い
て、本発明によるタンパク質を精製・単離することがで
きる。
て、本発明によるタンパク質を精製・単離することがで
きる。
【００７４】本発明による形質転換体は、本発明による
タンパク質のみならず、所望の異種タンパク質を発現す
るように改変されていてもよい。異種タンパク質をコー
ドするＤＮＡの導入は、本発明による遺伝子の導入と同
様にして実施できる。異種タンパク質は、生理活性タン
パク質、レポータータンパク質、受容体タンパク質であ
ることができる。
タンパク質のみならず、所望の異種タンパク質を発現す
るように改変されていてもよい。異種タンパク質をコー
ドするＤＮＡの導入は、本発明による遺伝子の導入と同
様にして実施できる。異種タンパク質は、生理活性タン
パク質、レポータータンパク質、受容体タンパク質であ
ることができる。
【００７５】遺伝子の発現に際しては、ＤＮＡの転写や
翻訳の段階で種々のＤＮＡ（あるいはＲＮＡ）−タンパ
ク質相互作用が関わっている。従って、本発明による遺
伝子を所望の異種遺伝子とともに発現させれば、異種遺
伝子の発現量を増大させることができる。異種遺伝子と
ともに本発明による遺伝子が導入された形質転換体は、
本発明による遺伝子が導入されていない形質転換体と比
べて異種遺伝子の発現量が増大し、異種タンパク質を大
量生産できる点で有利である。
翻訳の段階で種々のＤＮＡ（あるいはＲＮＡ）−タンパ
ク質相互作用が関わっている。従って、本発明による遺
伝子を所望の異種遺伝子とともに発現させれば、異種遺
伝子の発現量を増大させることができる。異種遺伝子と
ともに本発明による遺伝子が導入された形質転換体は、
本発明による遺伝子が導入されていない形質転換体と比
べて異種遺伝子の発現量が増大し、異種タンパク質を大
量生産できる点で有利である。
【００７６】レポータータンパク質をコードする遺伝子
（レポーター遺伝子）としては、ルシフェラーゼ遺伝
子、分泌型アルカリフォスファターゼ遺伝子、βガラク
トシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子、成長ホルモン遺伝子などが利用
できる。
（レポーター遺伝子）としては、ルシフェラーゼ遺伝
子、分泌型アルカリフォスファターゼ遺伝子、βガラク
トシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子、成長ホルモン遺伝子などが利用
できる。
【００７７】レポーター遺伝子とともに本発明によるベ
クターが導入された形質転換体は、本発明による発現ベ
クターを導入しない場合に比べて、レポーター遺伝子の
mRNA量が増加し、レポータータンパク質の形質転換細胞
細胞内における蓄積が増加する。本発明によるタンパク
質が発現することにより遺伝子発現量の基底レベルが増
加するため、測定系の感度や有効範囲の向上の点で有利
である。従って本発明による遺伝子は細胞内における遺
伝子発現量測定実験に利用することができる。
クターが導入された形質転換体は、本発明による発現ベ
クターを導入しない場合に比べて、レポーター遺伝子の
mRNA量が増加し、レポータータンパク質の形質転換細胞
細胞内における蓄積が増加する。本発明によるタンパク
質が発現することにより遺伝子発現量の基底レベルが増
加するため、測定系の感度や有効範囲の向上の点で有利
である。従って本発明による遺伝子は細胞内における遺
伝子発現量測定実験に利用することができる。
【００７８】例えば、レポーター遺伝子がルシフェラー
ゼ遺伝子である場合には、形質転換細胞を破砕して細胞
粗抽出物を調製し、細胞粗抽出物にルシフェラーゼの基
質であるルシフェリンを加え、発現量を測定することが
できる。発光量はルシフェラーゼ量に比例するため、こ
の発光量をルミノメーター等の測定装置で測定すること
により、ルシフェラーゼ遺伝子の発現量がわかる。ルシ
フェラーゼ遺伝子の発現量から、ルシフェラーゼ遺伝子
と同時に導入した本発明による発現ベクターにコードさ
れている本発明によるタンパク質の発現活性化能が明ら
かになる。
ゼ遺伝子である場合には、形質転換細胞を破砕して細胞
粗抽出物を調製し、細胞粗抽出物にルシフェラーゼの基
質であるルシフェリンを加え、発現量を測定することが
できる。発光量はルシフェラーゼ量に比例するため、こ
の発光量をルミノメーター等の測定装置で測定すること
により、ルシフェラーゼ遺伝子の発現量がわかる。ルシ
フェラーゼ遺伝子の発現量から、ルシフェラーゼ遺伝子
と同時に導入した本発明による発現ベクターにコードさ
れている本発明によるタンパク質の発現活性化能が明ら
かになる。
【００７９】タンパク質の用途 本発明によるタンパク質はＤＮＡとＤＮＡ結合因子との
結合を促進する活性を有する。
結合を促進する活性を有する。
【００８０】従って本発明によれば、本発明によるタン
パク質を含んでなる、ＤＮＡとＤＮＡ結合因子と間の相
互作用を促進するための組成物が提供される。
パク質を含んでなる、ＤＮＡとＤＮＡ結合因子と間の相
互作用を促進するための組成物が提供される。
【００８１】本発明によればまた、ＤＮＡおよびＤＮＡ
結合因子が存在する反応系に本発明によるタンパク質を
添加することを含んでなる、ＤＮＡとＤＮＡ結合因子と
間の相互作用を促進する方法が提供される。
結合因子が存在する反応系に本発明によるタンパク質を
添加することを含んでなる、ＤＮＡとＤＮＡ結合因子と
間の相互作用を促進する方法が提供される。
【００８２】ＤＮＡ結合因子は、ＤＮＡに結合して作用
する酵素であることができ、例えば、エンドヌクレアー
ゼ、エキソヌクレアーゼ、メチラーゼ、ＤＮＡポリメラ
ーゼ、ＤＮＡリガーゼ、およびＲＮＡポリメラーゼから
選択される酵素であることができ、本発明によるタンパ
ク質はエンドヌクレアーゼ反応、エキソヌクレアーゼ反
応、メチラーゼ反応、ＤＮＡポリメラーゼ反応、ＤＮＡ
リガーゼ反応、およびＲＮＡポリメラーゼ反応を促進す
ることができる。
する酵素であることができ、例えば、エンドヌクレアー
ゼ、エキソヌクレアーゼ、メチラーゼ、ＤＮＡポリメラ
ーゼ、ＤＮＡリガーゼ、およびＲＮＡポリメラーゼから
選択される酵素であることができ、本発明によるタンパ
ク質はエンドヌクレアーゼ反応、エキソヌクレアーゼ反
応、メチラーゼ反応、ＤＮＡポリメラーゼ反応、ＤＮＡ
リガーゼ反応、およびＲＮＡポリメラーゼ反応を促進す
ることができる。
【００８３】反応がエンドヌクレアーゼ反応の場合、例
えば、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶ、Ｈｉｎｆ
Ｉ（宝酒造（株）製）等の制限酵素と、λファージのゲ
ノム等のＤＮＡとを３７℃で反応させるときに本発明に
よるタンパク質を共存させることにより、制限酵素の活
性を促進することができる。この効果は４℃で反応させ
る場合にさらに顕著になる。
えば、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶ、Ｈｉｎｆ
Ｉ（宝酒造（株）製）等の制限酵素と、λファージのゲ
ノム等のＤＮＡとを３７℃で反応させるときに本発明に
よるタンパク質を共存させることにより、制限酵素の活
性を促進することができる。この効果は４℃で反応させ
る場合にさらに顕著になる。
【００８４】反応がエキソヌクレアーゼ反応の場合、例
えば、ｐＵＣ１１９（宝酒造（株）製）を上述のＥｃｏ
ＲＩで消化したＤＮＡ断片をＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ I
II（宝酒造（株）製）で消化する際に、本発明によるタ
ンパク質を共存させることにより、一本鎖部分の分解を
効率良く行うことができる。
えば、ｐＵＣ１１９（宝酒造（株）製）を上述のＥｃｏ
ＲＩで消化したＤＮＡ断片をＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ I
II（宝酒造（株）製）で消化する際に、本発明によるタ
ンパク質を共存させることにより、一本鎖部分の分解を
効率良く行うことができる。
【００８５】反応がＤＮＡポリメラーゼ反応の場合、例
えば、上述のｐＵＣ１１９のＥｃｏＲＩ消化物をＤＮＡ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＩ（宝酒造（株）製）と反応さ
せる際に本発明によるタンパク質を共存させることによ
り、ＤＮＡ断片末端の一本鎖構造の二本鎖構造への変換
を効率良く行うことができる。
えば、上述のｐＵＣ１１９のＥｃｏＲＩ消化物をＤＮＡ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＩ（宝酒造（株）製）と反応さ
せる際に本発明によるタンパク質を共存させることによ
り、ＤＮＡ断片末端の一本鎖構造の二本鎖構造への変換
を効率良く行うことができる。
【００８６】反応がＤＮＡリガーゼ反応の場合、上述の
ｐＵＣ１１９のＥｃｏＲＩ消化物とＥｃｏＲＩで消化し
た任意のＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（宝
酒造（株）製）で連結する際に、本発明によるタンパク
質を共存させることにより連結反応を促進することがで
きる。
ｐＵＣ１１９のＥｃｏＲＩ消化物とＥｃｏＲＩで消化し
た任意のＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（宝
酒造（株）製）で連結する際に、本発明によるタンパク
質を共存させることにより連結反応を促進することがで
きる。
【００８７】反応がＲＮＡポリメラーゼ反応の場合、イ
ンビトロ転写反応において本発明によるタンパク質を共
存させることにより、反応を促進させることができる。
例えば、転写の鋳型としてアデノウイルスの主要後期遺
伝子のプロモーター配列を含むＡｄ２ＭＬＰ ｗｉｔｈ
Ｇ−ｌｅｓｓ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｉｎ ｐＵＣ１８
ｃｃｃＤＮＡ（Sawadogo & Roeder (1985) PNAS 82,
4394-4398）、基本転写因子として、ＴＦＩＩＢ (recom
binant in E. coli)、TBP (recombinant)、ＴＦＩＩＦ
(recombinant in Baculovirus)、RNA polymerase II (p
urified fromcalf thymus)を用い、10 mM HEPES pH7.
6、 25 mM KCl、 6 mM MgCl2、 3% Glycerol、620 mM A
TP & UTP,、25 mM CTP、 5 mCi α-32P-CTP、 200 mM O
-methyl-GTPを含む反応系に本発明タンパク質を加えて
反応させ転写産物量を増加させることができる（実施例
９参照）。
ンビトロ転写反応において本発明によるタンパク質を共
存させることにより、反応を促進させることができる。
例えば、転写の鋳型としてアデノウイルスの主要後期遺
伝子のプロモーター配列を含むＡｄ２ＭＬＰ ｗｉｔｈ
Ｇ−ｌｅｓｓ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｉｎ ｐＵＣ１８
ｃｃｃＤＮＡ（Sawadogo & Roeder (1985) PNAS 82,
4394-4398）、基本転写因子として、ＴＦＩＩＢ (recom
binant in E. coli)、TBP (recombinant)、ＴＦＩＩＦ
(recombinant in Baculovirus)、RNA polymerase II (p
urified fromcalf thymus)を用い、10 mM HEPES pH7.
6、 25 mM KCl、 6 mM MgCl2、 3% Glycerol、620 mM A
TP & UTP,、25 mM CTP、 5 mCi α-32P-CTP、 200 mM O
-methyl-GTPを含む反応系に本発明タンパク質を加えて
反応させ転写産物量を増加させることができる（実施例
９参照）。
【００８８】本発明によるタンパク質はまた、ＤＮＡと
ＤＮＡ結合性因子との結合を非特異的に促進することが
できる。従って、本発明によるタンパク質は、ゲルシフ
トアッセイ法やサウスウエスタン法などDNA−タンパク
質間相互作用を利用した解析法の高感度化に用いること
ができる。
ＤＮＡ結合性因子との結合を非特異的に促進することが
できる。従って、本発明によるタンパク質は、ゲルシフ
トアッセイ法やサウスウエスタン法などDNA−タンパク
質間相互作用を利用した解析法の高感度化に用いること
ができる。
【００８９】反応がゲルシフトアッセイ（Takiya et al
(1997) Biochem. J. 321, 645-653およびMatsuno et a
l (1990) Nucl. Acids Res. 18, 1853-1858）の場合、
反応液10μl中の標準組成（12 mM HEPES pH7.9, 7.5 mM
MgCl2, 1.2 mM DTT, 0.1-0.2 mM EDTA, 17-20% Glycer
ol, 1 ug poly(dI-dC), 0.4-0.5 ng oligo DNA probe,
６０ｍＭ ＫＣｌ）に１２μｇ程度の本発明によるタン
パク質を添加し、試験対象ＤＮＡ結合性タンパク質とそ
の結合配列を持つオリゴプローブを使用して反応を行
い、非変性条件下で電気泳動により特異的結合の検出を
行うことができる。
(1997) Biochem. J. 321, 645-653およびMatsuno et a
l (1990) Nucl. Acids Res. 18, 1853-1858）の場合、
反応液10μl中の標準組成（12 mM HEPES pH7.9, 7.5 mM
MgCl2, 1.2 mM DTT, 0.1-0.2 mM EDTA, 17-20% Glycer
ol, 1 ug poly(dI-dC), 0.4-0.5 ng oligo DNA probe,
６０ｍＭ ＫＣｌ）に１２μｇ程度の本発明によるタン
パク質を添加し、試験対象ＤＮＡ結合性タンパク質とそ
の結合配列を持つオリゴプローブを使用して反応を行
い、非変性条件下で電気泳動により特異的結合の検出を
行うことができる。
【００９０】
【実施例】以下、本発明に係る実施例を詳述するが、本
発明はこれら実施例に限定されるものではない。
発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００９１】実施例１：カイコ絹糸腺抽出液の調製 カイコは実用品種“錦秋ｘ鐘和”（カネボウシルクエレ
ガンス社または上田蚕種協業組合より蚕種を購入）を用
い、主に人工飼料で一部は桑で飼育した。５齢起蚕後、
１〜２日経過した幼虫を解剖し、後部絹糸腺のみを切り
離して1xSSC（0.15M NaCl, 0.015M クエン酸Na pH7.0）
と抽出用バッファー（40 mM Tris pH7.9, 5 mM MgCl2,
12% Sucrose, 25% Glycerol, 2 mM DTT）で洗い、ただ
ちに-80℃で冷凍保存した。
ガンス社または上田蚕種協業組合より蚕種を購入）を用
い、主に人工飼料で一部は桑で飼育した。５齢起蚕後、
１〜２日経過した幼虫を解剖し、後部絹糸腺のみを切り
離して1xSSC（0.15M NaCl, 0.015M クエン酸Na pH7.0）
と抽出用バッファー（40 mM Tris pH7.9, 5 mM MgCl2,
12% Sucrose, 25% Glycerol, 2 mM DTT）で洗い、ただ
ちに-80℃で冷凍保存した。
【００９２】抽出液の調製法は、滝谷等（Takiya et al
(1990) EMBO J. 9, 489-496）に記載された方法を以下
のように大量調製用に改変して用いた。主な変更点は、
硫安沈澱を超遠心から高速冷却遠心にしたこと、沈澱を
溶かす溶液量や抽出バッファーの量を出発材料に対する
相対値より多くしたこと、ペレットを得る場合に、ピペ
ットで上清を捨てていたものをデカンテーションにした
ことなどである。
(1990) EMBO J. 9, 489-496）に記載された方法を以下
のように大量調製用に改変して用いた。主な変更点は、
硫安沈澱を超遠心から高速冷却遠心にしたこと、沈澱を
溶かす溶液量や抽出バッファーの量を出発材料に対する
相対値より多くしたこと、ペレットを得る場合に、ピペ
ットで上清を捨てていたものをデカンテーションにした
ことなどである。
【００９３】実際には後部絹糸腺（約３００頭）を凍っ
たままビーカーに移し、ハサミで切りながら、全部で60
mlの抽出バッファーを少しずつ加えた。氷が融けるま
では室温で、その後も組織が充分に細かくなるまで氷上
で切断した。切断した組織をガラス製Dounce型ホモゲナ
イザー（コンテス社製 １５ml サイズ A (loose fit
ting) type pestle を使用）で２回ホモゲナイズした
後、約1,800×gで5分間遠心を行い沈殿を得た。この沈
殿をビーカーに移し、100mlの抽出バッファーを加え、
充分に懸濁してから、さらに１５回ホモゲナイズした。
ホモゲナイズ後、溶液を1Lビーカーに移し、140ml（合
計240 ml）の抽出バッファーを添加した後、スターラー
で撹拌しながら24mlの飽和硫安溶液を一滴ずつ加えた。
硫安溶液添加後３０分間撹拌した後、Beckman社製 60Ti
ローターまたは日立社製50.2Ti ローターを使用して約
180,000×gで４時間遠心を行った。得られた上清をメス
シリンダーにデカンテーションで集めてから容量を測
り、1mlあたり0.33gの割合で粉末にした硫安を撹拌しな
がら少しずつ加え、添加後さらに３０分間撹拌した。攪
拌後トミー社製TA13ローターまたはSorval社製 ss34ロ
ーターまたはBeckman社製JA20ローターを使用して約10,
000×gで１時間遠心を行い沈殿を得た。この沈殿に10ml
の透析バッファー（20 mM HEPES pH7.9, 100 mM KCl, 1
2.5 mM MgCl2, 17% Glycerol, 0.1 mM EDTA, 2 mM DT
T）を加え溶解した後、タンパク溶解液を透析バッファ
ーにて１６時間程度透析した。透析後日立社製RP65Tま
たはBeckman社製 Type50を使用して、100,000×gで１時
間遠心を行い得られた上清をカイコ絹糸腺抽出液とし
た。
たままビーカーに移し、ハサミで切りながら、全部で60
mlの抽出バッファーを少しずつ加えた。氷が融けるま
では室温で、その後も組織が充分に細かくなるまで氷上
で切断した。切断した組織をガラス製Dounce型ホモゲナ
イザー（コンテス社製 １５ml サイズ A (loose fit
ting) type pestle を使用）で２回ホモゲナイズした
後、約1,800×gで5分間遠心を行い沈殿を得た。この沈
殿をビーカーに移し、100mlの抽出バッファーを加え、
充分に懸濁してから、さらに１５回ホモゲナイズした。
ホモゲナイズ後、溶液を1Lビーカーに移し、140ml（合
計240 ml）の抽出バッファーを添加した後、スターラー
で撹拌しながら24mlの飽和硫安溶液を一滴ずつ加えた。
硫安溶液添加後３０分間撹拌した後、Beckman社製 60Ti
ローターまたは日立社製50.2Ti ローターを使用して約
180,000×gで４時間遠心を行った。得られた上清をメス
シリンダーにデカンテーションで集めてから容量を測
り、1mlあたり0.33gの割合で粉末にした硫安を撹拌しな
がら少しずつ加え、添加後さらに３０分間撹拌した。攪
拌後トミー社製TA13ローターまたはSorval社製 ss34ロ
ーターまたはBeckman社製JA20ローターを使用して約10,
000×gで１時間遠心を行い沈殿を得た。この沈殿に10ml
の透析バッファー（20 mM HEPES pH7.9, 100 mM KCl, 1
2.5 mM MgCl2, 17% Glycerol, 0.1 mM EDTA, 2 mM DT
T）を加え溶解した後、タンパク溶解液を透析バッファ
ーにて１６時間程度透析した。透析後日立社製RP65Tま
たはBeckman社製 Type50を使用して、100,000×gで１時
間遠心を行い得られた上清をカイコ絹糸腺抽出液とし
た。
【００９４】実施例２：特異的DNA結合活性の検出（ゲ
ルシフト法：EMSA） カイコフィブロイン遺伝子転写制御領域に特異的に結合
するタンパク質が含まれる画分を同定するために、ゲル
シフトアッセイを行った。ゲルシフトアッセイは滝谷等
（Takiya et al (1997) Biochem. J. 321, 645-653）お
よび松尾等（Matsuno et al (1990) Nucl. Acids Res.
18, 1853-1858）に示された方法で行った。また、各画
分中のタンパク質量はBradford法（BioRad社製 Protein
Assay）により行った。具体的には、結合反応は、10μ
ｌの反応液中で行った。反応液10μｌ 中には標準組成
として、12 mM HEPES pH7.9, 7.5 mM MgCl2, 1.2 mM DT
T,0.1-0.2 mM EDTA, 17-20% Glycerol, 1 μg poly(dI
-dC)poly(dI-dC), 0.4-0.5 ng oligo DNA probe, 60 mM
KCl, 2-6 μｌタンパク質分画（タンパク質量として12
μg以下）を含む。なお、カラムからの溶出分画および
SDS PAGE からの回収画分の活性測定では 60-140 mM K
Cl または 100-240 mM NaCl, 2 mM heptyl-thioglucosi
de または 0.02% NP40 などを含むが、これらが本質的
に測定に影響を与えない。上記反応液を氷上で３０分間
置いた後、非変性条件下で電気泳動による特異的結合の
検出を行った。ゲルは7% ポリアクリルアミドとし、1 x
TBEバッファー（50 mM Tris-Borate pH8.3, 1 mM EDT
A）中で、200-250 V の電圧一定で泳動した。泳動後、
ゲルを乾燥してオートラジオグラフィーを行った。
ルシフト法：EMSA） カイコフィブロイン遺伝子転写制御領域に特異的に結合
するタンパク質が含まれる画分を同定するために、ゲル
シフトアッセイを行った。ゲルシフトアッセイは滝谷等
（Takiya et al (1997) Biochem. J. 321, 645-653）お
よび松尾等（Matsuno et al (1990) Nucl. Acids Res.
18, 1853-1858）に示された方法で行った。また、各画
分中のタンパク質量はBradford法（BioRad社製 Protein
Assay）により行った。具体的には、結合反応は、10μ
ｌの反応液中で行った。反応液10μｌ 中には標準組成
として、12 mM HEPES pH7.9, 7.5 mM MgCl2, 1.2 mM DT
T,0.1-0.2 mM EDTA, 17-20% Glycerol, 1 μg poly(dI
-dC)poly(dI-dC), 0.4-0.5 ng oligo DNA probe, 60 mM
KCl, 2-6 μｌタンパク質分画（タンパク質量として12
μg以下）を含む。なお、カラムからの溶出分画および
SDS PAGE からの回収画分の活性測定では 60-140 mM K
Cl または 100-240 mM NaCl, 2 mM heptyl-thioglucosi
de または 0.02% NP40 などを含むが、これらが本質的
に測定に影響を与えない。上記反応液を氷上で３０分間
置いた後、非変性条件下で電気泳動による特異的結合の
検出を行った。ゲルは7% ポリアクリルアミドとし、1 x
TBEバッファー（50 mM Tris-Borate pH8.3, 1 mM EDT
A）中で、200-250 V の電圧一定で泳動した。泳動後、
ゲルを乾燥してオートラジオグラフィーを行った。
【００９５】実施例３：ゲルからのタンパク質の回収と
精製 タンパク質の回収と精製はイノマタ等（Inomata et al.
(1992) Analytical Biochem. 206, 109-114）およびオ
リッツ等（Ortiz et al (1992) FEBS Lett.）に示され
た方法により行った。具体的には、電気泳動後ゲルを数
秒間 水で洗った後、0.2 M イミダゾール、0.1% SDS 中
で５分間振とうした。次にイミダゾール液を除去した
後、0.3 M ZnSO4 液中で振とうし、バックが白く染まり
タンパク質バンドが現れるのを確認（１ー３分程度）し
た後、ただちにZnSO4 溶液を捨てゲルを水で洗浄した。
続いて、タンパク質のバンドを含むゲルを切り出して1.
5ml チューブに入れ、2% クエン酸（1 ml）溶液中で１
０分間振とうして脱色した。さらに溶液を交換して、再
度５分間脱色した後、ゲルを細かく砕いて、 100μｌ
の抽出バッファー（50 mM Tris pH7.9, 150 mM NaCl,
0.1 mM EDTA, 5 mMDTT, 0.1% SDS, 100 μg/ml BSA）を
加えて室温で一晩振とうした。ミリポア社製ウルトラフ
リー C3GV フィルターでゲルを除いた後、少量の抽出バ
ッファーでゲル、フィルターを洗った。これらの操作に
より、ゲル中のタンパク質は150-200 μｌ 程度に回収
できた。
精製 タンパク質の回収と精製はイノマタ等（Inomata et al.
(1992) Analytical Biochem. 206, 109-114）およびオ
リッツ等（Ortiz et al (1992) FEBS Lett.）に示され
た方法により行った。具体的には、電気泳動後ゲルを数
秒間 水で洗った後、0.2 M イミダゾール、0.1% SDS 中
で５分間振とうした。次にイミダゾール液を除去した
後、0.3 M ZnSO4 液中で振とうし、バックが白く染まり
タンパク質バンドが現れるのを確認（１ー３分程度）し
た後、ただちにZnSO4 溶液を捨てゲルを水で洗浄した。
続いて、タンパク質のバンドを含むゲルを切り出して1.
5ml チューブに入れ、2% クエン酸（1 ml）溶液中で１
０分間振とうして脱色した。さらに溶液を交換して、再
度５分間脱色した後、ゲルを細かく砕いて、 100μｌ
の抽出バッファー（50 mM Tris pH7.9, 150 mM NaCl,
0.1 mM EDTA, 5 mMDTT, 0.1% SDS, 100 μg/ml BSA）を
加えて室温で一晩振とうした。ミリポア社製ウルトラフ
リー C3GV フィルターでゲルを除いた後、少量の抽出バ
ッファーでゲル、フィルターを洗った。これらの操作に
より、ゲル中のタンパク質は150-200 μｌ 程度に回収
できた。
【００９６】回収された溶液に-20℃に冷却した５倍量
のアセトンを加え混合し、マイクロ遠心機で遠心して
（15000 rpm, 4℃）ペレットを回収した。ペレットは真
空状態で短時間乾燥し 200 μl の変性溶液（6 M グア
ニジン塩酸、50 mM Tris pH7.9,150 mM NaCl, 0.1 mM E
DTA, 1 mM DTT, 20% Glycerol, 0.1% NP40, 100 μg/ml
BSA）に溶解した。溶液は室温で３０分間放置後、300ml
の再生用バッファー（50 mM Tris pH7.9, 100 mM NaCl
, 12.5 mM MgCl2, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 20%Glycer
ol, 0.1% NP40）に8時間透析した。この操作は2回繰り
返した。回収したタンパク質の濃度は、濃度既知のタン
パク質と同じゲルで泳動し、その染色程度で算定した。
のアセトンを加え混合し、マイクロ遠心機で遠心して
（15000 rpm, 4℃）ペレットを回収した。ペレットは真
空状態で短時間乾燥し 200 μl の変性溶液（6 M グア
ニジン塩酸、50 mM Tris pH7.9,150 mM NaCl, 0.1 mM E
DTA, 1 mM DTT, 20% Glycerol, 0.1% NP40, 100 μg/ml
BSA）に溶解した。溶液は室温で３０分間放置後、300ml
の再生用バッファー（50 mM Tris pH7.9, 100 mM NaCl
, 12.5 mM MgCl2, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 20%Glycer
ol, 0.1% NP40）に8時間透析した。この操作は2回繰り
返した。回収したタンパク質の濃度は、濃度既知のタン
パク質と同じゲルで泳動し、その染色程度で算定した。
【００９７】実施例４：P36タンパク質の分画 BYBタンパク質の分画は滝谷および鈴木の報告（Takiya
& Suzuki (1989) Eur.J. Biochem. 179, 1-9）に示した
方法を改変して行った。実際には、標準的方法で準備し
たPhosphocellulose(10 ml bed vol.；ワットマン社製)
を、K300バッファー（20mM HEPES pH7.9, 300mM KCl, 1
mM EDTA pH8.0, 15% Glycerol, 2mM DTT）で平衡化した
カラムを作製した（外径16mmのカラム管で高さ７ー８c
m）。500頭分のカイコから、実施例１に記載した方法に
より得られたカイコ絹糸腺抽出液をEDTA濃度12.5mMに変
更したK300バッファーに透析し、透析後の抽出液を1時
間あたり30mlの速さでカラムに添加した。抽出液添加
後、カラムを50mlのK300バッファーで洗浄し、さらに30
mlのK500バッファー（KCl濃度を500mMに変更したK300バ
ッファー）を添加して溶出液を2mlずつ分取した。
& Suzuki (1989) Eur.J. Biochem. 179, 1-9）に示した
方法を改変して行った。実際には、標準的方法で準備し
たPhosphocellulose(10 ml bed vol.；ワットマン社製)
を、K300バッファー（20mM HEPES pH7.9, 300mM KCl, 1
mM EDTA pH8.0, 15% Glycerol, 2mM DTT）で平衡化した
カラムを作製した（外径16mmのカラム管で高さ７ー８c
m）。500頭分のカイコから、実施例１に記載した方法に
より得られたカイコ絹糸腺抽出液をEDTA濃度12.5mMに変
更したK300バッファーに透析し、透析後の抽出液を1時
間あたり30mlの速さでカラムに添加した。抽出液添加
後、カラムを50mlのK300バッファーで洗浄し、さらに30
mlのK500バッファー（KCl濃度を500mMに変更したK300バ
ッファー）を添加して溶出液を2mlずつ分取した。
【００９８】上記分画物を用い、実施例２に記載された
方法によりゲルシフトアッセイを行った。反応に用いた
oligo DNA probeの配列は Fb(+290)：5’-aattGATGAATCTATGTAAATACTGGGCAGAC（配
列番号３） であり、前記分画物中に存在するDNA結合タンパク質FMB
P-1が結合する領域である、カイコフィブロインH鎖遺伝
子のプロモーター領域＋２８０から＋３０７の塩基配列
に相当する。
方法によりゲルシフトアッセイを行った。反応に用いた
oligo DNA probeの配列は Fb(+290)：5’-aattGATGAATCTATGTAAATACTGGGCAGAC（配
列番号３） であり、前記分画物中に存在するDNA結合タンパク質FMB
P-1が結合する領域である、カイコフィブロインH鎖遺伝
子のプロモーター領域＋２８０から＋３０７の塩基配列
に相当する。
【００９９】ゲルシフトアッセイの結果、標的オリゴDN
Aと強い結合活性を有するタンパク質の存在が認められ
た溶出画分計５画分の溶出液をまとめて、DNA cellulos
e column chromatographyによりさらに精製を行った。K
500バッファーで平衡化したnative calf thymus DNA ce
llulose（アマシャムファルマシア社製300ml）に上記５
画分混合溶液を添加した。カラムは300mlのN550バッフ
ァー（K500バッファーのKClを550mM NaClに変更し、10m
M heptyl-thioglucosideおよび1mg/ml ロイペプチンを
添加）および300mlのN600バッファー（K500バッファー
のKClを600mM NaClに変更）で洗浄した。洗浄後3mlのN9
00バッファー（K500バッファーのKClを900mM NaClに変
更）を添加し、DNA結合性タンパク質を含む溶出液を得
た。この溶出液中に標的オリゴDNAに対する特異的なDNA
結合活性を有するタンパク質が含まれる事をゲルシフト
アッセイにより確認した後、この画分をStrataClean re
sin（STRATAGENE社製）を用いて濃縮し、濃縮物を用い
て定法に従いSDS PAGE（Laemmli法）を行った。電気泳
動終了後、銀染色法（第一化学社製、2D 用シルバース
テインキット）によりゲルの染色を行い分離パターンの
確認を行った。
Aと強い結合活性を有するタンパク質の存在が認められ
た溶出画分計５画分の溶出液をまとめて、DNA cellulos
e column chromatographyによりさらに精製を行った。K
500バッファーで平衡化したnative calf thymus DNA ce
llulose（アマシャムファルマシア社製300ml）に上記５
画分混合溶液を添加した。カラムは300mlのN550バッフ
ァー（K500バッファーのKClを550mM NaClに変更し、10m
M heptyl-thioglucosideおよび1mg/ml ロイペプチンを
添加）および300mlのN600バッファー（K500バッファー
のKClを600mM NaClに変更）で洗浄した。洗浄後3mlのN9
00バッファー（K500バッファーのKClを900mM NaClに変
更）を添加し、DNA結合性タンパク質を含む溶出液を得
た。この溶出液中に標的オリゴDNAに対する特異的なDNA
結合活性を有するタンパク質が含まれる事をゲルシフト
アッセイにより確認した後、この画分をStrataClean re
sin（STRATAGENE社製）を用いて濃縮し、濃縮物を用い
て定法に従いSDS PAGE（Laemmli法）を行った。電気泳
動終了後、銀染色法（第一化学社製、2D 用シルバース
テインキット）によりゲルの染色を行い分離パターンの
確認を行った。
【０１００】その結果、主要なタンパク質バンドが数本
認められたため、実施例３に記載の方法により、それら
のバンドをゲルから回収して、実施例2に記載の方法に
より、ゲルシフトアッセイによる解析を行なった。その
結果、これらのバンドの中には、標的オリゴDNAを認識
して結合する転写因子FMBP1タンパク質の活性が分子量3
2kDa付近に検出された。
認められたため、実施例３に記載の方法により、それら
のバンドをゲルから回収して、実施例2に記載の方法に
より、ゲルシフトアッセイによる解析を行なった。その
結果、これらのバンドの中には、標的オリゴDNAを認識
して結合する転写因子FMBP1タンパク質の活性が分子量3
2kDa付近に検出された。
【０１０１】FMBP-1 の性質は滝谷の報告（ Takiya et
al 1997 Biochem. J.）にある。この他、分子量36kDaの
タンパク質が FMBP1と標的DNAとの結合活性を促進する
ユニークな活性を有することが判明した。
al 1997 Biochem. J.）にある。この他、分子量36kDaの
タンパク質が FMBP1と標的DNAとの結合活性を促進する
ユニークな活性を有することが判明した。
【０１０２】実施例５：P36タンパク質のアミノ酸配列
の決定 実施例１と３に記載の方法により、約１０００頭分のカ
イコ後部絹糸腺抽出液からDNA cellulose カラム結合分
画を得た。この画分を濃縮した後、直接調製用ゲルで分
離、CBB 染色によって、実施例４記載の、数μg相当の
分子量 36 kDaのタンパク質を検出した。p36 タンパク
質バンドを切り出した後、1.5 ml チューブに移し、0.5
M Tris pH9：アセトニトリル＝１：１を加え、脱色さ
れるまで３０分間振とうした。上清を捨て、真空中で半
乾燥状態にした後、0.5 μgのリシルエンドペプチダー
ゼを含む溶液（100 mM Tris pH9.0、0.02% Tween20）50
μｌを加え、ゲルを再膨潤した。37℃で２０時間保温
した後、上清を新しいチューブに移した。ゲルを細かく
砕いた後、200 μｌ の 100 mM Tris pH9.0, 0.02% Twe
en20 を加え、ミリポア社製ウルトラフリー C3GVフィル
ターを通して抽出液を得た。さらに 100 μｌ の Tris,
Tween 溶液を加え、ゲルとフィルターを洗ってから、
約350μｌのペプチダーゼ処理液をまとめた。アミノ酸
配列の決定は以下のように行った。ペプチダーゼ処理液
をスピードバック濃縮機により１／３程度に濃縮した
後、HPLC によりペプチドマップを作成し、ピークフラ
クションを分取した。各ピークをパーキンエルマーアプ
ライドバイオシステム社のプロテインシーケンサ４９２
にかけ、エドマン分解法（Edman,P.E. 1956 Acta Chem.
Scand.,10, 761-768）によってアミノ酸配列を決定し
た。
の決定 実施例１と３に記載の方法により、約１０００頭分のカ
イコ後部絹糸腺抽出液からDNA cellulose カラム結合分
画を得た。この画分を濃縮した後、直接調製用ゲルで分
離、CBB 染色によって、実施例４記載の、数μg相当の
分子量 36 kDaのタンパク質を検出した。p36 タンパク
質バンドを切り出した後、1.5 ml チューブに移し、0.5
M Tris pH9：アセトニトリル＝１：１を加え、脱色さ
れるまで３０分間振とうした。上清を捨て、真空中で半
乾燥状態にした後、0.5 μgのリシルエンドペプチダー
ゼを含む溶液（100 mM Tris pH9.0、0.02% Tween20）50
μｌを加え、ゲルを再膨潤した。37℃で２０時間保温
した後、上清を新しいチューブに移した。ゲルを細かく
砕いた後、200 μｌ の 100 mM Tris pH9.0, 0.02% Twe
en20 を加え、ミリポア社製ウルトラフリー C3GVフィル
ターを通して抽出液を得た。さらに 100 μｌ の Tris,
Tween 溶液を加え、ゲルとフィルターを洗ってから、
約350μｌのペプチダーゼ処理液をまとめた。アミノ酸
配列の決定は以下のように行った。ペプチダーゼ処理液
をスピードバック濃縮機により１／３程度に濃縮した
後、HPLC によりペプチドマップを作成し、ピークフラ
クションを分取した。各ピークをパーキンエルマーアプ
ライドバイオシステム社のプロテインシーケンサ４９２
にかけ、エドマン分解法（Edman,P.E. 1956 Acta Chem.
Scand.,10, 761-768）によってアミノ酸配列を決定し
た。
【０１０３】その結果5本のペプチドに関して以下の様
にアミノ酸配列が得られた。 i. APQPQPQQQLEQQPQAQQAK（配列番号４） ii. WFNVK（配列番号５） iii. SGYGFINRNDTK（配列番号６） iv. GFEAAGVTGPGGEPVK（配列番号７） v. PVGTTIETTTNES（配列番号８） 得られた部分アミノ酸配列についてBLAST (Altschul SF
et al (1990) J. Mol. Biol. 215; 403-410)によるホ
モロジー検索を行ったところ、これらのアミノ酸配列
が、ヒトのDbpA、DbpB、YB-1などY Boxタンパク質と総
称されるDNA結合性タンパク質（Wolffe et al (1992) N
ew Biol. 4, 290-298、Wolffe (1994) BioEssays 16, 2
45-251）と高い相同性を示すことから、当該タンパク質
がY Box（以下「YB」と略す） タンパク質ファミリーに
属することが明らかになり、本p36タンパク質をBYBタン
パク質と命名した。
にアミノ酸配列が得られた。 i. APQPQPQQQLEQQPQAQQAK（配列番号４） ii. WFNVK（配列番号５） iii. SGYGFINRNDTK（配列番号６） iv. GFEAAGVTGPGGEPVK（配列番号７） v. PVGTTIETTTNES（配列番号８） 得られた部分アミノ酸配列についてBLAST (Altschul SF
et al (1990) J. Mol. Biol. 215; 403-410)によるホ
モロジー検索を行ったところ、これらのアミノ酸配列
が、ヒトのDbpA、DbpB、YB-1などY Boxタンパク質と総
称されるDNA結合性タンパク質（Wolffe et al (1992) N
ew Biol. 4, 290-298、Wolffe (1994) BioEssays 16, 2
45-251）と高い相同性を示すことから、当該タンパク質
がY Box（以下「YB」と略す） タンパク質ファミリーに
属することが明らかになり、本p36タンパク質をBYBタン
パク質と命名した。
【０１０４】実施例６：BYBタンパク質のcDNAのクロー
ニング ５齢１２時間のカイコ幼虫１８頭分の後部絹糸腺より、
アマシャムファルマシア社製 Quick Prep mRNA 精製キ
ットにて、添付プロトコールに従い、約 100 μg のmRN
A を調製した。アマシャムファルマシア社製 Time Save
r cDNA 合成キットを使用し、添付プロトコールに従
い、オリゴdTプライマーを用いて、上記mRNAから２本鎖
cDNAを合成した。得られたcDNAは、Stratagene 社製λZ
apII EcoRI/CIAP arm とライゲーションした後、Strata
gene 社製 Gigapak III Gold パッケージ液を用いてパ
ッケージング反応を行った。反応液を用いてE. coli XL
1-blueMRF’ にトランスフェクションすることによっ
て、2.26 x 105の独立したクローンから成るサイズのcD
NAライブラリーを得た。生じたプラークは、ほぼ全てが
白いプラークを形成し、それらが組換え体であることが
示唆された。これらのうち、ランダムに拾った１２プラ
ークのうち１１プラークのファージにインサートが確認
され、インサートcDNAの長さは平均 1.6 kbであった。
ライブラリーは１回のみ増幅し、5 x 1010pfu/mlのファ
ージ液を調製、以下のスクリーニングに使用した。
ニング ５齢１２時間のカイコ幼虫１８頭分の後部絹糸腺より、
アマシャムファルマシア社製 Quick Prep mRNA 精製キ
ットにて、添付プロトコールに従い、約 100 μg のmRN
A を調製した。アマシャムファルマシア社製 Time Save
r cDNA 合成キットを使用し、添付プロトコールに従
い、オリゴdTプライマーを用いて、上記mRNAから２本鎖
cDNAを合成した。得られたcDNAは、Stratagene 社製λZ
apII EcoRI/CIAP arm とライゲーションした後、Strata
gene 社製 Gigapak III Gold パッケージ液を用いてパ
ッケージング反応を行った。反応液を用いてE. coli XL
1-blueMRF’ にトランスフェクションすることによっ
て、2.26 x 105の独立したクローンから成るサイズのcD
NAライブラリーを得た。生じたプラークは、ほぼ全てが
白いプラークを形成し、それらが組換え体であることが
示唆された。これらのうち、ランダムに拾った１２プラ
ークのうち１１プラークのファージにインサートが確認
され、インサートcDNAの長さは平均 1.6 kbであった。
ライブラリーは１回のみ増幅し、5 x 1010pfu/mlのファ
ージ液を調製、以下のスクリーニングに使用した。
【０１０５】前述したようにBYBタンパク質の部分アミ
ノ酸配列のホモロジー解析からBYBはYBホモログである
ことから、公知のYBホモローグアミノ酸配列と対比する
ことにより、各ペプチドの相対的な位置関係を確定し、
BYB より決定されたアミノ酸配列および YB ファミリー
における高度保存配列を参考に、以下のプライマーを合
成した。
ノ酸配列のホモロジー解析からBYBはYBホモログである
ことから、公知のYBホモローグアミノ酸配列と対比する
ことにより、各ペプチドの相対的な位置関係を確定し、
BYB より決定されたアミノ酸配列および YB ファミリー
における高度保存配列を参考に、以下のプライマーを合
成した。
【０１０６】５’側プライマー；{VK}WFNVK に対しp36-
1：GTNAAGTGGTTYAAYGTVAA（配列番号９） ３’側プライマー；FEAAGV に対し p36-2：ACNCCNGCNG
CYTCRAA（配列番号１０） 上記ｃDNAを鋳型として、p36-1, p36-2 各 0.5 ugをプ
ライマーとしたPCRを、94℃ １分、42℃ ２分、72℃ ２
分、３０サイクルの条件で行った。ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により特異的に増幅された約 200 bpのDNA
バンドを切り出した。0.5 M NH4OAc, 1 mM EDTA, 0.5%
SDS を加え、37℃ 一晩振とうし抽出した後、エタノー
ル沈澱により DNA を回収、少量の TE に溶解した。Pfu
DNAポリメラーゼ（Stratagene社製）を用いて DNA 断
片の末端を平滑化した後、pBluescript KS(-)（Stratag
ene社製）の EcoRV サイトへTakara社製ライゲーション
キット（Ver.2）を用いてライゲーションし、E.coli JM
109 に形質転換した。Blue/White 選択により数個のWhi
teコロニーを選び、インサートの存在を確認した後、定
法により、DNAシーケンシングを行った。
1：GTNAAGTGGTTYAAYGTVAA（配列番号９） ３’側プライマー；FEAAGV に対し p36-2：ACNCCNGCNG
CYTCRAA（配列番号１０） 上記ｃDNAを鋳型として、p36-1, p36-2 各 0.5 ugをプ
ライマーとしたPCRを、94℃ １分、42℃ ２分、72℃ ２
分、３０サイクルの条件で行った。ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により特異的に増幅された約 200 bpのDNA
バンドを切り出した。0.5 M NH4OAc, 1 mM EDTA, 0.5%
SDS を加え、37℃ 一晩振とうし抽出した後、エタノー
ル沈澱により DNA を回収、少量の TE に溶解した。Pfu
DNAポリメラーゼ（Stratagene社製）を用いて DNA 断
片の末端を平滑化した後、pBluescript KS(-)（Stratag
ene社製）の EcoRV サイトへTakara社製ライゲーション
キット（Ver.2）を用いてライゲーションし、E.coli JM
109 に形質転換した。Blue/White 選択により数個のWhi
teコロニーを選び、インサートの存在を確認した後、定
法により、DNAシーケンシングを行った。
【０１０７】決定された PCR クローンの内部配列よ
り、 ５’GATGGCAGTCTGAT GCACAAACACATCTTC３’（配列番号
１１） を p36-3 として合成した。p36-3 の5’末端を３２Ｐ標
識しプローブとした。定法により plating した cDNA
ライブラリーをニトロセルロースフィルターに転写し、
0.5 N NaOH, 1.5 M NaCl で変性、1.5 M NaCl, 0.5 M T
ris pH7.4 で中和、2 x SSC で洗った後、80℃ でDNAを
固定した。フィルターは、6 x SSC, 0.5%SDS, 1 mM EDT
A で 45℃、２時間洗った後、6 x SSC, 5 x Denhardt’
s soln, 0.5% SDS, 100 ug/ml ssDNA で45℃、２時間振
とう処理した。ハイブリダイゼーションは、同じ組成の
溶液に 10 6 cpm/ml のプローブを加え、45℃ 一晩行っ
た。フィルターは、2 x SSC, 0.1% SDS で室温２０分
間、さらに、1 x SSC, 0.1%SDS 49℃ で２０分間数回振
とうして洗った。フィルターは乾燥してオートラジオグ
ラフィーを行った。多数のポジティブプラークのうち、
９プラークについて同様の操作を繰り返し、それぞれ単
一クローン化した。
り、 ５’GATGGCAGTCTGAT GCACAAACACATCTTC３’（配列番号
１１） を p36-3 として合成した。p36-3 の5’末端を３２Ｐ標
識しプローブとした。定法により plating した cDNA
ライブラリーをニトロセルロースフィルターに転写し、
0.5 N NaOH, 1.5 M NaCl で変性、1.5 M NaCl, 0.5 M T
ris pH7.4 で中和、2 x SSC で洗った後、80℃ でDNAを
固定した。フィルターは、6 x SSC, 0.5%SDS, 1 mM EDT
A で 45℃、２時間洗った後、6 x SSC, 5 x Denhardt’
s soln, 0.5% SDS, 100 ug/ml ssDNA で45℃、２時間振
とう処理した。ハイブリダイゼーションは、同じ組成の
溶液に 10 6 cpm/ml のプローブを加え、45℃ 一晩行っ
た。フィルターは、2 x SSC, 0.1% SDS で室温２０分
間、さらに、1 x SSC, 0.1%SDS 49℃ で２０分間数回振
とうして洗った。フィルターは乾燥してオートラジオグ
ラフィーを行った。多数のポジティブプラークのうち、
９プラークについて同様の操作を繰り返し、それぞれ単
一クローン化した。
【０１０８】単離したλZapII cDNA クローンからヘル
パーファージを用いてインサート領域をpBluescript SK
(-) （Stratagene社製） クローンとして取り出し、イ
ンサートのチェックを行った。７クローンは同じ mRNA
に由来し切断点のみが異なるBYB の独立クローンであっ
た。そのうち、最長のインサートを持つと考えられたN
o.12 について詳細に解析し、両鎖それぞれ２回以上シ
ーケンスを確認した。
パーファージを用いてインサート領域をpBluescript SK
(-) （Stratagene社製） クローンとして取り出し、イ
ンサートのチェックを行った。７クローンは同じ mRNA
に由来し切断点のみが異なるBYB の独立クローンであっ
た。そのうち、最長のインサートを持つと考えられたN
o.12 について詳細に解析し、両鎖それぞれ２回以上シ
ーケンスを確認した。
【０１０９】その結果、配列番号１に示したように全長
１３９６塩基からなるcDNA配列が得られた。この配列に
は、80番目から始まり859番目で終わるオープンリーデ
ィングフレームが見出された。また、３’端にはポリA
付加シグナルが存在した。このORFは、２５９アミノ酸
（推定分子量 27.7 kDa）より成るタンパク質をコード
していた（配列番号２）。
１３９６塩基からなるcDNA配列が得られた。この配列に
は、80番目から始まり859番目で終わるオープンリーデ
ィングフレームが見出された。また、３’端にはポリA
付加シグナルが存在した。このORFは、２５９アミノ酸
（推定分子量 27.7 kDa）より成るタンパク質をコード
していた（配列番号２）。
【０１１０】実施例７：BYBタンパク質の大腸菌での発
現 （７−１）発現プラスミドの構築 BYBタンパク質をGST（グルタチオンSトランスフェラー
ゼ）との融合タンパク質として大腸菌にて発現させるた
めのプラスミドpGEX-BYB（全長アミノ酸に対応）、pGEX
-delN(アミノ酸120‐259に対応)、pGEX-delC(アミノ酸1
‐141に対応)、は、以下のように構築した。 BYB遺伝子
の ORF 中の開始コドンATG 部位を含んだCCATGG（配列
番号１の78-83）を NcoIで切断した後、Klenow Polymer
aseで 平滑化した。さらに、ｃDNA合成時に用いたアダ
プター配列内の NotI部位で切断し、得られたNcoI-NotI
断片をプラスミドpGEX-4T1（アマシャムファルマシア
社）の SmaI, NotI 間に挿入し、プラスミドpGEX-BYBを
構築した。BYBタンパク質のコールドショックドメイン
の３‘側末端のPstI部位CTGCAG（配列番号１の４３２−
４３７）で切断、Klenow Polymeraseの nuclease 活性
により平滑化した。さらに、アダプター配列内のNotI
で切断し、PstI-NotI 断片を pGEX-4T2（アマシャムフ
ァルマシア社） の SmaI, NotI 間に挿入して、プラス
ミドpGEX-delNを構築した。pGEX-BYB を SacI（配列番
号１の501−506）と、アダプター配列内のNotI で切断
し、 Klenow Polymeraseを用いて平滑化、さらに閉環化
して、pGEX-delCを構築した。構築したプラスミド中のB
YB遺伝子挿入断片についてDNAシーケンシングにより、D
NA配列が正しいことを確認した。
現 （７−１）発現プラスミドの構築 BYBタンパク質をGST（グルタチオンSトランスフェラー
ゼ）との融合タンパク質として大腸菌にて発現させるた
めのプラスミドpGEX-BYB（全長アミノ酸に対応）、pGEX
-delN(アミノ酸120‐259に対応)、pGEX-delC(アミノ酸1
‐141に対応)、は、以下のように構築した。 BYB遺伝子
の ORF 中の開始コドンATG 部位を含んだCCATGG（配列
番号１の78-83）を NcoIで切断した後、Klenow Polymer
aseで 平滑化した。さらに、ｃDNA合成時に用いたアダ
プター配列内の NotI部位で切断し、得られたNcoI-NotI
断片をプラスミドpGEX-4T1（アマシャムファルマシア
社）の SmaI, NotI 間に挿入し、プラスミドpGEX-BYBを
構築した。BYBタンパク質のコールドショックドメイン
の３‘側末端のPstI部位CTGCAG（配列番号１の４３２−
４３７）で切断、Klenow Polymeraseの nuclease 活性
により平滑化した。さらに、アダプター配列内のNotI
で切断し、PstI-NotI 断片を pGEX-4T2（アマシャムフ
ァルマシア社） の SmaI, NotI 間に挿入して、プラス
ミドpGEX-delNを構築した。pGEX-BYB を SacI（配列番
号１の501−506）と、アダプター配列内のNotI で切断
し、 Klenow Polymeraseを用いて平滑化、さらに閉環化
して、pGEX-delCを構築した。構築したプラスミド中のB
YB遺伝子挿入断片についてDNAシーケンシングにより、D
NA配列が正しいことを確認した。
【０１１１】（７−２）BYB タンパク質の大腸菌での発
現と精製 pGEX-BYB クローン（E. coli DH5α）を30mlのルリア培
地中、30℃で一晩培養した後、LB 培地で５x 希釈し30
℃でさらに１時間培養した。0.1 mM IPTG を加えて３時
間培養、集菌して PBS で洗浄後、 5 ml PBS, 1% Trito
n X-100 を加え、超音波で細胞を破壊した。8000 rpm,
30 分間遠心分離で残さを除き、上清にグルタチオンセ
ファロース4B（アマシャムファルマシア社） 200μｌ
懸濁液を加え、4℃ 一晩混合した。遠心（3000 rpm, 10
分間）でセファロースを集め、50 ml のPBS で洗浄、
さらに50 mlの50 mM Tris pH8.0 で洗浄した。回収した
グルタチオンセファロースを溶出液（50 mM Tris pH8.
0, 20 mM グルタチオン）100 μｌ に懸濁し、4℃ で５
分間振とう後、遠心し上清を回収した。融合タンパク質
をトロンビンで処理し、GST と BYB を分離する場合
は、融合タンパク質をセファロースに吸着させたまま、
100 μｌ の 50 mM Tris pH7.5, 150 mM NaCl,2.5 mM C
aCl２, 0.5 μg トロンビン、を加えた。室温で１時間
反応させた後、遠心して上清を回収し、BYBタンパク質
を得た。組換えタンパク質を SDS PAGEにより精製する
場合は、実施例３記載の方法で行った。
現と精製 pGEX-BYB クローン（E. coli DH5α）を30mlのルリア培
地中、30℃で一晩培養した後、LB 培地で５x 希釈し30
℃でさらに１時間培養した。0.1 mM IPTG を加えて３時
間培養、集菌して PBS で洗浄後、 5 ml PBS, 1% Trito
n X-100 を加え、超音波で細胞を破壊した。8000 rpm,
30 分間遠心分離で残さを除き、上清にグルタチオンセ
ファロース4B（アマシャムファルマシア社） 200μｌ
懸濁液を加え、4℃ 一晩混合した。遠心（3000 rpm, 10
分間）でセファロースを集め、50 ml のPBS で洗浄、
さらに50 mlの50 mM Tris pH8.0 で洗浄した。回収した
グルタチオンセファロースを溶出液（50 mM Tris pH8.
0, 20 mM グルタチオン）100 μｌ に懸濁し、4℃ で５
分間振とう後、遠心し上清を回収した。融合タンパク質
をトロンビンで処理し、GST と BYB を分離する場合
は、融合タンパク質をセファロースに吸着させたまま、
100 μｌ の 50 mM Tris pH7.5, 150 mM NaCl,2.5 mM C
aCl２, 0.5 μg トロンビン、を加えた。室温で１時間
反応させた後、遠心して上清を回収し、BYBタンパク質
を得た。組換えタンパク質を SDS PAGEにより精製する
場合は、実施例３記載の方法で行った。
【０１１２】（７−３）抗BYBタンパク質抗体の作成お
よびこれを用いた解析 （７−２）にて調整したGSTとBYBのアミノ酸120-259部
分との融合タンパク質（以下、「GST-delN」いう）を抗
原としてウサギを免疫し、抗 BYB 血清を調製した。こ
の抗体を用いてウエスタン解析を行ったところ、前記実
施例３記載の方法でカイコ絹糸腺からSDS PAGE 精製し
た 分子量約36kDaのタンパク質に対して反応したことか
ら、クローニングしたBYB遺伝子が同一のタンパク質を
コードすることが確認できた。また、絹糸腺の粗抽出液
やDNA cellulose カラム結合フラクションについて、同
様に解析を行ったところ、いずれのサンプルについても
36kDa のバンドのほかに28 kDa 附近に薄いバンドが検
出されこと、大腸菌で合成される組換え体タンパク質が
約 28 kDa であることから、本タンパク質が修飾または
SDS PAGE での移動度に影響する構造変換を受けている
ことが示唆された（データは示していない）。
よびこれを用いた解析 （７−２）にて調整したGSTとBYBのアミノ酸120-259部
分との融合タンパク質（以下、「GST-delN」いう）を抗
原としてウサギを免疫し、抗 BYB 血清を調製した。こ
の抗体を用いてウエスタン解析を行ったところ、前記実
施例３記載の方法でカイコ絹糸腺からSDS PAGE 精製し
た 分子量約36kDaのタンパク質に対して反応したことか
ら、クローニングしたBYB遺伝子が同一のタンパク質を
コードすることが確認できた。また、絹糸腺の粗抽出液
やDNA cellulose カラム結合フラクションについて、同
様に解析を行ったところ、いずれのサンプルについても
36kDa のバンドのほかに28 kDa 附近に薄いバンドが検
出されこと、大腸菌で合成される組換え体タンパク質が
約 28 kDa であることから、本タンパク質が修飾または
SDS PAGE での移動度に影響する構造変換を受けている
ことが示唆された（データは示していない）。
【０１１３】実施例８：BYBタンパク質の転写因子とDNA
との結合促進効果 （８−１）FMBP-1と特異的DNAとの結合促進効果 実施例３記載の方法により、ゲル から回収した BYBタ
ンパク質（2 ng/μｌ）と実施例１と３記載の方法によ
り調製した分子量32kDaタンパク質を含む FMBP-1フラク
ションについて、FMBP-1 の結合配列を持つ実施例４記
載のFb(+290 )オリゴプローブへの結合を、実施例２記
載のゲルシフト法によりそれぞれ単独および混合して比
較した（図３）。FMBP-1は精製が完了していないためタ
ンパク質量は不明で、添加量をゲルからの抽出原液を基
準に容量比（実際には μｌ）で示しており、これを相
対ユニットとした。BYBタンパク質は Fb(+290)プローブ
に特異的結合活性を示さなかったが、BYB タンパク質は
FMBP-1の結合を促進または安定化する機能を持つ事が示
された。
との結合促進効果 （８−１）FMBP-1と特異的DNAとの結合促進効果 実施例３記載の方法により、ゲル から回収した BYBタ
ンパク質（2 ng/μｌ）と実施例１と３記載の方法によ
り調製した分子量32kDaタンパク質を含む FMBP-1フラク
ションについて、FMBP-1 の結合配列を持つ実施例４記
載のFb(+290 )オリゴプローブへの結合を、実施例２記
載のゲルシフト法によりそれぞれ単独および混合して比
較した（図３）。FMBP-1は精製が完了していないためタ
ンパク質量は不明で、添加量をゲルからの抽出原液を基
準に容量比（実際には μｌ）で示しており、これを相
対ユニットとした。BYBタンパク質は Fb(+290)プローブ
に特異的結合活性を示さなかったが、BYB タンパク質は
FMBP-1の結合を促進または安定化する機能を持つ事が示
された。
【０１１４】さらに、大腸菌で発現したBYBタンパク質
のFMBP-1の特異的DNA結合への促進効果を検討した。組
換えBYBタンパク質は、実施例７記載の方法で調製し
た。反応条件は、実施例２記載の条件に従ったが、BYB,
FMBP-1 ともに 50 mM Tris pH7.9, 12.5 mM MgCl2, 10
0 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% Glycerol, 1 mM DTT, 0.1%
NP40 に溶解してあり、最終塩濃度はこの 0.6 x とな
る。コントロールの FMBP-1単独での活性もこれに合わ
せた。種々のBYBタンパク質の添加によるFMBP-1フラク
ション0.1ユニットの +290 プローブに対する結合促進
効果を調べた（図４）。その結果、GST-BYB （GSTとBYB
全長からなる融合タンパク質）は精製 BYB と同様に FM
BP-1 結合に対する促進効果を示し、その程度は添加量
に依存してることが示された。一方、コントロールの G
ST タンパク質は全く促進効果を示さなかった（結果は
示していない）。また、GST-delC（ GSTとBYBのアミノ
酸1-141部分との融合タンパク質）、GST-delN（前出）
はいずれも結合促進効果を示したが、コールドショック
ドメインを有するGST-delCでは、FMBP-1とオリゴDNA複
合体量が少なく、結合促進活性がやや弱まることが示さ
れた。GST-delCで認められる高分子側のバンドはGST-de
lCと一本鎖オリゴDNAの非特異的結合によるアーティフ
ァクトと考えられる。一方、コールドショックドメイン
を完全に欠くGST-delNのみで、BYBタンパク質全体と全
く同じ促進効果が認められた（図４）。以上のことか
ら、BYBタンパク質による転写因子のDNA結合促進活性
は、主にタンパク質のC末端側（アミノ酸120‐259）に
担われていることが明らかにされた。
のFMBP-1の特異的DNA結合への促進効果を検討した。組
換えBYBタンパク質は、実施例７記載の方法で調製し
た。反応条件は、実施例２記載の条件に従ったが、BYB,
FMBP-1 ともに 50 mM Tris pH7.9, 12.5 mM MgCl2, 10
0 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% Glycerol, 1 mM DTT, 0.1%
NP40 に溶解してあり、最終塩濃度はこの 0.6 x とな
る。コントロールの FMBP-1単独での活性もこれに合わ
せた。種々のBYBタンパク質の添加によるFMBP-1フラク
ション0.1ユニットの +290 プローブに対する結合促進
効果を調べた（図４）。その結果、GST-BYB （GSTとBYB
全長からなる融合タンパク質）は精製 BYB と同様に FM
BP-1 結合に対する促進効果を示し、その程度は添加量
に依存してることが示された。一方、コントロールの G
ST タンパク質は全く促進効果を示さなかった（結果は
示していない）。また、GST-delC（ GSTとBYBのアミノ
酸1-141部分との融合タンパク質）、GST-delN（前出）
はいずれも結合促進効果を示したが、コールドショック
ドメインを有するGST-delCでは、FMBP-1とオリゴDNA複
合体量が少なく、結合促進活性がやや弱まることが示さ
れた。GST-delCで認められる高分子側のバンドはGST-de
lCと一本鎖オリゴDNAの非特異的結合によるアーティフ
ァクトと考えられる。一方、コールドショックドメイン
を完全に欠くGST-delNのみで、BYBタンパク質全体と全
く同じ促進効果が認められた（図４）。以上のことか
ら、BYBタンパク質による転写因子のDNA結合促進活性
は、主にタンパク質のC末端側（アミノ酸120‐259）に
担われていることが明らかにされた。
【０１１５】（８−２）BYBタンパク質の種々の転写因
子と特異的DNAとの結合促進効果 同様のゲルシフトアッセイにより、BYBタンパク質は他
の転写因子群に対しても、特異的 DNA 結合を促進する
ことを確認した（図５および図６）。すなわち、FMBP-1
とFb(+290)の他にも、OTF2A（ベーリンガー社：カタロ
グ番号１６３５３５２）とFb(+290)との特異的結合、並
びにSP1（プロメガ社：カタログE3391、Kadonaga, J.T.
et al (1987) Cell 51, 1079-）とFb(+290)の特異的結
合を促進することが確認された。さらに転写因子AP2
（プロメガ社：カタログE3071、Williams, T. et al (1
988) Genes and Dev. 2, 1557-）とSP1の認識配列を含
むオリゴDNA“AP2/SP1”：5’-aattAACTGGCCGCGGGCGGGT
AGTTCGATCA （配列番号１２）との特異的結合、並びに
転写因子SP1とTBP（プロメガ社：カタログE3081、Peter
son, M.G. et al (1990) Science 248, 1625-）の認識
配列を含むオリゴDNA“Ad2MLP”：5’-aattGGGGGGCTATA
AAAGGGGGTGGGGGCGCG （配列番号１３）のオリゴプロー
ブを用いて転写因子の結合促進活性を検討した結果、SP
1とAP2/SP1、SP1とAd2MLP、AP2とAP2/SP1、TBPとAd2MLP
の結合を促進することが確認された（図５および図
６）。
子と特異的DNAとの結合促進効果 同様のゲルシフトアッセイにより、BYBタンパク質は他
の転写因子群に対しても、特異的 DNA 結合を促進する
ことを確認した（図５および図６）。すなわち、FMBP-1
とFb(+290)の他にも、OTF2A（ベーリンガー社：カタロ
グ番号１６３５３５２）とFb(+290)との特異的結合、並
びにSP1（プロメガ社：カタログE3391、Kadonaga, J.T.
et al (1987) Cell 51, 1079-）とFb(+290)の特異的結
合を促進することが確認された。さらに転写因子AP2
（プロメガ社：カタログE3071、Williams, T. et al (1
988) Genes and Dev. 2, 1557-）とSP1の認識配列を含
むオリゴDNA“AP2/SP1”：5’-aattAACTGGCCGCGGGCGGGT
AGTTCGATCA （配列番号１２）との特異的結合、並びに
転写因子SP1とTBP（プロメガ社：カタログE3081、Peter
son, M.G. et al (1990) Science 248, 1625-）の認識
配列を含むオリゴDNA“Ad2MLP”：5’-aattGGGGGGCTATA
AAAGGGGGTGGGGGCGCG （配列番号１３）のオリゴプロー
ブを用いて転写因子の結合促進活性を検討した結果、SP
1とAP2/SP1、SP1とAd2MLP、AP2とAP2/SP1、TBPとAd2MLP
の結合を促進することが確認された（図５および図
６）。
【０１１６】一方、FMBP-1とAP2/SP1、OTF2AとAP2/SP
1、AP2と+290のような非特異的結合の組み合わせでは、
BYBタンパク質による結合の促進効果は認められなかっ
た。
1、AP2と+290のような非特異的結合の組み合わせでは、
BYBタンパク質による結合の促進効果は認められなかっ
た。
【０１１７】以上より、BYBタンパク質は、DNAとDNA結
合タンパク質の特異的結合を促進する活性を有すること
が明らかとなった。
合タンパク質の特異的結合を促進する活性を有すること
が明らかとなった。
【０１１８】実施例９：組換えBYBタンパク質による試
験管内転写反応の促進 組換えBYBタンパク質による試験管内転写反応への効果
を調べるために、以下の条件で試験管内転写反応を行っ
た。転写の鋳型としては、アデノウイルスの主要後期遺
伝子のプロモーター配列を含むAd2MLP with G-less cas
sette in pUC18cccDNA（Sawadogo & Roeder (1985) PNA
S 82, 4394-4398）、基本転写因子として、TFIIB (reco
mbinant in E. coli)、TBP (recombinant in E. col
i)、TFIIF(recombinant in Baculovirus)、RNA polymer
ase II (purified from calf thymus)を用いたが、これ
らの調製はマキノの方法（Makino, Y. et al (1999) Mo
l.Cell. Biol. 7951-7960）に従って行った。反応系
は、10 mM HEPES pH7.6、 25mM KCl、 6 mM MgCl2、 3%
Glycerol、620 mM ATP & UTP,、25 mM CTP、 5 mCiα-
32P-CTP、 200 mM O-methyl-GTPを含む。鋳型DNA、基本
転写因子、および表1に示した量の組換えBYBタンパク質
（加えたBYBタンパク質の欠失部分を考慮して、テスト
した３点についてBYBの間で互いに等モルになるように
グラム数を変えて添加してある）を加えて、２０分間氷
上放置後、基質を添加し20μｌとした後、27℃４５分間
反応した。反応終了後、転写物をフェノール抽出、エタ
ノール沈澱後、定法の尿素PAGEにより解析を行った（図
７）。転写物のバンドをスキャンして定量した結果を表
1に示した。BYBタンパク質全長およびコールドショック
ドメインを含まないGST-delNタンパク質で、コントロー
ルの３〜６倍の転写促進活性が確認された。GST-delCタ
ンパク質では、転写促進活性はほとんど認められなかっ
た。このことからBYBタンパク質には、試験管内転写促
進活性があり、その活性はタンパク質のC末端側（アミ
ノ酸120‐259）に担われていることが明らかにされた。
験管内転写反応の促進 組換えBYBタンパク質による試験管内転写反応への効果
を調べるために、以下の条件で試験管内転写反応を行っ
た。転写の鋳型としては、アデノウイルスの主要後期遺
伝子のプロモーター配列を含むAd2MLP with G-less cas
sette in pUC18cccDNA（Sawadogo & Roeder (1985) PNA
S 82, 4394-4398）、基本転写因子として、TFIIB (reco
mbinant in E. coli)、TBP (recombinant in E. col
i)、TFIIF(recombinant in Baculovirus)、RNA polymer
ase II (purified from calf thymus)を用いたが、これ
らの調製はマキノの方法（Makino, Y. et al (1999) Mo
l.Cell. Biol. 7951-7960）に従って行った。反応系
は、10 mM HEPES pH7.6、 25mM KCl、 6 mM MgCl2、 3%
Glycerol、620 mM ATP & UTP,、25 mM CTP、 5 mCiα-
32P-CTP、 200 mM O-methyl-GTPを含む。鋳型DNA、基本
転写因子、および表1に示した量の組換えBYBタンパク質
（加えたBYBタンパク質の欠失部分を考慮して、テスト
した３点についてBYBの間で互いに等モルになるように
グラム数を変えて添加してある）を加えて、２０分間氷
上放置後、基質を添加し20μｌとした後、27℃４５分間
反応した。反応終了後、転写物をフェノール抽出、エタ
ノール沈澱後、定法の尿素PAGEにより解析を行った（図
７）。転写物のバンドをスキャンして定量した結果を表
1に示した。BYBタンパク質全長およびコールドショック
ドメインを含まないGST-delNタンパク質で、コントロー
ルの３〜６倍の転写促進活性が確認された。GST-delCタ
ンパク質では、転写促進活性はほとんど認められなかっ
た。このことからBYBタンパク質には、試験管内転写促
進活性があり、その活性はタンパク質のC末端側（アミ
ノ酸120‐259）に担われていることが明らかにされた。
【０１１９】
【表１】 実施例１０：BYBタンパク質の制限酵素反応の促進効果 DNA配列を認識する制限酵素の反応液中でのBYBの効果を
検討した。反応系としては、 0.3 μgλDNA, 50 mM Tr
is pH8.0, 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl が標準条件で、
これに 2 ngのBYBタンパク質 （ゲルからの回収の際に
100-200 ngのＢＳＡを添加してある）を添加した。制限
酵素 0.1 U または 0.3 Uを加え 4℃ または 37℃ で保
温した。基質であるλDNA0.3 μg あたり 0.1 U の Eco
RI を加え BYB 2 ng (+100-200 ng BSA) を添加して０
分から１８０分までの反応をコントロールBSA と比較し
た。37℃で反応、反応終了後、3 μlの loading dye so
ln.（sucrose 30%, EDTA 30 mM, BPB 0.1%, XC 0.1%）
を加え、ただちに -20℃ 冷凍庫で凍らせた。全ての反
応が終了後 １％ アガロースゲル電気泳動で反応を比較
した(図８)。また、同様にして調製した反応液を4℃ で
反応させた。この場合はEcoRI量を0.3 U添加した。その
結果、37℃ ではBYBタンパク質添加により、酵素反応が
早く進むことが示されたが（図８上段）、4℃で反応さ
せたところ、さらに酵素反応促進作用が顕著に認められ
た(図８下段)。即ち４℃では、BYB非添加群ではほとん
どDNA消化反応が進まなかったのに対し、BYB存在下では
反応が進行した。なお、この実験においてBYBの添加に
よって切断パターンが変化することはなかった。
検討した。反応系としては、 0.3 μgλDNA, 50 mM Tr
is pH8.0, 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl が標準条件で、
これに 2 ngのBYBタンパク質 （ゲルからの回収の際に
100-200 ngのＢＳＡを添加してある）を添加した。制限
酵素 0.1 U または 0.3 Uを加え 4℃ または 37℃ で保
温した。基質であるλDNA0.3 μg あたり 0.1 U の Eco
RI を加え BYB 2 ng (+100-200 ng BSA) を添加して０
分から１８０分までの反応をコントロールBSA と比較し
た。37℃で反応、反応終了後、3 μlの loading dye so
ln.（sucrose 30%, EDTA 30 mM, BPB 0.1%, XC 0.1%）
を加え、ただちに -20℃ 冷凍庫で凍らせた。全ての反
応が終了後 １％ アガロースゲル電気泳動で反応を比較
した(図８)。また、同様にして調製した反応液を4℃ で
反応させた。この場合はEcoRI量を0.3 U添加した。その
結果、37℃ ではBYBタンパク質添加により、酵素反応が
早く進むことが示されたが（図８上段）、4℃で反応さ
せたところ、さらに酵素反応促進作用が顕著に認められ
た(図８下段)。即ち４℃では、BYB非添加群ではほとん
どDNA消化反応が進まなかったのに対し、BYB存在下では
反応が進行した。なお、この実験においてBYBの添加に
よって切断パターンが変化することはなかった。
【０１２０】さらに、BYB タンパク質の制限酵素反応を
促進する活性に関する機能領域を推定するために、種々
のBYBタンパク質を用いて、これらが制限酵素EcoRIのλ
DNA消化反応に対して促進効果を示すかどうかを調べ
た。実験に用いたのは、ゲルから回収したBYBタンパク
質(実施例３)2ng、GST-BYB 4ng、GST-delC 3ng、GST-de
lN 3ng、GST 2ngで、それぞれモル濃度が等しくなる量
用いている。反応は、実施例10記載の4℃での条件で実
験を行った(図９)。その結果、ゲルから回収したBYBやG
ST-BYB、GST-delNでは、GST-BYBと同様の促進効果が認
められた。一方、GST-delCはこれらが活性を示した条件
では促進効果は認められなかったが、100ngまで量を増
加させると促進効果を示すことがわかった。この結果は
GST-delCが弱いながらも特異的結合を促進する効果を持
っていることと対応する。また、GSTではこの促進効果
は全く認められなかった。これらの結果より、BYBタン
パク質による制限酵素反応の促進活性は、主にBYBタン
パク質のC末端側（アミノ酸120‐259）に担われている
ことが明らかにされた。
促進する活性に関する機能領域を推定するために、種々
のBYBタンパク質を用いて、これらが制限酵素EcoRIのλ
DNA消化反応に対して促進効果を示すかどうかを調べ
た。実験に用いたのは、ゲルから回収したBYBタンパク
質(実施例３)2ng、GST-BYB 4ng、GST-delC 3ng、GST-de
lN 3ng、GST 2ngで、それぞれモル濃度が等しくなる量
用いている。反応は、実施例10記載の4℃での条件で実
験を行った(図９)。その結果、ゲルから回収したBYBやG
ST-BYB、GST-delNでは、GST-BYBと同様の促進効果が認
められた。一方、GST-delCはこれらが活性を示した条件
では促進効果は認められなかったが、100ngまで量を増
加させると促進効果を示すことがわかった。この結果は
GST-delCが弱いながらも特異的結合を促進する効果を持
っていることと対応する。また、GSTではこの促進効果
は全く認められなかった。これらの結果より、BYBタン
パク質による制限酵素反応の促進活性は、主にBYBタン
パク質のC末端側（アミノ酸120‐259）に担われている
ことが明らかにされた。
【０１２１】また、他の制限酵素に対する促進効果をに
ついても調べた。この実験では、GST-delNを100ng用い
て、各制限酵素の反応の至適条件で4℃反応を行った。
その結果、Asp700、BamHI、EcoRV、HinfIに対して促進
効果が確認できた。また、PstIでは、コントロールでも
ほとんど反応が進行していたものの、GST-delN添加によ
って切れ残りのバンドが消失しており、促進効果がある
ものと考えられた。以上の結果により、BYBタンパク質
は制限酵素の配列特異性には影響を及ぼさずに、その活
性を促進することが確認された。
ついても調べた。この実験では、GST-delNを100ng用い
て、各制限酵素の反応の至適条件で4℃反応を行った。
その結果、Asp700、BamHI、EcoRV、HinfIに対して促進
効果が確認できた。また、PstIでは、コントロールでも
ほとんど反応が進行していたものの、GST-delN添加によ
って切れ残りのバンドが消失しており、促進効果がある
ものと考えられた。以上の結果により、BYBタンパク質
は制限酵素の配列特異性には影響を及ぼさずに、その活
性を促進することが確認された。
【０１２２】実施例１１：BYBタンパク質の最小機能領
域の推定 BYB タンパク質の有するDNA結合タンパク質とDNAとの結
合を促進する活性に関して、その最小機能領域を推定す
るために以下の実験を行った。すなわちBYBタンパク質
の部分ペプチド断片を調製して、FMBP-1 とその結合配
列 +290 オリゴプローブへの結合を、実施例2記載のゲ
ルシフトアッセイ法で調べた。実験に用いたペプチドの
領域と結合促進活性の相対活性（コントロールのBSAの
みの時を１とした）は、表2に示した。これらのペプチ
ド配列は、図１および２に示したようなBYBタンパク質
に特徴的な領域を含み、それぞれGSTとの融合タンパク
質として発現した。このため、実施例7記載のプラスミ
ドpGEX-4T1、pGEX-delN、pGEX-delC以外に、表2に記載
のアミノ酸領域を発現するプラスミドを構築した。これ
らのアミノ酸領域に対応するDNAは、完全合成するか、P
CRにより対応するDNA配列を増幅して、それぞれｐGEX−
４T３（アマシャムファルマシア社）のEcoRIとXhoI間に
連結してプラスミドを構築した。PCRに用いたプライマ
ーは、増幅断片の5’側にEcoRI認識配列と3’側にXhoI
認識配列ができるようにデザインした。この実験の結果
から、転写因子とDNA結合の促進活性を有する主要な領
域は、BYBタンパク質のC末端側のG1領域からB/A3領域
（アミノ酸134‐207）にかけて存在することが示され
た。さらにこの活性は、その一部の領域を欠失しても保
持されるが、特にBasic / Aromatic domain２と３（図
１中B/A2とB/A3）が活性には必須であり、これらのうち
最低1個のドメインとGlycine rich-domain1と２（図１
中G1、G2）のうち少なくとも１つ以上のドメインを有す
ることが十分な促進活性に重要であることが示唆され
た。
域の推定 BYB タンパク質の有するDNA結合タンパク質とDNAとの結
合を促進する活性に関して、その最小機能領域を推定す
るために以下の実験を行った。すなわちBYBタンパク質
の部分ペプチド断片を調製して、FMBP-1 とその結合配
列 +290 オリゴプローブへの結合を、実施例2記載のゲ
ルシフトアッセイ法で調べた。実験に用いたペプチドの
領域と結合促進活性の相対活性（コントロールのBSAの
みの時を１とした）は、表2に示した。これらのペプチ
ド配列は、図１および２に示したようなBYBタンパク質
に特徴的な領域を含み、それぞれGSTとの融合タンパク
質として発現した。このため、実施例7記載のプラスミ
ドpGEX-4T1、pGEX-delN、pGEX-delC以外に、表2に記載
のアミノ酸領域を発現するプラスミドを構築した。これ
らのアミノ酸領域に対応するDNAは、完全合成するか、P
CRにより対応するDNA配列を増幅して、それぞれｐGEX−
４T３（アマシャムファルマシア社）のEcoRIとXhoI間に
連結してプラスミドを構築した。PCRに用いたプライマ
ーは、増幅断片の5’側にEcoRI認識配列と3’側にXhoI
認識配列ができるようにデザインした。この実験の結果
から、転写因子とDNA結合の促進活性を有する主要な領
域は、BYBタンパク質のC末端側のG1領域からB/A3領域
（アミノ酸134‐207）にかけて存在することが示され
た。さらにこの活性は、その一部の領域を欠失しても保
持されるが、特にBasic / Aromatic domain２と３（図
１中B/A2とB/A3）が活性には必須であり、これらのうち
最低1個のドメインとGlycine rich-domain1と２（図１
中G1、G2）のうち少なくとも１つ以上のドメインを有す
ることが十分な促進活性に重要であることが示唆され
た。
【０１２３】また、これらの部分ペプチドを用いて実施
例10記載の制限酵素反応の促進活性比較を行ったとこ
ろ、G1-G2、G2-Q2、B/A3に反応促進効果が認められ、G2
やQ2単独では促進効果が認められなかった(結果は示し
ていない)。以上の結果より、BYBタンパク質の制限酵素
反応促進効果と転写因子−DNA結合促進活性は、BYBタン
パク質の同一領域に担われていることが示唆された。
例10記載の制限酵素反応の促進活性比較を行ったとこ
ろ、G1-G2、G2-Q2、B/A3に反応促進効果が認められ、G2
やQ2単独では促進効果が認められなかった(結果は示し
ていない)。以上の結果より、BYBタンパク質の制限酵素
反応促進効果と転写因子−DNA結合促進活性は、BYBタン
パク質の同一領域に担われていることが示唆された。
【０１２４】
【表２】 実施例１２：動物細胞におけるBYBタンパク質の発現と
機能 （１２−１）発現ベクターの構築 BYB cDNAを鋳型に、以下の配列のプライマーを用いてPC
R（LA Taq ;TAKARA社）を行い、両端に制限酵素XhoI認
識配列を持ちかつSV40LargeT抗原の核移行シグナルに対
応する領域を5’末端に有する３種類のDNA断片を作製し
た。
機能 （１２−１）発現ベクターの構築 BYB cDNAを鋳型に、以下の配列のプライマーを用いてPC
R（LA Taq ;TAKARA社）を行い、両端に制限酵素XhoI認
識配列を持ちかつSV40LargeT抗原の核移行シグナルに対
応する領域を5’末端に有する３種類のDNA断片を作製し
た。
【０１２５】使用したプライマーは、 PBYF；5’AGTCCTCGAGACCATCGCCGTTCGCCAATTACACCATGGC （配列番号１４） CBYF；5’AGCTCTCGAGATGTATGCTGCAGACAAGCGCCGTGGCTACCAC（配列番号１５） NBYR；5’CGATCTCGAGCTATCCGCCACCTTGACGAGGGAAATATTGGCG（配列番号１６） PBYR；5’GACTCTCGAGCATAACGGCCTCTGGATGTCTAGGCCTGGC（配列番号１７） であり、PBYFとCBYFは、SV40のLargeT抗原N末端側の4ア
ミノ酸MDKV(+1〜+4)および核移行シグナルペプチドPKKK
RKVEDP(+126〜+135)に対応するDNA配列(Kalderon, D. e
t al., Cell 39, 499-509, 1984)を含んでいる。
ミノ酸MDKV(+1〜+4)および核移行シグナルペプチドPKKK
RKVEDP(+126〜+135)に対応するDNA配列(Kalderon, D. e
t al., Cell 39, 499-509, 1984)を含んでいる。
【０１２６】定法に従ったPCRにより、PBYF＋PBYR、 PB
YF＋NBYR 、CBYF＋PBYRの各組み合わせにて、SV40Large
T抗原の核移行シグナルに対応する領域の3’末端にそれ
ぞれBYBタンパク質全長、BYBタンパク質N末端側（アミ
ノ酸1〜136）、BYBタンパク質C末端側（Met＋アミノ酸1
17〜259）がコードされたDNA断片が得られた。PCR産物
をXhoIで消化後、High Pure PCR Product Purification
Kit (Roche Diagnostics社製)を用いて精製し、定法に
従ってpBluescript SK(-)のXhoI部位に挿入、大腸菌DH5
αに導入してインサートが入ったプラスミドを得た。得
られた各プラスミドはQIAGEN-tip 100（キアゲン社製）
を用いて精製した。精製DNAを用いてThermo Sequenase
ダイ・ターミネーターキット(アマシャムファルマシア
社製)にてM13フォワードおよびリバースプライマーを用
いて反応。ABI PRISM 377 Analyzer (Perkin Elmer/ Ap
plied Biosystems社製)により塩基配列の確認を行っ
た。
YF＋NBYR 、CBYF＋PBYRの各組み合わせにて、SV40Large
T抗原の核移行シグナルに対応する領域の3’末端にそれ
ぞれBYBタンパク質全長、BYBタンパク質N末端側（アミ
ノ酸1〜136）、BYBタンパク質C末端側（Met＋アミノ酸1
17〜259）がコードされたDNA断片が得られた。PCR産物
をXhoIで消化後、High Pure PCR Product Purification
Kit (Roche Diagnostics社製)を用いて精製し、定法に
従ってpBluescript SK(-)のXhoI部位に挿入、大腸菌DH5
αに導入してインサートが入ったプラスミドを得た。得
られた各プラスミドはQIAGEN-tip 100（キアゲン社製）
を用いて精製した。精製DNAを用いてThermo Sequenase
ダイ・ターミネーターキット(アマシャムファルマシア
社製)にてM13フォワードおよびリバースプライマーを用
いて反応。ABI PRISM 377 Analyzer (Perkin Elmer/ Ap
plied Biosystems社製)により塩基配列の確認を行っ
た。
【０１２７】塩基配列確認を行った後に各プラスミドを
XhoIで消化し、アガロースゲル電気泳動によりBYB遺伝
子断片を分離した。ゲルからAgarose Gel DNA Extracti
on Kit (Roche Diagnostics社製)を用いてDNAを精製
し、定法に従ってpCI-neo (Promega社製)のXhoI部位に
挿入した。これをSTBL2 competent cell (Gibco BRL社
製)に導入して動物細胞発現用プラスミドpCI-Full（全
長発現用）、pCI-delC（N末端側発現用）、pCI-delN（C
末端側発現用）をそれぞれ得た。得られた各プラスミド
はQIAGEN-tip 500（キアゲン社製）を用いて精製し、動
物細胞株のトランスフェクションに用いた。
XhoIで消化し、アガロースゲル電気泳動によりBYB遺伝
子断片を分離した。ゲルからAgarose Gel DNA Extracti
on Kit (Roche Diagnostics社製)を用いてDNAを精製
し、定法に従ってpCI-neo (Promega社製)のXhoI部位に
挿入した。これをSTBL2 competent cell (Gibco BRL社
製)に導入して動物細胞発現用プラスミドpCI-Full（全
長発現用）、pCI-delC（N末端側発現用）、pCI-delN（C
末端側発現用）をそれぞれ得た。得られた各プラスミド
はQIAGEN-tip 500（キアゲン社製）を用いて精製し、動
物細胞株のトランスフェクションに用いた。
【０１２８】（１２−２）培養細胞株への導入と発現確
認 アフリカミドリザル腎由来COS-7細胞は、10％のウシ胎
仔血清を含むDMEM (Gibco BRL社製)で培養した。12‐１
で作製したプラスミドの導入はリン酸カルシウム法（Fr
ederick M. Ausubelら編、Current Protocols発行、Cur
rent Protocolsin Molecular Biology ; chapter 9）を
用いて行った。1×10５のCOS-7細胞に1μｇの各プラス
ミドを用いてトランスフェクションを行い、48時間後に
細胞をPBS(-)で洗浄後回収し、80μlの1×SDS gel-load
ing buffer (50mM Tris-Cl (pH 6.8), 100mM DTT, 2% S
DS, 0.1% BPB, 10% glycerol)に懸濁した。氷上で10秒
間超音波処理後、12,000×g, 1 min, 4℃の遠心を行
い、上清10μlを用いてSDS-PAGEを行った。実施例６記
載の抗体を用いたウエスタン解析により、各タンパク質
の動物細胞における発現を確認した。
認 アフリカミドリザル腎由来COS-7細胞は、10％のウシ胎
仔血清を含むDMEM (Gibco BRL社製)で培養した。12‐１
で作製したプラスミドの導入はリン酸カルシウム法（Fr
ederick M. Ausubelら編、Current Protocols発行、Cur
rent Protocolsin Molecular Biology ; chapter 9）を
用いて行った。1×10５のCOS-7細胞に1μｇの各プラス
ミドを用いてトランスフェクションを行い、48時間後に
細胞をPBS(-)で洗浄後回収し、80μlの1×SDS gel-load
ing buffer (50mM Tris-Cl (pH 6.8), 100mM DTT, 2% S
DS, 0.1% BPB, 10% glycerol)に懸濁した。氷上で10秒
間超音波処理後、12,000×g, 1 min, 4℃の遠心を行
い、上清10μlを用いてSDS-PAGEを行った。実施例６記
載の抗体を用いたウエスタン解析により、各タンパク質
の動物細胞における発現を確認した。
【０１２９】（１２−３）BYBタンパク質の遺伝子発現
への効果 BYBタンパク質の遺伝子発現に対する効果を観察するた
めに、レポーター遺伝子とBYB遺伝子の共導入を行っ
た。レポーター遺伝子にはLuciferaseを用いた。pGL2-B
asic (Promega社製)を制限酵素XhoIおよびDraIで消化
し、1.9kbのDNA断片を回収した。このDNAのDraI切断末
端にｐXhoIリンカー（TAKARA）を定法に従って連結し、
得られた断片を宮崎等（Miyazaki J., et al. Gene 79;
269-277 (1989))の報告に記載されたｐCAGGSのXhoI部
位に挿入しpCAG-Lucを作製した。以下の組み合わせでpC
AG-Lucと各プラスミドをCOS-7細胞にリン酸カルシウム
法で共導入した。
への効果 BYBタンパク質の遺伝子発現に対する効果を観察するた
めに、レポーター遺伝子とBYB遺伝子の共導入を行っ
た。レポーター遺伝子にはLuciferaseを用いた。pGL2-B
asic (Promega社製)を制限酵素XhoIおよびDraIで消化
し、1.9kbのDNA断片を回収した。このDNAのDraI切断末
端にｐXhoIリンカー（TAKARA）を定法に従って連結し、
得られた断片を宮崎等（Miyazaki J., et al. Gene 79;
269-277 (1989))の報告に記載されたｐCAGGSのXhoI部
位に挿入しpCAG-Lucを作製した。以下の組み合わせでpC
AG-Lucと各プラスミドをCOS-7細胞にリン酸カルシウム
法で共導入した。
【０１３０】 1μgのpCAG-Lucと、0.5、1、2μgの各BYB発現プラスミ
ド、または対照として用いたpUC19、pCI-neoをそれぞれ
1×10５のCOS-7細胞にリン酸カルシウム法で共導入し、
48時間後に回収、Dual Luciferase Assay System (Prom
ega社製)を用いてLuciferase発現量を測定した。
ド、または対照として用いたpUC19、pCI-neoをそれぞれ
1×10５のCOS-7細胞にリン酸カルシウム法で共導入し、
48時間後に回収、Dual Luciferase Assay System (Prom
ega社製)を用いてLuciferase発現量を測定した。
【０１３１】その結果を図１０に示す。pCAG-LucとpCI-
neoを共導入すると、pUC19の場合の1/10にLuciferase発
現が低下することが示された。これはpCI-neoの影響に
より、pCAG-Lucの発現が阻害されたことを示している。
BYB発現プラスミドを共導入した場合には、この発現抑
制が解除される傾向を示した。この傾向はBYBタンパク
質のC端側により顕著であった。pCI-neoにより抑制され
た遺伝子発現がBYBタンパク質により回復するというこ
の現象は、BYBタンパク質が転写因子とＤＮＡとの特異
的結合を促進することにより転写レベルで遺伝子発現を
増強させたことによると考えられる。
neoを共導入すると、pUC19の場合の1/10にLuciferase発
現が低下することが示された。これはpCI-neoの影響に
より、pCAG-Lucの発現が阻害されたことを示している。
BYB発現プラスミドを共導入した場合には、この発現抑
制が解除される傾向を示した。この傾向はBYBタンパク
質のC端側により顕著であった。pCI-neoにより抑制され
た遺伝子発現がBYBタンパク質により回復するというこ
の現象は、BYBタンパク質が転写因子とＤＮＡとの特異
的結合を促進することにより転写レベルで遺伝子発現を
増強させたことによると考えられる。
【０１３２】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Kirin Beer Kabushiki Kaisha <120> Protein promoting the binding of DNA and DNA-binding factor and gene encoding the same <130> 128470 <140> <141> <160> 18 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1104 <212> DNA <213> Bombyx mori <220> <221> CDS <222> (75)..(851) <400> 1 aagcggtgaa catcgaggag aggtcgtgga gtattttacc atctttgcca ccatcgccgt 60 tcgccaatta cacc atg gct gat acc gaa aag gcg ccg cag ccg cag ccc 110 Met Ala Asp Thr Glu Lys Ala Pro Gln Pro Gln Pro 1 5 10 caa caa caa cta gaa caa caa cct caa gct caa caa gct aaa aca gtt 158 Gln Gln Gln Leu Glu Gln Gln Pro Gln Ala Gln Gln Ala Lys Thr Val 15 20 25 aaa caa aag cag gtc atc gct gag aaa gta tcg ggc act gtg aaa tgg 206 Lys Gln Lys Gln Val Ile Ala Glu Lys Val Ser Gly Thr Val Lys Trp 30 35 40 ttc aac gtc aag agt gga tat ggt ttc atc aac agg aat gac acc aag 254 Phe Asn Val Lys Ser Gly Tyr Gly Phe Ile Asn Arg Asn Asp Thr Lys 45 50 55 60 gaa gat gtg ttt gtg cat cag act gcc atc gcc cgt aac aac cca cgt 302 Glu Asp Val Phe Val His Gln Thr Ala Ile Ala Arg Asn Asn Pro Arg 65 70 75 aag gct gtg cgc tcg gtc ggc gac gga gag gcg gtg gag ttt gcc gtg 350 Lys Ala Val Arg Ser Val Gly Asp Gly Glu Ala Val Glu Phe Ala Val 80 85 90 gtt gcc ggg gag aaa ggc ttt gaa gca gct ggt gtt act ggt ccc ggt 398 Val Ala Gly Glu Lys Gly Phe Glu Ala Ala Gly Val Thr Gly Pro Gly 95 100 105 ggt gag cca gta aaa ggc tca cct tat gct gca gac aag cgc cgt ggc 446 Gly Glu Pro Val Lys Gly Ser Pro Tyr Ala Ala Asp Lys Arg Arg Gly 110 115 120 tac cac cgc caa tat ttc cct cgt caa ggt ggc gga cga ggc ggt gaa 494 Tyr His Arg Gln Tyr Phe Pro Arg Gln Gly Gly Gly Arg Gly Gly Glu 125 130 135 140 gga gct cca cgc aga gga gga tta gga cgt cgt gga ccc ccg ccc aac 542 Gly Ala Pro Arg Arg Gly Gly Leu Gly Arg Arg Gly Pro Pro Pro Asn 145 150 155 caa ggg ggt gca caa gga gat gag ggt caa gaa gga ggc att gta cca 590 Gln Gly Gly Ala Gln Gly Asp Glu Gly Gln Glu Gly Gly Ile Val Pro 160 165 170 tct cag cgc agt ttt ttc cgt cgc aat ttt cgc ggt gga cgc cgt ggg 638 Ser Gln Arg Ser Phe Phe Arg Arg Asn Phe Arg Gly Gly Arg Arg Gly 175 180 185 gga ggt cct ggc cca atg aat aga gga ggg ttc cgc cga gtg cgt ccg 686 Gly Gly Pro Gly Pro Met Asn Arg Gly Gly Phe Arg Arg Val Arg Pro 190 195 200 cgc aat ttc cag gcg ggg cag gga gga caa aat cag gct cag cgc caa 734 Arg Asn Phe Gln Ala Gly Gln Gly Gly Gln Asn Gln Ala Gln Arg Gln 205 210 215 220 aat ggc cag gat gga gat gcc tca gct aca aca tca aac caa cag cag 782 Asn Gly Gln Asp Gly Asp Ala Ser Ala Thr Thr Ser Asn Gln Gln Gln 225 230 235 ggg gcc aag cct aaa agt aac aaa cct gtt ggt act act att gag aca 830 Gly Ala Lys Pro Lys Ser Asn Lys Pro Val Gly Thr Thr Ile Glu Thr 240 245 250 act acc aat gag agc cag gcc tagacatcca gaggccgtta tgtgtggcac 881 Thr Thr Asn Glu Ser Gln Ala 255 atcatttatg tagtgcatgt tgattctagt tgtgtcacac tccacctcaa cttgtcttgt 941 ctgtacaact gatgagtgtt agtttttgat gttgtatcgc attgagatct ttgcgaattc 1001 tttatttgta ttggaacgta aggagcgggg tctctaatct ggaactgcat aggtatcatt 1061 ggatcaaaga tgtgatattt ttatcataat atattgatga att 1104 <210> 2 <211> 259 <212> PRT <213> Bombyx mori <400> 2 Met Ala Asp Thr Glu Lys Ala Pro Gln Pro Gln Pro Gln Gln Gln Leu 1 5 10 15 Glu Gln Gln Pro Gln Ala Gln Gln Ala Lys Thr Val Lys Gln Lys Gln 20 25 30 Val Ile Ala Glu Lys Val Ser Gly Thr Val Lys Trp Phe Asn Val Lys 35 40 45 Ser Gly Tyr Gly Phe Ile Asn Arg Asn Asp Thr Lys Glu Asp Val Phe 50 55 60 Val His Gln Thr Ala Ile Ala Arg Asn Asn Pro Arg Lys Ala Val Arg 65 70 75 80 Ser Val Gly Asp Gly Glu Ala Val Glu Phe Ala Val Val Ala Gly Glu 85 90 95 Lys Gly Phe Glu Ala Ala Gly Val Thr Gly Pro Gly Gly Glu Pro Val 100 105 110 Lys Gly Ser Pro Tyr Ala Ala Asp Lys Arg Arg Gly Tyr His Arg Gln 115 120 125 Tyr Phe Pro Arg Gln Gly Gly Gly Arg Gly Gly Glu Gly Ala Pro Arg 130 135 140 Arg Gly Gly Leu Gly Arg Arg Gly Pro Pro Pro Asn Gln Gly Gly Ala 145 150 155 160 Gln Gly Asp Glu Gly Gln Glu Gly Gly Ile Val Pro Ser Gln Arg Ser 165 170 175 Phe Phe Arg Arg Asn Phe Arg Gly Gly Arg Arg Gly Gly Gly Pro Gly 180 185 190 Pro Met Asn Arg Gly Gly Phe Arg Arg Val Arg Pro Arg Asn Phe Gln 195 200 205 Ala Gly Gln Gly Gly Gln Asn Gln Ala Gln Arg Gln Asn Gly Gln Asp 210 215 220 Gly Asp Ala Ser Ala Thr Thr Ser Asn Gln Gln Gln Gly Ala Lys Pro 225 230 235 240 Lys Ser Asn Lys Pro Val Gly Thr Thr Ile Glu Thr Thr Thr Asn Glu 245 250 255 Ser Gln Ala <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Binding sequence Fb(+290) <400> 3 aattgatgaa tctatgtaaa tactgggcag ac 32 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Bombyx mori <400> 4 Ala Pro Gln Pro Gln Pro Gln Gln Gln Leu Glu Gln Gln Pro Gln Ala 1 5 10 15 Gln Gln Ala Lys 20 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Bombyx mori <400> 5 Trp Phe Asn Val Lys 1 5 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Bombyx mori <400> 6 Ser Gly Tyr Gly Phe Ile Asn Arg Asn Asp Thr Lys 1 5 10 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Bombyx mori <400> 7 Gly Phe Glu Ala Ala Gly Val Thr Gly Pro Gly Gly Glu Pro Val Lys 1 5 10 15 <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> Bombyx mori <400> 8 Pro Val Gly Thr Thr Ile Glu Thr Thr Thr Asn Glu Ser 1 5 10 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer for BYB gene <400> 9 gtnaagtggt tyaaygtvaa 20 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer for BYB gene <400> 10 acnccngcng cytcraa 17 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Probe for BYB gene <400> 11 gatggcagtc tgatgcacaa acacatcttc 30 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Binding sequence AP2/SP1 <400> 12 aattaactgg ccgcgggcgg gtagttcgat ca 32 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Binding sequence Ad2MLP <400> 13 aattgggggg ctataaaagg gggtgggggc gcg 33 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer for BYB gene <400> 14 agtcctcgag accatcgccg ttcgccaatt acaccatggc 40 <210> 15 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer for BYB gene <400> 15 agctctcgag atgtatgctg cagacaagcg ccgtggctac cac 43 <210> 16 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer for BYB gene <400> 16 cgatctcgag ctatccgcca ccttgacgag ggaaatattg gcg 43 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer for BYB gene <400> 17 gactctcgag cataacggcc tctggatgtc taggcctggc 40 <210> 18 <211> 14 <212> PRT <213> Simian virus 40 <400> 18 Met Asp Lys Val Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Asp Pro 1 5 10
【図１】本発明によるタンパク質のアミノ酸配列および
それをコードするＤＮＡ配列を示した図である。ＹＢタ
ンパク質に特徴的に見出されるコールドショックドメイ
ン（ＣＳＤ）を黒枠で囲んだ。また、本発明によるタン
パク質に特徴的に認められるGlycine rich-domein（G1,
G2）、Glutamine rich-domain (Q1,Q2)、Basic/Aromati
c-domain (B/A1,B/A2)の位置を示した。さらに、精製し
たｐ３６タンパク質から得られた部分アミノ酸配列を図
中矢印で示した。
それをコードするＤＮＡ配列を示した図である。ＹＢタ
ンパク質に特徴的に見出されるコールドショックドメイ
ン（ＣＳＤ）を黒枠で囲んだ。また、本発明によるタン
パク質に特徴的に認められるGlycine rich-domein（G1,
G2）、Glutamine rich-domain (Q1,Q2)、Basic/Aromati
c-domain (B/A1,B/A2)の位置を示した。さらに、精製し
たｐ３６タンパク質から得られた部分アミノ酸配列を図
中矢印で示した。
【図２】図１に記載される配列の続きである。
【図３】ＦＭＢＰ−１（３２ｋＤａ）のＦｂ（＋２９
０）オリゴプローブへの結合に対するＢＹＢタンパク質
の効果を示した図である（実施例８−１）。ゲルシフト
法により、ＦＭＢＰ−１フラクション（ＦＭＢＰ−１
Ｆｒ．）単独の場合、およびＦＭＢＰ−１フラクション
と本発明によるタンパク質とを混合した場合とを比較し
た。
０）オリゴプローブへの結合に対するＢＹＢタンパク質
の効果を示した図である（実施例８−１）。ゲルシフト
法により、ＦＭＢＰ−１フラクション（ＦＭＢＰ−１
Ｆｒ．）単独の場合、およびＦＭＢＰ−１フラクション
と本発明によるタンパク質とを混合した場合とを比較し
た。
【図４】ＦＭＢＰ−１（３２ｋＤａ）のＦｂ（＋２９
０）オリゴプローブへの結合に対する本発明によるタン
パク質およびその断片（ＧＳＴ−ＢＹＢ、ｄｅｌ．Ｃ、
ｄｅｌ．Ｎ）の効果を示した図である（実施例８−
１）。ゲルシフト法により、ＦＭＢＰ−１フラクション
（ＦＭＢＰ−１ Ｆｒ．）単独の場合、およびＦＭＢＰ
−１フラクションと本発明によるタンパク質あるいはそ
の断片とを混合した場合とを比較した。
０）オリゴプローブへの結合に対する本発明によるタン
パク質およびその断片（ＧＳＴ−ＢＹＢ、ｄｅｌ．Ｃ、
ｄｅｌ．Ｎ）の効果を示した図である（実施例８−
１）。ゲルシフト法により、ＦＭＢＰ−１フラクション
（ＦＭＢＰ−１ Ｆｒ．）単独の場合、およびＦＭＢＰ
−１フラクションと本発明によるタンパク質あるいはそ
の断片とを混合した場合とを比較した。
【図５】種々の転写因子（ＦＭＢＰ−１、ＯＴＦ２Ａ、
ＳＰ１、ＡＰ２）とＤＮＡ（Ｆｂ（＋２９０）、ＡＰ２
／ＳＰ１、Ａｄ２ＭＬＰ）との特異的結合に対する本発
明によるタンパク質の効果を示した図である（実施例８
−２）。
ＳＰ１、ＡＰ２）とＤＮＡ（Ｆｂ（＋２９０）、ＡＰ２
／ＳＰ１、Ａｄ２ＭＬＰ）との特異的結合に対する本発
明によるタンパク質の効果を示した図である（実施例８
−２）。
【図６】転写因子ＴＢＰとＤＮＡとの特異的結合に対す
る本発明によるタンパク質の効果を示した図である（実
施例８−２）。
る本発明によるタンパク質の効果を示した図である（実
施例８−２）。
【図７】インビトロ転写反応に対する本発明によるタン
パク質およびその断片の促進効果を示した図である（実
施例９）。数字は被験タンパク質の添加量を示す。
パク質およびその断片の促進効果を示した図である（実
施例９）。数字は被験タンパク質の添加量を示す。
【図８】制限酵素EcoRIのλDNA消化反応に対する本発明
によるタンパク質の促進効果を示した図である（実施例
１０）。
によるタンパク質の促進効果を示した図である（実施例
１０）。
【図９】制限酵素EcoRIのλDNA消化反応に対する本発明
によるタンパク質およびその断片の促進効果を示した図
である（実施例１０）。
によるタンパク質およびその断片の促進効果を示した図
である（実施例１０）。
【図１０】培養細胞における遺伝子発現に対する本発明
によるタンパク質およびその断片の効果を示した図であ
る（実施例１２−３）。レポーター遺伝子にはルシフェ
ラーゼを用いた。
によるタンパク質およびその断片の効果を示した図であ
る（実施例１２−３）。レポーター遺伝子にはルシフェ
ラーゼを用いた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 9/38 // Ｃ１２Ｎ 9/10 (Ｃ１２Ｎ 1/21 9/38 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA80 CA04 DA02 DA06 EA04 FA02 FA18 GA11 HA01 4B050 CC07 HH01 HH02 KK18 LL03 4B064 AG01 CA02 CA10 CA19 CC24 DA13 DA16 4B065 AA26X AA90X AA90Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA46 4H045 AA10 BA10 BA41 CA51 DA70 EA50 FA74
Claims (27)
- 【請求項１】下記アミノ酸配列の少なくとも一つを含ん
でなる、ＤＮＡとＤＮＡ結合因子との結合を促進する活
性を有するタンパク質： （ａ）配列番号２の１７０〜１８３番のアミノ酸配列ま
たは１個以上の改変を有し、かつＤＮＡとＤＮＡ結合因
子との結合を促進する活性を有するその改変アミノ酸配
列 （ｂ）配列番号２の１９９〜２０７番のアミノ酸配列ま
たは１個以上の改変を有し、かつＤＮＡとＤＮＡ結合因
子との結合を促進する活性を有するその改変アミノ酸配
列。 - 【請求項２】配列番号２の１３４〜１６９番のアミノ酸
配列または１個以上の改変を有するその改変アミノ酸配
列および／または配列番号２の１８４〜１９８番のアミ
ノ酸配列または１個以上の改変を有するその改変アミノ
酸配列を更に含んでなる、請求項１に記載のタンパク
質。 - 【請求項３】配列番号２の１３４〜１６９番のアミノ酸
配列またはその改変アミノ酸配列が、配列（ａ）および
／または配列（ｂ）のＮ末端側に付加されてなる、請求
項２に記載のタンパク質。 - 【請求項４】配列番号２の１８４〜１９８番のアミノ酸
配列またはその改変アミノ酸配列が、配列（ａ）のＣ末
端側、かつ配列（ｂ）のＮ末端側の位置に付加されてな
る、請求項２または３に記載のタンパク質。 - 【請求項５】配列番号２の１〜１３３番のアミノ酸配列
または１個以上の改変を有するその改変アミノ酸配列お
よび／または配列番号２の２０８〜２５９番のアミノ酸
配列または１個以上の改変を有するその改変アミノ酸配
列を更に含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記
載のタンパク質。 - 【請求項６】配列番号２の１〜１３３番のアミノ酸配列
またはその改変アミノ酸配列が、タンパク質のＮ末端に
位置するように付加されてなる、請求項５に記載のタン
パク質。 - 【請求項７】配列番号２の２０８〜２５９番のアミノ酸
配列またはその改変アミノ酸配列が、タンパク質のＣ末
端に位置するように付加されてなる、請求項５または６
に記載のタンパク質。 - 【請求項８】タンパク質が、配列番号２の１２０〜２５
９番、１３４〜２０７番、１７０〜１８３番、１３４〜
１８３番、１７０〜１９８番、１３４〜１９８番、１９
９〜２０７番、１８４〜２０７番、１９９〜２２３番、
もしくは１８４〜２２３番のアミノ酸配列、または１個
以上の改変がなされたその改変アミノ酸配列からなる、
請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質。 - 【請求項９】下記からなる群から選択されるアミノ酸配
列を含んでなる、タンパク質： （ｃ）配列番号２のアミノ酸配列および （ｄ）置換、欠失、付加、および挿入から選択される１
以上の改変を有し、かつＤＮＡとＤＮＡ結合因子との結
合を促進する活性を有する配列番号２のアミノ酸配列の
改変アミノ酸配列。 - 【請求項１０】配列（ｄ）が、１〜１６９番および１８
４〜２５９番の領域において改変を有する配列番号２の
改変アミノ酸配列からなる、請求項９に記載のタンパク
質。 - 【請求項１１】配列（ｄ）が、１〜１９８番および２０
８〜２５９番の領域において改変を有する配列番号２の
改変アミノ酸配列からなる、請求項９に記載のタンパク
質。 - 【請求項１２】配列（ｄ）が、１〜１６９番、１８４〜
１９８番、および２０８〜２５９番の領域において改変
を有する配列番号２の改変アミノ酸配列からなる、請求
項９に記載のタンパク質。 - 【請求項１３】タンパク質のＮ末端に核移行シグナルペ
プチドを更に含んでなる、請求項１〜１２のいずれか一
項に記載のタンパク質。 - 【請求項１４】核移行シグナルペプチドがＳＶ４０ラー
ジＴ抗原由来である、請求項１３に記載のタンパク質。 - 【請求項１５】核移行シグナルペプチドが配列番号１８
のアミノ酸配列からなる、請求項１３または１４に記載
のタンパク質。 - 【請求項１６】請求項１〜１５のいずれか一項に記載の
タンパク質と他のタンパク質とからなる、融合タンパク
質。 - 【請求項１７】他のタンパク質が、グルタチオンＳトラ
ンスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはクロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼである、請
求項１６に記載のタンパク質。 - 【請求項１８】請求項１〜１７のいずれか一項に記載の
タンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 【請求項１９】請求項１８に記載のポリヌクレオチドを
含んでなる、組換えベクター。 - 【請求項２０】請求項１８に記載のポリヌクレオチドま
たは請求項１９に記載の組換えベクターを含んでなる宿
主。 - 【請求項２１】請求項２０に記載の宿主を培養し、培養
物からＤＮＡとＤＮＡ結合因子との結合を促進する活性
を有するタンパク質を採取することを含んでなる、ＤＮ
ＡとＤＮＡ結合因子との結合を促進する活性を有するタ
ンパク質の製造法。 - 【請求項２２】異種タンパク質をコードする遺伝子また
はその遺伝子を含む組換えベクターを更に含んでなる、
請求項２０に記載の宿主。 - 【請求項２３】請求項２２に記載の宿主を培養し、培養
物から異種タンパク質を採取することを含んでなる、異
種タンパク質の製造法。 - 【請求項２４】請求項１〜１７のいずれか一項に記載の
タンパク質を含んでなる、ＤＮＡとＤＮＡ結合因子と間
の相互作用を促進するための組成物。 - 【請求項２５】ＤＮＡとＤＮＡ結合性因子との相互作用
が下記のいずれかにおいて生じていることを特徴とす
る、請求項２４に記載の組成物。 ・エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、メチラー
ゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、およびＲＮ
Ａポリメラーゼから選択される酵素を利用した酵素反応 ・ゲルシフトアッセイ法 ・サウスウエスタン法 - 【請求項２６】ＤＮＡおよびＤＮＡ結合因子が存在する
反応系に請求項１〜１７のいずれか一項に記載のタンパ
ク質を添加することを含んでなる、ＤＮＡとＤＮＡ結合
因子と間の相互作用を促進する方法。 - 【請求項２７】ＤＮＡとＤＮＡ結合性因子との相互作用
が下記のいずれかにおいて生じていることを特徴とす
る、請求項２６に記載の方法。 ・エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、メチラー
ゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、およびＲＮ
Ａポリメラーゼから選択される酵素を利用した酵素反応 ・ゲルシフトアッセイ法 ・サウスウエスタン法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000356568A JP2002153280A (ja) | 2000-11-22 | 2000-11-22 | Ｄｎａとｄｎａ結合因子との結合を促進するタンパク質およびそのタンパク質をコードする遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000356568A JP2002153280A (ja) | 2000-11-22 | 2000-11-22 | Ｄｎａとｄｎａ結合因子との結合を促進するタンパク質およびそのタンパク質をコードする遺伝子 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002153280A true JP2002153280A (ja) | 2002-05-28 |
Family
ID=18828791
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000356568A Pending JP2002153280A (ja) | 2000-11-22 | 2000-11-22 | Ｄｎａとｄｎａ結合因子との結合を促進するタンパク質およびそのタンパク質をコードする遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002153280A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011512821A (ja) * | 2008-02-29 | 2011-04-28 | ユニヴァーシティ オブ メディシン アンド デンティストリ オブ ニュージャーシィ | コールドショックタンパク質組成物、並びにその使用のための方法及びキット |
| US9422599B2 (en) | 2008-02-29 | 2016-08-23 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Cold shock protein compositions and methods and kits for the use thereof |
-
2000
- 2000-11-22 JP JP2000356568A patent/JP2002153280A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011512821A (ja) * | 2008-02-29 | 2011-04-28 | ユニヴァーシティ オブ メディシン アンド デンティストリ オブ ニュージャーシィ | コールドショックタンパク質組成物、並びにその使用のための方法及びキット |
| US9422599B2 (en) | 2008-02-29 | 2016-08-23 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Cold shock protein compositions and methods and kits for the use thereof |
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