JP2005253301A - 骨形成蛋白結合領域を有する蛋白質及びそれをコードする遺伝子 - Google Patents
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Abstract
【課題】ラットアストロサイト初代培養由来の骨形成蛋白結合領域を有する新規蛋白質KOHJIRINと、それをコードする遺伝子kohjirinを提供する。
【解決手段】ラットアストロサイト初代培養由来のcDNAライブラリーからのクローニングによって骨形成蛋白結合領域を有する新規蛋白質KOHJIRINをコードする遺伝子kohjirinが得られ、該遺伝子を有する発現ベクターによる形質転換体の培養により、新規蛋白質KOHJIRINが得られる。該蛋白質は骨形成蛋白結合領域を有し、医薬又は医薬の開発に用いることができる。
【選択図】 なし
【解決手段】ラットアストロサイト初代培養由来のcDNAライブラリーからのクローニングによって骨形成蛋白結合領域を有する新規蛋白質KOHJIRINをコードする遺伝子kohjirinが得られ、該遺伝子を有する発現ベクターによる形質転換体の培養により、新規蛋白質KOHJIRINが得られる。該蛋白質は骨形成蛋白結合領域を有し、医薬又は医薬の開発に用いることができる。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、骨形成蛋白結合領域を有する、ラットアストロサイト初代培養細胞由来の新規蛋白質（以下、KOHJIRINとも称する）、それをコードする遺伝子（以下、kohjirinとも称する）、並びにそれらの利用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
中枢神経系を構築する主要な細胞の一つであるアストロサイトは、ニューロンを機械的に支持するのみならず、神経栄養因子等の種々の蛋白質性因子を産生することにより、ニューロンの分化や機能の調節に関わることが近年明らかとなりつつある。特に、虚血性脳障害・外傷性脳障害、あるいは神経変性疾患においては、その病変部において反応性のアストロサイトの増殖、すなわちグリオーシスが起こることが知られている。このグリオーシス現象は本来、中枢神経系を保護する上で重要な働きを有すると考えられている。
【０００３】
また、近年、成人脳においても神経幹細胞の存在が示され、それらを神経細胞に効果的に分化させることにより広範囲な神経疾患の治療に結びつくものと期待されている。更に、最近、骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Protein: BMP)が、外胚葉細胞の表皮化あるいは多能性の神経幹細胞のグリアへの分化を促進することが明らかにされ、また、骨形成蛋白に結合しその活性を阻害することにより、外胚葉細胞の神経化または神経幹細胞のニューロンへの分化を促進する生理機能を有する骨形成蛋白阻害因子(BMP antagonist)の存在が示された。
【０００４】
上述のようにアストロサイトは脳虚血や頭部外傷等の脳障害において、盛んに増殖し反応性のグリオーシス、すなわちアストロサイトーシスを呈する他、各種病態において神経栄養因子等の種々の神経保護作用因子を産生することが知られている。しかし、神経幹細胞に作用しニューロンの新生を促すと思われる骨形成蛋白阻害因子が成熟したアストロサイトにおいて産生されるとの報告は未だない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上述した疾患を治療する上で、分化したアストロサイトがどのような蛋白質性因子を分泌し、神経細胞あるいは神経幹細胞に対してどのような影響を与えているかを解明することは、神経損傷・神経変性に起因する疾患の根本的な治療薬を探索する上で、きわめて重要なことである。例えば、骨形成蛋白阻害性の蛋白質はそれ自体が有効な医薬となりうる可能性がある。さらに、このような蛋白質は、該蛋白質の機能と同様の機能を有する物質、当該機能を阻害または促進する作用を有する物質を医薬として開発するに際しても、究めて有用である。以上の観点から、分化したアストロサイトから分泌される骨形成蛋白阻害性の蛋白質の同定と、その機能の解明が望まれている。
【０００６】
即ち、本発明は、分化したアストロサイトから分泌される骨形成蛋白阻害性の蛋白質の同定し、骨形成蛋白結合領域を有する新規蛋白質とそれをコードする遺伝子を提供することを解決すべき課題とした。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、分化したアストロサイトから分泌される骨形成蛋白阻害性の蛋白質の同定を目的として、ラットアストロサイト初代培養細胞で発現している遺伝子にコードされている蛋白質の中から、所望の骨形成蛋白阻害性の蛋白質を同定するべく鋭意検討した結果、ラットアストロサイト初代培養由来の新規蛋白質（KOHJIRIN）と、それをコードする遺伝子（kohjirin）の単離に成功した。さらに、この蛋白質（KOHJIRIN）が骨形成蛋白結合領域を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明によれば、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかに記載の蛋白質が提供される。
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ骨形成蛋白結合領域を有する蛋白質；又は
（ｃ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ骨形成蛋白結合領域を有する蛋白質：
【０００９】
本発明の別の側面によれば、上記した本発明の蛋白質をコードする遺伝子が提供される。
本発明の遺伝子の具体例は、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかに記載の遺伝子である。
（ａ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなる遺伝子；
（ｂ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなり、かつ骨形成蛋白結合領域を有する蛋白質をコードする遺伝子；又は
（ｃ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつ骨形成蛋白結合領域を有する蛋白質をコードする遺伝子：
【００１０】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の遺伝子を含有する、組み換えベクターが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の組み換えベクターを有する、形質転換体が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の形質転換体を培養し、得られる培養物から本発明の蛋白質を採取することを含む、本発明の蛋白質の製造方法が提供される。
【００１１】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の蛋白質を発現する発現系を用いて被験物質の存在下において該蛋白質を発現させ、産生される該蛋白質又はそれをコードするｍＲＮＡを検出又は測定することを含む、本発明の蛋白質の発現を調節する物質をスクリーニングする方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の蛋白質を発現する発現系を用いて被験物質の存在下において該蛋白質を発現させ、産生される蛋白質の局在性を測定することを含む、本発明の蛋白質の局在性を変化させる物質をスクリーニングする方法が提供される。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（１）本発明の蛋白質
本発明の蛋白質は、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかに記載の蛋白質である。
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ骨形成蛋白結合領域を有する蛋白質；又は
（ｃ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ骨形成蛋白結合領域を有する蛋白質：
【００１３】
本明細書で言う「アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００１４】
本明細書で言う「９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列とは」とは、アミノ酸の相同性が少なくとも９５％以上であることを意味し、相同性は好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上である。
【００１５】
上述の通り、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有する遺伝子kohjirinと相同性の高い変異体遺伝子にコードされる蛋白質であって、骨形成蛋白結合領域を有する生理活性蛋白質は全て本発明の範囲内のものである。
【００１６】
蛋白質の構成要素となるアミノ酸の側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるものであるが、実質的に蛋白質全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測により知られている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）、等が挙げられる。
【００１７】
従って、配列表の配列番号１に記載したKOHJIRINのアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等による変異蛋白質であっても、その変異がKOHJIRINの３次元構造において保存性が高い変異であって、その変異蛋白質がKOHJIRINと同様に骨形成蛋白結合領域を有する生理活性蛋白質であれば、これらは全て本発明の範囲内に属する。
【００１８】
本明細書で言う「骨形成蛋白結合領域を有する蛋白質」とは、図４に記載の本発明のKOHJIRIN蛋白の三つのシステインの豊富な領域（Kjr-CR1, Kjr-CR2, Kjr-CR3）のアミノ酸配列またはそれと同等の機能を有するアミノ酸配列を有する蛋白質を意味する。このシステインの豊富な領域の配列は、骨形成蛋白と結合することが既に報告されているCHORDIN、NOGGIN、FOLLISTATIN等の蛋白質にも広く保存されていることが明らかになっている（Cell. 1992 Sep 4, 70(5):829-40; Cell. 1994 Dec 2;779-90; Mech Dev.1997 Apr;63(1):39-50）。更に、最近CHORDIN蛋白質においては、この骨形成蛋白結合領域内に存在するＷＨＰ配列が骨形成蛋白との結合に特に重要であることが報告されており（Development.2000 Feb;127(4):821-30）、本発明のKOHJIRIN蛋白の三つのシステインの豊富な領域（Kjr-CR1, Kjr-CR2, Kjr-CR3）のうち、Kjr-CR1, Kjr-CR3においてＷＨＰ配列が確認されている。
【００１９】
本発明の蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、生体試料又は培養細胞などから単離した天然由来の蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質でもよい。
組み換え蛋白質を作製する場合には、先ず当該蛋白質をコードする遺伝子を入手することが必要である。組み換え遺伝子と好適な発現系を用いて組み換え蛋白質を産生する方法については本明細書中で後記する。
【００２０】
（２）本発明の遺伝子
上記（１）で説明した蛋白質をコードする遺伝子は全て本発明の範囲内に属する。本発明の遺伝子の具体例としては、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかに記載の遺伝子が挙げられる。
（ａ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなる遺伝子；
（ｂ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなり、かつ骨形成蛋白結合領域を有する蛋白質をコードする遺伝子；又は
（ｃ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつ骨形成蛋白結合領域を有する蛋白質をコードする遺伝子：
【００２１】
本明細書で言う「塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列」における「１もしくは数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から６０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、さらに好ましくは１から１０個、特に好ましくは１から５個程度を意味する。
上記のＤＮＡ変異の程度としては、例えば、配列表の配列番号２に記載した遺伝子kohjirinの塩基配列と８０％以上の相同性を有するものが挙げられる。
【００２２】
本明細書で言う「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、通常の条件下（例えば ＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製Ｃａｔ Ｎｏ．１１７５０３３）でプローブをラベルした場合に、３２℃のＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ溶液（ベーリンガー・マンハイム社製ＣａｔＮｏ．１６０３５５８）中でハイブリダイズさせ、５０℃の０．５×ＳＳＣ溶液（０．１％［ｗ／ｖ］ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条件（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウムである）でのサザンハイブリダイゼーションで、遺伝子kohjirinにハイブリダイズする程度であればよい。ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989（以下、モレキュラークローニング第２版と略記）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２３】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００２４】
（３）本発明の遺伝子の取得
本発明の遺伝子の取得方法は特に限定されない。本明細書の配列表の配列番号１及び２に記載したアミノ酸配列および塩基配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて、ラットアストロサイト初代培養細胞由来のcDNAライブラリーやゲノムＤＮＡライブラリーなどをスクリーニングすることにより本発明の遺伝子を単離することができる。
【００２５】
ＰＣＲ法により本発明の遺伝子を取得することもできる。例えば、ラットアストロサイト初代培養細胞由来の染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号２に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを使用してＰＣＲを行う。
ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を1サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００２６】
上記したブローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法に準じて行うことができる。
【００２７】
本明細書中上記した、配列表の配列番号２に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなり、かつ骨形成蛋白結合領域を有する蛋白質をコードする遺伝子（変異遺伝子）は、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することもできる。例えば、配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡを利用し、これらＤＮＡに変異を導入することにより変異ＤＮＡを取得することができる。具体的には、配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００２８】
上述の通り、配列表の配列番号２に記載した遺伝子kohjirinの塩基配列において、種々の人為的処理、例えば部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるＤＮＡ断片の変異・欠失・連結等により、部分的にＤＮＡ配列が変化したものであっても、これらＤＮＡ変異体が骨形成蛋白結合領域を有する（さらに好ましくは、骨形成蛋白質を阻害する活性を持つ）蛋白質をコードするＤＮＡであれば、配列番号２に示したＤＮＡ配列との相違に関わらず、本発明の範囲内のものである。
【００２９】
本明細書中上記した、配列表の配列番号２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつ骨形成蛋白結合領域を有する蛋白質をコードする遺伝子は、上述した条件下で、一定のハイブリダイゼーション条件下でコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを行うことにより得ることができる。
【００３０】
本発明の遺伝子の取得方法の一例を以下に記載する。
本発明の遺伝子は、ラットアストロサイト初代培養細胞由来のｃＤＮＡライブラリーから、該遺伝子を含んだｃＤＮＡ断片として単離することができる。本発明者らが使用したｃＤＮＡライブラリーは、ラットアストロサイト初代培養細胞を長期間培養し接触阻害を呈している時期の培養細胞から得られるｍＲＮＡをもとに、調製したものである。上述のｃＤＮＡライブラリーにおいて、接触阻害を呈している時期の分化したアストロサイト培養細胞で特異的に発現している遺伝子を有すると思われるｃＤＮＡを識別する方法として、differential display-PCR法を用いることができる。
【００３１】
まず、３日間培養したラットアストロサイト初代培養細胞と、３週間培養し接触阻害を呈しているラットアストロサイト初代培養細胞から、それぞれｍＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴをプライマーとしてｃＤＮＡを合成する。任意の配列を持ったプライマーを用いたＰＣＲ反応において、３週間培養し接触阻害を呈しているラットアストロサイト初代培養細胞において特異的に発現上昇している遺伝子の部分ＰＣＲ産物を得ることができる。上記ＰＣＲ産物をクローンテック社のpGEM-TAベクターにサブクローニングし、その全塩基配列を決定する。本法は、このようにして異なる条件下で発現量の違う遺伝子を識別する方法である。本法において、組換え体ｃＤＮＡの抽出並びにｃＤＮＡの塩基配列の決定は、いずれも当業者にとって自体公知の各種操作法（モレキュラークローニング第２版、その他当業者にとって標準的な方法を紹介した技術解説書等に記載の方法、以下常法とする）により行うことができる。
【００３２】
尚、本発明者らは5'-GACGTCTAAGAAACCAT-3'（配列番号３）の配列を持ったプライマーを用いて、上記方法を実施し、３週間培養し接触阻害を呈しているラットアストロサイト初代培養細胞において特異的に発現上昇している本遺伝子の部分ＰＣＲ産物を得ることができた。上記ＰＣＲ産物をクローンテック社のpGEM-TAベクターにサブクローニングし、その全塩基配列を決定した。上記ｃＤＮＡ断片は該ｍＲＮＡの３’端の一部の領域しか含んでいなかった。そこで本発明者らは当該領域（以下３’断片）の塩基情報を元にして、Invitrogen社の5'RACEシステムおよび3'RACEシステムのプロトコールに従い、cDNA断片の既知の塩基配列よりDNA oligo primerを合成し、RACE法の常法により、その５’側および３’側の塩基配列を明らかにした。上記システムにより与えられるSuperScript II Reverse Transcriptaseのtemplateには、ラット胎仔大脳皮質より初代培養されたアストロサイトからInvitrogen社のTRIzol reagentを用いて調製されたtotal RNAを用いた。さらに、5'RACEによっても明らかでないｃＤＮＡの５’末端塩基配列を解析するため、Invitrogen社のGeneRacerキットを用い、oligo capping法の常法に従って５’末端塩基配列を明らかにした。このキットにより与えられるcalf intestinal phosphatase、tobacco acid pyrophosphatase、T4 RNA ligaseおよびSuperScript II Reverse Transcriptaseのtemplateには、ラット胎仔大脳皮質より初代培養されたアストロサイトからInvitrogen社のTRIzol reagentを用いて調製されたtotal RNAを用いた。
【００３３】
なお、上記方法によって得られた遺伝子が脳組織で発現していることは、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて確認することができる。本発明者はこの方法を用いて、該遺伝子のラット脳内発現について検討した結果、胎生１４日、生後１日、生後１４日のラット脳で特異的に発現していることが明らかとなった。
【００３４】
また、塩基配列中の蛋白質をコードする領域（ORF, open reading frame）の存在は、塩基配列をコンピュータープログラムを用いて解析する汎用の方法により確認することができる。該ｃＤＮＡ配列の中に目的とする遺伝子の存在を確信した本発明者らは、コンピューターを利用して該配列中にＯＲＦを見いだし、この遺伝子をkohjirin、該遺伝子にコードされる蛋白質をKOHJIRINと命名した。またこの該蛋白質には、骨形成蛋白と結合することができることが知られているアミノ酸配列を有する領域が二カ所発見され、KOHJIRINが骨形成蛋白結合領域を有することが明らかとなった。
【００３５】
（４）本発明の組み換えベクター
本発明の組み換えベクターは、本発明の遺伝子を用いて、適当な宿主ベクター系による一般的遺伝子組み換え技術によって、組み換え遺伝子を調製することができる。即ち、本発明の遺伝子は適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自律的に複製するベクター（例えば、プラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
【００３６】
また、組み換えベクターとしては、発現ベクターを用いることもできる。発現ベクターに組み込まれた本発明の遺伝子には、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜することができる。
【００３７】
適当なベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、pBR322、 pUC118その他）、枯草菌由来のプラスミド（例、pUB110、 pSH19その他）、さらにバクテリオファージやレトロウイルスやワクシニアウイルス等の動物ウイルス等が利用できる。組み換えに際しては、適当な合成DNAアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドンを付加することも可能である。
【００３８】
発現ベクターにおいて使用するプロモーターは、宿主に応じて適宜選択すればよい。
例えば、宿主が大腸菌である場合には、T7プロモーター、 lacプロモーター、trpプロモーター、λPLプロモーター等が、宿主がバチルス属菌である場合にはSOP系プロモーターが、宿主が酵母である場合にはPHO5プロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター等が、宿主が動物細胞である場合にはSV40由来プロモーター、レトロウイルスプロモーター、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター等が、宿主が昆虫細胞である場合には、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモーター、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモーター、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモーター、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモーター等がそれぞれ使用できる。
【００３９】
また、本発明の遺伝子は、必要に応じて、例えばヒト成長ホルモンターミネーターまたは真菌宿主についてはＴＰＩ１ターミネーター若しくはＡＤＨ３ターミネーターのような適切なターミネーターに機能的に結合されてもよい。本発明の組み換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル(例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの)、転写エンハンサー配列（例えばＳＶ４０エンハンサー）および翻訳エンハンサー配列（例えばアデノウイルス ＶＡ ＲＮＡ をコードするもの）のような要素を有していてもよい。
本発明の組み換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
【００４０】
本発明の組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。
本発明の遺伝子、プロモーター、および所望によりターミネーターおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
【００４１】
また、本発明の遺伝子を他の蛋白質（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡその他）との融合蛋白質として発現させることも可能である。このようにして発現させた融合型の本発明の蛋白質は、適当なプロテアーゼを用いて切り出すことが可能である。
【００４２】
（５）本発明の形質転換体
本発明の遺伝子又は組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。
本発明の遺伝子または組み換えベクターを導入される宿主細胞は、本発明のＤＮＡ構築物を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。
【００４３】
細菌細胞の例としては、バチルス属細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはストレプトマイセス属細菌等のグラム陽性菌又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。
哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ−７細胞など）、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入された遺伝子を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
【００４４】
酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevis1ae)またはサッカロマイセス・クルイベリ(Ｓaccharomyces kluyveri)等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
【００４５】
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
【００４６】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる（例えば、Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manua1；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Bio/Technology, 6, 47(1988)等に記載）。
【００４７】
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。
【００４８】
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(W. H. Freeman and Company)、ニューヨーク(New York)、(1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ(インビトロジェン社製)等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
【００４９】
（６）形質転換体を用いた本発明の蛋白質の製造
上記の形質転換体は、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明の蛋白質を単離精製するには、通常の蛋白質の単離、精製法を用いればよい。
【００５０】
例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００５１】
（７）本発明の蛋白質を利用したスクリーニング
本発明の蛋白質を発現する発現系を用いて被験物質の存在下において該蛋白質を発現させ、産生される該蛋白質又はそれをコードするｍＲＮＡを検出又は測定することによって、本発明の蛋白質の発現を調節する物質をスクリーニングすることができる。同様に、本発明の蛋白質を発現する発現系を用いて被験物質の存在下において該蛋白質を発現させ、産生される蛋白質の局在性を測定することによって、本発明の蛋白質の局在性を変化させる物質をスクリーニングすることができる。これらのスクリーニング方法は何れも本発明の範囲に属する。
【００５２】
本発明のスクリーニング方法に供される被験物質としては任意の物質を使用することができる。被験物質の種類は特に限定されず、個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、合成ペプチドでもよい。あるいは、被験化合物はまた、化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリーもしくはコンビナトリアルライブラリーでもよい。被験物質は、好ましくは低分子化合物であり、低分子化合物の化合物ライブラリーが好ましい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
【００５３】
産生される本発明の蛋白質又はそれをコードするｍＲＮＡの検出又は測定は、モレキュラークローニング第２版又はカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された当業者に公知の常法により行うことができる。蛋白質の検出又は測定は、例えば、該蛋白質に対する抗体を用いたウエスタンブロッティング法又はＥＬＩＳＡなどにより行なうことができる。また、ｍＲＮＡの検出又は測定は、ノザンブロット法又はＲＴ−ＰＣＲ法などにより行うことができる。ＲＴ−ＰＣＲ法の代わりに、全ｍＲＮＡより予め作製したｃＤＮＡを鋳型として本発明の遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行なうことにより、本発明の遺伝子のｍＲＮＡを検出又は測定することもできる。
【００５４】
産生される蛋白質の局在性の測定も、当業者に公知の常法により行うことができる。具体的には、本発明の蛋白質を、検出のための標識物質（好ましくは、GFP又はEGFPなどの蛍光蛋白質）との融合蛋白質の形態で細胞内で発現させる。発現した融合蛋白質の局在性は、標識物質に基づいて測定することができる。例えば、標識物質としてGFP又はEGFPなどの蛍光蛋白質を用いる場合には、細胞を蛍光顕微鏡で観察することにより、融合蛋白質の細胞内における局在性を測定することができる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
【００５５】
【実施例１】
実施例１：遺伝子kohjirinのクローニング
３日間培養したラットアストロサイト初代培養細胞と、３週間培養し接触阻害を呈しているラットアストロサイト初代培養細胞から、それぞれ常法により、total RNAを抽出し、オリゴdTをプライマーとしてcDNAを合成した。以下のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド１）を、ＤＮＡ合成機（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製３８０Ｂ）で合成した。
オリゴヌクレオチド１： GACGTCTAAGAAACCAT （配列番号３）
【００５６】
上記のcDNAそれぞれ1μlを下記に示すＰＣＲ反応液に懸濁した。
10×PCRバッファー(100mM Tris-HCl(pH8.3), 500mM KCl, 25mM MgCl2)（2μl）、2.5mM dNTP（1.6μl）、10μM オリゴヌクレオチド１（ 1μｌ）、水（14.1μl）、Taqポリメラーゼ（Takara Taq）（0.25μl）、 総量 20 μl。
【００５７】
ＰＣＲサイクルは、９５℃で２分保持後、３５℃で４０秒保持、７２℃で１分３０秒保持、９５℃で4０秒保持を４回繰り返して行ったのち、５５℃で４０秒保持、７２℃で１分３０秒保持、９５℃で４０秒保持を３２回繰り返して行った後、７２℃で５分間反応させた。
【００５８】
上記ＰＣＲ産物を、常法によりアクリルアミドゲルで展開し、３週間培養し、接触阻害を呈しているラットアストロサイト初代培養細胞由来のcDNAにおいて特異的に発現上昇している遺伝子の部分のバンドを切り出し、常法によりゲルから抽出しＰＣＲ産物を得た。上記ＰＣＲ産物をクローンテック社のpGEM-TAベクターにサブクローニングし、その全塩基配列を決定し、図１に示す配列を有する遺伝子（断片−１）を得た。配列決定にはＰＥアプライドバイオシステムズ社製のＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３７７）と同社製反応キットを用いた。
【００５９】
さらに断片−１を含む遺伝子が確かに３週間培養し接触阻害を呈しているラットアストロサイト初代培養細胞にて発現上昇している遺伝子であることを確認するためにノーザンブロット法を行った。３日間培養したラットアストロサイト初代培養細胞と、３週間培養し接触阻害を呈しているラットアストロサイト初代培養細胞から、それぞれ常法により、total RNAを抽出し、アガロースゲルで電気泳動後、ナイロン膜（アマーシャム社製）に転写した。上記の断片−1を鋳型として、32P-dCTP存在下で、Ready to go kit(ファーマシア社製)でプローブを合成した。ハイブリダイゼーションは以下の組成の溶液中で（濃度は全て終濃度）、４２℃で一晩行った。
（ハイブリダイゼーション溶液の組成）50% ホルムアミド、5 x SSC、0.05 M リン酸ナトリウム、10×デンハルト溶液、1% SDS、200μg/ml Salmon sperm DNA
【００６０】
ハイブリダイゼーション終了後、メンブレインを2 x SSC、0.1% SDS溶液で室温で二回洗浄した。シグナルの検出には、X-OMAT (コダック社製)フィルムを用いた。その結果、図２に示すように当該遺伝子は、３週間培養し接触阻害を呈しているラットアストロサイト初代培養細胞にて発現上昇していた。
以上から、図１を含む遺伝子が、３週間培養し接触阻害を呈しているラットアストロサイト初代培養細胞にて発現上昇している遺伝子であることが示された。
【００６１】
実施例２：断片−１を含むｃＤＮＡ断片のクローニング
断片−１を含むｃＤＮＡ断片のクローニングを以下の方法により行った。
上記ｃＤＮＡ断片は該ｍＲＮＡの３’端の一部の領域しか含んでいなかった。そこで本発明者らは当該領域（以下３’断片）の塩基情報を元にして ｃＤＮＡ断片の既知の塩基配列より５’側オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド２）、３’側オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド３）をＤＮＡ合成機（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製３８０Ｂ）で合成した。
オリゴヌクレオチド２:ATGCAGCTCAGAGACTCC （配列番号４）
オリゴヌクレオチド３:GAAATCAGCCATAGTCTTAGA （配列番号５）
【００６２】
これらのオリゴヌクレオチドを用い、Invitrogen社の5'RACEシステムおよび3'RACEシステムのプロトコールに従いRACE法の常法により、その5'側および3'側の塩基配列を明らかにした。システムにより与えられるSuperScript II Reverse Transcriptaseのtemplateには、ラット胎仔大脳皮質より初代培養されたアストロサイトからInvitrogen社のTRIzol reagentを用いて調製されたtotal RNAを用いた。さらに、5'RACEによっても明らかでないcDNAの5'末端塩基配列を解析するため、既知の塩基配列よりオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド４）をＤＮＡ合成機（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製３８０Ｂ）で合成した。
オリゴヌクレオチド４:CAAGGTGTGCTGTGACTGGAT （配列番号６）
【００６３】
このオリゴヌクレオチドを用い、Invitrogen社のGeneRacerキットを用い、oligo capping法の常法に従って5'末端塩基配列を明らかにした。キットにより与えられるcalf intestinal phosphatase、tobacco acid pyrophosphatase、T4 RNA ligaseおよびSuperScript II Reverse Transcriptaseのtemplateには、ラット胎仔大脳皮質より初代培養されたアストロサイトからInvitrogen社のTRIzol reagentを用いて調製されたtotal RNAを用いた。
【００６４】
当該ｃＤＮＡは、522残基より成る蛋白質（KOHJIRIN）をコードするＯＲＦを含んでいる。該蛋白質の開始コドンであるメチオニン残基の上流域に同じｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅで終止コドンが出現していた、また当該ｃＤＮＡ断片がコードする蛋白質のアミノ酸配列は、配列表の配列番号1に示したものが唯一のものであった。KOHJIRINの一次構造上の特徴を図３、 図４及び図５に示す。なお疎水性領域等の予測はアミノ酸構造解析ソフトＳＯＳＵＩ（美宅 成樹 ：蛋白質核酸酵素、１９９７年、ＶＯＬ４２、ｐ３０２０−３０２５）を用いた。KOHJIRINはＮ末端アミノ酸部分に蛋白質分泌シグナル配列を有している。また、遺伝子kohjirinのＯＲＦを含むｃＤＮＡの塩基配列を配列表の配列番号1に示す。
【００６５】
実施例３：ラット脳におけるkohjirin ｍＲＮＡの同定法
ラット脳より常法にて、total RNAを抽出し、オリゴdTをプライマーとしてcDNAを合成した。kohjirin cDNAに含まれる配列を有するオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド５）と逆相補鎖と配列を有するオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド６）のそれぞれを、ＤＮＡ合成機（ＡＢＩ社製３８０Ｂ）で合成した。
オリゴヌクレオチド５: TAGGACTTTGTGGTACAGCTC （配列番号７）
オリゴヌクレオチド６: TTACAACCTGCCTCAAAGGCT （配列番号８）
【００６６】
オリゴヌクレオチド５とオリゴヌクレオチド６をプライマーとして、タカラＬＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２とＰＣＲサーマルサイクラーＭＰ（いずれも宝酒造製）を用いて以下のＰＣＲ操作を行った。
cDNA （2μl(40ng)）、10×PCRバッファー(25mM Mg++を含む) （1.5μl）、2.5mM dNTP（2.4μl）、10μM オリゴヌクレオチド５（0.4μl）、10μMオリゴヌクレオチド６（0.4μl）、水 （8.15μl）、LA Taqポリメラーセ（0.15μl）、総量 15 μl。
【００６７】
ＰＣＲサイクルは、９５℃で５分保持後、９５℃で３５秒反応させ、５７℃で３５秒保持し、更に７２℃で１分間保持を３３回繰り返して行った。
反応後のＰＣＲ反応液を、１％アガロースゲル電気泳動で分画した。ゲルをエチジウムブロマイドで染色した後、紫外光照射して増幅される約480ｂｐのバンドを検出した。胎生14日、生後1日、生後14日のラット脳に於ける結果を図６に示す。
上記方法でKOHJIRINのｍＲＮＡの発現を定量することが可能であり、 KOHJIRINｍＲＮＡ発現を調節する物質をスクリーニングすることができる。
【００６８】
実施例４：KOHJIRIN局在性を確認する方法
（１） ＯＲＦを含むｃＤＮＡの塩基配列（配列表の配列番号２）を有する遺伝子kohjirinのcoding regionを含むプラスミド（pGEM-kohjirin）を下記の反応条件で1時間制限酵素処理を行った。EcoRI (15U/μl)（1μl）、buffer （500mM Tris-HCl(pH8.5), 100mM MgCl2, 10mM Dithiothreitol, 1M NaCl）（2μl）、プラスミド (2μｇ/μl)（1μl）、 水（16μl）、総量 20μl。
１％アガロースゲル電気泳動で分画し、目的の約１．６ｋｂのＰＣＲ産物を切り出し、ｇｅｎｅｃｌｅａｎ ｋｉｔ（フナコシ）にて精製した。精製した産物を更に、下記の反応条件で３７℃で２０分間、続いて５０℃で２０分間処理を行った。Calf intestinal phosphatase (15U/μl)（1μl）、buffer（ 2μl）、 上記産物 (1μｇ/μl)（1μl）、水（16μl）、総量 20μl。
【００６９】
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（クロンテック社製）についても同様にEcoRIで1時間制限酵素処理を行った。Ｔａｋａｒａ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造）を用いて、制限酵素処理したｃＤＮＡ断片をｐＥＧＦＰ−Ｎ１（クロンテック社製）に挿入し、常法に従い組み換え体を単離し、配列表の配列番号２に示した配列のＤＮＡを正確に含むｐKOHJIRIN−ＥＧＦＰプラスミドを得た。
【００７０】
（２） HEK細胞への導入１０％非働化ウシ胎児血清（大日本製薬）、抗生物質を含むＤ−ＭＥＭ培地（ライフテック社製）を基本培地としてＣＯＳ−７細胞を培養した。ＣＯＳ−７細胞を直径３５ｍｍの培養皿にあらかじめ１０5個播種した。１０μｌのLIPOFECTAMINE遺伝子導入試薬（in vitrogen社）と２μｇのｐKOHJIRIN−ＥＧＦＰプラスミドを予め３０分間混合した溶液を含む基礎培地で２時間培養し、遺伝子導入を行った。遺伝子導入後２４時間後に蛍光顕微鏡にて細胞を観察した。
【００７１】
図７に示す通り、KOHJIRIN−ＥＧＦＰ蛋白質は、主に核近傍の細胞質に存在することが認められた。このことはKOHJIRIN蛋白質が細胞内で合成され分泌される蛋白であることを示している。さらに、ｐKOHJIRIN−ＥＧＦＰプラスミドを同様の方法で様々な培養細胞株等に導入し、同時に化合物を添加させることで、蛋白発現量は変化させず、局在性を変化させる化合物をスクリーニングすることが可能となる。
【００７２】
【発明の効果】
本発明の蛋白質（代表例としてはKOHJIRIN）は、中枢神経系に発現し神経細胞の分化を抑制する骨形成蛋白を阻害する作用を有していると考えられることから、遺伝子kohjirinの発現異常、あるいは蛋白質KOHJIRINの機能不全は、脳の高次機能を維持する上で重大な障害となると推測される。
【００７３】
従って、本発明の蛋白質それ自体は虚血性脳障害・外傷性脳障害、あるいはアルツハイマー病、パーキンソン病などの神経変性疾患の治療薬として有用と考えられる。また、当該蛋白質の機能と同様の機能を有する物質、当該機能を促進する物質、あるいはまた当該遺伝子の発現を促進する物質等の創出に利用することができる。
【００７４】
【配列表】
【００７５】
【００７６】
【００７７】
【００７８】
【００７９】
【００８０】
【００８１】
【００８２】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、３週間培養し接触阻害を呈しているラットアストロサイト初代培養細胞にて発現上昇しているDNA断片である断片１の塩基配列を示す。
【図２】図２は、ラットアストロサイト初代培養細胞におけるkohjirin mRNAのノーザンハイブリダイゼーション法による同定と、３週間培養し接触阻害を呈しているラットアストロサイト初代培養細胞にて発現が上昇していることを示す。
【図３】図３は、KOHJIRIN蛋白のアミノ酸配列を示す。波下線はシグナルペプチドを示し、実下線はシステインの豊富な領域を示す。
【図４】図４は、KOHJIRIN蛋白の三つのシステインの豊富な領域（Kjr-CR1, Kjr-CR2, Kjr-CR3）のアミノ酸配列を、既に骨形成因子に結合することが明らかとなっているCHORDIN蛋白質のシステインの豊富な領域（Chd-CR1, Chd-CR3）のアミノ酸配列と比較した結果を示す。骨形成因子との結合に重要なWHP配列がKjr-CR1と Kjr-CR3に存在することを示す。
【図５】図５は、蛋白質KOHJIRIN の構造上の特徴を示す。
【図６】図６は、ラット脳における、kohjirin mRNAのRT-PCR法による同定を示す。
【図７】図７はCOS-7細胞におけるKOHJIRIN-EGFP融合蛋白質の局在性を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、骨形成蛋白結合領域を有する、ラットアストロサイト初代培養細胞由来の新規蛋白質（以下、KOHJIRINとも称する）、それをコードする遺伝子（以下、kohjirinとも称する）、並びにそれらの利用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
中枢神経系を構築する主要な細胞の一つであるアストロサイトは、ニューロンを機械的に支持するのみならず、神経栄養因子等の種々の蛋白質性因子を産生することにより、ニューロンの分化や機能の調節に関わることが近年明らかとなりつつある。特に、虚血性脳障害・外傷性脳障害、あるいは神経変性疾患においては、その病変部において反応性のアストロサイトの増殖、すなわちグリオーシスが起こることが知られている。このグリオーシス現象は本来、中枢神経系を保護する上で重要な働きを有すると考えられている。
【０００３】
また、近年、成人脳においても神経幹細胞の存在が示され、それらを神経細胞に効果的に分化させることにより広範囲な神経疾患の治療に結びつくものと期待されている。更に、最近、骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Protein: BMP)が、外胚葉細胞の表皮化あるいは多能性の神経幹細胞のグリアへの分化を促進することが明らかにされ、また、骨形成蛋白に結合しその活性を阻害することにより、外胚葉細胞の神経化または神経幹細胞のニューロンへの分化を促進する生理機能を有する骨形成蛋白阻害因子(BMP antagonist)の存在が示された。
【０００４】
上述のようにアストロサイトは脳虚血や頭部外傷等の脳障害において、盛んに増殖し反応性のグリオーシス、すなわちアストロサイトーシスを呈する他、各種病態において神経栄養因子等の種々の神経保護作用因子を産生することが知られている。しかし、神経幹細胞に作用しニューロンの新生を促すと思われる骨形成蛋白阻害因子が成熟したアストロサイトにおいて産生されるとの報告は未だない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上述した疾患を治療する上で、分化したアストロサイトがどのような蛋白質性因子を分泌し、神経細胞あるいは神経幹細胞に対してどのような影響を与えているかを解明することは、神経損傷・神経変性に起因する疾患の根本的な治療薬を探索する上で、きわめて重要なことである。例えば、骨形成蛋白阻害性の蛋白質はそれ自体が有効な医薬となりうる可能性がある。さらに、このような蛋白質は、該蛋白質の機能と同様の機能を有する物質、当該機能を阻害または促進する作用を有する物質を医薬として開発するに際しても、究めて有用である。以上の観点から、分化したアストロサイトから分泌される骨形成蛋白阻害性の蛋白質の同定と、その機能の解明が望まれている。
【０００６】
即ち、本発明は、分化したアストロサイトから分泌される骨形成蛋白阻害性の蛋白質の同定し、骨形成蛋白結合領域を有する新規蛋白質とそれをコードする遺伝子を提供することを解決すべき課題とした。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、分化したアストロサイトから分泌される骨形成蛋白阻害性の蛋白質の同定を目的として、ラットアストロサイト初代培養細胞で発現している遺伝子にコードされている蛋白質の中から、所望の骨形成蛋白阻害性の蛋白質を同定するべく鋭意検討した結果、ラットアストロサイト初代培養由来の新規蛋白質（KOHJIRIN）と、それをコードする遺伝子（kohjirin）の単離に成功した。さらに、この蛋白質（KOHJIRIN）が骨形成蛋白結合領域を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明によれば、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかに記載の蛋白質が提供される。
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ骨形成蛋白結合領域を有する蛋白質；又は
（ｃ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ骨形成蛋白結合領域を有する蛋白質：
【０００９】
本発明の別の側面によれば、上記した本発明の蛋白質をコードする遺伝子が提供される。
本発明の遺伝子の具体例は、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかに記載の遺伝子である。
（ａ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなる遺伝子；
（ｂ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなり、かつ骨形成蛋白結合領域を有する蛋白質をコードする遺伝子；又は
（ｃ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつ骨形成蛋白結合領域を有する蛋白質をコードする遺伝子：
【００１０】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の遺伝子を含有する、組み換えベクターが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の組み換えベクターを有する、形質転換体が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の形質転換体を培養し、得られる培養物から本発明の蛋白質を採取することを含む、本発明の蛋白質の製造方法が提供される。
【００１１】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の蛋白質を発現する発現系を用いて被験物質の存在下において該蛋白質を発現させ、産生される該蛋白質又はそれをコードするｍＲＮＡを検出又は測定することを含む、本発明の蛋白質の発現を調節する物質をスクリーニングする方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の蛋白質を発現する発現系を用いて被験物質の存在下において該蛋白質を発現させ、産生される蛋白質の局在性を測定することを含む、本発明の蛋白質の局在性を変化させる物質をスクリーニングする方法が提供される。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（１）本発明の蛋白質
本発明の蛋白質は、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかに記載の蛋白質である。
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ骨形成蛋白結合領域を有する蛋白質；又は
（ｃ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ骨形成蛋白結合領域を有する蛋白質：
【００１３】
本明細書で言う「アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００１４】
本明細書で言う「９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列とは」とは、アミノ酸の相同性が少なくとも９５％以上であることを意味し、相同性は好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上である。
【００１５】
上述の通り、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有する遺伝子kohjirinと相同性の高い変異体遺伝子にコードされる蛋白質であって、骨形成蛋白結合領域を有する生理活性蛋白質は全て本発明の範囲内のものである。
【００１６】
蛋白質の構成要素となるアミノ酸の側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるものであるが、実質的に蛋白質全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測により知られている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）、等が挙げられる。
【００１７】
従って、配列表の配列番号１に記載したKOHJIRINのアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等による変異蛋白質であっても、その変異がKOHJIRINの３次元構造において保存性が高い変異であって、その変異蛋白質がKOHJIRINと同様に骨形成蛋白結合領域を有する生理活性蛋白質であれば、これらは全て本発明の範囲内に属する。
【００１８】
本明細書で言う「骨形成蛋白結合領域を有する蛋白質」とは、図４に記載の本発明のKOHJIRIN蛋白の三つのシステインの豊富な領域（Kjr-CR1, Kjr-CR2, Kjr-CR3）のアミノ酸配列またはそれと同等の機能を有するアミノ酸配列を有する蛋白質を意味する。このシステインの豊富な領域の配列は、骨形成蛋白と結合することが既に報告されているCHORDIN、NOGGIN、FOLLISTATIN等の蛋白質にも広く保存されていることが明らかになっている（Cell. 1992 Sep 4, 70(5):829-40; Cell. 1994 Dec 2;779-90; Mech Dev.1997 Apr;63(1):39-50）。更に、最近CHORDIN蛋白質においては、この骨形成蛋白結合領域内に存在するＷＨＰ配列が骨形成蛋白との結合に特に重要であることが報告されており（Development.2000 Feb;127(4):821-30）、本発明のKOHJIRIN蛋白の三つのシステインの豊富な領域（Kjr-CR1, Kjr-CR2, Kjr-CR3）のうち、Kjr-CR1, Kjr-CR3においてＷＨＰ配列が確認されている。
【００１９】
本発明の蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、生体試料又は培養細胞などから単離した天然由来の蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質でもよい。
組み換え蛋白質を作製する場合には、先ず当該蛋白質をコードする遺伝子を入手することが必要である。組み換え遺伝子と好適な発現系を用いて組み換え蛋白質を産生する方法については本明細書中で後記する。
【００２０】
（２）本発明の遺伝子
上記（１）で説明した蛋白質をコードする遺伝子は全て本発明の範囲内に属する。本発明の遺伝子の具体例としては、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかに記載の遺伝子が挙げられる。
（ａ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなる遺伝子；
（ｂ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなり、かつ骨形成蛋白結合領域を有する蛋白質をコードする遺伝子；又は
（ｃ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつ骨形成蛋白結合領域を有する蛋白質をコードする遺伝子：
【００２１】
本明細書で言う「塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列」における「１もしくは数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から６０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、さらに好ましくは１から１０個、特に好ましくは１から５個程度を意味する。
上記のＤＮＡ変異の程度としては、例えば、配列表の配列番号２に記載した遺伝子kohjirinの塩基配列と８０％以上の相同性を有するものが挙げられる。
【００２２】
本明細書で言う「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、通常の条件下（例えば ＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製Ｃａｔ Ｎｏ．１１７５０３３）でプローブをラベルした場合に、３２℃のＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ溶液（ベーリンガー・マンハイム社製ＣａｔＮｏ．１６０３５５８）中でハイブリダイズさせ、５０℃の０．５×ＳＳＣ溶液（０．１％［ｗ／ｖ］ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条件（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウムである）でのサザンハイブリダイゼーションで、遺伝子kohjirinにハイブリダイズする程度であればよい。ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989（以下、モレキュラークローニング第２版と略記）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２３】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００２４】
（３）本発明の遺伝子の取得
本発明の遺伝子の取得方法は特に限定されない。本明細書の配列表の配列番号１及び２に記載したアミノ酸配列および塩基配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて、ラットアストロサイト初代培養細胞由来のcDNAライブラリーやゲノムＤＮＡライブラリーなどをスクリーニングすることにより本発明の遺伝子を単離することができる。
【００２５】
ＰＣＲ法により本発明の遺伝子を取得することもできる。例えば、ラットアストロサイト初代培養細胞由来の染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号２に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを使用してＰＣＲを行う。
ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を1サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００２６】
上記したブローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法に準じて行うことができる。
【００２７】
本明細書中上記した、配列表の配列番号２に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなり、かつ骨形成蛋白結合領域を有する蛋白質をコードする遺伝子（変異遺伝子）は、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することもできる。例えば、配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡを利用し、これらＤＮＡに変異を導入することにより変異ＤＮＡを取得することができる。具体的には、配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００２８】
上述の通り、配列表の配列番号２に記載した遺伝子kohjirinの塩基配列において、種々の人為的処理、例えば部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるＤＮＡ断片の変異・欠失・連結等により、部分的にＤＮＡ配列が変化したものであっても、これらＤＮＡ変異体が骨形成蛋白結合領域を有する（さらに好ましくは、骨形成蛋白質を阻害する活性を持つ）蛋白質をコードするＤＮＡであれば、配列番号２に示したＤＮＡ配列との相違に関わらず、本発明の範囲内のものである。
【００２９】
本明細書中上記した、配列表の配列番号２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつ骨形成蛋白結合領域を有する蛋白質をコードする遺伝子は、上述した条件下で、一定のハイブリダイゼーション条件下でコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを行うことにより得ることができる。
【００３０】
本発明の遺伝子の取得方法の一例を以下に記載する。
本発明の遺伝子は、ラットアストロサイト初代培養細胞由来のｃＤＮＡライブラリーから、該遺伝子を含んだｃＤＮＡ断片として単離することができる。本発明者らが使用したｃＤＮＡライブラリーは、ラットアストロサイト初代培養細胞を長期間培養し接触阻害を呈している時期の培養細胞から得られるｍＲＮＡをもとに、調製したものである。上述のｃＤＮＡライブラリーにおいて、接触阻害を呈している時期の分化したアストロサイト培養細胞で特異的に発現している遺伝子を有すると思われるｃＤＮＡを識別する方法として、differential display-PCR法を用いることができる。
【００３１】
まず、３日間培養したラットアストロサイト初代培養細胞と、３週間培養し接触阻害を呈しているラットアストロサイト初代培養細胞から、それぞれｍＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴをプライマーとしてｃＤＮＡを合成する。任意の配列を持ったプライマーを用いたＰＣＲ反応において、３週間培養し接触阻害を呈しているラットアストロサイト初代培養細胞において特異的に発現上昇している遺伝子の部分ＰＣＲ産物を得ることができる。上記ＰＣＲ産物をクローンテック社のpGEM-TAベクターにサブクローニングし、その全塩基配列を決定する。本法は、このようにして異なる条件下で発現量の違う遺伝子を識別する方法である。本法において、組換え体ｃＤＮＡの抽出並びにｃＤＮＡの塩基配列の決定は、いずれも当業者にとって自体公知の各種操作法（モレキュラークローニング第２版、その他当業者にとって標準的な方法を紹介した技術解説書等に記載の方法、以下常法とする）により行うことができる。
【００３２】
尚、本発明者らは5'-GACGTCTAAGAAACCAT-3'（配列番号３）の配列を持ったプライマーを用いて、上記方法を実施し、３週間培養し接触阻害を呈しているラットアストロサイト初代培養細胞において特異的に発現上昇している本遺伝子の部分ＰＣＲ産物を得ることができた。上記ＰＣＲ産物をクローンテック社のpGEM-TAベクターにサブクローニングし、その全塩基配列を決定した。上記ｃＤＮＡ断片は該ｍＲＮＡの３’端の一部の領域しか含んでいなかった。そこで本発明者らは当該領域（以下３’断片）の塩基情報を元にして、Invitrogen社の5'RACEシステムおよび3'RACEシステムのプロトコールに従い、cDNA断片の既知の塩基配列よりDNA oligo primerを合成し、RACE法の常法により、その５’側および３’側の塩基配列を明らかにした。上記システムにより与えられるSuperScript II Reverse Transcriptaseのtemplateには、ラット胎仔大脳皮質より初代培養されたアストロサイトからInvitrogen社のTRIzol reagentを用いて調製されたtotal RNAを用いた。さらに、5'RACEによっても明らかでないｃＤＮＡの５’末端塩基配列を解析するため、Invitrogen社のGeneRacerキットを用い、oligo capping法の常法に従って５’末端塩基配列を明らかにした。このキットにより与えられるcalf intestinal phosphatase、tobacco acid pyrophosphatase、T4 RNA ligaseおよびSuperScript II Reverse Transcriptaseのtemplateには、ラット胎仔大脳皮質より初代培養されたアストロサイトからInvitrogen社のTRIzol reagentを用いて調製されたtotal RNAを用いた。
【００３３】
なお、上記方法によって得られた遺伝子が脳組織で発現していることは、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて確認することができる。本発明者はこの方法を用いて、該遺伝子のラット脳内発現について検討した結果、胎生１４日、生後１日、生後１４日のラット脳で特異的に発現していることが明らかとなった。
【００３４】
また、塩基配列中の蛋白質をコードする領域（ORF, open reading frame）の存在は、塩基配列をコンピュータープログラムを用いて解析する汎用の方法により確認することができる。該ｃＤＮＡ配列の中に目的とする遺伝子の存在を確信した本発明者らは、コンピューターを利用して該配列中にＯＲＦを見いだし、この遺伝子をkohjirin、該遺伝子にコードされる蛋白質をKOHJIRINと命名した。またこの該蛋白質には、骨形成蛋白と結合することができることが知られているアミノ酸配列を有する領域が二カ所発見され、KOHJIRINが骨形成蛋白結合領域を有することが明らかとなった。
【００３５】
（４）本発明の組み換えベクター
本発明の組み換えベクターは、本発明の遺伝子を用いて、適当な宿主ベクター系による一般的遺伝子組み換え技術によって、組み換え遺伝子を調製することができる。即ち、本発明の遺伝子は適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自律的に複製するベクター（例えば、プラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
【００３６】
また、組み換えベクターとしては、発現ベクターを用いることもできる。発現ベクターに組み込まれた本発明の遺伝子には、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜することができる。
【００３７】
適当なベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、pBR322、 pUC118その他）、枯草菌由来のプラスミド（例、pUB110、 pSH19その他）、さらにバクテリオファージやレトロウイルスやワクシニアウイルス等の動物ウイルス等が利用できる。組み換えに際しては、適当な合成DNAアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドンを付加することも可能である。
【００３８】
発現ベクターにおいて使用するプロモーターは、宿主に応じて適宜選択すればよい。
例えば、宿主が大腸菌である場合には、T7プロモーター、 lacプロモーター、trpプロモーター、λPLプロモーター等が、宿主がバチルス属菌である場合にはSOP系プロモーターが、宿主が酵母である場合にはPHO5プロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター等が、宿主が動物細胞である場合にはSV40由来プロモーター、レトロウイルスプロモーター、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター等が、宿主が昆虫細胞である場合には、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモーター、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモーター、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモーター、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモーター等がそれぞれ使用できる。
【００３９】
また、本発明の遺伝子は、必要に応じて、例えばヒト成長ホルモンターミネーターまたは真菌宿主についてはＴＰＩ１ターミネーター若しくはＡＤＨ３ターミネーターのような適切なターミネーターに機能的に結合されてもよい。本発明の組み換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル(例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの)、転写エンハンサー配列（例えばＳＶ４０エンハンサー）および翻訳エンハンサー配列（例えばアデノウイルス ＶＡ ＲＮＡ をコードするもの）のような要素を有していてもよい。
本発明の組み換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
【００４０】
本発明の組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。
本発明の遺伝子、プロモーター、および所望によりターミネーターおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
【００４１】
また、本発明の遺伝子を他の蛋白質（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡその他）との融合蛋白質として発現させることも可能である。このようにして発現させた融合型の本発明の蛋白質は、適当なプロテアーゼを用いて切り出すことが可能である。
【００４２】
（５）本発明の形質転換体
本発明の遺伝子又は組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。
本発明の遺伝子または組み換えベクターを導入される宿主細胞は、本発明のＤＮＡ構築物を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。
【００４３】
細菌細胞の例としては、バチルス属細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはストレプトマイセス属細菌等のグラム陽性菌又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。
哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ−７細胞など）、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入された遺伝子を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
【００４４】
酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevis1ae)またはサッカロマイセス・クルイベリ(Ｓaccharomyces kluyveri)等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
【００４５】
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
【００４６】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる（例えば、Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manua1；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Bio/Technology, 6, 47(1988)等に記載）。
【００４７】
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。
【００４８】
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(W. H. Freeman and Company)、ニューヨーク(New York)、(1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ(インビトロジェン社製)等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
【００４９】
（６）形質転換体を用いた本発明の蛋白質の製造
上記の形質転換体は、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明の蛋白質を単離精製するには、通常の蛋白質の単離、精製法を用いればよい。
【００５０】
例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００５１】
（７）本発明の蛋白質を利用したスクリーニング
本発明の蛋白質を発現する発現系を用いて被験物質の存在下において該蛋白質を発現させ、産生される該蛋白質又はそれをコードするｍＲＮＡを検出又は測定することによって、本発明の蛋白質の発現を調節する物質をスクリーニングすることができる。同様に、本発明の蛋白質を発現する発現系を用いて被験物質の存在下において該蛋白質を発現させ、産生される蛋白質の局在性を測定することによって、本発明の蛋白質の局在性を変化させる物質をスクリーニングすることができる。これらのスクリーニング方法は何れも本発明の範囲に属する。
【００５２】
本発明のスクリーニング方法に供される被験物質としては任意の物質を使用することができる。被験物質の種類は特に限定されず、個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、合成ペプチドでもよい。あるいは、被験化合物はまた、化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリーもしくはコンビナトリアルライブラリーでもよい。被験物質は、好ましくは低分子化合物であり、低分子化合物の化合物ライブラリーが好ましい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
【００５３】
産生される本発明の蛋白質又はそれをコードするｍＲＮＡの検出又は測定は、モレキュラークローニング第２版又はカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された当業者に公知の常法により行うことができる。蛋白質の検出又は測定は、例えば、該蛋白質に対する抗体を用いたウエスタンブロッティング法又はＥＬＩＳＡなどにより行なうことができる。また、ｍＲＮＡの検出又は測定は、ノザンブロット法又はＲＴ−ＰＣＲ法などにより行うことができる。ＲＴ−ＰＣＲ法の代わりに、全ｍＲＮＡより予め作製したｃＤＮＡを鋳型として本発明の遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行なうことにより、本発明の遺伝子のｍＲＮＡを検出又は測定することもできる。
【００５４】
産生される蛋白質の局在性の測定も、当業者に公知の常法により行うことができる。具体的には、本発明の蛋白質を、検出のための標識物質（好ましくは、GFP又はEGFPなどの蛍光蛋白質）との融合蛋白質の形態で細胞内で発現させる。発現した融合蛋白質の局在性は、標識物質に基づいて測定することができる。例えば、標識物質としてGFP又はEGFPなどの蛍光蛋白質を用いる場合には、細胞を蛍光顕微鏡で観察することにより、融合蛋白質の細胞内における局在性を測定することができる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
【００５５】
【実施例１】
実施例１：遺伝子kohjirinのクローニング
３日間培養したラットアストロサイト初代培養細胞と、３週間培養し接触阻害を呈しているラットアストロサイト初代培養細胞から、それぞれ常法により、total RNAを抽出し、オリゴdTをプライマーとしてcDNAを合成した。以下のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド１）を、ＤＮＡ合成機（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製３８０Ｂ）で合成した。
オリゴヌクレオチド１： GACGTCTAAGAAACCAT （配列番号３）
【００５６】
上記のcDNAそれぞれ1μlを下記に示すＰＣＲ反応液に懸濁した。
10×PCRバッファー(100mM Tris-HCl(pH8.3), 500mM KCl, 25mM MgCl2)（2μl）、2.5mM dNTP（1.6μl）、10μM オリゴヌクレオチド１（ 1μｌ）、水（14.1μl）、Taqポリメラーゼ（Takara Taq）（0.25μl）、 総量 20 μl。
【００５７】
ＰＣＲサイクルは、９５℃で２分保持後、３５℃で４０秒保持、７２℃で１分３０秒保持、９５℃で4０秒保持を４回繰り返して行ったのち、５５℃で４０秒保持、７２℃で１分３０秒保持、９５℃で４０秒保持を３２回繰り返して行った後、７２℃で５分間反応させた。
【００５８】
上記ＰＣＲ産物を、常法によりアクリルアミドゲルで展開し、３週間培養し、接触阻害を呈しているラットアストロサイト初代培養細胞由来のcDNAにおいて特異的に発現上昇している遺伝子の部分のバンドを切り出し、常法によりゲルから抽出しＰＣＲ産物を得た。上記ＰＣＲ産物をクローンテック社のpGEM-TAベクターにサブクローニングし、その全塩基配列を決定し、図１に示す配列を有する遺伝子（断片−１）を得た。配列決定にはＰＥアプライドバイオシステムズ社製のＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３７７）と同社製反応キットを用いた。
【００５９】
さらに断片−１を含む遺伝子が確かに３週間培養し接触阻害を呈しているラットアストロサイト初代培養細胞にて発現上昇している遺伝子であることを確認するためにノーザンブロット法を行った。３日間培養したラットアストロサイト初代培養細胞と、３週間培養し接触阻害を呈しているラットアストロサイト初代培養細胞から、それぞれ常法により、total RNAを抽出し、アガロースゲルで電気泳動後、ナイロン膜（アマーシャム社製）に転写した。上記の断片−1を鋳型として、32P-dCTP存在下で、Ready to go kit(ファーマシア社製)でプローブを合成した。ハイブリダイゼーションは以下の組成の溶液中で（濃度は全て終濃度）、４２℃で一晩行った。
（ハイブリダイゼーション溶液の組成）50% ホルムアミド、5 x SSC、0.05 M リン酸ナトリウム、10×デンハルト溶液、1% SDS、200μg/ml Salmon sperm DNA
【００６０】
ハイブリダイゼーション終了後、メンブレインを2 x SSC、0.1% SDS溶液で室温で二回洗浄した。シグナルの検出には、X-OMAT (コダック社製)フィルムを用いた。その結果、図２に示すように当該遺伝子は、３週間培養し接触阻害を呈しているラットアストロサイト初代培養細胞にて発現上昇していた。
以上から、図１を含む遺伝子が、３週間培養し接触阻害を呈しているラットアストロサイト初代培養細胞にて発現上昇している遺伝子であることが示された。
【００６１】
実施例２：断片−１を含むｃＤＮＡ断片のクローニング
断片−１を含むｃＤＮＡ断片のクローニングを以下の方法により行った。
上記ｃＤＮＡ断片は該ｍＲＮＡの３’端の一部の領域しか含んでいなかった。そこで本発明者らは当該領域（以下３’断片）の塩基情報を元にして ｃＤＮＡ断片の既知の塩基配列より５’側オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド２）、３’側オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド３）をＤＮＡ合成機（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製３８０Ｂ）で合成した。
オリゴヌクレオチド２:ATGCAGCTCAGAGACTCC （配列番号４）
オリゴヌクレオチド３:GAAATCAGCCATAGTCTTAGA （配列番号５）
【００６２】
これらのオリゴヌクレオチドを用い、Invitrogen社の5'RACEシステムおよび3'RACEシステムのプロトコールに従いRACE法の常法により、その5'側および3'側の塩基配列を明らかにした。システムにより与えられるSuperScript II Reverse Transcriptaseのtemplateには、ラット胎仔大脳皮質より初代培養されたアストロサイトからInvitrogen社のTRIzol reagentを用いて調製されたtotal RNAを用いた。さらに、5'RACEによっても明らかでないcDNAの5'末端塩基配列を解析するため、既知の塩基配列よりオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド４）をＤＮＡ合成機（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製３８０Ｂ）で合成した。
オリゴヌクレオチド４:CAAGGTGTGCTGTGACTGGAT （配列番号６）
【００６３】
このオリゴヌクレオチドを用い、Invitrogen社のGeneRacerキットを用い、oligo capping法の常法に従って5'末端塩基配列を明らかにした。キットにより与えられるcalf intestinal phosphatase、tobacco acid pyrophosphatase、T4 RNA ligaseおよびSuperScript II Reverse Transcriptaseのtemplateには、ラット胎仔大脳皮質より初代培養されたアストロサイトからInvitrogen社のTRIzol reagentを用いて調製されたtotal RNAを用いた。
【００６４】
当該ｃＤＮＡは、522残基より成る蛋白質（KOHJIRIN）をコードするＯＲＦを含んでいる。該蛋白質の開始コドンであるメチオニン残基の上流域に同じｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅで終止コドンが出現していた、また当該ｃＤＮＡ断片がコードする蛋白質のアミノ酸配列は、配列表の配列番号1に示したものが唯一のものであった。KOHJIRINの一次構造上の特徴を図３、 図４及び図５に示す。なお疎水性領域等の予測はアミノ酸構造解析ソフトＳＯＳＵＩ（美宅 成樹 ：蛋白質核酸酵素、１９９７年、ＶＯＬ４２、ｐ３０２０−３０２５）を用いた。KOHJIRINはＮ末端アミノ酸部分に蛋白質分泌シグナル配列を有している。また、遺伝子kohjirinのＯＲＦを含むｃＤＮＡの塩基配列を配列表の配列番号1に示す。
【００６５】
実施例３：ラット脳におけるkohjirin ｍＲＮＡの同定法
ラット脳より常法にて、total RNAを抽出し、オリゴdTをプライマーとしてcDNAを合成した。kohjirin cDNAに含まれる配列を有するオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド５）と逆相補鎖と配列を有するオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド６）のそれぞれを、ＤＮＡ合成機（ＡＢＩ社製３８０Ｂ）で合成した。
オリゴヌクレオチド５: TAGGACTTTGTGGTACAGCTC （配列番号７）
オリゴヌクレオチド６: TTACAACCTGCCTCAAAGGCT （配列番号８）
【００６６】
オリゴヌクレオチド５とオリゴヌクレオチド６をプライマーとして、タカラＬＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２とＰＣＲサーマルサイクラーＭＰ（いずれも宝酒造製）を用いて以下のＰＣＲ操作を行った。
cDNA （2μl(40ng)）、10×PCRバッファー(25mM Mg++を含む) （1.5μl）、2.5mM dNTP（2.4μl）、10μM オリゴヌクレオチド５（0.4μl）、10μMオリゴヌクレオチド６（0.4μl）、水 （8.15μl）、LA Taqポリメラーセ（0.15μl）、総量 15 μl。
【００６７】
ＰＣＲサイクルは、９５℃で５分保持後、９５℃で３５秒反応させ、５７℃で３５秒保持し、更に７２℃で１分間保持を３３回繰り返して行った。
反応後のＰＣＲ反応液を、１％アガロースゲル電気泳動で分画した。ゲルをエチジウムブロマイドで染色した後、紫外光照射して増幅される約480ｂｐのバンドを検出した。胎生14日、生後1日、生後14日のラット脳に於ける結果を図６に示す。
上記方法でKOHJIRINのｍＲＮＡの発現を定量することが可能であり、 KOHJIRINｍＲＮＡ発現を調節する物質をスクリーニングすることができる。
【００６８】
実施例４：KOHJIRIN局在性を確認する方法
（１） ＯＲＦを含むｃＤＮＡの塩基配列（配列表の配列番号２）を有する遺伝子kohjirinのcoding regionを含むプラスミド（pGEM-kohjirin）を下記の反応条件で1時間制限酵素処理を行った。EcoRI (15U/μl)（1μl）、buffer （500mM Tris-HCl(pH8.5), 100mM MgCl2, 10mM Dithiothreitol, 1M NaCl）（2μl）、プラスミド (2μｇ/μl)（1μl）、 水（16μl）、総量 20μl。
１％アガロースゲル電気泳動で分画し、目的の約１．６ｋｂのＰＣＲ産物を切り出し、ｇｅｎｅｃｌｅａｎ ｋｉｔ（フナコシ）にて精製した。精製した産物を更に、下記の反応条件で３７℃で２０分間、続いて５０℃で２０分間処理を行った。Calf intestinal phosphatase (15U/μl)（1μl）、buffer（ 2μl）、 上記産物 (1μｇ/μl)（1μl）、水（16μl）、総量 20μl。
【００６９】
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（クロンテック社製）についても同様にEcoRIで1時間制限酵素処理を行った。Ｔａｋａｒａ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造）を用いて、制限酵素処理したｃＤＮＡ断片をｐＥＧＦＰ−Ｎ１（クロンテック社製）に挿入し、常法に従い組み換え体を単離し、配列表の配列番号２に示した配列のＤＮＡを正確に含むｐKOHJIRIN−ＥＧＦＰプラスミドを得た。
【００７０】
（２） HEK細胞への導入１０％非働化ウシ胎児血清（大日本製薬）、抗生物質を含むＤ−ＭＥＭ培地（ライフテック社製）を基本培地としてＣＯＳ−７細胞を培養した。ＣＯＳ−７細胞を直径３５ｍｍの培養皿にあらかじめ１０5個播種した。１０μｌのLIPOFECTAMINE遺伝子導入試薬（in vitrogen社）と２μｇのｐKOHJIRIN−ＥＧＦＰプラスミドを予め３０分間混合した溶液を含む基礎培地で２時間培養し、遺伝子導入を行った。遺伝子導入後２４時間後に蛍光顕微鏡にて細胞を観察した。
【００７１】
図７に示す通り、KOHJIRIN−ＥＧＦＰ蛋白質は、主に核近傍の細胞質に存在することが認められた。このことはKOHJIRIN蛋白質が細胞内で合成され分泌される蛋白であることを示している。さらに、ｐKOHJIRIN−ＥＧＦＰプラスミドを同様の方法で様々な培養細胞株等に導入し、同時に化合物を添加させることで、蛋白発現量は変化させず、局在性を変化させる化合物をスクリーニングすることが可能となる。
【００７２】
【発明の効果】
本発明の蛋白質（代表例としてはKOHJIRIN）は、中枢神経系に発現し神経細胞の分化を抑制する骨形成蛋白を阻害する作用を有していると考えられることから、遺伝子kohjirinの発現異常、あるいは蛋白質KOHJIRINの機能不全は、脳の高次機能を維持する上で重大な障害となると推測される。
【００７３】
従って、本発明の蛋白質それ自体は虚血性脳障害・外傷性脳障害、あるいはアルツハイマー病、パーキンソン病などの神経変性疾患の治療薬として有用と考えられる。また、当該蛋白質の機能と同様の機能を有する物質、当該機能を促進する物質、あるいはまた当該遺伝子の発現を促進する物質等の創出に利用することができる。
【００７４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、３週間培養し接触阻害を呈しているラットアストロサイト初代培養細胞にて発現上昇しているDNA断片である断片１の塩基配列を示す。
【図２】図２は、ラットアストロサイト初代培養細胞におけるkohjirin mRNAのノーザンハイブリダイゼーション法による同定と、３週間培養し接触阻害を呈しているラットアストロサイト初代培養細胞にて発現が上昇していることを示す。
【図３】図３は、KOHJIRIN蛋白のアミノ酸配列を示す。波下線はシグナルペプチドを示し、実下線はシステインの豊富な領域を示す。
【図４】図４は、KOHJIRIN蛋白の三つのシステインの豊富な領域（Kjr-CR1, Kjr-CR2, Kjr-CR3）のアミノ酸配列を、既に骨形成因子に結合することが明らかとなっているCHORDIN蛋白質のシステインの豊富な領域（Chd-CR1, Chd-CR3）のアミノ酸配列と比較した結果を示す。骨形成因子との結合に重要なWHP配列がKjr-CR1と Kjr-CR3に存在することを示す。
【図５】図５は、蛋白質KOHJIRIN の構造上の特徴を示す。
【図６】図６は、ラット脳における、kohjirin mRNAのRT-PCR法による同定を示す。
【図７】図７はCOS-7細胞におけるKOHJIRIN-EGFP融合蛋白質の局在性を示す。
Claims (8)
- 以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかに記載の蛋白質。
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ骨形成蛋白結合領域を有する蛋白質；又は
（ｃ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ骨形成蛋白結合領域を有する蛋白質： - 請求項１に記載の蛋白質をコードする遺伝子。
- 以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかに記載の遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなる遺伝子；
（ｂ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなり、かつ骨形成蛋白結合領域を有する蛋白質をコードする遺伝子；又は
（ｃ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつ骨形成蛋白結合領域を有する蛋白質をコードする遺伝子： - 請求項２又は３に記載の遺伝子を含有する、組み換えベクター。
- 請求項４に記載の組み換えベクターを有する、形質転換体。
- 請求項５に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物から請求項１に記載の蛋白質を採取することを含む、請求項１に記載の蛋白質の製造方法。
- 請求項１に記載の蛋白質を発現する発現系を用いて被験物質の存在下において該蛋白質を発現させ、産生される該蛋白質又はそれをコードするｍＲＮＡを検出又は測定することを含む、請求項１に記載の蛋白質の発現を調節する物質をスクリーニングする方法。
- 請求項１に記載の蛋白質を発現する発現系を用いて被験物質の存在下において該蛋白質を発現させ、産生される蛋白質の局在性を測定することを含む、請求項１に記載の蛋白質の局在性を変化させる物質をスクリーニングする方法。
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