CN104498451A

CN104498451A - 兼具核酸外切和单链dna交换活性的重组酶及其应用

Info

Publication number: CN104498451A
Application number: CN201510004317.7A
Authority: CN
Inventors: 刁文一; 孙德斌; 杨平
Original assignee: SUZHOU SYNBIO TECH Co Ltd
Current assignee: SUZHOU SYNBIO TECH Co Ltd
Priority date: 2015-01-06
Filing date: 2015-01-06
Publication date: 2015-04-08

Abstract

本发明公开了一种新型的兼具核酸外切和单链DNA交换活性的通过人工合成的重组酶，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，以及其所组成的组合物和试剂盒。本发明还公开了其在克隆外源基因至载体靶位点中的应用，采用该新型重组酶所进行的将外源基因克隆至载体靶位点的方法，准确率更高,更为简单方便,更为快速,稳定性更好,且多片段链接一步成功率更高。

Description

兼具核酸外切和单链DNA交换活性的重组酶及其应用

技术领域

本发明属于分子克隆技术领域，具体涉及一种新型的兼具核酸外切和单链DNA交换活性的通过人工合成的重组酶及其应用。

背景技术

DNA克隆和亚克隆以当今生物技术产业和分子生物学为基础，如今市场上将若干个DNA片段连接起来以及将目的片段克隆到目标载体靶位点的需求一直持续不断，传统的将外源基因导入载体靶位点中的方法通常包括以下几个步骤：(1)首先要用一种或多种限制性内切酶将载体进行酶切，将载体线性化；(2)用碱性磷酸酶处理线性载体防止连接过程中载体的重新环化；(3)利用引物进行外源DNA的PCR扩增反应；(4)利用同样的限制性外切酶处理扩增后的外源DNA产物并纯化；(5)将载体与外源DNA连接；(6)将连接产物转化到受体细胞中，比如大肠杆菌，并筛选出包含目的DNA片段的重组子。传统的克隆方法繁琐费时，克隆效率相对较低，并且受限于载体和外源基因上的的限制性酶切位点。

近来基于重组的克隆方法已经大大加快了克隆的速度，Pentao Liu等（2003）阐述了一种不依靠限制性内切酶和连接酶，只利用E.coli噬菌体同源重组来获得基因敲除产物的重组方法，该方法利用噬菌体红蛋白及重组酶Cre、Flpe通过空缺修复把来自于BAC人工染色体中的DNA导入高拷贝的质粒中，进而将LoxP,FRT位点融合到亚克隆DNA中，此方法中的同源区域长度超过45-55bp。和其他重组方法类似，这一方法依靠于宿主细胞中特异性表达的噬菌体蛋白与载体之间的特异序列区域，因此受限于特殊的载体和宿主细胞。

另一个基于重组克隆的例子是由Clonetech Laboratories开发的In-Fusion^TM PCR试剂盒，该试剂盒可以在无任何限制性内切酶和连接酶的情况下，将任意片段导入任意线性载体中，此款In-Fusion^TM 系列通过将引物末端加上15bp的与线性载体末端同源的碱基，进而把PCR产物的末端插入到线性载体的同源序列中。这种方法首先要对线性载体、PCR产物以及酶的混合物进行30分钟孵育，再转化到大肠杆菌中。此方法中的In-Fusion酶可以将双链DNA产物转变成单链，并融合到线性载体的同源序列中。此种方法不受宿主细胞与载体限制，即可实现PCR产物的快速克隆，但是由于In-Fusion酶的专有性，因此制约了In-Fusion^TM PCR试剂盒以及Clonetech公司生产的其他类似试剂盒的使用。

而最新的案列是GenScript公司所开发的CloneEZ^TM 试剂盒,基于之前的专利，此方法是利用一种含有核酸外切酶和单链DNA结合蛋白的酶复合物来实现的同源重组方法。但酶混合物的选用，依然无法克服克隆效率和稳定性的问题。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种兼具核酸外切和单链DNA交换活性的新型重组酶，以及其在克隆外源基因至载体靶位点中的应用，采用该新型重组酶将外源基因克隆至载体靶位点的方法，本方法准确率更高,更为简单，使用方便,更为快速,且具有更高的克隆效率和稳定性。

本发明所提供的兼具核酸外切和单链DNA交换活性的新型重组酶，其特征在于,具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种所述重组酶形成的用于克隆外源基因至载体靶位点的组合物。

所述组合物包含所述酶，以及反应缓冲液，所述反应缓冲液配比为：

50-500mM Tris-HCl,pH7.5

10-50mM MgCl₂

50-200mM KCl

10-100mM (NH₄)₂SO₄

0.01-0.2% BSA。

本发明还提供了所述的组合物在克隆外源基因至载体靶位点中的应用，其特征在于，具体包括如下步骤：

1）延长外源DNA：将外源DNA的两条引物5’端和3’端分别加上与线性载体末端序列一致的，且核苷酸长度≥12bp的碱基序列；

2）将所述的组合物、线性载体、外源DNA混合形成反应体系；

3）孵育反应体系以获得中间产物；

4）将中间产物进行细胞转化，从而获得转化细胞；

5）培养该转化细胞，获得包含外源DNA的重组DNA分子。

步骤1）所述的延长外源DNA通过聚合酶链式反应（PCR）来制备。

步骤3）所述的孵育温度为22-25℃，时间20-40分钟。

步骤4）所述的转化细胞为Top10大肠杆菌感受态细胞。

步骤4)和5)中的转化和培养条件具体如下:

a.5μl加入至50μl Top10 大肠杆菌感受态细胞中，冰上放置20分钟；

b.42℃加热90秒钟后，再在冰上放置5分钟；

c.加入945μl带有 Amp抗性的LB培养基，37℃振荡培养40分钟；

d.以5000rpm的速度离心3分钟,倒掉上清液,取20μl铺板,得到含有外

源DNA的单克隆抗体。

本发明还提供了一种用于克隆外源基因至载体靶位点的试剂盒，所述试

剂盒包含：组成成分以及使用这些组合成分的说明书；所述的组成成分包括：

1）线性载体；

2）延长了的外源DNA：外源DNA的两条引物5’端和3’端分别加上与线性载体末端序列一致的，且核苷酸长度≥12bp的碱基序列；

3）所述的新型重组酶；

4）所述的反应缓冲液。

本发明所述的新型重组酶以及其在克隆外源基因至载体靶位点中的应用，相比于现有技术，具有如下优势：

1. 准确率高 (阳性克隆>95%)；

2. 简单(一种重组酶，一种反应体系)；

3. 快速 (20-40分钟)；

4. 使用方便 (常温使用,22-25℃)；

5. 稳定性高；

6. 多片段连接一步成功率高。

附图说明

图1 为本发明所述的重组酶的制备方法流程图；

图2 为本发明所述的组合物在克隆外源基因至载体靶位点中的流程图。

具体实施方式

如无特别说明，本文中的所有技术和科学术语均按本发明所涉及的行业普通技术人员普遍理解的正常含义，否则请参考标注，所有已发表的专利和引用的出版物已经在文中详尽展示；特别指出的是，本文中的所用的“一”和“这一”如无特别说明，也包括其复数含义。

文中的“序列”代表着聚合物中单体的排列顺序，比如氨基酸残基在多肽中的排列或者核苷酸在多核甘酸序列中的排列顺序，此处所说的“核苷酸序列”“核酸”或者“多核苷酸”指的是单链或者双链中的脱氧核糖核苷酸，核酸序列是由自然的核苷酸A,T,C,G,U或者其他合成的自然碱基的类似物组成，本发明中，腺嘌呤缩写为A,鸟嘌呤缩写为G,胞嘧啶缩写为C,胸腺嘧啶缩写为T,尿嘧啶缩写为U。多核酸序列可以是单链或者双链，若无特别说明，多核苷酸也包括了较长的核苷酸或较短的核苷酸，比如寡核苷酸。

文中采用传统的标记方法来描述多核苷酸序列，单链和左端为5’端，双链的左端为正链5’端，从5’到3’的方向代表着转录起始的方向，与mRNA具有相同序列信息的链也被称作编码链，靠近编码链的5’序列被称为上游序列，而在靠近3’端的称为下游序列。

本文的“互补序列”是指与核酸序列的碱基100%互补配对的序列，而序列“一致性”是指两条或两条以上的多肽或核苷酸序列，通过相互比较得出的相似度。“一致性”是在进行序列比对分析时，相同氨基酸残基或者核苷酸所占的比例大小。这可以通过手工或比对程序来完成，在进行序列比对时，一条链将作为参考链，而查询链将会与之做出比对。在使用比对程序时，如果需要也会设计其他辅助序列，比对软件中的一些参数已经设计好。关于一些比较理想的比对软件可参考相关文献，比如对于同源性软件在Needleman & Wunsch, .1. Mol. Biol. 48:443(1970), Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981) or Pearson & Lipman, Proc. Nat ’l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)中都有所描述，通过计算机来操作这些程序（GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.),或者肉眼鉴定。BLAST算法也是适合做序列间的一致性和相似程度的一个程序，在Altschul et al, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)曾报道，而且进行BLAST比对的软件在NCBI网站上为在线公开使用。

本文中的“重组”代表着由被分析生物学修饰过的单核苷酸或者细胞、病毒、微生物所编码的多核苷酸、多肽。

实施例1 兼具核酸外切和单链DNA交换活性的重组酶的制备方法

本实施例中所述的重组酶通过基因合成的方法制备,是一种人工合成的具有重组功能的酶,此重组酶兼具核酸外切和单链DNA交换活性,具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

如图1所示，本发明所述的兼具核酸外切和单链DNA交换活性的重组酶的制备方法具体为：

1. 合成编码本重组酶的DNA序列以及和载体酶切位点相对应的碱基序列；

2. 用NcoI和XhoI酶切,酶切反应体系和反应条件为

酶切后的DNA片段 2μl

NcoI 2μl

XhoI 2μl

10×酶反应缓冲液 5μl

ddH2O 39μl

总体积 50μl

3. 酶切载体pET-15b,酶切反应体系和反应条件与上一步相同；

4. 酶切片段用T4 DNA连接酶连接, 反应中DNA片段和质粒载体的摩尔比为2:1.反应体系和反应条件为：

酶切后的DNA片段 3μl

酶切后的线性载体 1μl

T4 DNA 连接酶 1μl

5×T4 DNA连接酶缓冲液 2μl

ddH2O 3μl

总体积 10μl

在22℃，反应60分钟；

5. 转化入Top10大肠杆菌感受态细胞在37℃，摇床40分钟表达；

6. 转化后的大肠杆菌表达以后，纯化得到重组酶。

实施例2 组合物

实施例1所述的重组酶形成的用于克隆外源基因至载体靶位点的组合物，包括实例1所述的酶，以及反应缓冲液，所述反应缓冲液配比为：

50-500mM Tris-HCl,pH 7.5

10-50mM MgCl₂

50-200mM KCl

10-100mM (NH₄)₂SO₄

0.01-0.2% BSA。

实施例3 实施例2所述的组合物在克隆外源基因至载体靶位点中的应用

如图2所示，具体包括如下步骤：

1）延长外源DNA通过聚合酶链式反应（PCR）来制备：将外源DNA的两条引物5’端和3’端分别加上与线性载体末端序列一致的，且核苷酸长度≥12bp的碱基序列；所使用的线性载体为pUC19载体；

2）将所述的组合物、线性载体、外源DNA混合形成反应体系，反应中DNA片段和质粒载体的摩尔比为2:1.具体反应体系如下：

pUC19 1μl

DNA片段 1μl

重组酶 1μl

10×酶缓冲液 2μl

ddH ₂ O 15μl

总体积 20μl；

3）孵育反应体系以获得中间产物，孵育温度为25℃，时间30分钟；

4）将中间产物进行细胞转化，从而获得转化细胞；

5）培养该转化细胞，获得包含外源DNA的重组DNA分子

其中：步骤4)和5)中的转化和培养条件具体如下:

b.42℃加热90秒后，再在冰上放置5分钟；

c.加入945μl带有 Amp抗性的LB培养基，37℃振荡培养40分钟；

源DNA的单克隆抗体。

步骤1用PCR扩增获得不同长度的外源DNA片段,本实验中获得的片段长

度分别为1kb, 2kb, 4kb和8kb,通过上述应用所获得克隆结果如表1所示:

表1 不同片段大小的外源DNA的克隆活性

片段大小	1Kb	2Kb	4Kb	8Kb
					活性(阳性克隆)	>95%	>90%	>80%	>25%

由表1可得，对于小片段(1kb和2kb),本重组酶可以获得超过90%的阳性克隆率;对于4k的外源DNA片段,本重组酶可以获得超过80%的阳性克隆率；对于较为困难的大片段外源DNA克隆, 本重组酶也可以获得超过25%的阳性克隆。本重组酶对于不同大小外源DNA的阳性克隆率均优于目前市场上的同类型产品。

实施例4 试剂盒

所述试剂盒包含:组成成分以及使用这些组合成分的说明书;所述的组成成分包括:

1）线性载体；

3）实施例1所述的重组酶；

4）实施例2所述的反应缓冲液。

实施例4所述的试剂盒不同条件的应用实例及数据

1.稳定性检测

实施例4所述的试剂盒放置在不同温度下30天后,检测其中实施例1所述重组酶把1kb外源DNA片段克隆入载体所获得的阳性克隆结果。反应中DNA片段和质粒载体的摩尔比为2:1.用于本实验的反应体系和反应条件如下:

pUC19 1μl

1kb DNA片段 1μl

重组酶 1μl

10×酶缓冲液 2μl

ddH ₂ O 15μl

总体积 20μl

在22-25℃下温育20-40分钟,得到的阳性克隆比例见表2:

表2 不同温度下30天重组酶稳定性检测

温度	-20°C	4°C	25°C	37°C
					活性(阳性克隆)	>95%	>95%	>80%	>30%

本专利申请的重组酶非常稳定,把1kb的外源DNA片段克隆入pUC19载体,重组酶在4℃保存30天后,仍然可以得到95%的阳性克隆.在25℃放置30天后,阳性克隆率不低于80%.在37℃放置30天后,依然可以得到30%的阳性克隆。本专利所申请的新型重组酶在稳定性上显著优于目前市面上的同类型产品。

2. 多片段连接效率检测

不同片段重组的反应条件相同,均为在22-25℃下温育20-40分钟.不同片段反应中DNA片段和质粒载体的摩尔比均为2:1.不同片段的反应体系如下：

单片段反应体系:

pUC19 1μl

DNA片段,1kb 1μl

重组酶 1μl

10×酶缓冲液 2μl

ddH ₂ O 15μl

总体积 20μl

两个片段反应体系:

pUC19 1μl

DNA片段1,1kb 1μl

DNA片段2,1kb 1μl

重组酶 1μl

10×酶缓冲液 2μl

ddH ₂ O 14μl

总体积 20μl

三个片段反应体系:

pUC19 1μl

DNA片段1,1kb 1μl

DNA片段2,1kb 1μl

DNA片段3,1kb 1μl

重组酶 1μl

10×酶缓冲液 2μl

ddH ₂ O 13μl

总体积 20μl

四个片段反应体系:

pUC19 1μl

DNA片段1,1kb 1μl

DNA片段2,1kb 1μl

DNA片段3,1kb 1μl

DNA片段4,1kb 1μl

重组酶 1μl

10×酶缓冲液 2μl

ddH ₂ O 12μl

总体积 20μl

实施例1所述重组酶对不同片段数的重组效率总结如表3所示:

表3 不同片段数重组效率的结果

片段数	1	2	3	4
					活性(阳性克隆)	>95%	>90%	>80%	>60%

本专利申请的重组酶非常稳定,把不同数目的外源DNA片段(均为1kb)克隆入pUC19载体,单个片段的重组效率在95%以上,两个片段的重组效率在90%以上, 3个片段的重组效率在80%以上,4个片段的重组效率在60%以上.本专利所申请的新型重组酶在重组效率上显著优于目前市面上的同类型产品。

<110> 苏州泓迅生物科技有限公司

<120> 兼具核酸外切和单链DNA交换活性的重组酶及其应用

<130> 2015

<170> PatentIn version 3.3

<210>1

<211> 2004

<212> DNA

<213>大肠杆菌

<400> 1

atggcgatcg atgaaaacaa acagaaagca ctggcagcag cgctgggaca aattgaaaaa 60

cagtttggta aaggcagcat tatgcgtctg ggcgaagacc gctcaatgga tgtcgaaacc 120

attagcacgg gctccctgtc tctggacatt gcactgggtg caggtgggct gccgatgggc 180

cgcattgttg aaatttatgg cccggaaagc tcggggaaaa caaccctgac actgcaggtt 240

attgcggcag cacagcgtga aggcaaaacg tgtgctttca ttgatgcaga acatgcgctg 300

gacccgatct atgctcgcaa gctgggagtg gacattgata atctgctgtg ttcgcaaccg 360

gacaccggtg agcaggccct ggaaatctgt gatgcgctgg cgcgtagcgg cgctgtggat 420

gtgattgtag tggattcagt tgcagccctg accccgaagg ccgaaattga aggtgaaatc 480

ggggactccc acatggggct ggcggctcgc atgatgtctc aggccatgcg taaactggcg 540

ggtaatctga aacagagcaa cacgctgctg atctttatca atcagattcg catgaaaatc 600

ggtgtgatgt tcggcaaccc ggagacaacg accggcggta acgcgctgaa attttatgcc 660

tccgtgcgcc tggatatccg ccgtatcggt gcggtgaaag aaggggaaaa cgtggtaggc 720

agtgaaacac gtgtgaaagt ggtaaaaaac aagattgcgg ccccttttaa acaggcggag 780

ttccagattc tgtacggtga aggcattaac ttctatggtg aactggtgga cctgggtgta 840

aaggaaaagc tgattgaaaa agccggcgct tggtattcgt ataaaggcga gaaaattggc 900

cagggtaaag caaatgcgac tgcgtggctg aaagataacc cggaaaccgc caaagaaatt 960

gagaaaaaag tacgcgagct gctgctgtcc aacccgaact ctaccccgga tttcagtgta 1020

gatgatagtg aaggtgtcgc cgaaaccaat gaggattttg gtggaggcgg ttcaggcgga 1080

ggtggctctg gcggtggcgg atcgatggcg ctgctggatc tgaaacagtt ctatgaactg 1140

cgtgaagatt gtgatgataa aggtatcctg gtgatggatg gtgattggct ggtgttccag 1200

gccatgagcg cggcggaatt tgatgtgagc tgggaagaag aaatttggca tcgctgctgt 1260

gatcatgcga aagcgcgcca gattctggaa gatagcatta aaagctatga aacccgtaaa 1320

aaagcctggg cgggtgcgcc gattgtgctg gcgtttaccg atagcgtgaa ttggcgtaaa 1380

gaactggttg atccgaacta taaaaccaac cgcaaagcgg tgaaaaaacc ggtgggctat 1440

tttgaatttc tggatgcgct gtttgaacgc gaagaatttt attgcattcg tgaaccgatg 1500

ctggaaggcg atgatgtgat gggcgtgatt gcgagcaacc cgagcgcgtt tggtgcgcgt 1560

aaagcggtga ttatcagctg tgataaagat tttaaaacca ttccgaattg cgattttctg 1620

tggtgtacca ccggcaatat cctgacccag accgaagaaa gcgccgattg gtggcacctg 1680

tttcagacca ttaaaggcga tattaccgat ggctatagcg gcattgccgg ctggggcgat 1740

accgcggaag attttctgaa caatccgttt atcaccgaac cgaaaacctt tgtgctgaaa 1800

agcggtaaaa acaaaggcca ggaagtgacc aaatgggtta aacgtgatcc ggaaccgcat 1860

gaaaccctgt gggattgcat taaaagcatt ggcgccaaag ttggcatgac cgaagaagat 1920

attatcaaac agggccagat ggcgcgtatc ctgcgcttca acgaatataa ctttatcgat 1980

aaagaaattt atctgtggcg tccg 2004

<210>2

<211> 668

<212> PRT

<213>大肠杆菌

<400> 2

Met Ala Ile Asp Glu Asn Lys Gln Lys Ala Ala Ala Ala Leu Gly Gln Ile Glu Lys Gln Phe Gly Lys Gly Ser Ile Met

1 5 10 15 20 25

Arg Leu Gly Glu Asp Arg Ser Met Asp Val Glu Thr Ile Ser Thr Gly Ser Leu Ser Leu Asp Ile Ala Leu Gly Ala Gly

30 35 40 45 50

Gly Leu Pro Met Gly Arg Ile Val Glu Ile Tyr Gly Pro Glu Ser Ser Gly Lys Thr Thr Leu Thr Leu Gln Val Ile Ala Ala

55 60 65 70 75 80

Ala Gln Arg Glu Gly Lys Thr Cys Ala Phe Ile Asp Ala Glu His Ala Leu Asp Pro Ile Tyr Ala Arg Lys Leu Gly Val

85 90 95 100 105

Asp Ile Asp Asn Leu Leu Cys Ser Gln Pro Asp Thr Gly Glu Gln Ala Leu Glu Ile Cys Asp Ala Leu Ala Arg Ser Gly

110 115 120 125 130 135

Ala Val Asp Val Ile Val Val Asp Ser Val Ala Ala Leu Thr Pro Lys Ala Glu Ile Glu Gly Glu Ile Gly Asp Ser His Met

140 145 150 155 160

Gly Leu Ala Ala Arg Met Met Ser Gln Ala Met Arg Lys Leu Ala Gly Asn Leu Lys Gln Ser Asn Thr Leu Leu Ile

165 170 175 180 185 190

Phe Ile Asn Gln Ile Arg Met Lys Ile Gly Val Met Phe Gly Asn Pro Glu Thr Thr Thr Gly Gly Asn Ala Leu Lys Phe

195 200 205 210 215

Tyr Ala Ser Val Arg Leu Asp Ile Arg Arg Ile Gly Ala Val Lys Glu Gly Glu Asn Val Val Gly Ser Glu Thr Arg Val

220 225 230 235 240

Lys Val Val Lys Asn Lys Ile Ala Ala Pro Phe Lys Gln Ala Glu Phe Gln Ile Leu Tyr Gly Glu Gly Ile Asn Phe Tyr

245 250 255 260 265 270

Gly Glu Leu Val Asp Leu Gly Val Lys Glu Lys Leu Ile Glu Lys Ala Gly Ala Trp Tyr Ser Tyr Lys Gly Glu Lys Ile

275 280 285 290 295

Gly Gln Gly Lys Ala Asn Ala Thr Ala Trp Leu Lys Asp Asn Pro Glu Thr Ala Lys Glu Ile Glu Lys Lys Val Arg Glu

300 305 310 315 320 325

Leu Leu Leu Ser Asn Pro Asn Ser Thr Pro Asp Phe Ser Val Asp Asp Ser Glu Gly Val Ala Glu Thr Asn Glu Asp Phe

330 335 340 345 350

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala Leu Leu Asp Leu Lys Gln Phe Tyr Glu

355 360 365 370 375

Leu Arg Glu Asp Cys Asp Asp Lys Gly Ile Leu Val Met Asp Gly Asp Trp Leu Val Phe Gln Ala Met Ser Ala Ala

380 385 390 395 400

Glu Phe Asp Val Ser Trp Glu Glu Glu Ile Trp His Arg Cys Cys Asp His Ala Lys Ala Arg Gln Ile Leu Glu Asp Ser

405 410 415 420 425 430

Ile Lys Ser Tyr Glu Thr Arg Lys Lys Ala Trp Ala Gly Ala Pro Ile Val Leu Ala Phe Thr Asp Ser Val Asn Trp Arg Lys

435 440 445 450 455

Glu Leu Val Asp Pro Asn Tyr Lys Thr Asn Arg Lys Ala Val Lys Lys Pro Val Gly Tyr Phe Glu Phe Leu Asp Ala Leu

460 465 470 475 480 485

Phe Glu Arg Glu Glu Phe Tyr Cys Ile Arg Glu Pro Met Leu Glu Gly Asp Asp Val Met Gly Val Ile Ala Ser Asn Pro

490 495 500 505 510

Ser Ala Phe Gly Ala Arg Lys Ala Val Ile Ile Ser Cys Asp Lys Asp Phe Lys Thr Ile Pro Asn Cys Asp Phe Leu Trp

515 520 525 530 535 540

Cys Thr Thr Gly Asn Ile Leu Thr Gln Thr Glu Glu Ser Ala Asp Trp Trp His Leu Phe Gln Thr Ile Lys Gly Asp Ile

545 550 555 560 565

Thr Asp Gly Tyr Ser Gly Ile Ala Gly Trp Gly Asp Thr Ala Glu Asp Phe Leu Asn Asn Pro Phe Ile Thr Glu Pro Lys

570 575 580 585 590

Thr Phe Val Leu Lys Ser Gly Lys Asn Lys Gly Gln Glu Val Thr Lys Trp Val Lys Arg Asp Pro Glu Pro His Glu Thr

595 600 605 610 615 620

Leu Trp Asp Cys Ile Lys Ser Ile Gly Ala Lys Val Gly Met Thr Glu Glu Asp Ile Ile Lys Gln Gly Gln Met Ala Arg Ile

625 630 635 640 645

Leu Arg Phe Asn Glu Tyr Asn Phe Ile Asp Lys Glu Ile Tyr Leu Trp Arg Pro

650 655 660 665

Claims

1.兼具核酸外切和单链DNA交换活性的重组酶，其特征在于，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

2.权利要求1所述的重组酶形成的用于克隆外源基因至载体靶位点的组合物。

3.权利要求2所述的组合物，其特征在于，包含所述重组酶，以及反应缓冲液，所述反缓冲液配比为：

50-500mM Tris-HCl,pH7.5

10-50mM MgCl₂

50-200mM KCl

10-100mM (NH₄)₂SO₄

0.01-0.2% BSA。

4.权利要求2或3所述的组合物在克隆外源基因至载体靶位点中的应用,其特征在于,具体包括如下步骤：

1)延长外源DNA：将外源DNA的两条引物5’端和3’端分别加上与线性载体末端序列一致的，且核苷酸长度≥12bp的碱基序列；

2)将所述的组合物、线性载体、外源DNA混合形成反应体系；

3)孵育反应体系以获得中间产物；

4)将中间产物进行细胞转化,获得转化细胞；

5)培养该转化细胞,获得包含外源DNA的重组DNA分子。

5.权利要求4所述的应用,其特征在于,步骤1）所述的延长外源DNA通过聚合酶链式反应(PCR)来制备。

6.权利要求4所述的应用,其特征在于,步骤3）所述的孵育温度为22-25℃，时间20-40分钟。

7.权利要求4所述的应用,其特征在于,步骤4）所述的转化细胞为Top10 大肠杆菌感受态细胞。

8.权利要求4所述的应用,其特征在于,步骤4)和5)中的转化和培养条件具体如下:

b.42℃加热90秒钟后，再在冰上放置5分钟；

c.加入945μl带有 Amp抗性的LB培养基，37℃振荡培养40分钟;

d.以5000rpm的速度离心3分钟,倒掉上清液,取20μl铺板,得到含有外源DNA的单克隆抗体。

9.一种用于克隆外源基因至载体靶位点的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含：组成成分以及使用这些组合成分的说明书；所述的组成成分包括：

1）线性载体；

2）延长了的外源DNA：外源DNA的两条引物5’端和3’端分别加上与线性载体末端序列一致的,且核苷酸长度≥12bp的碱基序列；

3）权利要求1所述的重组酶；

4）权利要求2所述的反应缓冲液。

10.权利要求9所述的试剂盒在克隆外源基因至载体靶位点中的应用。