KR20010012165A

KR20010012165A - 융합 단백질을 사용하여 아미드화 펩티드를 생성하는 방법

Info

Publication number: KR20010012165A
Application number: KR19997010114A
Authority: KR
Inventors: 코팅함얀로버트
Original assignee: 피피엘 테라퓨틱스 (스코틀랜드) 리미티드
Priority date: 1997-05-01
Filing date: 1998-05-01
Publication date: 2001-02-15
Also published as: CN1254379A; AU7224498A; CA2287204A1; WO1998050563A1; JP2001525664A; GB9708918D0; EP0979291A1; NZ500507A

Abstract

본 발명은 재조합 방법에 의한 펩티드, 특히 아미드화와 같이 카르복시 말단을 변형시킨 펩티드에 관한 것이다.

Description

융합 단백질을 사용하여 아미드화 펩티드를 생성하는 방법{METHODS OF PRODUCTION OF AN AMIDATED PEPTIDE THROUGH THE USE OF A FUSION PROTEIN}

"펩티드"는 아미노산의 쇄에 광범위하게 적용하는 용어로서, 3 내지 100 이상 성분의 서열이지만 아미노산 말단 및 카르복시 말단을 통해 결합될 가능성이 높은 서열에 임의적으로 적용된다. 호르몬, 전령, 성장 인자, 항균제, 계면활성제 등과 각종 의학제로서 작용하는 자연 발생적인 펩티드의 예가 많이 있으며 기타 용도에 대해서도 생각할 수 있다.

현재, 최소 3가지인 펩티드의 주 공급원으로는 천연 공급원 유래의 추출물, 화학 합성물, 및 재조합 DNA 작제물로 형질전환된 유기체 유래의 추출물이 있다. 형질전환된 유기체를 사용한 경로의 잇점으로는 합성 과정의 생물학적 충실성, 화학적으로 합성하기 어려운 서열을 합성하는 능력, 용매를 사용하는 화학적 공정의 회피 등이 있으며, 특히 길이가 더 긴 펩티드를 비용면에서 효율적으로 얻을 수 있다.

재조합 기법으로 펩티드를 제조하는데 있어서 단점은 사용된 유기체가 단서열의 아미노산 합성시, 그리고 필요에 따라 이를 분비시 불량해지는 경향이 있다는 것이다. 따라서, 산업용으로 고려되는 다수의 방법은 단펩티드 서열이 또 다른 단백질에서 아미노 말단 연장 또는 카르복시 말단 연장을 행하여 만들어지는 융합 단백질을 이용한다. 이들 융합 단백질은 다량 생성할 수 있고, 종종 융합 파트너의 특별한 특성을 이용하여 정제하므로써 정제 과정을 단순화할 수 있지만, 펩티드를 회수하는데 어려움이 있다. 단백질은 화학적으로 안정한 분자이므로 한정된 아미노 말단 및 카르복시 말단을 보유한 통합 펩티드를 회수하기 위해서는 특이적인 절단 방법이 필요하다.

넓은 패널의 단백질 절단 기법을 생각할 수 있다. 이들 기법은 특정 아미노산에서의 화학적 절단 내지는 서열 특이적 효소를 사용한 효소적 절단을 포함한다. 화학적 절단의 예로는 메티오닌 잔기 뒤에서의 시아노겐 브로마이드 절단과 아스파라긴-글리신 아미노산쌍 사이의 히드록실아민 절단을 포함한다. 특정 단백질 서열에서 절단하기에 적절한 효소의 예로는 서열 (아스파르트산)₄-리신 다음을 절단하는 엔테로키나제와 염기성 아미노산인 리신 또는 아르기닌 다음을 절단하는 트롬빈을 포함한다.

상기 2가지 절단 방법에 있어서 공통적인 문제점은 진정한 아미노 말단을 형성할 필요성과 펩티드내의 내부 위치의 존재에 대해 서열 제약이 있다는 것이다. 예를 들어, 펩티드내 내부 메티오닌이 없는 경우에만 시아노겐 브로마이드가 유용하고, 트롬빈은 염기성 아미노산 뒤에 다수의 상이한 위치를 절단할 수 있다. 효소 절단법은 공정의 경제성 측면에서 또 다른 문제가 있다. 효소는 허용되고 확인된 공급원(엔테로키나제의 일반적인 공급원은 송아지 위 내피세포임)으로부터 얻어야 하며, 경제적으로 허용가능한 양이 유용해야 한다.

카르복시 말단 아미드화는 유효한 상업적 대상인 다수의 생물학적 활성 펩티드에서 발견되는 통상적인 번역후 변형 과정이다. 예로는 칼시토닌(calcitonin), 마가이닌(magainin) 등이 있다. 많은 경우, 예컨대 천연 아미드화된 펩티드인 칼시토닌은 아미드화 되지 않은 형태에 비해 약 2000배의 활성을 나타낸다.

카르복시 말단 아미드화 펩티드를 제조하는 방법으로는 다수의 상이한 화학적 및 생물학적 방법이 있다. 그러나, 이 방법은 부가적인 임의의 공정 단계를 수행해야 하기 때문에, 최종 생성물의 총 비용을 증가시킨다는 점에서 바람직하지 않다.

도 1은 트립신으로 분해한 후 sCT-G의 C18 RP-HPLC 분석 결과를 나타낸 도면이다.

도 2는 LHRH 생성물의 전기분무 질량 분광분석을 도시한 도면이다.

본 발명은 재조합계에서 융합 단백질의 아미노 말단을 연장하여 펩티드를 생성하는 방법에 관한 것이다. 본 발명자들은 신규 방법을 제공하였는데, 이 방법에 의하면 융합 단백질로부터 펩티드를 절단하고 그 펩티드를 카르복시 아미드화와 같이 변형시키는 과정이 단일 공정에서 일련의 연속 반응으로 일어날 수 있다. 이러한 접근법은 별도의 분리 단계의 필요성에 의해 야기되는 단점없이 생물학적 발현계에서 합성의 충실도 및 저렴한 비용면에서 유리하다.

따라서, 본 발명의 제1 양태는 융합 단백질의 일부로서 펩티드를 발현한 후 황함유 환원제와 같은 아실 수용체에 의해 융합 단백질로부터 펩티드를 방출하는 단계를 포함하여 펩티드를 생성하는 방법을 제공한다. 융합 단백질의 최소한 일부는 아실 부분으로서 펩티드를 인접 황 원자와 같은 적절한 수용체로 전달하여 티오-에스테르 형성을 촉진할 수 있는 분자가 적절하다.

바람직한 구체예에서, 펩티드를 화학적으로 변형시킨다. 즉, 융합 단백질로부터 방출 후에 이 펩티드의 카르복시 말단을 아미드화시킨다. 아미드화 단계는 적절한 pH에서 암모늄 이온원의 존재하에 수행하며, 아미드화 단계는 펩티드의 방출 단계와 동시에 실시하는 것이 적절하다. 이들 방법을 사용하여 제조할 수 있는 아미드화 펩티드의 예로는, 연어의 칼시토닌, 인간의 칼시토닌, 황체형성 호르몬 유리 호르몬, 옥시토신, 가스트린 신경 펩티드 Y, 바소프레신, 코르티코트로핀 유리 호르몬, 성장 호르몬 유리 호르몬, 인간의 칼시토닌 유전자 관련 펩티드, 가스트린, D-tyr-trp-gly, phe-gly-phe-gly, gly-phe-gly, 멜라닌 세포 자극 호르몬 전구체, 세크레틴, 티로트로핀 유리 호르몬, 아밀린, 물질 P, 췌장 폴리펩티드, 콜레시스토키닌, 가스트린 분비 인자, phe-his-ile, phe-tyr-tyr, 사바진, 마스토파린 M, 카에룰레인 및 FMRF 아미드가 있다.

또한, 암모니아의 부재하에 펩티드의 단순한 가수분해를 수행하며 유리 카르복실산 말단기를 형성시킬 수도 있다. 이러한 본 발명은 의학 또는 기타 용도를 위해 유리 카르복시 말단을 가지는 펩티드를 상업적으로 생성하는데 적절하다. 이러한 펩티드의 예로는 히룰로그, 마가이닌, 티모신 알파-1, 뇌 천연(naturetic) 펩티드, 심방 천연(naturetic) 펩티드 또는 살균/투과성 증가 단백질이 있다.

본 발명의 방법은 예컨대 융합 단백질로서 단백질을 제조하기 위해 고안된 시판용 발현 벡터를 이용할 수 있다. 이 벡터는 변형된 자가 스플라이싱 단백질, 즉 인테인(intein)을 통합하여, 단순한 화학 반응에 의해 융합 파트너로부터 단백질을 유리할 수 있다. 본 발명은 변형된 화학적 조건/단계를 이용하여 융합 단백질을 절단하고, 따라서 소정의 펩티드를 유리시킬 수 있으며, 이 펩티드는 카르복시 말단을 원하는대로 변형시킬 수 있다.

인테인은 아미노 말단과 카르복시 말단에서 모두 인접 단백질 서열과 함께 발현되는 단백질이다. 아미노 말단 서열 및 카르복시 말단 서열은 엑손 및 인트론 DNA 명명법에 따라 엑스테인(extein)이라 명명하였다. 알려진 인테인 계열의 전형적인 구성원은 효모에서 얻은 VMA1 유전자 생성물이다. 이의 분자량은 약 50 kDa이며, 아미노 말단(시스테인) 및 카르복시 말단(히스티딘 및 아스파라긴)에서 필수 아미노산을 포함한다. 또한, 카르복시 말단 엑스테인은 시스테인을 사용하여 개시해야 한다. 번역이 완료된 후 일부 지점에서, 아미노 말단 펩티드 결합이 끊어지고 엑스테인은 인접한 시스테인의 황원자로 전달되어 티오-에스테르를 형성한다. 그 다음 이 결합을 카르복시 말단 엑스테인의 출발점에서 시스테인과 교환한 뒤, 인접 아스파라긴을 사용하여 인테인의 단부에 펩티드 결합과 교환한다. 이러한 관련 반응의 총 효과는 2개의 엑스테인이 이음새 없이 결합되고 인테인이 방출된다는 것이다.

이들 반응에 대한 상세한 이해는 인테인의 어느 한 단부 및 엑스테인의 단부 부근에 있는 필수 군이 전체적으로 대체된 일련의 돌연변이 분석 후에 얻어졌다. 이러한 이해로 아미노 말단 엑스테인이 임의의 기타 단백질에 의해 대체될 수 있고, 자가 스플라이싱 기능이 무력해진 돌연변이 인테인을 고안하였다. 그러나, 생성 융합 단백질의 절단은 환원제인 디티오트레이톨과 같은 이종 화학제를 첨가하여야 가능하다. 융합 단백질은 용액내에서 첨가된 환원제에 의해 티오-에스테르로서 유리된 뒤 유리산으로 점차적으로 가수분해된다.

칼시토닌은 본 발명에 기재된 방법을 사용하여 제조하기에 적절한 의학 및 상업적으로 중요한 펩티드의 일례이다. 이는 32개의 아미노산을 포함하며, 그 카르복시 말단이 아미드화되어 있다. 작용 활성 및 아미노산 서열은 종간 보존성이 높다. 따라서, 본래 주로 자연 공급원으로부터 얻었지만 현재는 직접 합성하여 만들어지는 연어의 칼시토닌은 광범위하게 임상 용도로 사용되고 있다. 과거에는, 파겟병 및 칼슘부족증 쇼크 치료에 중점을 두어왔다. 그러나, 최근에 폐경기후 여성의 골다공증을 치료하기 위한 물질로서의 수요가 늘어나고 있다. 이 용도로 이용하기 위해서는 상당량의 물질이 필요하여, 생산 비용이 점차로 중요한 요소가 되고 있다.

인테인 벡터를 사용하여 칼시토닌을 만들기 위해서, 적절한 부위 5'에서 변형된 인테인으로 삽입되도록 고안된 제한 부위에 인접한 칼시토닌 서열을 암호화하는 상보적인 올리고뉴클레오티드를 제조해야 한다. 이들 부위는 펩티드의 암호 서열이 나머지 발현된 단백질과 동일한 암호틀내에 있도록 선택한다. 적절한 올리고뉴클레오티드는 당업계에 공지된 임의의 다수 방법, 예컨대 통상적인 제한 부위를 포함하도록 고안된 프라이머를 사용하여 천연 서열로부터 가장 명확한 직접적인 합성법 및 폴리머라제 연쇄 반응 증폭으로 만들 수 있다. 이 DNA 작제물을 적절한 발현계로 형질전환시켜, 그 결과 생성된 융합 단백질을 수거한다.

추가로 개량한 계에서, 융합 단백질은 표지를 포함할 수도 있는데, 이 표지는 친화 크로마토그래피 방법 또는 기타 크로마토그래피 방법으로 융합 단백질 및 펩티드를 동정 및/또는 정제할 수 있다. 적절한 표지의 예로는 특이적 키틴 결합 도메인, 이의 부분, 산성 또는 염기성 아미노산의 반복부, 폴리히스티딘 서열, 글루타티온 S 트랜스퍼라제 및 리소자임이 있다. 예를 들어, 인테인의 카르복시 말단을 특정 키틴 결합 도메인과 융합시킬 수 있다. 이것은 키틴 비이드의 충전된 컬럼에 단단히 결합하는 바, 완전한 융합 단백질의 친화도 정제에 사용할 수 있다. 충분히 세척을 수행한 후에, 컬럼을 적절한 절단 시약을 사용하여 처리하고 유리된 표적 펩티드를 용출시킬 수 있다.

전술한 인테인계 벡터는 이.콜리(E.coli)에 사용하기 위해 고안되었지만 상업적 규모에서 작동할 수 있는 임의의 발현계가 적절하다. 기타의 벡터를 특정 발현계에 최적으로 사용하기 위해 고안할 수 있다. 예를 들어, 포유류 발현계를 선택한 경우, 단백질 암호화 영역은 특정계에 대해 코돈 사용을 최적화해야 한다. 전술한 산성 또는 염기성 아미노산의 반복체와 같이 동정 및/또는 정제에 더 작은 친화도를 가진 태그를 사용하여 발현을 개선시켜, 이온 교환 크로마토그래피를 사용하거나 금속 킬레이트 매트릭스상에 정제를 위한 폴리히스티딘 서열을 봉입시키므로써 오염 단백질로부터 분리할 수 있다. 포유류의 계로부터 분비를 개선시킬 수 있는 추가의 변형은(현재 이.콜리 벡터는 세포내 단백질 생성을 위해 고안된 것임) 칼시토닌에 분비 리더 서열을 첨가시켜 배지 또는 돌연변이 동물의 젖으로 분비를 촉진시킬 수 있다. 이러한 리더 서열은 천연 프로세싱 효소에 의한 분비 과정에서 제거되어야 한다.

펩티드 융합 단백질을 발현시키는데 사용될 수 있는 발현계의 예로는 박테리아[이.콜리, 비.서브틸리스(B.subtilis) 등], 효모[에스. 세레비시애(S. cerevisiae), 피.파스토랄리스(P.pastoralis) 등], 곤충 세포[에스.프루기페르다 (S.frugiperda)], 포유류의 발현계(중국산 햄스터 난소, 어린 햄스터의 신장 등), 우유 또는 기타 체액내의 돌연변이 포유류 발현계(바람직하게는 돼지, 소, 양, 염소, 토끼 등) 및 식물(감자, 옥수수 등)이 있다. 이.콜리 발현계의 경우, 개시자 메티오닌은 발현 생성물내에 보유되어 있다. 해당 펩티드가 서열내에 추가의 메티오닌을 포함하지 않는 펩티드인 경우, 이 개시자 메티오닌은 시아노겐 브로마이드를 사용하여 제거할 수 있다. 이러한 펩티드의 예로는 칼시토닌이 있다.

발현은 리더 서열, 코돈 사용, 인테인 또는 이의 돌연변이, 및 정제 방법의 적절한 선택으로 이들 임의의 계에 대해, 세포내 또는 세포외 생성을 위해 최적화할 수 있다. 당업자들은 본 발명이 공급원으로서 인테인 또는 임의의 종에 한하는 것이 아님을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 전체 인테인 분자를 사용해야 할 필요는 없다. 이 서열의 많은 부분은 소정의 공정과 무관할 수 있으며, 아마 분자의 거의 대부분은 작용적으로 필요하지 않을 것이다. 실제로, "인테인"의 범위에 속하지 않는 기타 단백질은 표적 펩티드의 카르복시 말단에서의 펩티드 결합을 적절한 티올기로 전달할 수 있으며, 따라서 절단에 필요한 티오-에스테르기를 형성하여 아미드화를 수반한다.

티오-에스테르는 펩티드 결합 또는 산소 에스테르에 비하여 상대적으로 반응성이 있는 화학기이며, 따라서 온화한 반응 조건하에 쉽게 아미드로 전환된다. 융합된 펩티드가 카르복시 말단 아미드로 전환되는 동안 정상적인 절단 및 방출 경로에는 2가지 지점이 있다. 첫번째는, 아마 이것이 가장 적절한 것으로 생각되는데, 펩티드가 티올 시약을 첨가하여 융합 파트너로부터 방출된 후이다. 시약으로는 디티오트레이톨이 바람직하지만, 임의의 다수의 황 함유 환원제도 효과적으로 작용할 수 있다. 이 반응은 본질적으로 펩티드의 카르복시 말단과 인테인 시스테인의 황 사이에 형성된 티올 에스테르가 디티오트레이톨 황 원자 중 하나로 전달되는 티올 상호 교환 반응이다. 임의의 화학 반응에서와 같이, 인테인의 아미노 말단에 있는 시스테인의 아민과 동일한 아미노산 잔기의 황 사이에 아실 전이 반응은 평형을 이룬다. 전술한 효모 인테인의 경우, 이 평형은 아민기를 선호하는 쪽으로 이동하여 티오 에스테르가 소량 성분이 된다.

첨가된 티올 시약은 이 티오-에스테르 종을 제거하며, 따라서 모든 펩티드가 효과적으로 유리 티오-에스테르로서 방출될 때까지 티오-에스테르를 더 많이 생성하는 방향으로 반응을 추진한다. 방출된 티오-에스테르는 물에 의한 가수분해(원하지 않는 유리산을 생성함)에 비교적 안정하여, 따라서 아미드 형성을 촉진하는 임의의 화학적 조건하에 절단하는데 적절하다.

펩티드가 티오-에스테르를 나타내는 제2 지점은 인테인이지만, 전술한 바와 같이 이러한 종류는 소량 성분이다. 그러나, 여기서도 아미드화 종으로서 펩티드를 동시에 방출하는 화학적 조건을 고안할 수 있다.

아미드화를 수반하는 티오-에스테르 절단에 바람직할 것으로 예상되는 조건은 여러가지이며, 다음 조건은 대표적으로 가능한 시약 및 반응을 예시적으로 선택한 것이다. 화학적으로, 암모니아 및 관련 화합물로 티오 에스테르를 절단하여 아미드를 형성할 수 있다. 이는 카르보닐의 양전하가 증가하는(인접 황 원자의 영향임) 조건을 필요로 하며, 암모니아의 질소 전자 고립쌍을 이용할 수 있다. 수용액에서 인산암모늄 또는 황산암모늄과 같은 염에 의해 제공되는 양전하 암모늄 이온은 반응성 종인 비하전된 암모니아와 평형 상태에 있고, 유리 암모니아의 농도는 수소 이온 농도를 낮추면 증가한다. 따라서, 상대적으로 낮은 pH 값, 예컨대 pH 4.0∼6.0에서 진행할 것 같지만 아미드 생성물 형성을 촉진하는 반응은 pH가 6.0∼9.0 또는 심지어 10.0으로 증가하는 경우 더 급속하게 발생하며, 이 때 평형은 상당한 암모니아를 형성하는 방향으로 이동한다.

최적 범위는 펩티드 기질 자체에 의해 용인되는 최고 pH와 허용가능한 속도로 반응이 진행되는 최저 pH 사이에 있다. 이러한 최적 범위는 펩티드 자체의 서열과 융합 파트너의 특성 및 공정 관련, 특히 정제 관련 문제와 연관이 있는 기타 인자에 의해 결정된다. 유사한 조건 및 제약은 절단/아미드화 반응이 동시에 발생하는지 또는 순차적으로 발생하는지 여부에 관련 없이 적용할 수 있다. 수성계 및 비수성계에서 소정의 반응을 달성할 수 있고 당업자들이 고려할 수 있는 기타 화학적 조건이 많이 있다. 전술한 내용은 적절한 방법의 예시로서 간단히 설명한 것이며, 기타 가능한 방법을 배제하려는 것은 아니다.

본 발명은 다음 실시예의 방법으로 개시하였으며, 어떤 방식으로도 본 발명을 제한하는 것으로 해석해서는 안된다.

실시예 1 : 글리신으로 연장된 연어의 칼시토닌

1.1 클로닝 방법

번역 개시에 NdeI 부위와, 인테인에 직접 인접한 SapI 부위를 함유하는, 뉴 잉글랜드 바이오랩에서 입수가능한 벡터 pCYB1을 사용하여 글리신으로 연장된 연어의 칼시토닌(sCT-G)을 클로닝 및 발현하였다. sCT-G 암호 서열을 103개 염기 및 104개 염기의 2개의 상보성 1본쇄 올리고뉴클레오티드로서 합성하였다. 코돈 사용은 이.콜리에서의 발현에 대해 최적화하였다. 2개의 가닥을 어닐링시켜 NdeI(5' 단부) 및 SpaI 부위(3' 말단)에 상보적인 5' 점착말단체를 생성하였다. 이 2본쇄 올리고뉴클레오티드를 NdeI 및 SapI를 사용하여 분해된 pCYB1내로 삽입하였다. 융합 유전자 발현은 P_tac프로모터의 제어하에 있고, 벡터상의 lacl^q유전자의 존재로 인하여 IPTG에 의해 조절된다.

1.2. 융합 단백질 발현 및 분석

sCT-G를 포함하는 pCYB1 벡터를 사용하여 DH5-α를 형질감염시키고, 세포를 성장시키고, IPTG로 유도하고, 수거한 후 초음파로 용해시켰다. 발현된 융합체를 키틴 아가로스상에 포집하고, 이를 세척한 후 SDS-PAGE 샘플 완충액에서 비등시켰다. 상청액을 16% SDS-PAGE 겔에서 전개시키고, N-말단 서열 결정을 위해 단백질을 쿠마씨 블루 염색으로 가시화하거나 또는 PVDF 막에 대해 전기블롯팅하였다. 서열 분석으로 sCT-G가 2개의 위치, 즉 Ser2 및 Thr6에서 N-말단 절두되었다는 것을 확인할 수 있다.

1.3. 융합 단백질 절단 및 펩티드 아미드화

융합체가 결합된 키틴 아가로스를 20 mM 헤페스 pH 8.0, 40 mM DTT(절단 완충액 A) 또는 3.0 M 중탄산암모늄(절단 완충액 B)으로 보충한 절단 완충액 A를 사용하여 세척하고, 밤새 4℃에서 항온처리하였다. 방출된 sCT-G를 컬럼으로부터 세척하고 양이온 교환 수지상에 포집시킨 후 염 단계로 용출시켰다. 트립신으로 분해한 후에 C18 RP-HPLC 분석한 결과, 절단 완충액 B를 사용하여 형성된 생성물은 90% 이상의 아미드화 C 말단을 포함하지만, 절단 완충액 A를 사용한 생성물은 카르복실 C 말단과 인테인 N-말단으로부터 유래했을 것으로 생각되는 단일 Cys 잔기에 의해 연장된 부가 생성물의 혼합물을 포함한다는 것을 알 수 있다(도 1).

실시예 2 : 황체형성 호르몬 유리 호르몬(LHRH)

2.1 클로닝 방법

올리고뉴클레오티드가 LHRH 암호 서열을 포함하는 것 이외에는 sCT-G에 대해 전술한 바와 동일하게 클로닝을 수행하였다[Tan, L. and Rousseau, P. Biochem. Biophys. Res. Com. 109: 1061-1071 (1982)].

2.2 융합 단백질 발현 및 분석

sCT-G에 대해 기술한 바와 같이, N-말단 서열 결정한 결과, 이.콜리 개시 시그널로부터 보존된 단일 Met 잔기에 의해 LHRH가 N-말단 연장되어 있음을 확인하였다.

2.3 융합 단백질 절단 및 펩티드 아미드화

최종 양이온 포집 단계까지 sCT-G 융합체에서와 동일한 방식으로 LHRH 융합체를 처리하였다. 컬럼 세척물을 전자분무 질량 분광기에 적용하고 자료를 재구성하여 모이온의 질량을 얻었다(도 2). 절단 완충액 B(실시예 1에 개시된 바와 동일)로부터 얻은 LHRH는 Met 연장되고 아미드화된 분자와 일치하는 1331Da의 질량을 갖는 모이온을 형성한다. 절단 완충액 A(실시예 1에 개시한 바와 같음)에서 얻은 LHRH는 Met 연장된 유리산과 일치하는 1332 Da의 질량을 갖는 모이온을 제공하였다. 1 Da의 차이는 아미드와 카르복실산 사이의 질량 차이로 예상된다.

실시예 3

인간의 아밀린 클로닝

뉴 잉글랜드 바이오랩(NEB)로부터 입수가능한 IMPACT I(친화성 키틴 결합 태그를 이용한 인테인 매개된 정제)는 4개의 이.콜리 발현 벡터를 제공하는데, 이 벡터들은 이용가능한 클로닝 부위가 다르다. 인간의 아밀린은 NEB 벡터 pCYB1을 사용하여 클로닝하는데, 이 벡터는 번역 개시부에 NdeI 부위 및 인테인에 직접 인접한 SapI 부위를 포함한다.

인간의 아밀린 서열은 각각 115개 염기 및 116개 염기의 2개의 상보적인 1본쇄 올리고뉴클레오티드로서 합성된다. 코돈 사용은 이.콜리 발현에 대해 최적화한다. 2개의 가닥을 어닐링시키면 NdeI(5' 단부) 및 SapI 부위 (3'단부)에 상보적인 5' 점착말단체를 생성한다. 전에 NdeI 및 SapI으로 분해한 pCYB1내로 2본쇄 올리고뉴클레오티드를 직접 삽입할 수 있다.

인간의 아밀린

실시예 4

이.콜리에서 펩티드 융합 단백질을 발현하기 위한 일반적인 프로토콜 및 융합 단백질 및 방출된 펩티드의 정제

박테리아에서 발현하기 위해서는 임의의 표준 방법을 사용하여 발현 작제물로 세포를 형질전환시켜야 한다(Maniatis et al., 상기 문헌 참조). 세포가 증식한 후에, 유도성 프로모터(예, β-갈락토시다제 프로모터)와 IPTG와 같은 소분자 유도인자의 조합체를 사용하여 표적 융합 단백질의 발현을 유도하는 것이 일반적이다. 이어서, 융합 단백질은 세포를 수거하고 절단한 후에 회수하고, 이어서 친화도 크로마토그래피로 정제하였다. 이는 융합 단백질이 결합된 리간드를 갖고 있는 적절한 친화 매트릭스의 컬럼을 통해 정화된 세포 용해물을 통과시키는 것을 포함한다. 그 다음 오염물을 융합 단백질의 특이적 용출 또는 결합된 융합 단백질의 동일계내 절단 전에 매트릭스로부터 세척한다. 예를 들어, 실시예 2 및 3에 개시된 Impact 벡터를 사용하여, 리소자임을 함유하는 융합 단백질을 양이온 교환 크로마토그래피로 정제한다. 이 경우, 절단 조건이 융합 단백질의 용출을 촉진시키는 것이 아니라는 것을 발견할 수 없는 한 동일계에서의 절단은 아마도 선택사항이 아닌 듯 하다. 이 환경하에서, 용액상에서의 절단이 필요하다. 매트릭스에 결합되어 있는 상태에서 융합 단백질을 절단하는 것은 후속되어야 하는 펩티드의 정제 방법을 간단하게 한다.

10 mM DTT와 같은 티올 아실 수용체를 직접 첨가하여 융합 단백질을 절단시켜 티오에스테르 중간체를 생성할 수 있으며, 이 중간체는 pH 6.0 이상의 암모니아염으로 처리하여 아미드로 전환시킬 수 있다. 수용체 티올 및 암모니아염의 적절한 혼합물을 첨가하여 절단 및 아미드로의 전환을 동시에 할 수 있다.

방출된 펩티드는, 필요에 따라 용매 분획 및 HPLC와 같은 기법을 사용하여 추가로 정제한다.

〈110〉 PPL Therapeutics (Scotland) Ltd

〈120〉 METHODS OF PRODUCTION OF AN AMIDATED PEPTIDE THROUGH THE USE OF A

FUSION PROTEIN

〈130〉 1

〈150〉 PCT/GB 1998/01281

〈151〉 1998-05-01

〈160〉 2

〈170〉 KOPATIN 1.5

〈210〉 1

〈211〉 27

〈212〉 DNA

〈213〉 pCYB1

〈400〉 1

catatggcta gcggctcttc ctgcttt 27

〈210〉 2

〈211〉 122

〈212〉 DNA

〈213〉 Human Amylin

〈400〉 2

catatgaaat gcaacaccgc gacctgcgcg acccagcgcc tggcgaactt cctggtgcat 60

agcagcaaca acttcggcgc gatcctgagc agcaccaact gggcagcaac acctattgct 120

tt 122

Claims

융합 단백질의 일부로서 펩티드를 발현하는 단계, 그 다음 황 함유 환원제와 같은 아실 수용체에 의해 융합 단백질로부터 펩티드를 방출하는 단계를 포함하는 펩티드 생성 방법.
제1항에 있어서, 융합 단백질의 최소한 일부가 아실 부분으로서 펩티드를 인접 황 원자와 같은 적절한 수용체로 전달시키는 것을 촉진하여 티오-에스테르를 형성할 수 있는 분자인 것이 특징인 펩티드 생성 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 펩티드가 융합 단백질로부터 방출된 후에 카르복시 말단이 아미드화되는 것이 특징인 펩티드 생성 방법.
제3항에 있어서, 아미드화 단계가 적절한 pH에서 암모늄 이온의 공급원의 존재하에 수행되는 것이 특징인 펩티드 생성 방법.
제3항 또는 제4항에 있어서, 아미드화 단계가 펩티드 방출과 동시에 발생되는 것이 특징인 펩티드 생성 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 펩티드가 연어의 칼시토닌, 인간의 칼시토닌, 황체형성 호르몬 유리 호르몬, 옥시토신, 가스트린 신경 펩티드 Y, 바소프레신, 코르티코트로핀 유리 호르몬, 성장 호르몬 유리 호르몬, 인간의 칼시토닌 유전자 관련 펩티드, 가스트린, D-tyr-trp-gly, phe-gly-phe-gly, gly-phe-gly, 멜라닌 세포 자극 호르몬 전구체, 세크레틴, 티로트로핀 유리 호르몬, 아밀린, 물질 P, 췌장 폴리펩티드, 콜레시스토키닌, 가스트린 분비 인자, phe-his-ile, phe-tyr-tyr, 사바진, 마스토파린 M, 카에룰레인 또는 FMRF 아미드인 것이 특징인 펩티드 생성 방법.
제6항에 있어서, 펩티드가 연어의 칼시토닌 또는 인간의 칼시토닌인 것이 특징인 펩티드 생성 방법.
제2항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 융합 단백질이 변형된 인테인 서열의 최소한 일부를 포함하는 것이 특징인 펩티드 생성 방법.
제8항에 있어서, 인테인 서열, 또는 이 서열 일부의 변형으로 자가 스플라이싱 기능이 무력화되는 것이 특징인 펩티드 생성 방법.
제8항 또는 제9항에 있어서, 인테인 서열 또는 이의 일부 서열이 효모의 VMA1 유전자로부터 유래한 것이 특징인 펩티드 생성 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 펩티드가 가수분해에 의해 융합 단백질로부터 방출되는 것이 특징인 펩티드 생성 방법.
제11항에 있어서, 펩티드가 히룰로그, 마가이닌, 티모신 알파-1, 뇌 천연(naturetic) 펩티드, 심방 천연(naturetic) 펩티드 또는 살균성/투과성 증가 단백질인 것이 특징인 펩티드 생성 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 융합 단백질이 표지를 포함하고, 이 표지가 친화도 크로마토그래피 방법 또는 기타 크로마토그래피 방법으로 융합 단백질을 동정 및/또는 정제하는데 사용될 수 있는 것이 특징인 펩티드 생성 방법.
제13항에 있어서, 표지가 친화도 표지인 것이 특징인 펩티드 생성 방법.
제14항에 있어서, 친화도 표지가 특이적 키틴 결합 도메인, 또는 이의 일부, 산성 또는 염기성 아미노산의 반복체, 폴리히스티딘 서열, 글루타티온 신테타제 및 리소자임을 포함하는 것이 특징인 펩티드 생성 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 융합 단백질이 박테리아, 효모, 전체 식물을 비롯한 식물 조직, 곤충 세포, 포유류 세포 또는 돌연변이 포유류의 체액내에서 발현되는 것이 특징인 펩티드 생성 방법.
제15항에 있어서, 융합 단백질이 이.콜리(E.coli) 또는 비.서브틸리스(B. subtilis)에서 발현되는 것이 특징인 펩티드 생성 방법.
제17항에 있어서, 융합 단백질이 이.콜리에서 발현되고, 펩티드가 서열내에 메티오닌을 포함하지 않는 경우 시아노겐 브로마이드로 처리되는 것이 특징인 펩티드 생성 방법.
제15항에 있어서, 융합 단백질이 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 또는 피.파스토랄리스(P.pastoralis)에서 발현되는 것이 특징인 펩티드 생성 방법.
제15항에 있어서, 융합 단백질이 중국산 햄스터 난소 세포 또는 어린 햄스터 신장 세포에서 발현되는 것이 특징인 펩티드 생성 방법.
제15항에 있어서, 융합 단백질이 돌연변이 감자 조직 또는 돌연변이 옥수수 조직에서 발현되는 것이 특징인 펩티드 생성 방법.
제15항에 있어서, 융합 단백질이 돌연변이 돼지, 소, 양, 염소 또는 토끼의 젖에서 발현되는 것이 특징인 펩티드 생성 방법.
제15항에 있어서, 융합 단백질이 에스.프루기페르다(S. frugiperda) 세포와 같은 곤충 세포에서 발현되는 것이 특징인 펩티드 생성 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 있어서, 융합 단백질을 암호화하는 서열이 분비 리더 서열을 포함하는 것이 특징인 펩티드 생성 방법.
제24항에 있어서, 분비 리더 서열이 분비 과정에서 천연 프로세싱 효소에 의해 제거되는 것이 특징인 펩티드 생성 방법.
제1항, 제2항, 제6항 내지 제15항, 제24항 및 제25항 중 어느 하나의 항에 기재된 융합 단백질을 암호화하는 DNA 작제물.
제26항에 있어서, 벡터의 형태로 존재하는 것이 특징인 DNA 작제물.
제26항 또는 제27항에 기재된 DNA 작제물로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포.
제28항에 있어서, 제16항 내지 제21항 중 어느 하나의 항에 기재된 바와 같이 변형되는 것이 특징인 숙주 세포.
제26항에 기재된 바와 같은 DNA 작제물을 게놈내로 통합시킨 인간을 제외한 돌연변이 포유류.
제29항에 있어서, 돌연변이 돼지, 소, 양, 염소 또는 토끼인 돌연변이 포유류.