JP2001525664A

JP2001525664A - 融合タンパク質を使用するアミド化されたペプチドの製造方法

Info

Publication number: JP2001525664A
Application number: JP54783598A
Authority: JP
Inventors: ロバートコティンガムイアン
Original assignee: ピーピーエルセラピューティクス（スコットランド）リミティッド
Priority date: 1997-05-01
Filing date: 1998-05-01
Publication date: 2001-12-11
Also published as: CA2287204A1; GB9708918D0; CN1254379A; AU7224498A; NZ500507A; KR20010012165A; EP0979291A1; WO1998050563A1

Abstract

(57)【要約】組換え手段によるペプチドの製造方法、特に、ただしこれに限定されるものではないが、アミド化のようなカルボキシ末端の修飾を持つペプチドの製造方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】融合タンパク質を使用するアミド化されたペプチドの製造方法本発明は、組換え手段によるペプチドの製造、特に、ただしこれに限定されるものではないが、アミド化のようなカルボキシ末端の修飾を持つペプチドの製造に関する。「ペプチド」とは、アミノ酸の鎖に対し緩やかに適用される用語であり、構成成分のアミノ末端及びカルボキシ末端を介して結合した３ないし１００を越える、多分それ以上の、構成成分の配列に対して恣意的に適用される用語である。天然に存在するペプチドには多くの例があり、それらはホルモン、メッセンジャー、成長因子、抗菌剤、界面活性剤等として機能し、そして医薬及びその他の広範な適用が予見されうる。現在、少なくとも３つの主要なペプチドの供給源がある。すなわち、天然の供給源からの抽出、化学合成及び組換えＤＮＡ構築物で形質転換した生物由来のものである。形質転換した生物を用いる経路の利点は、合成過程が生物学的に忠実であること、化学的に好ましくない配列を合成できること、溶媒等を用いる化学過程を回避できること、及び特により長いペプチドについての費用効果である。組換え技術によるペプチド製造の不利な点は、アミノ酸の短い配列を合成することそして必要な場合はそれを分泌することが不得手である傾向があることである。したがって、工業的利用を考慮した方法の多くは、融合タンパク質を利用する。ここでは、短いペプチド配列は別のタンパク質の上にアミノ末端か又はカルボキシ末端いずれかの伸長物として作られる。これらの融合タンパク質は大量に製造することができ、そして精製を単純化するため融合パートナーの特別な性質を利用することにより精製されることが多いが、ペプチドを回収する際に困難に遭遇しうる。タンパク質は化学的に安定な分子であり、それゆえに定まったアミノ末端及びカルボキシ末端を持つ完全なペプチドを回収するためには、特別の切断ストラテジーを必要とする。広範なタンパク質切断技術が予見されうる。これらは、特定のアミノ酸での化学切断から配列特異的酵素を用いる酵素による切断までにわたる。化学切断の例としては、メチオニン残基の後での臭化シアン切断及びアスパラギン−グリシンというアミノ酸対の間でのヒドロキシルアミン切断が挙げられる。特異的タンパク質配列での切断に適する酵素の例としては、（アスパラギン酸）₄−リジンの配列の後で切断するエンテロキナーゼ及び塩基性アミノ酸であるリジン又はアルギニンの後で切断するトロンビンが挙げられる。これらの切断ストラテジーの両方に共通の問題は、配列の制約がペプチド内の中間部位の存在と正しいアミノ末端を創出する必要性の両方に影響を及ぼすことである。例えば、臭化シアンは、ペプチドに中間のメチオニンが存在しない場合のみに使用され、トロンビンは、塩基性アミノ酸の後のいくつかの異なる部位で切断可能である。酵素による切断は、プロセス経済の観点からさらなる問題を有する。酵素は、許容可能でかつ実証された供給源（エンテロキナーゼの一般的供給源は、ウシの腸の内皮である）に由来せねばならず、かつ、経済的に許容されうる量で入手可能でなければならない。カルボキシ末端のアミド化は、潜在的に市場価値を有する多くの生物学的に活性なペプチドに見出される共通の翻訳後修飾である。カルシトニン、マガイニン等が例示される。多くの例において、例えば、天然のアミド化されたペプチドであるカルシトニンは、非アミド化版のおよそ２０００倍の活性がある。カルボキシ末端のアミド化ペプチドを製造するように設計された多種類の化学的及び生物学的方法がある。しかしながら、いかなる余分のプロセス工程を用いても、それらはいずれも最終産物の全費用に追加される点で不利である。本発明は、組換え系において、融合タンパク質のアミノ末端伸長物としてペプチドを製造する方法を記載する。本発明者らは、融合タンパク質からのペプチドの切断とカルボキシ−アミド化のようなペプチドの修飾が単一のプロセスの中で一連の連結した反応として起こることが可能な新規な方法を提供する。そのようなアプローチは、別々の切断工程の必要性により引き起こされる不都合なしに、生物学的発現系における低コストと合成の忠実性という利益を得る。こうして、第１の側面において、本発明は、融合タンパク質の一部としてペプチドを発現させる工程、それに続きイオウ含有還元剤等のアシル受容体により融合タンパク質から該ペプチドを放出させる工程を含むペプチドの製造方法を提供する。この融合タンパク質の少なくとも一部は、アシル部分として、近くにいるイオウ原子のような適当な受容体へ該ペプチドを移転しチオエステルを生成させる転移反応を触媒することができる分子であることが適当である。好ましい態様においては、ペプチドは、融合タンパク質から放出後に、例えば、そのカルボキシ末端でアミド化される等、化学的に修飾される。アミド化工程は適当なｐＨでアンモニウムイオンの供給源の存在下で行ない、そしてアミド化工程がペプチドの放出と同時に起こるようにするのが適当である。これらの方法を用いて調製されうるアミド化ペプチドの例としては、サケカルシトニン、ヒトカルシトニン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、オキシトシン、ガストリンニューロペプチドＹ、バソプレッシン、コルチコトロピン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチド、ガストリン、Ｄ−ｔｙｒ−ｔｒｐ−ｇｌｙ、ｐｈｅ−ｇｌｙ−ｐｈｅ−ｇｌｙ、ｇｌｙ−ｐｈｅ−ｇｌｙ、メラニン細胞刺激ホルモン前駆体、セクテチン（Sectetin）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、アミリン、サブスタンスＰ、膵臓ポリペプチド、コレシストキニン、ガストリン分泌因子、ｐｈｅ−ｈｉｓ−ｉｌｅ、ｐｈｅ−ｔｙｒ−ｔｙｒ、サバギン、マストパリンＭ、カエルレイン及びＦＭＲＦアミドが挙げられる。しかしながら、遊離のカルボン酸末端基の生成を結果として生ずる、アンモニアの非存在下でのペプチドの単純な加水分解を行なうことも可能である。これは、本発明の方法を、医薬又はその他の適用のために遊離のカルボキシ末端を有するペプチドの商業的製造に適当なものとする。このようなペプチドの例としては、ヒルログ、マガイニン、チモシンアルファ−１、脳栄養ペプチド、房栄養ペプチド、又は殺菌性／透過性増加タンパク質が挙げられる。本発明の方法は、例えば、融合タンパク質としてタンパク質を製造するように設計された市販の発現ベクターを利用することができる。このベクターは、単純な化学反応によりその融合パートナーからタンパク質を遊離することを可能とする改変された自己スプライシングタンパク質であるインテインを組み込んでいる。本発明は、改変した化学的条件／工程を利用して、融合タンパク質の切断を生じさせ、それにより所望のペプチドを遊離させる。そしてこのペプチドは、例えば、カルボキシ末端の活性化により、修飾することができる。インテインは、アミノ末端及びカルボキシ末端の両方に隣接するタンパク質配列とともに発現するタンパク質である。そのアミノ末端配列及びカルボキシ末端配列は、エキソン及びイントロンのＤＮＡの名称に合わせてエキステインと称されている。インテインの新生のファミリーの外観上典型的なメンバーは、酵母由来のＶＭＡ１遺伝子産物である。これは、約５０ｋＤａの分子量であり、アミノ末端（システィン）及びカルボキシ末端（ヒスタミン及びアスパラギン）に必須のアミノ酸を含んでいる。さらに、カルボキシ末端のエキステインは、システインで開始しなければならない。翻訳が完了した後のある点で、アミノ末端ペプチド結合は切断され、エキステインは隣接するシステインのイオウ原子に転移して、チオエステルを生成する。次いで、この結合はカルボキシ末端エキステインの開始部位のシステインと交換し、次いで、隣接するアスパラギンの関与によりインテインのこの末端のペプチド結合と交換する。これらの協奏反応の全体としての結果は、２つのエキステインが途切れることなく結合し、そしてインテインが放出されるということである。インテインのいずれか一方の末端の必須の基とエキステインの近位の末端が規則的に置換された一連の変異体の分析の後に、これらの反応の詳細が理解されるに至った。この知見により、アミノ末端エキステインをいかなる他のタンパク質にも置換可能な変異体インテインの設計が可能となり、そしてその自己スプライシング機能は作動しないようにされた。しかしながら、その結果生じる融合タンパク質を切断することは、還元剤ジチオスレイトールのような外来の化学剤の添加によりいまだ可能である。融合タンパク質は添加した還元剤とのチオエステルとして遊離し、このチオエステルは溶液中で徐々に加水分解して、遊離の酸になる。カルシトニンは、本発明に記載された方法を用いる製造に適する、医学上かつ商業上重要なペプチドの一例である。それは、３２個のアミノ酸を含み、カルボキシ末端でアミド化されている。その機能的活性及びアミノ酸配列は、種間で高度に保存されている。こうして、元来天然資源からほとんど得られていたが現在では直接合成で製造されているサケカルシトニンは、広範に臨床的に使用されている。過去において、治療は、パジェット病及び低カルシウム性ショックに集中していた。しかしながら、最近、閉経後の女性における骨粗しょう症を治療するために大量の材料の需要がある。この適用はかなりの量の材料を必要とし、製造コストを益々重要な要因とする傾向を強めている。インテインベクターを用いてカルシトニンを作るためには、改変されたインテインの適当な５’部位での挿入用に設計された制限部位に挟まれたカルシトニン配列をコードする相補的オリゴヌクレオチドを調製することが必要である。これらの部位は、該ペプチドのコード配列が発現タンパク質の残りと同じコードフレーム中にあるように選択されなければならない。好ましいオリゴヌクレオチドは当業者に知られたいかなる方法でも作製することができる。これらには、最も明らかな直接合成及び便利な制限部位を含むように設計されたプライマーを用いる天然の配列からのポリメラーゼ連鎖反応増幅が含まれる。次いで、このＤＮＡ構築物を適当な発現系中に形質転換させ、その結果生ずる融合タンパク質を収穫する。この系のさらなる改良において、融合タンパク質は、アフィニティー又はその他のクロマトグラフィー法により融合タンパク質、従ってペプチドの同定及び／又は精製を可能にする標識をも含有する。適当な標識の例としては、特異的キチン結合ドメイン又はその一部、酸性又は塩基性アミノ酸の繰り返し、ポリヒスチジン配列、グルタチオンＳトランスフェラーゼ及びリゾチームが挙げられる。例えば、インテインのカルボキシ末端を特異的キチン結合ドメインと融合させることができる。これは、キチンビーズが充填されたカラムに強固に結合し、融合タンパク質そのもののアフィニティー精製に使用することができる。徹底的に洗浄した後、次に、カラムを適当な切断試薬で処理して、遊離する標的ペプチドを溶出することができる。前述のインテイン系ベクターは、大腸菌に使用するために設計されたものであるけれども、商業的規模で操作可能なものであればどのような発現系でも適当である。他のベクターでも、特定の発現系に最適に使用されるように設計することができる。例えば、哺乳動物の発現系を選択したとするならば、そのときはタンパク質コード領域をその特定の系に対するコドン用語に最適化すべきであろう。また、発現は、イオン交換クロマトグラフィーにより混入したタンパク質からの分離を可能にするために前述したような酸性又は塩基性アミノ酸の繰り返し等の同定及び／又は精製用のより小さな親和性のタグを使用することにより、又は金属キレートマトリックスでの精製用のポリヒスチジン配列を包含させることにより改良することができる。哺乳動物系からの分泌を改良しうるさらなる改変（現在の大腸菌ベクターは、細胞内タンパク質生産用に設計されている）は、培地中又はトランスジェニック動物の乳中への分泌を促進するために、カルシトニンに分泌性リーダー配列を付加することであろう。このようなリーダー配列は、天然のプロセシング酵素により分泌過程中に除去されることが好ましい。ペプチド融合タンパク質を発現させるために用いられうる発現系の例としては、細菌（大腸菌、ビー．ズブチリス等）、酵母（エス．セレビシエ、ピー．パストラリス等）、昆虫細胞（エス．フルギペルダ）、哺乳動物発現系（チャイニーズハムスター卵巣、ベイビーハムスター腎臓等）、乳又はその他の体液中へのトランスジェニック哺乳動物発現（好ましくはブタ、ウシ、ヒッジ、ヤギ、ウサギ等）及び植物（ジャガイモ、トウモロコシ等）が挙げられる。大腸菌発現系の場合、開始メチオニンは発現産物内に保持される。したがって、目的のペプチドがその配列中に付加的メチオニンを含まないものである場合、この開始メチオニンは臭化シアンを用いて除去することができる。このようなペプチドの一例は、カルシトニンである。発現は、リーダー配列、コドン用語、インテイン又はその変異体及び精製ストラテジーの適当な選択により、これらの系のいずれに対しても、そして細胞内又は細胞外の生産に対しても最適化することができよう。当業者は、本発明がインテイン又は供給源としてのいかなる種の特定の明示に拘束されないことを認めるであろう。例えば、インテインの分子全体を使用する必要はないかも知れず、該配列の多くは所望のプロセスに無関係かも知れないし、恐らく該分子のほとんどは、機能的に必要ないであろう。実際、「インテイン」の定義から外れる他のタンパク質でも、標的ペプチドのカルボキシ末端のペプチド結合を適当なチオール基に転移し、こうして付随的アミド化を伴う切断に必要なチオエステル基を創出することができうる。チオエステルは、ペプチド結合又は酸素エステルのいずれかと比較して相対的に反応性に富む化学基であり、したがって、温和な反応条件下で容易にアミド類に変換される。融合ペプチドがカルボキシ末端アミドに変換されうる正常の切断及び放出経路には、二つのポイントがある。第１のそしておそらくは最も好適なポイントは、ペプチドがチオール試薬の添加により融合パートナーから放出された後である。好ましい試薬は、ジチオスレイトールであるが、幾つものイオウ含有還元剤も有効に機能できるであろう。この反応は本質的にはチオール交換反応である。そこでは、ペプチドのカルボキシ末端とインテインのシステインのイオウとの間で形成されたチオールエステルがジチオスレイトールのイオウ原子の一つに転移する。いかなる化学反応とも同様に、インテインのアミノ末端のシステインのアミンと同じアミノ酸残基のイオウとの間のアシル基シフト反応は平衡である。前述の酵母インテインでは、この平衡は、アミン基に偏ってシフトしており、チオエステルはマイナーな成分である。添加したチオール試薬は、このチオエステル種を除去する。したがって、事実上すべてのペプチドが遊離のチオエステルとして放出されるまで、さらにチオエステルを生成する方向に反応を進める。放出されたチオエステルは、水による加水分解（望ましくない遊離の酸を生成する）に比較的安定であり、したがって、アミド生成を促進するいかなる化学的条件による切断にも適する。ペプチドがチオエステルを示す第２のポイントは、インテイン自体に対するものであるが、前述したように、この種はマイナーな成分である。しかしながら、ここでさえも、アミド化された種としてのペプチドの同時放出を可能にする化学的条件を設計することができるであろう。付随的アミド化を伴うチオエステル切断を有利にすると予測される条件は多く、下記のものは可能な試薬及び反応の代表的な選択の例示を意味するに過ぎない。化学的には、アミドは、アンモニア及び関連化合物によるチオエステルの切断により形成させることができる。これは、カルボニルの正の荷電が増強される条件（これは隣接するイオウ原子の効果である）を必要とし、アンモニア窒素上の孤立電子対が利用可能である。水溶液中では、リン酸アンモニウム又は硫酸アンモニウム等の塩により提供される正に荷電したアンモニウムイオンが荷電を持たないアンモニア、すなわち、反応性種と平衡状態にあり、そして遊離アンモニアの濃度は水素イオン濃度の低下につれて上昇する。したがって、アミド生産物の形成を促進する反応は、例えば、ｐＨ４．０〜６．０の相対的に低いｐＨ値で進行し易いけれども、平衡がアンモニアの生成に有利なように顕著にシフトする６．０〜９．０の範囲では又は１０．０でさえも、ｐＨが上昇するにつれてより迅速に起こるであろうことが予想される。その最適の範囲は、ペプチド基質それ自体が耐えられる最高のｐＨと、許容されうる速度でこの反応がなお進行する最低のｐＨとの間の中間である。この最適範囲は、ペプチド自体の配列ならびに融合パートナーの性質及びプロセス関連、特に精製関連の諸問題に関する他の要因により決定されるであろう。同様の条件及び制約は、切断／アミド化反応が同時に起ころうが連続して起ころうが当てはまるように思われる。水系及び非水系の両方で当業者が予見可能な他の多くの化学的条件であって、所望の反応を達成可能なものが存在する。前述のものは、好適な方法の例示を単に意味し、これらの他の可能なアプローチを排除することを意図するものではない。本発明を下記実施例により記載するが、これはいかなる方法でも本発明を限定するものとして解釈すべきではない。実施例１：グリシン伸長サケカルシトニン１．１．クローニングストラテジーニューイングランドバイオラブズ(New England Biolabs)より入手可能な、翻訳開始用ＮｄｅＩ部位及びインテインに直接隣接するＳａｐＩ部位を含むベクターｐＣＹＢ１を用いて、グリシンで伸長したサケカルシトニン（ｓＣＴ−Ｇ）をクローニングし発現させた。このｓＣＴ−Ｇコード配列は、１０３塩基及び１０４塩基の二つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドとして合成された。そのコドン用語は、大腸菌での発現用に最適化した。二つの鎖のアニーリングにより、ＮｄｅＩ部位（５’末端）及びＳａｐＩ部位（３’末端）に相補的な５’突出部が生成した。この二本鎖オリゴヌクレオチドを、ＮｄｅＩ及びＳａｐＩで消化したｐＣＹＢ１中に挿入した。この融合遺伝子の発現は、Ｐ_tacプロモーターの制御下にあり、このベクター上のｌａｃ１^q遺伝子の存在に依存するＩＰＴＧにより調節される。１．２．融合タンパク質の発現及び分析ｓＣＴ−Ｇを含むｐＣＹＢ１ベクターを、ＤＨ５−α中にトランスフェクトし、細胞を生育させ、ＩＰＴＧで誘導し、回収して超音波処理により溶解した。発現した融合物は、キチンアガロース上で捕捉し、これを洗浄し、次いで、ＳＤＳ −ＰＡＧＥ試料緩衝液中で煮沸した。上清を１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動し、タンパク質をクーマシー染色で可視化し、又はＮ末端配列決定用にＰＶＤＦ膜にエレクトロブロットした。配列分析により、ｓＣＴ−ＧはＳｅｒ２及びＴｈｒ６の２つの位置でＮ末端が切断されていた。１．３．融合タンパク質の切断及びペプチドのアミド化キチンアガロースに結合した融合物を、２０ｍＭヘペス，ｐＨ８．０、４０ｍＭのＤＴＴ（切断緩衝液Ａ）又は３．０Ｍの炭酸水素アンモニウムを補充した切断緩衝液Ａ（切断緩衝液Ｂ）で洗浄し、４℃で一晩インキュベートした。放出されたｓＣＴ−Ｇをカラムから洗浄し、陽イオン交換樹脂上に捕捉し、次いで塩の工程で溶出した。トリプシンで消化した後のＣ１８ＲＰ−ＨＰＬＣ分析により、切断緩衝液Ｂで生成した産物は、９０％を越えるアミド化Ｃ末端を含んでいたのに対し、切断緩衝液Ａでの産物は、カルボキシＣ末端とおそらくインテインＮ末端に由来する１つのＣｙｓ残基だけ伸長した付加物との混合物を有することが示された（図１）。実施例２：黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）２．１クローニングストラテジークローニングは、オリゴヌクレオチドがＬＨＲＨコード配列(タン（Tan，L.）とラウッソー（Rousseau，P.）Biochem．Biophys．Res．Com．109:1061-1071(19 82))を含むことを除いて、ｓＣＴ−Ｇについて記載されたとおり正確に行なった。２．２．融合タンパク質の発現及び分析ｓＣＴ−Ｇについて記載したように、Ｎ末端配列決定により、このＬＨＲＨは大腸菌開始シグナルから持ち続けた１個のＭｅｔ残基だけＮ末端で伸長されたことが示された。２．３．融合タンパク質の切断及びペプチドのアミド化ＬＨＲＨ融合物を、最終の陽イオン捕捉工程までｓＣＴ−Ｇ融合物と同様に処理した。カラム洗浄物を電子噴霧質量分析計に直接適用し、データを親イオンの質量を与えるように再編した（図２）。切断緩衝液Ｂ（実施例１で記載されたもの）由来のＬＨＲＨは、Ｍｅｔを伸長したアミド化分子と一致する１３３１Ｄａの質量を有する親イオンを生じた。切断緩衝液Ａ（実施例１で記載されたもの）由来のＬＨＲＨは、Ｍｅｔを伸長した遊離酸と一致する１３３２Ｄａの親イオン質量を生じた。この１Ｄａの差は、アミドとカルボン酸の間の予想される質量差である。実施例３ヒトアミリンのクローニングニューイングランドバイオラブズ(NEB)製のＩＭＰＡＣＴＩ（アフィニティーキチン結合タグを用いるインテイン介在精製）タンパク質精製系は、四つの大腸菌発現ベクターを提供する。それらは利用可能なクローニング部位が異なっている。ヒトアミリンは、翻訳開始用ＮｄｅＩ部位及びインテインに直接隣接するＳａｐＩ部位を含むＮＥＢベクターｐＣＹＢ１を用いてクローニングする。ヒトアミリン配列を、それぞれ１１５塩基及び１１６塩基の二つの相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドとして合成する。そのコドン用語は大腸菌での発現用に最適化する。二つの鎖をアニーリングすると、ＮｄｅＩ部位（５’末端）及びＳａｐＩ部位（３’末端）に相補的な５’突出部が生成する。この二本鎖オリゴヌクレオチドを、ＮｄｅＩ及びＳａｐＩの両方で前もって消化しておいたｐＣＹＢ１に直接挿入することができる。ＰＣＹＢ１：ヒトアミリン：実施例４大腸菌におけるペプチド融合タンパク質の発現ならびに融合タンパク質及び放出ペプチドの精製に関する一般的プロトコル細菌での発現は、標準的方法（マニアティス（Maniatis）ら、前述）の範囲内のいずれか一つを用いて、発現構築物での細胞の形質転換を必要とする。細胞の生育後、誘導可能プロモーター、例えばβ−ガラクトシダーゼプロモーターとＩＰＴＧ等の低分子誘導物質との組合せを用いて、標的融合タンパク質の発現を誘導するのが通常である。次に、細胞の収穫及び破砕の後にこの融合タンパク質を回収し、次いで、アフィニティークロマトグラフィーにより精製する。これは、清澄化した細胞溶解物を、融合タンパク質がそれに結合するリガンドを保持する適当なアフィニティーマトリックスのカラムを通過させる工程を含むのが最も普通である。次いで、混入物をマトリックスから洗浄した後、融合タンパク質又は結合した融合タンパク質のイン・サイチュ切断のいずれかを特異的に溶出する。例えば、実施例２及び３で記載したＩｍｐａｃｔベクターを用いて、リゾチームを含む融合タンパク質を陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製する。この場合において、融合タンパク質の溶出を促進しない切断条件を見出し得ない限り、イン・サイチュでの切断は、おそらく選択肢とはならないであろう。これらの状況下では、溶液相での切断が必要となるであろう。マトリックスに結合している間の融合タンパク質の切断は、その後のペプチドの精製を簡単にする。融合タンパク質の切断は、１０ｍＭのＤＴＴ等のチオールアシル受容体の直接添加により行なってチオエステル中間体を生じさせることができ、これを次いで６．０より上のｐＨでのアンモニア塩での処理によりアミドに変換することができる。また、切断とアミドへの変換を同時に行なうことも、受容体チオールとアンモニア塩の適当な混合物の添加で可能となるであろう。次いで、放出されたペプチドは、必要ならば、溶媒分配及びＨＰＬＣ等の慣用的技術を用いて、さらに精製する。

【手続補正書】【提出日】平成１１年１１月１６日（１９９９．１１．１６）【補正内容】明細書融合タンパク質を使用するアミド化されたペプチドの製造方法本発明は、組換え手段によるペプチドの製造、特に、ただしこれに限定されるものではないが、アミド化のようなカルボキシ末端の修飾を持つペプチドの製造に関する。「ペプチド」とは、アミノ酸の鎖に対し緩やかに適用される用語であり、構成成分のアミノ末端及びカルボキシ末端を介して結合した３ないし１００を越える、多分それ以上の、構成成分の配列に対して恣意的に適用される用語である。天然に存在するペプチドには多くの例があり、それらはホルモン、メッセンジャー、成長因子、抗菌剤、界面活性剤等として機能し、そして医薬及びその他の広範な適用が予見されうる。現在、少なくとも３つの主要なペプチドの供給源がある。すなわち、天然の供給源からの抽出、化学合成及び組換えＤＮＡ構築物で形質転換した生物由来のものである。形質転換した生物を用いる経路の利点は、合成過程が生物学的に忠実であること、化学的に好ましくない配列を合成できること、溶媒等を用いる化学過程を回避できること、及び特により長いペプチドについての費用効果である。組換え技術によるペプチド製造の不利な点は、アミノ酸の短い配列を合成することそして必要な場合はそれを分泌することが不得手である傾向があることである。したがって、工業的利用を考慮した方法の多くは、融合タンパク質を利用する。ここでは、短いペプチド配列は別のタンパク質の上にアミノ末端か又はカルボキシ末端いずれかの伸長物として作られる。これらの融合タンパク質は大量に製造することができ、そして精製を単純化するため融合パートナーの特別な性質を利用することにより精製されることが多いが、ペプチドを回収する際に困難に遭遇しうる。タンパク質は化学的に安定な分子であり、それゆえに定まったアミノ末端及びカルボキシ末端を持つ完全なペプチドを回収するためには、特別の切断ストラテジーを必要とする。広範なタンパク質切断技術が予見されうる。これらは、特定のアミノ酸での化学切断から配列特異的酵素を用いる酵素による切断までにわたる。化学切断の例としては、メチオニン残基の後での臭化シアン切断及びアスパラギン−グリシンというアミノ酸対の間でのヒドロキシルアミン切断が挙げられる。特異的タンパク質配列での切断に適する酵素の例としては、（アスパラギン酸）₄−リジンの配列の後で切断するエンテロキナーゼ及び塩基性アミノ酸であるリジン又はアルギニンの後で切断するトロンビンが挙げられる。これらの切断ストラテジーの両方に共通の問題は、配列の制約がペプチド内の中間部位の存在と正しいアミノ末端を創出する必要性の両方に影響を及ぼすことである。例えば、臭化シアンは、ペプチドに中間のメチオニンが存在しない場合のみに使用され、トロンビンは、塩基性アミノ酸の後のいくつかの異なる部位で切断可能である。酵素による切断は、プロセス経済の観点からさらなる問題を有する。酵素は、許容可能でかつ実証された供給源（エンテロキナーゼの一般的供給源は、ウシの腸の内皮である）に由来せねばならず、かつ、経済的に許容されうる量で入手可能でなければならない。カルボキシ末端のアミド化は、潜在的に市場価値を有する多くの生物学的に活性なペプチドに見出される共通の翻訳後修飾である。カルシトニン、マガイニン等が例示される。多くの例において、例えば、天然のアミド化されたペプチドであるカルシトニンは、非アミド化版のおよそ２０００倍の活性がある。カルボキシ末端のアミド化ペプチドを製造するように設計された多種類の化学的及び生物学的方法がある。しかしながら、いかなる余分のプロセス工程を用いても、それらはいずれも最終産物の全費用に追加される点で不利である。本発明は、組換え系において、融合タンパク質のアミノ末端伸長物としてペプチドを製造する方法を記載する。本発明者らは、融合タンパク質からのペプチドの切断とカルボキシ−アミド化のようなペプチドの修飾が単一のプロセスの中で一連の連結した反応として起こることが可能な新規な方法を提供する。そのようなアプローチは、別々の切断工程の必要性により引き起こされる不都合なしに、生物学的発現系における低コストと合成の忠実性という利益を得る。こうして、第１の側面において、本発明は、融合タンパク質の一部としてペプチドを発現させる工程、それに続きイオウ含有還元剤等のアシル受容体により融合タンパク質から該ペプチドを放出させる工程を含むペプチドの製造方法を提供する。この融合タンパク質の少なくとも一部は、アシル部分として、近くにいるイオウ原子のような適当な受容体へ該ペプチドを移転しチオエステルを生成させる転移反応を触媒することができる分子であることが適当である。好ましい態様においては、ペプチドは、融合タンパク質から放出後に、例えば、そのカルボキシ末端でアミド化される等、化学的に修飾される。アミド化工程は適当なｐＨでアンモニウムイオンの供給源の存在下で行ない、そしてアミド化工程がペプチドの放出と同時に起こるようにするのが適当である。これらの方法を用いて調製されうるアミド化ペプチドの例としては、サケカルシトニン、ヒトカルシトニン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、オキシトシン、ガストリンニューロペプチドＹ、バソプレッシン、コルチコトロピン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチド、ガストリン、Ｄ−ｔｙｒ−ｔｒｐ−ｇｌｙ、ｐｈｅ−ｇｌｙ−ｐｈｅ−ｇｌｙ、ｇｌｙ−ｐｈｅ−ｇｌｙ、メラニン細胞刺激ホルモン前駆体、セクレチン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、アミリン、サブスタンスＰ、膵臓ポリペプチド、コレシストキニン、ガストリン分泌因子、ｐｈｅ−ｈｉｓ−ｉｌｅ、ｐｈｅ−ｔｙｒ−ｔｙｒ、サバギン、マストパリンＭ、カエルレイン及びＦＭＲＦアミドが挙げられる。しかしながら、遊離のカルボン酸末端基の生成を結果として生ずる、アンモニアの非存在下でのペプチドの単純な加水分解を行なうことも可能である。これは、本発明の方法を、医薬又はその他の適用のために遊離のカルボキシ末端を有するペプチドの商業的製造に適当なものとする。このようなペプチドの例としては、ヒルログ、マガイニン、チモシンアルファ−１、脳栄養ペプチド、房栄養ペプチド、又は殺菌性／透過性増加タンパク質が挙げられる。本発明の方法は、例えば、融合タンパク質としてタンパク質を製造するように設計された市販の発現ベクターを利用することができる。このベクターは、単純な化学反応によりその融合パートナーからタンパク質を遊離することを可能とする改変された自己スプライシングタンパク質であるインテインを組み込んでいる。本発明は、改変した化学的条件／工程を利用して、融合タンパク質の切断を生じさせ、それにより所望のペプチドを遊離させる。そしてこのペプチドは、例えば、カルボキシ末端の活性化により、修飾することができる。インテインは、アミノ末端及びカルボキシ末端の両方に隣接するタンパク質配列とともに発現するタンパク質である。そのアミノ末端配列及びカルボキシ末端配列は、エキソン及びイントロンのＤＮＡの名称に合わせてエキステインと称されている。インテインの新生のファミリーの外観上典型的なメンバーは、酵母由来のＶＭＡ１遺伝子産物である。これは、約５０ｋＤａの分子量であり、アミノ末端（システイン）及びカルボキシ末端（ヒスタミン及びアスパラギン）に必須のアミノ酸を含んでいる。さらに、カルボキシ末端のエキステインは、システインで開始しなければならない。翻訳が完了した後のある点で、アミノ末端ペプチド結合は切断され、エキステインは隣接するシステインのイオウ原子に転移して、チオエステルを生成する。次いで、この結合はカルボキシ末端エキステインの開始部位のシステインと交換し、次いで、隣接するアスパラギンの関与によりインテインのこの末端のペプチド結合と交換する。これらの協奏反応の全体としての結果は、２つのエキステインが途切れることなく結合し、そしてインテインが放出されるということである。インテインのいずれか一方の末端の必須の基とエキステインの近位の末端が規則的に置換された一連の変異体の分析の後に、これらの反応の詳細が理解されるに至った。この知見により、アミノ末端エキステインをいかなる他のタンパク質にも置換可能な変異体インテインの設計が可能となり、そしてその自己スプライシング機能は作動しないようにされた。しかしながら、その結果生じる融合タンパク質を切断することは、還元剤ジチオスレイトールのような外来の化学剤の添加によりいまだ可能である。融合タンパク質は添加した還元剤とのチオエステルとして遊離し、このチオエステルは溶液中で徐々に加水分解して、遊離の酸になる。カルシトニンは、本発明に記載された方法を用いる製造に適する、医学上かつ商業上重要なペプチドの一例である。それは、３２個のアミノ酸を含み、カルボキシ末端でアミド化されている。その機能的活性及びアミノ酸配列は、種間で高度に保存されている。こうして、元来天然資源からほとんど得られていたが現在では直接合成で製造されているサケカルシトニンは、広範に臨床的に使用されている。過去において、治療は、パジェット病及び低カルシウム性ショックに集中していた。しかしながら、最近、閉経後の女性における骨粗しょう症を治療するために大量の材料の需要がある。この適用はかなりの量の材料を必要とし、製造コストを益々重要な要因とする傾向を強めている。インテインベクターを用いてカルシトニンを作るためには、改変されたインテインの適当な５’部位での挿入用に設計された制限部位に挟まれたカルシトニン配列をコードする相補的オリゴヌクレオチドを調製することが必要である。これらの部位は、該ペプチドのコード配列が発現タンパク質の残りと同じコードフレーム中にあるように選択されなければならない。好ましいオリゴヌクレオチドは当業者に知られたいかなる方法でも作製することができる。これらには、最も明らかな直接合成及び便利な制限部位を含むように設計されたプライマーを用いる天然の配列からのポリメラーゼ連鎖反応増幅が含まれる。次いで、このＤＮＡ構築物を適当な発現系中に形質転換させ、その結果生ずる融合タンパク質を収穫する。この系のさらなる改良において、融合タンパク質は、アフィニティー又はその他のクロマトグラフィー法により融合タンパク質、従ってペプチドの同定及び／又は精製を可能にする標識をも含有する。適当な標識の例としては、特異的キチン結合ドメイン又はその一部、酸性又は塩基性アミノ酸の繰り返し、ポリヒスチジン配列、グルタチオンＳトランスフェラーゼ及びリゾチームが挙げられる。例えば、インテインのカルボキシ末端を特異的キチン結合ドメインと融合させることができる。これは、キチンビーズが充填されたカラムに強固に結合し、融合タンパク質そのもののアフィニティー精製に使用することができる。徹底的に洗浄した後、次に、カラムを適当な切断試薬で処理して、遊離する標的ペプチドを溶出することができる。前述のインテイン系ベクターは、大腸菌に使用するために設計されたものであるけれども、商業的規模で操作可能なものであればどのような発現系でも適当である。他のベクターでも、特定の発現系に最適に使用されるように設計することができる。例えば、哺乳動物の発現系を選択したとするならば、そのときはタンパク質コード領域をその特定の系に対するコドン用語に最適化すべきであろう。また、発現は、イオン交換クロマトグラフィーにより混入したタンパク質からの分離を可能にするために前述したような酸性又は塩基性アミノ酸の繰り返し等の同定及び／又は精製用のより小さな親和性のタグを使用することにより、又は金属キレートマトリックスでの精製用のポリヒスチジン配列を包含させることにより改良することができる。哺乳動物系からの分泌を改良しうるさらなる改変（現在の大腸菌ベクターは、細胞内タンパク質生産用に設計されている）は、培地中又はトランスジェニック動物の乳中への分泌を促進するために、カルシトニンに分泌性リーダー配列を付加することであろう。このようなリーダー配列は、天然のプロセシング酵素により分泌過程中に除去されることが好ましい。ペプチド融合タンパク質を発現させるために用いられうる発現系の例としては、細菌（大腸菌、ビー．ズブチリス等）、酵母（エス．セレビシエ、ピー．パストラリス等）、昆虫細胞（エス．フルギペルダ）、哺乳動物発現系（チャイニーズハムスター卵巣、ベイビーハムスター腎臓等）、乳又はその他の体液中へのトランスジェニック哺乳動物発現（好ましくはブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ等）及び植物（ジャガイモ、トウモロコシ等）が挙げられる。大腸菌発現系の場合、開始メチオニンは発現産物内に保持される。したがって、目的のペプチドがその配列中に付加的メチオニンを含まないものである場合、この開始メチオニンは臭化シアンを用いて除去することができる。このようなペプチドの一例は、カルシトニンである。発現は、リーダー配列、コドン用語、インテイン又はその変異体及び精製ストラテジーの適当な選択により、これらの系のいずれに対しても、そして細胞内又は細胞外の生産に対しても最適化することができよう。当業者は、本発明がインテイン又は供給源としてのいかなる種の特定の明示にも拘束されないことを認めるであろう。例えば、インテインの分子全体を使用する必要はないかも知れず、該配列の多くは所望のプロセスに無関係かも知れないし、恐らく該分子のほとんどは、機能的に必要ないであろう。実際、「インテイン」の定義から外れる他のタンパク質でも、標的ペプチドのカルボキシ末端のペプチド結合を適当なチオール基に転移し、こうして付随的アミド化を伴う切断に必要なチオエステル基を創出することができうる。チオエステルは、ペプチド結合又は酸素エステルのいずれかと比較して相対的に反応性に富む化学基であり、したがって、温和な反応条件下で容易にアミド類に変換される。融合ペプチドがカルボキシ末端アミドに変換されうる正常の切断及び放出経路には、二つのポイントがある。第１のそしておそらくは最も好適なポイントは、ペプチドがチオール試薬の添加により融合パートナーから放出された後である。好ましい試薬は、ジチオスレイトールであるが、幾つものイオウ含有還元剤も有効に機能できるであろう。この反応は本質的にはチオール交換反応である。そこでは、ペプチドのカルボキシ末端とインテインのシステインのイオウとの間で形成されたチオールエステルがジチオスレイトールのイオウ原子の一つに転移する。いかなる化学反応とも同様に、インテインのアミノ末端のシステインのアミンと同じアミノ酸残基のイオウとの間のアシル基シフト反応は平衡である。前述の酵母インテインでは、この平衡は、アミン基に偏ってシフトしており、チオエステルはマイナーな成分である。添加したチオール試薬は、このチオエステル種を除去する。したがって、事実上すべてのペプチドが遊離のチオエステルとして放出されるまで、さらにチオエステルを生成する方向に反応を進める。放出されたチオエステルは、水による加水分解（望ましくない遊離の酸を生成する）に比較的安定であり、したがって、アミド生成を促進するいかなる化学的条件による切断にも適する。ペプチドがチオエステルを示す第２のポイントは、インテイン自体に対するものであるが、前述したように、この種はマイナーな成分である。しかしながら、ここでさえも、アミド化された種としてのペプチドの同時放出を可能にする化学的条件を設計することができるであろう。付随的アミド化を伴うチオエステル切断を有利にすると予測される条件は多く、下記のものは可能な試薬及び反応の代表的な選択の例示を意味するに過ぎない。化学的には、アミドは、アンモニア及び関連化合物によるチオエステルの切断により形成させることができる。これは、カルボニルの正の荷電が増強される条件（これは隣接するイオウ原子の効果である）を必要とし、アンモニア窒素上の孤立電子対が利用可能である。水溶液中では、リン酸アンモニウム又は硫酸アンモニウム等の塩により提供される正に荷電したアンモニウムイオンが荷電を持たないアンモニア、すなわち、反応性種と平衡状態にあり、そして遊離アンモニアの濃度は水素イオン濃度の低下につれて上昇する。したがって、アミド生産物の形成を促進する反応は、例えば、ｐＨ４．０〜６．０の相対的に低いｐＨ値で進行し易いけれども、平衡がアンモニアの生成に有利なように顕著にシフトする６．０〜９．０の範囲では又は１０．０でさえも、ｐＨが上昇するにつれてより迅速に起こるであろうことが予想される。その最適の範囲は、ペプチド基質それ自体が耐えられる最高のｐＨと、許容されうる速度でこの反応がなお進行する最低のｐＨとの間の中間である。この最適範囲は、ペプチド自体の配列ならびに融合パートナーの性質及びプロセス関連、特に精製関連の諸問題に関する他の要因により決定されるであろう。同様の条件及び制約は、切断／アミド化反応が同時に起ころうが連続して起ころうが当てはまるように思われる。水系及び非水系の両方で当業者が予見可能な他の多くの化学的条件であって、所望の反応を達成可能なものが存在する。前述のものは、好適な方法の例示を単に意味し、これらの他の可能なアプローチを排除することを意図するものではない。本発明を下記実施例により記載するが、これはいかなる方法でも本発明を限定するものとして解釈すべきではない。実施例１：グリシン伸長サケカルシトニン１．１．クローニングストラテジーニューイングランドバイオラブズ(New England Biolabs)より入手可能な、翻訳開始用ＮｄｅＩ部位及びインテインに直接隣接するＳａｐＩ部位を含むベクターｐＣＹＢ１を用いて、グリシンで伸長したサケカルシトニン（ｓＣＴ−Ｇ）をクローニングし発現させた。このｓＣＴ−Ｇコード配列は、１０３塩基及び１０４塩基の二つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドとして合成された。そのコドン用語は、大腸菌での発現用に最適化した。二つの鎖のアニーリングにより、ＮｄｅＩ部位（５’末端）及びＳａｐＩ部位（３’末端）に相補的な５’突出部が生成した。この二本鎖オリゴヌクレオチドを、ＮｄｅＩ及びＳａｐＩで消化したｐＣＹＢ１中に挿入した。この融合遺伝子の発現は、Ｐ_tacプロモーターの制御下にあり、このベクター上のｌａｃ１^q遺伝子の存在に依存するＩＰＴＧにより調節される。１．２．融合タンパク質の発現及び分析ｓＣＴ−Ｇを含むｐＣＹＢ１ベクターを、ＤＨ５−α中にトランスフェクトし、細胞を生育させ、ＩＰＴＧで誘導し、回収して超音波処理により溶解した。発現した融合物は、キチンアガロース上で捕捉し、これを洗浄し、次いで、ＳＤＳ −ＰＡＧＥ試料緩衝液中で煮沸した。上清を１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動し、タンパク質をクーマシー染色で可視化し、又はＮ末端配列決定用にＰＶＤＦ膜にエレクトロブロットした。配列分析により、ｓＣＴ−ＧはＳｅｒ２及びＴｈｒ６の２つの位置でＮ末端が切断されていた。１．３．融合タンパク質の切断及びペプチドのアミド化キチンアガロースに結合した融合物を、２０ｍＭヘペス，ｐＨ８．０、４０ｍＭのＤＴＴ（切断緩衝液Ａ）又は３．０Ｍの炭酸水素アンモニウムを補充した切断緩衝液Ａ（切断緩衝液Ｂ）で洗浄し、４℃で一晩インキュベートした。放出されたｓＣＴ−Ｇをカラムから洗浄し、陽イオン交換樹脂上に捕捉し、次いで塩の工程で溶出した。トリプシンで消化した後のＣ１８ＲＰ−ＨＰＬＣ分析により、切断緩衝液Ｂで生成した産物は、９０％を越えるアミド化Ｃ末端を含んでいたのに対し、切断緩衝液Ａでの産物は、カルボキシＣ末端とおそらくインテインＮ末端に由来する１つのＣｙｓ残基だけ伸長した付加物との混合物を有することが示された（図１）。実施例２：黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）２．１クローニングストラテジークローニングは、オリゴヌクレオチドがＬＨＲＨコード配列（タン（Tan，L. ）とラウッソー（Rousseau，P.）Biochem．Biophys．Res．Com．109:1061-1071( 1982))を含むことを除いて、ｓＣＴ−Ｇについて記載されたとおり正確に行なった。２．２．融合タンパク質の発現及び分析ｓＣＴ−Ｇについて記載したように、Ｎ末端配列決定により、このＬＨＲＨは大腸菌開始シグナルから持ち続けた１個のＭｅｔ残基だけＮ末端で伸長されたことが示された。２．３．融合タンパク質の切断及びペプチドのアミド化ＬＨＲＨ融合物を、最終の陽イオン捕捉工程までｓＣＴ−Ｇ融合物と同様に処理した。カラム洗浄物を電子噴霧質量分析計に直接適用し、データを親イオンの質量を与えるように再編した（図２）。切断緩衝液Ｂ（実施例１で記載されたもの）由来のＬＨＲＨは、Ｍｅｔを伸長したアミド化分子と一致する１３３１Ｄａの質量を有する親イオンを生じた。切断緩衝液Ａ（実施例１で記載されたもの）由来のＬＨＲＨは、Ｍｅｔを伸長した遊離酸と一致する１３３２Ｄａの親イオン質量を生じた。この１Ｄａの差は、アミドとカルボン酸の間の予想される質量差である。実施例３ヒトアミリンのクローニングニューイングランドバイオラブズ(NEB)製のＩＭＰＡＣＴＩ（アフィニティーキチン結合タグを用いるインテイン介在精製）タンパク質精製系は、四つの大腸菌発現ベクターを提供する。それらは利用可能なクローニング部位が異なっている。ヒトアミリンは、翻訳開始用ＮｄｅＩ部位及びインテインに直接隣接するＳａｐＩ部位を含むＮＥＢベクターｐＣＹＢ１を用いてクローニングする。ヒトアミリン配列（配列番号：２）を、それぞれ１１５塩基及び１１６塩基の二つの相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドとして合成する。そのコドン用語は大腸菌での発現用に最適化する。二つの鎖をアニーリングすると、ＮｄｅＩ部位（５’末端）及びＳａｐＩ部位（３’末端）に相補的な５’突出部が生成する。この二本鎖オリゴヌクレオチドを、ＮｄｅＩ及びＳａｐＩの両方で前もって消化しておいたｐＣＹＢ１（配列番号：１）に直接挿入することができる。ＰＣＹＢ１（配列番号：１）ヒトアミリン（配列番号：２）実施例４大腸菌におけるペプチド融合タンパク質の発現ならびに融合タンパク質及び放出ペプチドの精製に関する一般的プロトコル細菌での発現は、標準的方法（マニアティス（Maniatis）ら、前述）の範囲内のいずれか一つを用いて、発現構築物での細胞の形質転換を必要とする。細胞の生育後、誘導可能プロモーター、例えばβ−ガラクトシダーゼプロモーターとＩＰＴＧ等の低分子誘導物質との組合せを用いて、標的融合タンパク質の発現を誘導するのが通常である。次に、細胞の収穫及び破砕の後にこの融合タンパク質を回収し、次いで、アフィニティークロマトグラフィーにより精製する。これは、清澄化した細胞溶解物を、融合タンパク質がそれに結合するリガンドを保持する適当なアフィニティーマトリックスのカラムを通過させる工程を含むのが最も普通である。次いで、混入物をマトリックスから洗浄した後、融合タンパク質又は結合した融合タンパク質のイン・サイチュ切断のいずれかを特異的に溶出する。例えば、実施例２及び３で記載したＩｍｐａｃｔベクターを用いて、リゾチームを含む融合タンパク質を陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製する。この場合において、融合タンパク質の溶出を促進しない切断条件を見出し得ない限り、イン・サイチュでの切断は、おそらく選択肢とはならないであろう。これらの状況下では、溶液相での切断が必要となるであろう。マトリックスに結合している間の融合タンパク質の切断は、その後のペプチドの精製を簡単にする。融合タンパク質の切断は、１０ｍＭのＤＴＴ等のチオールアシル受容体の直接添加により行なってチオエステル中間体を生じさせることができ、これを次いで６．０より上のｐＨでのアンモニア塩での処理によりアミドに変換することができる。また、切断とアミドへの変換を同時に行なうことも、受容体チオールとアンモニア塩の適当な混合物の添加で可能となるであろう。次いで、放出されたペプチドは、必要ならば、溶媒分配及びＨＰＬＣ等の慣用的技術を用いて、さらに精製する。請求の範囲１．融合タンパク質の一部としてのペプチドを発現させる工程、その後、アシル受容体により該融合タンパク質から該ペプチドを放出させる工程を含んで成るペプチドの製造方法。２．該アシル受容体がイオウ含有還元剤である、請求項１記載の方法。３．該融合タンパク質の少なくとも一部が、適当な受容体にアシル部分としてペプチドを移転しチオエステルを形成させる転移反応を触媒することができる分子である、請求項１又は請求項２記載の方法。４．該適当な受容体が近位のイオウ原子である、請求項３記載の方法。５．該ペプチドが、融合タンパク質から放出された後にそのカルボキシ末端でアミド化されるものである、請求項１〜請求項４いずれか１項に記載の方法。６．該アミド化工程が、適当なｐＨでアンモニウムイオンの供給源の存在下に行なわれるものである、請求項５記載の方法。７．該アミド化工程がペプチドの放出と同時に起こるものである、請求項５又は請求項６記載の方法。８．該ペプチドが、サケカルシトニン、ヒトカルシトニン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、オキシトシン、ガストリンニューロペプチドＹ、バソプレッシン、コルチコトロピン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチド、ガストリン、Ｄ−ｔｙｒ−ｔｒｐ−ｇｌｙ、ｐｈｅ−ｇｌｙ−ｐｈｅ−ｇｌｙ、ｇｌｙ−ｐｈｅ−ｇｌｙ、メラニン細胞刺激ホルモン前駆体、セクレチン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、アミリン、サブスタンスＰ、膵臓ポリペプチド、コレシストキニン、ガストリン分泌因子、ｐｈｅ−ｈｉｓ−ｉｌｅ、ｐｈｅ−ｔｙｒ−ｔｙｒ、サバギン、マストパリンＭ、カエルレイン又はＦＭＲＦアミドである請求項１〜請求項７いずれか１項に記載の方法。９．該ペプチドがサケカルシトニン又はヒトカルシトニンである請求項８記載の方法。１０．該融合タンパク質が改変されたインテイン配列の少なくとも一部を含むものである、請求項３〜請求項９いずれか１項に記載の方法。１１．インテイン配列又はその一部の該改変が、自己スプライシング機能が作動しなくなるという結果を生ずるものである、請求項１０記載の方法。１２．該インテイン配列又はその一部が酵母由来のＶＭＡ１遺伝子に由来するものである、請求項１０又は請求項１１記載の方法。１３．該ペプチドが加水分解により融合タンパク質から放出されるものである、請求項１〜請求項４いずれか１項に記載の方法。１４．該ペプチドがヒルログ、マガイニン、チモシンアルファ−１、脳栄養ペプチド、房栄養ペプチド又は殺菌性／透過性増強タンパク質である請求項１３記載の方法。１５．該融合タンパク質が、アフィニティー又はその他のクロマトグラフィー法により融合タンパク質の同定及び／又は精製を可能にする標識を含むものである、請求項１〜請求項１４いずれか１項に記載の方法。１６．該標識がアフィニティー標識である請求項１５記載の方法。１７．該アフィニティー標識が特異的キチン結合ドメイン又はその一部、酸性又は塩基性アミノ酸の繰り返し、ポリヒスチジン配列、グルタチオンＳトランスフェラーゼ及びリゾチームを含むものである請求項１６記載の方法。１８．該融合タンパク質が細菌、酵母、植物全体を含む植物組織、昆虫細胞、哺乳動物細胞、又はトランスジェニック哺乳動物の体液中で発現されるものである、請求項１〜請求項１７いずれか１項に記載の方法。１９．該融合タンパク質が大腸菌又はビー．ズブチリスで発現されるものである、請求項１８記載の方法。２０．該融合タンパク質が大腸菌で発現され、該ペプチドがその配列中にメチオニンを含まない場合に臭化シアンで処理されるものである、請求項１９記載の方法。２１．該融合タンパク質がエス．セレビシエ又はピー．パストラリス中で発現されるものである、請求項１８記載の方法。２２．該融合タンパク質がチャイニーズハムスター卵巣細胞又はベイビーハムスター腎臓細胞中で発現されるものである、請求項１８記載の方法。２３．該融合タンパク質がトランスジェニックジャガイモ組織又はトランスジェニックトウモロコシ組織で発現されるものである、請求項１８記載の方法。２４．該融合タンパク質がトランスジェニックブタ、トランスジェニックウシ、トランスジェニックヒツジ、トランスジェニックヤギ又はトランスジェニックウサギの乳中に発現されるものである、請求項１８記載の方法。２５．該融合タンパク質がエス．フルギペルダ細胞中で発現されるものである、請求項１８記載の方法。２６．該融合タンパク質をコードする配列が分泌性リーダー配列をも含むものである、請求項１〜請求項２５いずれか１項に記載の方法。２７．該分泌性リーダーが分泌中に天然のプロセシング酵素により除去されるものである、請求項２６記載の方法。２８．請求項１〜請求項４、請求項８〜請求項１７、請求項２６又は請求項２７いずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物。２９．ベクターの形態で存在する、請求項２８記載のＤＮＡ構築物。３０．請求項２８又は請求項２９記載のＤＮＡ構築物で形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞。３１．請求項１８〜請求項２３に記載の特徴のいずれか一つ又は二つ以上により改変された請求項３０記載の宿主細胞。３２．請求項２８記載のＤＮＡ構築物をそのゲノムに組み込まれた、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。３３．トランスジェニックブタ、トランスジェニックウシ、トランスジェニックヒツジ、トランスジェニックヤギ又はトランスジェニックウサギである請求項３２記載のトランスジェニック哺乳動物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:19） 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．融合タンパク質の一部としてのペプチドを発現させる工程、その後、イオウ含有還元剤等のアシル受容体により該融合タンパク質から該ペプチドを放出させる工程を含んで成るペプチドの製造方法。２．該融合タンパク質の少なくとも一部が、近位のイオウ原子等の適当な受容体にアシル部分としてペプチドを移転しチオエステルを形成させる転移反応を触媒することができる分子である、請求項１記載の方法。３．該ペプチドが、融合タンパク質から放出された後にそのカルボキシ末端でアミド化されるものである、請求項１又は請求項２記載の方法。４．該アミド化工程が、適当なｐＨでアンモニウムイオンの供給源の存在下に行なわれるものである、請求項３記載の方法。５．該アミド化工程がペプチドの放出と同時に起こるものである、請求項３又は請求項４記載の方法。６．該ペプチドが、サケカルシトニン、ヒトカルシトニン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、オキシトシン、ガストリンニューロペプチドＹ、バソプレッシン、コルチコトロピン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチド、ガストリン、Ｄ−ｔｙｒ−ｔｒｐ−ｇｌｙ、ｐｈｅ−ｇｌｙ−ｐｈｅ−ｇｌｙ、ｇｌｙ−ｐｈｅ−ｇｌｙ、メラニン細胞刺激ホルモン前駆体、セクテチン（Sectetin）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、アミリン、サブスタンスＰ、膵臓ポリペプチド、コレシストキニン、ガストリン分泌因子、ｐｈｅ−ｈｉｓ−ｉｌｅ、ｐｈｅ−ｔｙｒ−ｔｙｒ、サバギン、マストパリンＭ、カエルレイン又はＦＭＲＦアミドである請求項１〜請求項５いずれか１項に記載の方法。７．該ペプチドがサケカルシトニン又はヒトカルシトニンである請求項６記載の方法。８．該融合タンパク質が改変されたインテイン配列の少なくとも一部を含むものである、請求項２〜請求項７いずれか１項に記載の方法。９．インテイン配列又はその一部の該改変が、自己スプライシング機能が作動しなくなるという結果を生ずるものである、請求項８記載の方法。１０．該インテイン配列又はその一部が酵母由来のＶＭＡ１遺伝子に由来するものである、請求項８又は請求項９記載の方法。１１．該ペプチドが加水分解により融合タンパク質から放出されるものである、請求項１又は請求項２記載の方法。１２．該ペプチドがヒルログ、マガイニン、チモシンアルファ−１、脳栄養ペプチド、房栄養ペプチド又は殺菌性／透過性増強タンパク質である請求項１１記載の方法。１３．該融合タンパク質が、アフィニティー又はその他のクロマトグラフィー法により融合タンパク質の同定及び／又は精製を可能にする標識を含むものである、請求項１〜請求項１２いずれか１項に記載の方法。１４．該標識がアフィニティー標識である請求項１３記載の方法。１５．該アフィニティー標識が特異的キチン結合ドメイン又はその一部、酸性又は塩基性アミノ酸の繰り返し、ポリヒスチジン配列、グルタチオンシンテターゼ及びリゾチームを含むものである請求項１４記載の方法。１６．該融合タンパク質が細菌、酵母、植物全体を含む植物組織、昆虫細胞、哺乳動物細胞、又はトランスジェニック哺乳動物の体液中で発現されるものである、請求項１〜請求項15いずれか１項に記載の方法。１７．該融合タンパク質が大腸菌又はビー．ズブチリスで発現されるものである、請求項１５記載の方法。１８．該融合タンパク質が大腸菌で発現され、該ペプチドがその配列中にメチオニンを含まない場合に臭化シアンで処理されるものである、請求項１７記載の方法。１９．該融合タンパク質がエス．セレビシエ又はピー．パストラリス中で発現されるものである、請求項１５記載の方法。２０．該融合タンパク質がチャイニーズハムスター卵巣細胞又はベイビーハムスター腎臓細胞中で発現されるものである、請求項１５記載の方法。２１．該融合タンパク質がトランスジェニックジャガイモ組織又はトランスジェニックトウモロコシ組織で発現されるものである、請求項１５記載の方法。２２．該融合タンパク質がトランスジェニックブタ、トランスジェニックウシ、トランスジェニックヒツジ、トランスジェニックヤギ又はトランスジェニックウサギの乳中に発現されるものである、請求項１５記載の方法。２３．該融合タンパク質が昆虫細胞、例えばエス．フルギペルダ細胞中で発現されるものである、請求項１５記載の方法。２４．該融合タンパク質をコードする配列が分泌性リーダー配列をも含むものである、請求項１〜請求項２３いずれか１項に記載の方法。２５．該分泌性リーダーが分泌中に天然のプロセシング酵素により除去されるものである、請求項２４記載の方法。２６．請求項１、請求項２、請求項６〜請求項１５、請求項２４又は請求項２５いずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物。２７．ベクターの形態で存在する、請求項２６記載のＤＮＡ構築物。２８．請求項２６又は請求項２７記載のＤＮＡ構築物で形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞。２９．請求項１６〜請求項２１に記載の特徴のいずれか一つ又は二つ以上により改変された請求項２８記載の宿主細胞。３０．請求項２６記載のＤＮＡ構築物をそのゲノムに組み込まれた、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。３１．トランスジェニックブタ、トランスジェニックウシ、トランスジェニックヒツジ、トランスジェニックヤギ又はトランスジェニックウサギである請求項２９記載のトランスジェニック哺乳動物。