KR20240094178A

KR20240094178A - 미생물을 이용한 리그닌 과산화효소의 제조방법

Info

Publication number: KR20240094178A
Application number: KR1020220174988A
Authority: KR
Inventors: 김용환; 백희연
Original assignee: 울산과학기술원
Filing date: 2022-12-14
Publication date: 2024-06-25

Abstract

본 발명은 미생물을 이용한 리그닌 과산화효소의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 미생물에 최적화된 헴 공급, 글루타티온 이황화물 공급 및 pH 조절 등을 통해 불수용성 봉입체를 포함하지 않는 활성화된 리그닌 과산화효소를 생산하는 방법을 확립하였다. 또한, 미생물을 사용한 리그닌 과산화효소 생산의 문제점을 해결하였기에, 저렴한 비용으로 리그닌 과산화효소의 대량 생산이 가능하며 이에 따라, 리그닌을 연구 또는 활용하는 산업분야 전반에 폭넓게 활용될 수 있다.

Description

미생물을 이용한 리그닌 과산화효소의 제조방법{Manufacturing method of lignin peroxidase using microorganisms}

미생물을 이용한 리그닌 과산화효소의 제조방법에 관한 것이다.

리그닌은 나무에서 얻을 수 있는 셀룰로오스 다음으로 풍부한 생물 고분자 물질이지만, 글루코스로 구성된 셀룰로오스와는 달리 방향족 화합물로 구성된 중합체이다. 이 방향족 고분자는 방향족 화합물을 원료로 하는 섬유, 화장품, 식품첨가물 등 연료뿐만 아니라 많은 산업에서 화석원을 대체할 수 있는 재생 가능한 공급원으로서 높은 잠재력을 가지고 있다. 따라서 리그닌의 유용화를 위해 리그닌을 분해하는 많은 연구가 진행되고 있으나, 리그닌의 분해는 무작위화 및 산화된 중합에서 비롯된 구조적 복잡성으로 인해 여전히 어려운 과제이다.

이러한 리그닌을 분해하기 위해 주로 사용되는 리그닌 과산화효소(lignin peroxidase)의 경우, 이를 생산하기 위한 여러가지 노력을 하고 있으나, 대장균을 통해 리그닌 과산화효소를 생산하는 경우, 불수용성 봉입체(inclusion body)를 형성한다는 치명적인 단점이 있다. 이러한 봉입체가 형성된 리그닌은 그대로 사용할 수 없으며, 오랜 시간 및 노동력이 필요한 봉입체 회수법을 통해서야 비로소 사용 가능한 형태로 준비될 수 있다(Applied microbiology and biotechnology, 98(22), 9283-9294). 따라서, 대장균을 통해 리그닌 과산화효소의 대량생산을 가능케 하면서도, 봉입체 형성 등과 같은 문제가 없는 제조방법의 개발이 필요한 실정이다.

일 양상은 서열번호 1, 또는 서열번호 2 로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 형질전환 벡터를 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 형질전환 벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 서열번호 1, 또는 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 형질전환 벡터를 제작하는 단계; 상기 형질전환 벡터로 미생물을 형질전환하는 형질전환 단계; 및 상기 형질전환된 미생물을 배양하는 배양 단계를 포함하는, 리그닌 과산화효소(Lignin peroxidase) 제조방법을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

일 양상은 서열번호 1, 또는 서열번호 2 로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 형질전환 벡터를 제공한다.

본 명세서에서 용어, "형질전환"이란, 유전자조작 기법을 사용하여 외부로부터 도입된 핵산을 포함하는 플라스미드 또는 유전체에 의해 숙주세포(원핵 및 진핵생물, 동물세포 및 식물세포)의 유전형질이 변화되는 현상을 의미하며, 용어 "형질전환체"란 외부로부터 도입된 플라스미드 유전자 또는 유전체 DNA가 세포분열을 반복 하더라도 안정적으로 유전자를 보유하며, 안정적으로 유전자의 발현을 유지하는 세포를 의미한다. 상기 형질전환을 수행하기 위하여는, 핵산을 유기체, 세포, 조직, 기관 또는 핵산내로 도입하는 어떤 방법도 사용될 수 있고, 구체적으로 당해 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다.

본 명세서에서 용어, "숙주세포"란, 외부 핵산의 도입 대상이 되는 세포를 의미하며, 이는 본 발명의 미생물일 수 있고, 구체적으로 대장균(Escherichiacoli), 바실러스 서브틸리스(Bacillussubtilis), 스트렙토마이세스 속(Streptomycessp.), 슈도모나스 속(Pseudomonassp.), 프로테우스 미라빌리스(Proteusmirabilis) 또는 스타필로코쿠스 속(Staphylococcussp.)과 같은 원핵생물; 진균(예를 들어, 아스페르길러스 속(Aspergillussp.)), 효모(예를들어, 피키아 파스토리스 (Pichiapastoris), 사카로마이세스 세르비시애 (Saccharomycescerevisiae), 쉬조사카로마이세스 속 (Schizosaccharomyces sp.), 뉴로스포라 크라사 (Neurosporacrassa) 등과 같은 하등 진핵생물; 곤충 세포, 식물 세포, CHO, HeLa, HEK293, 및 COS-1과 같은 포유 동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포 등이 사용될 수 있다. 또한, 당 업계에서 일반적으로 사용되는, 배양된 세포 (in vitro), 이식된 세포 (graft cell) 및 일차 세포 배양 (인 비트로(in vitro) 및 엑스 비보(ex vivo)), 및 인 비보 (in vivo) 세포,및 또한 인간을 포함하는 포유동물의 세포 (mammalian cell)일 수 있으며, 바람직하게는 대장균(Escherichiacoli)일 수 있다.

본 발명에 있어서 “형질전환 벡터”는 “발현벡터”와 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 적당한 숙주세포에 도입되어 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 상기 용어 "작동가능하게 연결된(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 용이하게 할 수 있다.

본 발명의 적합한 발현벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 일반 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있고, 원핵 세포의 경우에는 lac, tac, T3 및 T7 프로모터, 진핵세포의 경우에는 원숭이 바이러스 40(SV40), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 사람 면역 결핍 바이러스(HIV), 예를 들어 HIV의 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스, 시토메갈로바이러스(CMV), 엡스타인 바 바이러스(EBV), 로우스 사코마 바이러스(RSV) 프로모터뿐만 아니라, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈, 사람 근육 크레아틴, 사람 메탈로티오네인 유래의 프로모터 등이 있지만, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함할 수 있다. 선택마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하므로 형질전환된 세포가 선별 가능하다. 또한, 벡터가 복제 가능한 발현벡터인 경우, 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 복제원점(replication origin)을 포함할 수 있다.

외래 유전자를 삽입하기 위한 재조합 발현 벡터로는 플라스미드, 바이러스, 코즈미드 등 다양한 형태의 벡터를 사용할 수 있다. 재조합 벡터의 종류는 원핵세포 및 진핵세포의 각종 숙주세포에서 원하는 유전자를 발현하고 원하는 단백질을 생산하는 기능을 하는 한 특별히 제한되지 않지만, 구체적으로 강력한 활성을 나타내는 프로모터와 강한 발현력을 보유하면서 자연 상태와 유사한 형태의 외래 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 벡터가 이용될 수 있다.

본 발명의 단백질을 발현시키기 위하여, 미생물 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터로는 이에 제한되지 않지만, pET21a, pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, pUC 벡터, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 또는 이들의 유도체 등을 포함하는 대장균(Escherichia coli)에서 얻어지는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, λgt10, λgt11 또는 NM989 등의 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지 등이 포함될 수 있다.

상기 발현벡터는 이에 제한되는 것은 아니나, 서열번호 5로 표시되는, pCold IV 벡터에 특정 서열을 삽입하여 제작한 것일 수 있다. 구체적으로는, 서열번호 6으로 표시되는 TN 서열이 삽입된, 서열번호 1로 표시되는 N말단에 TEE 및 6xHis 가 위치하는 벡터; 서열번호 7로 표시되는 TC 서열이 삽입된, 서열번호 2로 표시되는 N말단에는 TEE tag가, C 말단에는 6xHis가 위치하는 벡터; 서열번호 8로 표시되는 N 서열이 삽입된, 서열번호 3으로 표시되는 N말단에 6xHis만 위치한 벡터; 및 서열번호 9로 표시되는 C 서열이 삽입된, 서열번호 4로 표시되는 C말단에 6xHis만 위치한 벡터일 수 있다.

상기 발현벡터는 리그닌 과산화효소를 발현하는 것으로서, 불용성 봉입체가 포함되지 않은 수용성 분획이 85.4% 이상인 리그닌 과산화효소를 발현하는 것일 수 있다.

다른 양상은 서열번호 1, 또는 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 형질전환 벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 미생물에도 공히 적용된다.

상기 미생물(microorganism)은 사람의 눈으로 볼 수 있는 한계영역을 넘어선 0.1mm 이하의 크기인 작은 생물을 의미하며, 이에 제한되는 것은 아니지만, 시아노박테리아(Cyanobacteria), 시네코코커스(Synechococcus), 시네코코커스 엘롱가투스(Synechococcus elongatus), 시네코코커스 레오폴리엔시스(Synechococcus leopoliensis), 시네코시스티스(Synechocystis), 아나베나(Anabaena), 슈도모나스(Pseudomonas), 슈도모나스 시링가에(Pseudomonas syringae), 슈도모나스 사바스타노이(Pseudomonas savastanoi), 클라미도모나스(Chlamydomonas), 클라미도모나스 레인하르티이(Chlamydomonas reinhardtii), 에세리키아(Escherichia), 에세리키아 콜라이(Escherichia coli), 지오박테리아(Geobacteria), 조류, 미세조류, 전해합성(electrosynthesis) 세균, 광합성　미생물, 효모, 사상 진균 또는 식물 세포일 수 있으며, 바람직하게는 대장균인 에세리키아 콜라이(Escherichia coli)일 수 있다.

또 다른 양상은 서열번호 1, 또는 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 형질전환 벡터를 제작하는 단계; 상기 형질전환 벡터로 미생물을 형질전환하는 형질전환 단계; 및 상기 형질전환된 미생물을 배양하는 배양 단계를 포함하는, 리그닌 과산화효소(Lignin peroxidase) 제조방법을 제공한다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 제조방법에도 공히 적용된다.

또한, 상기 배양 단계는 배양전에 헴(Heme)을 공급하는 단계를 포함하는 것일 수 있으며, 공급되는 헴은 15 μM 내지 40 μM, 15 μM 내지 35 μM, 15 μM 내지 30 μM, 17 μM 내지 30 μM, 19 μM 내지 30 μM, 20 μM 내지 30 μM, 23 μM 내지 27 μM, 24 μM 내지 26 μM, 또는 25 μM의 농도로 공급되는 것일 수 있다.

상기 농도로 헴을 공급하는 경우, 리그닌 과산화효소가 단백질의 접힘에 영향을 줄 수 있는 헴을 충분한 수준으로 포함할 수 있으며, 상기 범위를 초과하는 경우 세포 독성이 발생할 수 있고, 상기 범위에 달하지 않는 경우 헴이 충분한 수준으로 포함되지 못할 수 있다.

또한, 상기 배양 단계는 18 °C 내지 33 °C의 온도로 배양하는 것일 수 있으며, 상기 온도는 20 °C 내지 30 °C, 22 °C 내지 28 °C, 23 °C 내지 27 °C, 24 °C 내지 26 °C 또는 25°C일 수 있다.

상기 범위의 온도로 형질전환된 미생물을 배양하는 경우 가장 높은 리그닌 과산화효소의 활성수준을 관찰할 수 있다.

또한, 상기 배양 단계는 글루타티온 이황화물(Glutathione disulfide; GSSG)를 공급하는 단계를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 글루타티온 이황화물은 2mM 내지 9mM, 3mM 내지 8mM, 4mM 내지 8mM, 4mM 내지 7mM, 4mM 내지 6mM, 또는 5mM일 수 있다.

상기 범위를 벗어나는 경우, 미생물에 의해 생산된 리그닌 과산화효소의 활성 수준이 감소된 것을 확인할 수 있었다.

또한, 상기 배양 단계는 미생물을 5시간 내지 40시간 배양하는 것일 수 있으며, 배양하는 시간은 5시간 이상, 10시간 이상, 15시간 이상, 10시간 내지 40시간, 15시간 내지 40시간, 15시간 내지 30시간, 18시간 내지 25시간, 19시간 내지 24시간, 19시간 내지 23시간, 20시간 내지 22시간, 또는 21시간일 수 있다.

상기의 배양 시간 보다 짧은 시간을 배양하는 경우, 리그닌 과산화효소가 충분히 활성화되지 않으며, 더 긴 시간을 배양하는 경우, 리그닌 과산화효소의 생산에 너무 많은 시간이 소요될 수 있다.

또한, 제조방법은 배양단계 다음에 pH를 5.5 내지 pH 6.5로 조절하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 pH는 이에 제한되지 않으나, pH 5.5 내지 pH 6.5, pH 5.7 내지 pH 6.3, pH 5.8 내지 pH 6.2, pH 5.9 내지 pH 6.1, 또는 pH 6.0일 수 있다.

배양단계 이후 상기와 같이 pH를 조절하는 경우, 리그닌 과산화효소가 단량체로 4차 구조가 바뀔 수 있으며, 활성화 수준이 현저하게 증가할 수 있다. 그러나, 상기 pH 조건보다 강한 산성으로 조절하는 경우, 현저한 수준의 단백질 침착이 일어날 수 있으며, 그보다 약한 산성으로 pH를 조절하는 경우, 리그닌 과산화효소의 활성 수준이 낮아질 수 있다.

본 발명은 미생물에 최적화된 헴 공급, 글루타티온 이황화물 공급 및 pH 조절 등을 통해 불수용성 봉입체를 포함하지 않는 활성화된 리그닌 과산화효소를 생산하는 방법을 확립하였다. 또한, 미생물을 사용한 리그닌 과산화효소 생산의 문제점을 해결하였기에, 저렴한 비용으로 리그닌 과산화효소의 대량 생산이 가능하며 이에 따라, 리그닌을 연구 또는 활용하는 산업분야 전반에 폭넓게 활용될 수 있다.

도 1은 pCold IV vector 구조를 나타낸 도이다.
도 2는 리그닌 과산화효소 생합성을 위해 제작한 유전자 인서트의 구조를 나타낸 도이다.
도 3a 및 도 3b는 pCold IV vector에 삽입된 상기 유전자 인서트에 따른 리그닌 과산화효소의 발현 수준 및 이의 수용성 여부를 확인한 도이다.
도 4는 배양중에 공급하는 헴의 농도에 따른 RZ값을 확인한 도이다.
도 5는 배양중 헤민의 공급여부 및 공급 시점에 따른 RZ값을 확인한 도로서, 도 5a는 공급여부에 따른 RZ값을 확인한 도이고, 도 5b는 공급 시점에 따른 RZ값을 확인한 도이다.
도 6은 환원제 처리 유무에 따른 리그닌 과산화효소의 활성화 정도를 확인한 도이다.
도 7은 배양 온도에 따른 리그닌 과산화효소의 활성화 정도를 확인한 도이다.
도 8은 글루타티온 이황화물 처리 농도에 따른 리그닌 과산화효소의 활성화 정도를 확인한 도이다.
도 9는 최적의 조건에서 배양 시간에 따른 리그닌 과산화효소의 활성화 정도를 확인한 도이다.
도 10은 pH 전환한 다음 리그닌 과산화효소의 활성화 수준을 확인한 도로서, 도 10a는 pH 4.0, pH 5.0 또는 pH 6.0으로 pH 전환하면서 단백질의 침전 수준을 확인한 도이고, 도 10b는 pH 6.0으로 전환한 다음, 리그닌 과산화효소의 활성화 수준을 확인한 도이다.
도 11은 pH 전환한 다음, 리그닌 과산화효소의 4차 단백질 구조를 확인한 도이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 다른 경우를 분명히 지적하는 것이 아니라면, 복수의 형태를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 경우 “포함한다(comprise, include)”및/또는 “포함하는(comprising, including)”은 언급한 형상들, 숫자, 단계, 동작, 부재, 요소 및/또는 이들 그룹의 존재를 특정하는 것이며, 하나 이상의 다른 형상, 숫자, 동작, 부재, 요소 및/또는 그룹들의 존재 또는 부가를 배제하는 것이 아니다.

실시예

실시예 1. 리그닌 과산화효소 생산을 위한 발현 벡터 제작

대장균을 숙주로 한 리그닌 과산화효소(Liginin peroxidase)를 생산하기 위한 벡터를 제작하였다. 구체적으로 목표하는 활성화된 리그닌 과산화효소(이하, PcLiP01)을 생산하기 위하여 cspA 프로모터, lac Ⅰ 및 암피실린 저항성을 가진 단백질 생산용 저온 발현 벡터인 pCold 벡터를 준비하였으며, 그 중에서도 다중 클로닝 사이트 이전에 번역 강화 요소(TEE)와 6x히스티딘 태그(6xHis)인 두 개의 융합 태그를 N 말단에 포함하고 있는 pCold IV(도 1)를 선택하여 벡터를 제작하였다. N 말단에 포함된 융합 태그의 효과를 확인하기 위하여 클로닝 복제 사이트 전후에 융합 태그가 없는 pColdⅣ 벡터를 사용하여, 융합태그의 유무에 따른 수용성 발현 결과를 비교하였다. 구체적으로, 도 2의 4개의 인서트(4개의 인서트는 N말단에 TEE 및 6xHis 가 위치하는 TN; N말단에는 TEE tag, C 말단에는 6xHis가 위치하는 TC; N말단에 6xHis만 위치한 N; 및 C말단에 6xHis만 위치한 C;로 구성된다)에 따른 융합태그의 효과를 확인하였다.

그 결과, 도 3a 및 3b에 나타낸 바와 같이, TEE 태그가 N-말단에 포함된 경우인 TN 및 TC 인서트가 포함된 벡터의 경우, 리그닌 과산화효소가 발현될 뿐만 아니라, 생산된 리그닌 과산화효소 중에서도 수용성 분획이 우세하게 확인되었다. 그에 반해, TEE 태그가 N-말단에 포함되지 않은 N 및 C의 경우, 리그닌 과산화효소 자체가 발현되지 않음을 확인할 수 있었다.

상기와 같은 결과를 통해, N 말단의 태그가 활성화된 리그닌 과산화효소의 생산에 중요한 역할을 수행함을 확인할 수 있었고, 가장 많은 리그닌 과산화효소의 발현 수준을 보여준 TN 인서트를 최종 후보로 선정하여 실험을 진행하였다.

실시예 2. 헴 공급 최적화를 통한 헴 함유 리그닌 과산화효소의 제조

헴(Heme)이 단백질인 접힘에 관여할 수 있음은 이미 공지에 사실이기에, 헴을 적정량 투여하는 경우, 리그닌 과산화효소의 접힘에도 관여하여 활성화된 리그닌 과산화효소를 제작할 수 있을 것으로 예상하여 리그닌 과산화효소 생산과정에 헴을 투여하였고, 그 투여양을 최적화하였다. 대장균 배양시 공급되는 헴의 농도를 최적화 하기 위하여 투여하는 헴의 농도를 다르게 한 다음, 시료에서 409nm 흡광도를 280nm 흡광도로 나눈 값이면서, 단백질에 포함된 헴의 비율을 나타내는 주요 파라미터인 RZ값(Reinheitszahl 값)을 확인하였다. 그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 본 발명의 리그닌 과산화효소의 경우, 헴 농도가 25μM 이상일 때, RZ 값이 1.5 수준으로 포화되는 것을 확인하였다. 고농도의 헴은 세포의 독성이 있을 수 있기에, 25μM 전후의 헴을 투여하는 것이, 최적의 농도임을 확인하였다.

또한 이러한 헴의 투여는 배양중에 이루어지는 것이 최적이며, 리그닌 과산화효소가 생산된 다음 헴을 공급하는 경우, RZ값의 변화가 크게 확인되지 않았다(도 5a 및 도 5b).

실시예 3. 리그닌 과산화효소의 이황화 결합 확인

상기 실시예 2에서 확인한 것처럼, 수용성으로 발현된 리그닌 과산화효소는 헴을 가지고 있음에도, 활성을 가지지 않는 것으로 확인되었다. 상기와 같은 문제점은 리그닌 과산화효소내의 이황화결합에 따른 것으로 보아 실험을 진행하였으며, 구체적으로 효소내에서 이황화결합 형성이 리그닌 과산화효소의 활성화와 관련있는지 여부를 확인하기 위하여 산화조건하에서 이황화결합이 형성된 리그닌 과산화효소를 25℃에서 1시간 동안 환원제인 1,4-디티오트레이톨(DTT)를 처리한 다음, ABTS(2,2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)를 측정하였으며, ABTS는 항산화 수준을 확인할 수 있기에, ABTS에 대한 비활성화 수준을 측정하였으며, 이를 Specific activity로 표현하였다. 그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 용출 직후의 리그닌 과산화효소 그룹(Eluted PcLiP01), 및 환원제(10mM, DTT)를 처리한 다음, 25℃에서 1시간 배양한 그룹(25℃, 1hr incubation with DTT)의 경우 매우 낮은 ABTS에 대한 비활성화 수준을 보여주었다. 상기 DTT 환원제를 처리한 경우에는 환원제를 처리하지 않은 그룹보다 처리전 대비 2.5% 수준의 감소를 확인하였다. 이황화결합을 끊을 수 있는 환원제가 용출 완충액에서 배양을 통해 얻은 ABTS와의 비활성을 감소시킬 수 있다는 것의 의미는, 효소 활성 증가가 이황화결합 형성에 의해 얻어지는 것임을 강력히 지지하는 것이다.

따라서, 상기와 같은 결과를 토대로 하여, 이황화결합 형성을 가속화하기 위한 몇 가지의 파라미터를 조사하였으며, 그에 따른 효과를 확인하기 위한 실험을 추가적으로 수행하였다.

실시예 4. 리그닌 과산화효소의 이황화결합 촉진을 위한 최적의 조건 확인

4-1. 온도 조절에 의한 이황화결합 수준 확인

리그닌 과산화효소에서 이황화결합의 형성을 가속화하기 위한 최적의 온도를 찾기 위한 실험을 수행하였다. 구체적으로, 상기에서 수득한 리그닌 과산화효소(PcLiP01)의 온도를 달리하면서 ABTS에 대한 비활성 값을 확인하였다. 그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 25℃에서 이황화결합 결합 형성에 의한 ABTS와의 비활성이 가장 높게 나타남을 확인하였다.

4-2. GSSG 조절에 의한 이황화결합 수준 확인

진핵생물에서 이황화결합을 형성하는 곳으로 알려진 소포체에 고농도로 존재한다고 알려진 글루타티온 이황화물(Glutathione disulfide, GSSG)의 농도의 조절이 이황화결합의 형성에 영향을 주는지 여부를 확인하기 위한 추가적인 실험을 수행하였다. 세포내 GSSG의 농도가 약 10 mM으로 알려져 있기에, 0 내지 9 mM의 GSSG를 첨가하여 12시간을 배양한 다음, ABTS에 대한 비활성 수준을 확인하였다. 그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 5mM GSSG를 첨가한 그룹에서 가장 높게 나타남을 확인할 수 있었다.

4-3. 배양 시간에 따른 이황화결합 수준 확인

상기 실시예 4-1 및 4-2를 통하여 확인한 최적의 조건(25℃ 및 5mM의 GSSG)에서 배양시간을 달리 하면서 이황화결합의 수준을 확인하였다. 그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 상기와 같은 최적조건에서 21시간을 배양했을 때, ABTS에 대한 비활성의 효과가 포화되는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 상기와 같은 결과를 통해, 25℃, 및 5mM의 GSSG를 첨가한 다음, 21시간 배양하는 경우, 가장 높은 이황화결합 수준을 보여주어, 리그닌 과산화효소의 가장 높은 활성 수준을 보여주었다.

실시예 5. 약산성 환경 조성을 통한 활성화된 리그닌 과산화효소의 생산

미생물에 의해 생산된 리그닌 과산화효소는 이황화결합을 생성한 다음, 세포 외부로 분비되어 약산성 환경으로 노출된다. 이에 따라 노출되는 환경의 최적의 조건을 확인하기 위하여 pH값을 달리하며 리그닌 과산화효소의 활성화 수준을 확인하였다. 그 결과, 도 10a에 나타낸 바와 같이, pH값이 4.0 또는 5.0인 경우, pH값이 리그닌 과산화효소의 등전점(isoelectric point)에 가까워져 현저한 수준의 단백질 침전이 확인되었다. 그러나, pH가 6.0인 그룹의 경우, 이러한 침전이 확인되지 않아, 이에 대하여 ABTS와의 비활성 수준을 확인하였다. 그 결과, 도 10b에 나타낸 바와 같이, ABTS 뿐만 아니라 VA를 기질로 사용하였을 때에도 비활성이 유의하게 증가하였으며 ABTS와 VA에 대해서 PcLiP01의 최종 비활성은 각각 7.54 U/mg, 4.65 U/mg로 나타났다.

이러한 pH의 전환이 리그닌 과산화효소의 4차 구조에 영향을 주는지 여부를 확인하기 위하여 크기 교환 수지를 사용하여 추가적인 분석을 수행하였다. 구체적으로, 크기 교환 수지 분석은 pH 전환 전후로 실시되었으며, 각 단계에서 단백질을 포함하고 있는 버퍼와 동일한 농도, pH조건의 버퍼를 이동상으로 사용하여 분석하였다. 그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, pH 전환 전의 리그닌 과산화효소는 올리고머 35.2%, 이량체 64.8%로 구성되어 있음을 확인하였으며, pH 6으로 전환한 후에는 36.7%의 올리고머, 16.8%는 이량체, 46.6%는 단량체로 구성된 것을 확인할 수 있었다.

상기와 같은 결과를 통하여, 약산성 조건으로 pH 전환을 수행하는 경우, 단백질의 4차 구조가 이량체에서 일반적인 리그닌 과산화효소의 단량체로 전환될 수 있음을 확인하였으며, 이를 통해 pH 전환이 리그닌 과산화효소를 활성화 시킬 수 있음을 확인하였다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1, 또는 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 형질전환 벡터.
청구항 1에 있어서,
상기 벡터는 서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 pColdⅣ 벡터인 것인, 벡터.
청구항 1에 있어서,
상기 서열번호 1, 또는 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드는 TEE 태그가 N-말단에 위치한 것인, 벡터.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 벡터는 서열번호 6 또는 서열번호 7로 표시되는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 것인, 벡터.
서열번호 1, 또는 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 형질전환 벡터로 형질전환된 미생물.
청구항 5에 있어서,
상기 벡터는 서열번호 6 또는 서열번호 7로 표시되는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 것인, 미생물.
청구항 5에 있어서,
상기 미생물은 대장균(Escherichia coli; E. coli)인 것인, 미생물.
서열번호 1, 또는 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 형질전환 벡터를 제작하는 단계;
상기 형질전환 벡터로 미생물을 형질전환하는 형질전환 단계; 및
상기 형질전환된 미생물을 배양하는 배양 단계를 포함하는, 리그닌 과산화효소(Lignin peroxidase) 제조방법.
청구항 8에 있어서,
상기 배양 단계는 배양전에 15 μM 내지 40 μM의 헴(Heme)을 공급하는 단계를 포함하는 것인, 제조방법.
청구항 8에 있어서,
상기 배양 단계는 18 °C 내지 33 °C의 온도로 배양하는 것인, 제조방법.
청구항 8에 있어서,
상기 배양 단계는 2mM 내지 9mM의 글루타티온 이황화물(Glutathione disulfide; GSSG)를 공급하는 단계를 포함하는 것인, 제조방법.
청구항 8에 있어서,
상기 배양 단계는 미생물을 5시간 내지 40시간 배양하는 것인, 제조방법.
청구항 8에 있어서,
상기 제조방법은 배양단계 다음에 pH를 5.5 내지 pH 6.5로 조절하는 단계를 더 포함하는 것인, 제조방법.