CN108588079A - 普通野生稻根特异启动子OrRSGp及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了普通野生稻根特异启动子OrRSGp及其应用。本发明提供了一种DNA分子，是如下1)‑3)中任一种的DNA分子：1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；3)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且具有相同功能的DNA分子。本发明从普通野生稻基因组中分离得到一个根特异的启动子,转基因GUS分析显示，启动子的片段有根特异的活性。

Description

普通野生稻根特异启动子OrRSGp及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体是普通野生稻根特异启动子OrRSGp及其应用。

背景技术

启动子是指DNA分子上被RNA聚合酶、转录调节因子等识别并结合形成转录起始复合物的区域。启动子在基因转录起始和调控中起着非常重要的作用(Li Y,Sun Y,Yang Q,et al.Cloning and function analysis of an alfalfa(Medicago sativa L.)zincfinger protein promoter MsZPP[J].Mol Biol Rep,2012,39:8559–8569.)。启动子可以分为三类：组成型、特异型和诱导型。组成型启动子广泛用于基因工程。如花椰菜(Brassicaoleracea var.botrytis)花叶病毒(CaMV)35S启动子(Odell JT,Nagy F,and ChuaNH.et.al.Identification of DNA sequences required for activity of thecauliflower mosaic virus 35S promoter[J].Nature,1985,313:810–812.)、根癌农杆菌Ti质粒T-DNA区域的胭脂碱合成酶基因Nos启动子(Leisner SM,Gelvin SB..Structure ofthe octopine synthase upstream activator sequence[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1988，85：2552-2557.)、章鱼碱合成酶基因Ocs启动子(Joseph N.M.Mol,Antoine R.S.,Alexander K..Genetic Manipulation of Floral Pigmentation Genes[J].Plant MolBiol.,1989,13:287-294.)、水稻Actin1基因的Act1启动子(McElroy,D.,Zhang,W.,Cao,J.,et al..Isolation of an efficient actin promoter for use in ricetransformation[J].Plant Cell,1990,2:163–171.)和玉米Ubiquitin基因的Ubi启动子等(Christensen,A.H.,Sharrock,R.A.,and Quail,P.H..Maize polyubiquitin genes:structure,thermal perturbation of expression and transcript splicing,andpromoter activity following transfer to protoplasts by electroporation[J].Plant Mol.Biol.,1992,18:675–689.)。其中分别在单、双子叶植物中应用最多的35S启动子和Ubi启动子几乎在所有组织的全部发育阶段指导靶基因的表达(Fang RX,Nagy F,Sivasubramaniam S,et al..Multiple cis-regulatory elements for maximalexpression of the Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter in transgenic plants[J].Plant Cell,1989,1:141–150.)。

外源基因的组成型表达并不总是适用于转基因的研究和应用。用于研究基因功能的组成型表达将掩盖该基因的某些精细功能，特别是与信号转导，能量转化和物质运输相关的功能。外源基因的组成型表达可能在转基因植物中引起额外的代谢负担或能量损耗(Shelton,A.M.,Zhao,J.Z.,and Roush,R.T..Economic,ecological,food safety,andsocial consequences of the deployment of bt transgenic plants[J].Annu.Rev.Entomol.,2002,47:845–881.)。此外，在遗传转化中，重复使用相同的启动子可能引起转基因沉默。组织特异型启动子又称为器官特异型启动子，它指导基因在植物的特定组织或器官中表达，并表现出发育调节的特性，可以避免植物营养的不必要浪费。组织特异型启动子的特性使其在基因工程中成为一种重要的顺式作用元件，在生物反应器、作物品种改良、抗病、抗虫、抗逆等作物分子育种中广泛应用。

根系在植物生长、发育和适应中起重要作用，同时也负责水分和营养的摄取，并且对整个植物有固定和稳定的作用(Kong,X.,Zhang,M.,De Smet,et al..Designer crops:optimal root system architecture for nutrient acquisition[J].TrendsBiotechnol.2014,32:597–598.)。普通野生稻是栽培稻的近缘祖先种，宿根繁殖，根系发达，在抗旱等方面进行了广泛研究，但还没有根特异表达基因和启动子的报道(周少霞.江西东乡普通野生稻抗旱渗入系的构建及抗旱基因定位[J].北京：中国农业大学，2005.)。

发明内容

本发明的目的是提供一种DNA分子。

本发明提供的DNA分子，是如下1)-3)中任一种的DNA分子：

1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；

3)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且具有相同功能的DNA分子。

含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。

用于扩增上述DNA分子全长或部分片段的引物对也是本发明保护的范围。

上述DNA分子在作为植物启动子中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述植物启动子为植物组织特异性启动子。

上述应用中，所述组织为根。

上述DNA分子在驱动植物组织中目的基因表达中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述植物组织为根。上述目的基因为GUS。

上述应用中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

本发明从普通野生稻基因组中分离得到一个根特异的启动子,将分离得到的根特异的启动子与GUS报告基因进行融合导入拟南芥中，获得转基因材料,转基因拟南芥GUS分析显示，启动子的片段有根特异的活性,最后将全长的启动子序列融合GUS报告基因导入水稻中，转基因水稻GUS分析显示，该启动子驱动GUS报告基因在水稻的根中表达。

附图说明

图1为OrRSGp的扩增电泳图。

图2为OrRSGp启动子转基因拟南芥营养期不同时期的GUS染色。

图3为OrRSGp启动子转基因拟南芥生殖期不同器官的GUS染色。

图4为OrRSGp启动子转基因拟南芥根和叶中GUS活性分析。

图5为OrRSGp启动子转基因水稻不同器官的GUS染色。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

普通野生稻种子来自于广东省野生稻保护区。

实施例1、普通野生稻根特异表达片段OrRSGp的克隆

利用CTAB法提取普通野生稻的基因组DNA为模板，用如下扩增引物FP和RP为引物进行PCR扩增，反应体系是50μL。

扩增引物序列：

FP：5'ACGCGTAAGGGGATCCTGGCAAAGCAAGGATTGCTTA 3'；

RP:5’GATCTACCATGAATTCCATGTTTCAAATCAGAGTGATTATCC 3'

上述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性30sec，接着95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，进行35个循环，最后彻底延伸5min。

得到896bp的PCR产物，将该PCR产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳分离(图1)，进行片段的回收，经过测序，该PCR产物的核苷酸序列为序列1，将该PCR产物所示的片段命名为OrRSGP。

上述50μL反应体系如下表1：

表1为反应体系

实施例2、普通野生稻根特异表达片段OrRSGp的功能研究

一、重组载体的制备

用于拟南芥转化重组载体pBinGlyRed-GUS-OrRSGp为将序列1所示的OrRSGp替换pBinGlyRed-GUS(赵志强等，普通野生稻绿色组织特异表达启动子的克隆与鉴定。生物技术通报，2017，(7):51-57)载体的BamH I和EcoR I酶切位点间驱动GUS表达的aMV35S启动子，得到的载体。

用于水稻转化重组载体pCAMBIA1305-OrRSGp为将序列1所示的OrRSGp替换pCAMBIA1305(武汉淼灵生物科技有限公司，P1117，且该载体中含有GUS基因)载体的HindIII和NcoI位点间驱动GUS表达的aMV 35S启动子，得到的载体。

二、启动子片段调控目的基因在植物根中特异表达的应用

1、转OrRSGp拟南芥的获得

将上述重组载体pBinGlyRed-GUS-OrRSGp通过冻融法转入农杆菌感受态EHA105，在含有50mg/L的卡那霉素和50mg/L的利福平的平板上进行培养2-3天，用启动子特异的引物(FP和RP)进行PCR扩增，目的片段大小一致的，在28℃YEB的培养基中活化菌种，采用浸花法(Clough S J,Bent A F.Floral dip:a simplified method forAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana[J].Plant Journal,1998,16(6):735-743.)转化拟南芥Col-0(以下也称为野生型拟南芥)。每次侵染30秒，侵染三次，等到种子成熟收获，得到T1代转OrRSGp拟南芥，在绿色的荧光灯下利用过滤绿光的眼镜挑选红色的种子即为阳性的T1代转OrRSGp拟南芥种子。

种植阳性的T1代转OrRSGp拟南芥种子，收集植株的叶片用CTAB法提取基因组DNA，用FP和RP引物进行PCR扩增，得到896bp的片段，为阳性T1代转OrRSGp拟南芥。

播种，收获，得到T3代转OrRSGp拟南芥。

采用同样的方法将空载体pBinGlyRed-GUS转入野生型拟南芥，得到转空载体水稻。

2、转OrRSGp水稻的获得

将上述重组载体pCAMBIA1305-OrRSGp通过冻融法转入农杆菌感受态EHA105，在含有50mg/L的卡那霉素和50mg/L的利福平的平板上进行培养2-3天，用启动子特异的引物进行PCR扩增(FP和RP)，目的片段大小一致的，28℃YEB的培养基中活化菌种，采用农杆菌介导的方式转化水稻品种日本晴(Htwe N N,Ling H C,Zaman F Q,et al.Plant genetictransformation efficiency of selected Malaysian rice based on selectablemarker gene(hptII).[J].Pakistan Journal of Biological Sciences Pjbs,2014,17(4):472.)，得到T0代转OrRSGp水稻。

种植T0代转OrRSGp水稻，收集植株的叶片用CTAB法提取基因组DNA，用如下引物进行PCR扩增，1305-RSGp-F:GCAGGCATGCAAGCTTTGGCAAAGCAAGGATTGCTTA1305-RSGp-R:CTCAGATCTACCATGGCATGTATTTCAAATCAGAGTGATTATCC。

结果得到896bp的片段，为阳性T0代转OrRSGp水稻。

播种，收获，得到T3代转OrRSGp水稻。

采用同样的方法将空载体pCAMBIA1305转入野生型水稻，得到转空载体水稻。

3、转OrRSGp拟南芥GUS染色和酶活分析

T3代转OrRSGp拟南芥分别取不同时期的幼苗和开花后的不同组织进行GUS染色和GUS酶活分析：

1)GUS染色步骤如下：

(1)将不同时期T3代转OrRSGp拟南芥的不同组织取样，小心的放入离心管，置于冰上；

(2)按照北京Coolaber公司的GUS染色液进行染色，抽真空15分钟，37℃放置过夜；

(3)用95％的酒精脱色1小时，75％的酒精脱色至对照完全变白；

(4)在ZISS的体式解剖镜下观察并且照相。

T3代转OrRSGp拟南芥营养期不同时期的GUS染色结果如图2所示，T3代转OrRSGp拟南芥生殖期不同器官的GUS染色结果如图3所示。

结果显示：无论是营养期还是生殖期，T3代转OrRSGp拟南芥只有根部显现蓝色，表明OrRSGp驱动GUS基因只在根中表达。

2)GUS酶活检测

分别取T3代转OrRSGp拟南芥不同株系的根和叶进行提取总蛋白的提取，然后测定其GUS活性。总蛋白的提取和浓度测定参考Bradford的方法(Bradford,MM.(1976)A rapidand sensitive method for the quantification of microgram quantities ofprotein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Anal Biochem(72),248–254.)，GUS活性测定参考Xu等的方法(Xu L,Ye R,Zheng Y,et al.Isolation of theendosperm-specific LPAAT gene promoter from coconut(Cocos nucifera L.)and itsfunctional analysis in transgenic rice plants[J].Plant Cell Rep,2010,29(9):1061-1068.)。

结果如图4所示，WT为野生型拟南芥，35S为转空载体拟南芥，L4、L8、L19、L23分别为T3代转OrRSGp拟南芥不同株系；可以看出，GUS蛋白在L4、L8、L19、L23四个转基因株系的叶中含量很低，在根中含量很高，说明OrRSGp启动子启动GUS蛋白在根中特异表达，叶中不表达或表达量很低。进一步证明了OrRSGp作为启动子的根特异性。

野生型拟南芥和转空载体拟南芥中GUS蛋白表达无组织特异性。

4、转OrRSGp水稻GUS染色

将T3代转OrRSGp水稻取不同的组织进行GUS染色，方法同上。

结果如图5所示(2000um)，T3代转OrRSGp水稻GUS染色后根系呈现明显的蓝色，而叶片中没有颜色，说明OrRSGp启动子在水稻中的表达模式为根特异，与在双子叶植物拟南芥中表达模式一致。

序列表

<110>中国农业科学院生物技术研究所

<120>普通野生稻根特异启动子OrRSGp及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 896

<212> DNA

<213> 普通野生稻（Oryza rufipogon Griff.）

<400> 1

atgaattact attcgttaac tgatgtgcct ttagcattat atttgtttct ttagcattat 60

atatttttaa aggaacgtta tatatgatgc tacattaatt gtgatgttga tttttttttc 120

cagaatttgg tttagctaaa tgggtcggtt tagttgcaaa gtttgaaccc aaaaaaatca 180

catcgaactt ttctacacac acaaacttcc aacttttccg tcatattgtt ccaattttct 240

tcaaactttc atttttggtg tggaactaaa cacacccttg gttggttcac aacttcctgt 300

tcctgaaaac tggatctgct atcagatcac tttattacat gccttttttc gccggccaat 360

cagtttatat gcctatattt tgctcgaaaa aactatattc agctaataat gaaatttaga 420

cttatattag gactatatat atatactcgc atgcgaacta ctagctaggc tttacgttac 480

catccaccga taacccttac cgtaccgcac gataagcgtg gttactacgg taacctcgcg 540

gttaggttac cggtggtttg agtaacaccc tgctactata tagccagtat atatggaagt 600

acaggatgtg cagtgcctag ctagccattg gaaagaggtg cagaaataga taccttaagc 660

gatatacgag atgatgagca tcacacagac ttaatttgta agttttgtgg cagtcaaaca 720

agattggatc cggcttacta aacacaagtt ttactagcta tagctagcta cactcataga 780

cctatatttc gccaacacgc catccaaaca cttggatcat gcatgcgtgc tgcagtgcaa 840

gtgcaagact ctatcgattg ggcactataa atacctaagc aatccttgct ttgcca 896

Claims (9)

1.一种DNA分子，是如下1)-3)中任一种的DNA分子：

1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；

3)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且具有相同功能的DNA分子。

2.含有权利要求1所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

3.用于扩增权利要求1所述DNA分子全长或部分片段的引物对。

4.权利要求1所述DNA分子在作为植物启动子中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述植物启动子为植物组织特异性启动子。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述组织为根。

7.权利要求1所述DNA分子在驱动植物组织中目的基因表达中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述植物组织为根。

9.根据权利要求4-8中任一所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。