CN108588080B

CN108588080B - 普通野生稻绿色组织特异表达基因启动子及其应用

Info

Publication number: CN108588080B
Application number: CN201810612890.XA
Authority: CN
Inventors: 裴新梧; 龙艳; 薛满德; 赵志强
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2018-06-14
Filing date: 2018-06-14
Publication date: 2021-08-31
Anticipated expiration: 2038-06-14
Also published as: CN108588080A

Abstract

本发明公开了普通野生稻绿色组织特异表达基因启动子及其应用。本发明提供了一种DNA分子，是如下DNA分子：1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；2)编码区为序列表中序列2所示的DNA分子；3)编码区为序列表中序列3所示的DNA分子；4)编码区为序列表中序列4所示的DNA分子；5)在严格条件下与1)‑4)任一限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子。本发明发现一个新的绿色组织特异的启动子，为水稻的基因工程育种提供了新的调控元件。

Description

普通野生稻绿色组织特异表达基因启动子及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体是普通野生稻绿色组织特异表达基因启动子及其应用。

背景技术

启动子在基因的表达调控中起着非常关键的作用，同时在植物的基因工程育种中也发挥着重要的作用。植物的启动子主要分为三类：组成型启动子、诱导型启动子和组织特异型启动子。在植物的基因工程领域，研究最多的是诱导性启动子和组织特异型启动子。Wang等从胡杨中分离了PeNAC1基因的启动子，转化拟南芥，经非生物胁迫处理和GUS活性分析发现，PeNAC1的启动子受到干旱和盐胁迫的诱导(Wang J Y,Wang J P,Yang HF.Identification and functional characterization of the NAC gene promoterfrom Populuseuphratica[J].Planta,2016,244(2):417-427.)。Tanabe等在甘薯中克隆了IbRbcS的启动子，转化拟南芥，GUS染色表明IbRbcS的启动子是一个绿色组织特异的启动子(Tanabe N,Tamoi M,Shigeoka S.The sweet potato RbcS gene(IbRbcS1)promoterconfers high-level and green tissue-specific expression of the GUS reportergene in transgenic Arabidopsis[J].Gene,2015,567(2):244-250.)。赵志强等(赵志强等，普通野生稻绿色组织特异表达启动子的克隆与鉴定。生物技术通报，2017，(7):51-57)从普通野生稻中克隆得到一个绿色组织特异的启动子OrGSP，融合GUS报告基因转化拟南芥，GUS染色发现OrGSP驱动报告基因在绿色组织高效的表达。

以上这些研究都是从不同的植物中克隆启动子片段，通过与报告基因融合，转化模式植物拟南芥来验证启动子的活性。这种通过模式植物来验证其他植物来源的启动子的方法是被广泛认可和接受的。本研究的普通野生稻绿色组织特异的启动子功能分析也是通过模式植物拟南芥来鉴定的，最后在水稻中鉴定。由于该方法的应用，很多作物的组织特异的启动子能快速的被鉴定。基因工程育种的快速发展，已经鉴定的很多绿色组织特异的启动子已经成功运用在抗虫抗病作物培育中。

为了高效的利用能量，很多的转基因抗虫作物是通过绿色组织特异启动子和抗虫基因融合，转化受体作物。Yang等用绿色组织特异的启动子pGreen融合Cry1AcCry1l基因，转化水稻品种Xiushui-134，酶联免疫分析显示，该转基因水稻有较好的抗虫性，但是种子中几乎检测不到Bt蛋白(Yang Y Y,Mei F,Zhang W,et al.Creation of Bt riceexpressing a fusion protein of Cry1Ac and Cry1I-like using a green tissue-specific promoter[J].J Econ Entomol,2014,107(4):1674-1679.)。Wang等将绿色组织特异的启动子PNZIP和Cry9C融合，转化棉花，抗虫实验分析表明，PNZIP::Cry9C转基因棉花有很好的抗虫作用，但是种子中Bt含量低至0.26μg/g(Wang Q,Zhu Y,Sun L,etal.Transgenic Bt cotton driven by the green tissue-specific promoter showsstrong toxicity to lepidopteran pests and lower Bt toxin accumulation inseeds[J].Science China-Life Sciences,2016,59(2):172-182.)。Ghasimi等利用玉米的C4-PEPC启动子驱动cry1Ab基因在土豆中表达，阳性转基因材料分析发现，转基因植株对马铃薯茎蛾有很好的抗性，但是马铃薯块茎中Bt蛋白含量极低(GhasimiHagh Z,Rahnama H,Panahandeh J,et al.Green-tissue-specific,C(4)-PEPC-promoter-driven expressionof Cry1Ab makes transgenic potato plants resistant to tuber moth(Phthorimaeaoperculella,Zeller)[J].Plant Cell Rep,2009,28(12):1869-1879.)。由此可见，利用组织特异型的启动子来驱动抗虫基因的异源表达，进行基因工程分子育种是可以实现的。并且能很好的发挥抗虫作用。

绿色组织特异的启动子在转基因育种中发挥重要的作用。普通野生稻是亚洲栽培稻的近缘祖先种，有丰富的遗传资源。从普通野生稻的基因组中挖掘基因资源有非常重要的意义。因此，普通野生稻的绿色组织特异的启动子的克隆和鉴定，为水稻和其他作物的抗虫抗病转基因育种提供有利的调控元件，从而为水稻新品种的培育打下基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种DNA分子。

本发明提供的DNA分子，是如下1)-6)中任一种的DNA分子：

1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；

2)编码区为序列表中序列2所示的DNA分子；

3)编码区为序列表中序列3所示的DNA分子；

4)编码区为序列表中序列4所示的DNA分子；

5)在严格条件下与1)-4)任一限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；

6)与1)-4)任一限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且具有相同功能的DNA分子。

含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。

用于扩增上述DNA分子全长或部分片段的引物对也是本发明保护的范围。

上述DNA分子在作为植物启动子中的应用也是本发明保护的范围。

上述DNA分子中的1)-3)所示的DNA分子在作为植物光诱导性启动子中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述植物启动子为植物组织特异性启动子。

上述应用中，所述植物组织为绿色组织；

和/或，所述绿色组织为叶片。

上述DNA分子在驱动植物组织中目的基因表达中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述植物组织为绿色组织；

和/或，所述绿色组织为叶片。

上述目的基因为GUS。

上述中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

本发明从普通野生稻基因组中分离得到一个绿色组织特异的启动子。将分离得到的绿色组织特异的启动子和不同的缺失片段与GUS报告基因进行融合导入拟南芥中，获得转基因材料。转基因拟南芥GUS分析显示，启动子的不同片段有不同的活性。最后将全长的启动子序列融合GUS报告基因导入水稻中，转基因水稻GUS分析显示，该启动子驱动GUS报告基因在水稻的绿色组织部分表达。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明借助于高通量测序的方式，利用转录组文库进行前筛选绿色组织特异表达的基因；

2、本发明发现一个新的绿色组织特异的启动子，为水稻的基因工程育种提供了新的调控元件。

附图说明

图1为OrGSEp-374的核苷酸序列分析和载体构建。

图2为OrGSEp-374启动子及其缺失片段转基因拟南芥营养期不同时期的GUS染色。

图3为OrGSEp-374启动子及其缺失片段转基因拟南芥生殖期不同器官的GUS染色。

图4为OrGSEp-374启动子及其缺失片段转基因拟南芥根和叶中GUS活性分析。

图5为OrGSEp-374启动子及其缺失片段转基因拟南芥光诱导性分析。

图6为OrGSEp-374启动子转基因水稻GUS染色和GUS活性分析。

图7为pBinGlyRed-GUS载体示意图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

普通野生稻种子来自于广东省野生稻保护区。

实施例1、普通野生稻绿色组织特异OrGSEp的克隆

利用CTAB法提取普通野生稻的基因组DNA为模板，用如下扩增引物FP和RP为引物进行PCR扩增，反应体系是50μL。

扩增OrGSEp-374的引物序列是：

F-374:(BamHI)ACGCGTAAGGGGATCCAGTCGTCGTCGTCGTACGTC、

R:(EcoR I)GATCTACCATGAATTCAGTCGTCGTCGTCGTACGTC；

扩增OrGSEp-274的引物序列是:

F-274:(BamH I)ACGCGTAAGGGGATCCATCCAAAACCGCCTTCAAAACC、

R:(EcoR I)GATCTACCATGAATTCAGTCGTCGTCGTCGTACGTC；

扩增OrGSEp-204的引物序列是:

F-204:(BamHI):ACGCGTAAGGGGATCCACCCGGTTTTGCGGTCGAGGGA、

R:(EcoR I)GATCTACCATGAATTCAGTCGTCGTCGTCGTACGTC；

扩增OrGSEp-114的引物序列是:

F-114:(BamHI):ACGCGTAAGGGGATCCCATTGGACTTGCCATCCTTTGG、

R:(EcoR I)GATCTACCATGAATTCAGTCGTCGTCGTCGTACGTC；

扩增OrGSEp-54的引物序列是:

F-54:(BamHI):ACGCGTAAGGGGATCCGAATCGCCACAAACATCATCAC、

R:(EcoR I)GATCTACCATGAATTCAGTCGTCGTCGTCGTACGTC；

PCR反应程序为：95℃预变性30sec，接着95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，进行35个循环，最后彻底延伸5min。

将所有的PCR产物测序，结果如下：

扩增OrGSEp-374的引物得到的PCR产物的核苷酸序列为序列1，将该PCR产物所示的片段命名为OrGSEp-374；

扩增OrGSEp-274的引物得到的PCR产物的核苷酸序列为序列2，将该PCR产物所示的片段命名为OrGSEp-274；

扩增OrGSEp-204的引物得到的PCR产物的核苷酸序列为序列3，将该PCR产物所示的片段命名为OrGSEp-204；

扩增OrGSEp-114的引物得到的PCR产物的核苷酸序列为序列4，将该PCR产物所示的片段命名为OrGSEp-114；

扩增OrGSEp-54的引物得到的PCR产物的核苷酸序列为序列5，将该PCR产物所示的片段命名为OrGSEp-54。

图1为OrGSEp-374的核苷酸序列分析和载体构建。

上述50μL反应体系如下表1：

表1为反应体系

实施例2、普通野生稻根特异表达片段OrGSEp的功能研究

一、重组载体的制备

重组载体pBinGlyRed-GUS-OrGSEp374为将序列1所示的OrGSEp374替换pBinGlyRed-GUS(图7，赵志强等，普通野生稻绿色组织特异表达启动子的克隆与鉴定。生物技术通报，2017，(7):51-57)载体的BamH I和EcoR I酶切位点间的驱动GUS基因表达的CaMV35S启动子，得到的载体。

重组载体pBinGlyRed-GUS-OrGSEp274为将序列2所示的OrGSEp274替换pBinGlyRed-GUS载体的BamH I和EcoR I酶切位点间驱动GUS基因表达的CaMV 35S启动子，得到的载体。

重组载体pBinGlyRed-GUS-OrGSEp204为将序列3所示的OrGSEp204替换pBinGlyRed-GUS载体的BamH I和EcoR I酶切位点间驱动GUS基因表达的CaMV 35S启动子，得到的载体。

重组载体pBinGlyRed-GUS-OrGSEp114为将序列4所示的OrGSEp114替换pBinGlyRed-GUS载体的BamH I和EcoR I酶切位点间驱动GUS基因表达的CaMV 35S启动子，得到的载体。

重组载体pBinGlyRed-GUS-OrGSEp54为将序列5所示的OrGSEp54替换pBinGlyRed-GUS载体的BamH I和EcoR I酶切位点间驱动GUS基因表达的CaMV 35S启动子，得到的载体。

二、启动子片段调控目的基因在植物根中特异表达的应用

将上述重组载体pBinGlyRed-GUS-OrGSEp374、pBinGlyRed-GUS-OrGSEp274、pBinGlyRed-GUS-OrGSEp204、pBinGlyRed-GUS-OrGSEp114和pBinGlyRed-GUS-OrGSEp54分别通过冻融法转入农杆菌感受态EHA105，在含有50mg/L的卡那霉素和50mg/L的利福平的平板上进行培养2-3天，用各自对应的特异引物(F和R)进行PCR扩增，目的片段大小一致的，在28℃YEB的培养基中活化菌种，采用浸花法(Clough S J,Bent A F.Floral dip:asimplified method forAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana[J].Plant Journal,1998,16(6):735-743.)转化拟南芥Col-0(以下也称为野生型拟南芥)。每次侵染30秒，侵染三次，等到种子成熟收获，得到T1代转OrGSEp374拟南芥、T1代转OrGSEp274拟南芥、T1代转OrGSEp204拟南芥、T1代转OrGSEp114拟南芥、T1代转OrGSEp54拟南芥，在绿色的荧光灯下利用过滤绿光的眼镜挑选红色的种子即为阳性的T1代转基因拟南芥种子。

种植阳性的T1代转OrGSEp374拟南芥、T1代转OrGSEp274拟南芥、T1代转OrGSEp204拟南芥、T1代转OrGSEp114拟南芥、T1代转OrGSEp54拟南芥的种子，收集植株的叶片用CTAB法提取基因组DNA，用各自对应的F和R引物进行PCR扩增，分别得到和PCR产物大小一致的片段，为阳性T1代转OrGSEp374拟南芥、T1代转OrGSEp274拟南芥、T1代转OrGSEp204拟南芥、T1代转OrGSEp114拟南芥、T1代转OrGSEp54拟南芥。

播种，收获，得到T3代转OrGSEp374拟南芥、T3代转OrGSEp274拟南芥、T3代转OrGSEp204拟南芥、T3代转OrGSEp114拟南芥、T3代转OrGSEp54拟南芥。

采用同样的方法将空载体pBinGlyRed-GUS转入野生型拟南芥，得到转空载体拟南芥。

3、转基因拟南芥GUS染色和酶活分析

1)GUS染色步骤如下：

T3代转OrGSEp374拟南芥、T3代转OrGSEp274拟南芥、T3代转OrGSEp204拟南芥、T3代转OrGSEp114拟南芥、T3代转OrGSEp54拟南芥植株分别取不同时期的幼苗和开花后的不同组织进行GUS染色和GUS酶活分析。GUS染色步骤如下：

(1)将不同时期的转基因拟南芥的不同组织取样，小心的放入离心管，置于冰上；

(2)按照北京Coolaber公司的GUS染色液进行染色，抽真空15分钟，37℃放置过夜；

(3)用95％的酒精脱色1小时，75％的酒精脱色至对照完全变白；

(4)在ZISS的体式解剖镜下观察并且照相。

以转空载体拟南芥(CaMV 35S：GUS)为对照。

T3代转OrGSEp374拟南芥(OrGSEp-374)、T3代转OrGSEp274拟南芥(OrGSEp-274)、T3代转OrGSEp204拟南芥(OrGSEp-204)、T3代转OrGSEp114拟南芥(OrGSEp-114)、T3代转OrGSEp54拟南芥植株(OrGSEp-54)营养期不同时期的GUS染色结果如图2所示。

T3代转OrGSEp374拟南芥、T3代转OrGSEp274拟南芥、T3代转OrGSEp204拟南芥、T3代转OrGSEp114拟南芥、T3代转OrGSEp54拟南芥植株生殖期不同器官的GUS染色结果如图3所示。

结果显示：在3天、5天和14天的转基因拟南芥的苗中，OrGSEp-374、OrGSEp-274、OrGSEp-204和OrGSEp-114驱动报告基因均在绿色组织表达；而OrGSEp-54却未检测到驱动报告基因的表达。在开花后，OrGSEp-54依旧未检测到驱动报告基因的表达，而OrGSEp-204报告基因的转基因材料在柱头和角果中检测到了报告基因的表达。而OrGSEp-374、OrGSEp-274和OrGSEp-114只在叶片中检测到了GUS蛋白的表达，而花器官、角果和根中未检测到报告基因的表达，呈现明显的绿色组织特异。证实上述启动子的绿色组织表达特性。

2)、GUS活性

分别取T3代转OrGSEp374拟南芥、T3代转OrGSEp274拟南芥、T3代转OrGSEp204拟南芥、T3代转OrGSEp114拟南芥、T3代转OrGSEp54拟南芥的根和叶进行提取总蛋白的提取，然后测定其GUS活性。总蛋白的提取和浓度测定参考Bradford的方法(Bradford,MM.(1976)Arapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities ofprotein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Anal Biochem(72),248–254.)，GUS活性测定参考Xu等的方法(Xu L,Ye R,Zheng Y,et al.Isolation of theendosperm-specific LPAAT gene promoter from coconut(Cocos nucifera L.)and itsfunctional analysis in transgenic rice plants[J].Plant Cell Rep,2010,29(9):1061-1068.)。

结果如图4所示：OrGSEp-374、OrGSEp-274、OrGSEp-204和OrGSEp-114驱动报告基因在叶片中高效表达，而在根中几乎不表达，而OrGSEp-54在根中和叶中的表达一致，几乎检测不到表达，进一步证明OrGSEp-54可能已经没有启动子活性了。而其余的启动子片段表现出绿色组织特异的特性。

4、绿色组织特异表达启动子的光诱导活性分析

将T3代转OrGSEp374拟南芥、T3代转OrGSEp274拟南芥、T3代转OrGSEp204拟南芥、T3代转OrGSEp114拟南芥、T3代转OrGSEp54拟南芥种植在正常的条件下，3周大的苗部分转移到黑暗条件下，剩下的继续在正常条件下培养。24小时后进行取样进行GUS活性分析。同时取将拟南芥种子在70％酒精中消毒8分钟，95％酒精1分钟，晾干，点在1/2MS培养基中4℃放2天，转移到正常条件下，萌发10天后黑暗放置24小时，进行GUS染色。

染色结果如图5所示，OrGSEp-374和OrGSEp-274明显的受到光诱导，而OrGSEp-204也受到光诱导的作用，但是诱导作用较弱。但是OrGSEp-114在光照和黑暗条件下，GUS染色都比较浅，没有明显的差别。证明OrGSEp-114不受光的诱导作用。GUS活性的分析结果和GUS染色的结果一致，更进一步证明了OrGSEp-374、OrGSEp-274和OrGSEp-204的启动子片段有光诱导活性。

5、转基因水稻GUS染色和酶活分析

用于水稻转化重组载体pCAMBIA1305-OrGSEp-374为将序列1所示的OrGSEp-374替换pCAMBIA1305载体(武汉淼灵生物科技有限公司，P1117)的Hind III和NcoI位点间的片段，得到的载体通过农杆菌转化的方式转化水稻品种日本晴。水稻转化方法参考Htwe等的方法(Htwe N N,Ling H C,Zaman F Q,et al.Plant genetic transformationefficiency of selected Malaysian rice based on selectable marker gene(hptII).[J].Pakistan Journal of Biological Sciences Pjbs,2014,17(4):472.)。

转基因纯合水稻株系取不同的组织进行GUS染色和GUS活性分析,方法同上。

结果如图6所示，显示转基因材料中GUS报告基因在叶片、茎、叶鞘和胚芽中表达,但是在根和胚乳中没有表达。进一步的GUS活性分析表明：检测结果和GUS染色的结果是一致的。证明OrGSEp-374是一个绿色组织特异的启动子。

序列表

<110>中国农业科学院生物技术研究所

<120>普通野生稻绿色组织特异表达基因启动子及其应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 374

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atttttcggg ttgaaaattg ccacgtaagc gctacgttaa ttccacgtgg gacggagacc 60

tagtcaaaca agccacgtag atgccacgtc atccaaaacc gccttcaaaa ccgctgaggg 120

acctcgtttg cccggttttc gtaagttggg ggacgggtcg tacccggttt tgcggtcgag 180

ggacgaaaat cggactgagt gacaaataga gggacccaaa gtgaacttat tccaaggtga 240

aaattttagc ccattggact tgccatcctt tgggcctcca cacaaaaaat cgtgggcgcc 300

acgagccaat cgaatcgcca caaacatcat caccatcacc atataatcca ccaaattatt 360

gtggccgtcg tgca 374

<210> 2

<211> 274

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gccttcaaaa ccgctgaggg acctcgtttg cccggttttc gtaagttggg ggacgggtcg 60

tacccggttt tgcggtcgag ggacgaaaat cggactgagt gacaaataga gggacccaaa 120

gtgaacttat tccaaggtga aaattttagc ccattggact tgccatcctt tgggcctcca 180

cacaaaaaat cgtgggcgcc acgagccaat cgaatcgcca caaacatcat caccatcacc 240

atataatcca ccaaattatt gtggccgtcg tgca 274

<210> 3

<211> 204

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgcggtcgag ggacgaaaat cggactgagt gacaaataga gggacccaaa gtgaacttat 60

tccaaggtga aaattttagc ccattggact tgccatcctt tgggcctcca cacaaaaaat 120

cgtgggcgcc acgagccaat cgaatcgcca caaacatcat caccatcacc atataatcca 180

ccaaattatt gtggccgtcg tgca 204

<210> 4

<211> 114

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgccatcctt tgggcctcca cacaaaaaat cgtgggcgcc acgagccaat cgaatcgcca 60

caaacatcat caccatcacc atataatcca ccaaattatt gtggccgtcg tgca 114

<210> 5

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caaacatcat caccatcacc atataatcca ccaaattatt gtggccgtcg tgca 54

Claims

1.DNA分子在作为植物启动子中的应用；

所述DNA分子，是如下1）-4）中任一种的DNA分子：

1）编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；

2）编码区为序列表中序列2所示的DNA分子；

3）编码区为序列表中序列3所示的DNA分子；

4）编码区为序列表中序列4所示的DNA分子。

2.权利要求1所述DNA分子中的1）-3）所示的DNA分子在作为植物光诱导性启动子中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述植物启动子为植物组织特异性启动子。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述植物组织为绿色组织。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述绿色组织为叶片。

6.DNA分子在驱动植物组织中目的基因表达中的应用；

所述DNA分子，是如下1）-4）中任一种的DNA分子：

1）编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；

2）编码区为序列表中序列2所示的DNA分子；

3）编码区为序列表中序列3所示的DNA分子；

4）编码区为序列表中序列4所示的DNA分子。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述植物组织为绿色组织。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述绿色组织为叶片。

9.根据权利要求1-8中任一所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。