CN105063054A - 一种具有侧根特异性表达特性的dna片段 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种具有侧根特异性表达特性的DNA片段，所述DNA片段包含：1)、序列表中SEQ？ID？NO：1所示的DNA序列；或者2)在严格条件下与1)、中所述的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；或者3)、与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上的同源性，且具有启动子功能的DNA片段。该DNA片段可以用作根特异表达启动子。本发明还提供了含有该DNA片段的表达盒、植物表达载体并将其应用于植物基因工程中。本发明还提供了一种利用该DNA片段获得转基因水稻的方法，采用本发明的启动子构筑转基因水稻可以针对性地改善水稻根部的性状。本发明在农业领域将具有广阔的应用和市场前景。

Description

一种具有侧根特异性表达特性的DNA片段

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及能够在水稻转基因调控体系中特异性的驱动目标基因的表达的一段DNA片段。

背景技术

启动子是参与特定基因转录及其调控的DNA序列。它决定了一个基因是否表达、何时表达以及何处表达。按作用方式和功能，启动子可分成组成型启动子、特异型启动子和诱导型启动子三类。在植物基因工程中，人们利用具有不同表达调控水平的启动子来启动目标基因的表达。例如来源于玉米的Ubiqutin和水稻的Actin启动子，能够调控目的基因在根、叶中强烈表达，是植物转基因中被广泛使用的启动子。虽然组成型启动子能驱动目标基因在植物中非特异性地高效表达，但往往造成植株大量积累异源蛋白，打破原有代谢平衡，过分消耗植株能量，因而得不到所预期的表型。因此，选择一些能在组织、器官以及发育各阶段特异的启动子，使目标基因只在特定组织或特定时期表达，对于基因功能研究、作物性状改良有重要的意义。

作为植物的地下部，根直接与土壤接触，从土壤中吸取水分和养分、运输物质和储存营养等，是植物极其重要的生理器官，因此研究根特异性启动子具有实在的应用价值。如利用根特异性启动子可以改善植物根的生长，提高植物的抗旱盐能力，增加根的分泌物，对土壤污染进行生物修复等。同时利用根特异性启动子研究植物根的发育、根系的形态建成和根构型的重建并进行作物的遗传改良培育高产稳产的作物新品种具有重要的意义。

目前使用中的根特异性启动子并不多。在植物内源的根特异性启动子开发应用之前，使用的农杆菌Ri质粒中的一个根特异的基序rolD(ElmayanT,TepferM.EvaluationintobaccooftheorganspecificityandstrengthoftherolDpromoterdomanAofthe35Spromoterandthe35Spromoter.TransgenicRes,1995,4:388-396)。最近几年人们也找到一些根特异性启动子，如利用拟南芥的黑芥子酶(myrosinase)PYK10启动子调控CKX3基因，使该基因在根中表达，促进根的加快生长，提高了作物抗旱和吸收矿物质的能力(WernerT,NehnevajovaE,KollmerI,NovakO,StrnadM,KramerU,SchmullingT.Root-specificfeductionofcytokinincausesenhancedrootgrowth,droughttolerance,andleafmineralenrichmentinArabidopsisandtobacco.PlantCell.2010,22(12):3905-3920)；用根特异性引物Rcc3驱动OsNAC10，发现特异性表达该基因后，也使根变大，并能在干旱胁迫下增加植物产量(JinSeoJeong,YounShicKim,KwangHunBaek,HarinJung,Sun-HwaHa,YangDoChoi,MinkyunKim,ChristopheReuzeau,andJu-konKim.Root-SpecificExpressionofOsNAC10ImprovesDroughtToleranceandGrainYieldinRiceunderFieldDroughtConditions.PlantPhysiol.2010153:185-197)。

综上所述，在植物中，合理使用根特异性启动子能明显改善植物性状，但应用于水稻等禾谷类作物基因工程遗传载体构建中能够选用的植物内源根特异性启动子依然较少，因此，发展更多的水稻等禾谷类作物的根特异性启动子对基础研究和生产应用都具有重要的意义。

发明内容

因此，针对上述问题，本发明针对水稻根中相关基因的表达，获得一个DNA片段，其具有根表达特异性，可以用于驱动在根中特异性表达的一些功能基因或结构基因。

本发明的还获得了获得含有上述DNA片段的表达盒和重组载体，并且本发明还利用该DNA片段获得了相应的转基因植物。其中，本文中所涉及的“植物”是指单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高梁或燕麦，优选为水稻。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种DNA片段，所述DNA片段包含：

1)序列表中SEQIDNO：1所示的DNA序列；或者

2)在严格条件下与1)中所述的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；或者

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上的同源性，且具有启动子功能的DNA分子。

2)和3)中的序列与SEQIDNo:1所示的DNA序列具有相同的功能，即驱动目标基因在植物中表达，其中，

SEQIDNO：1中所示序列为:

需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，序列开头的序列“atttcccttgtcactcctctgg”共计22bp为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列；序列末尾的序列“aacgaggacggcaaggacaaga”共计22bp为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)；该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。需要说明的是，即便本领域技术人员在本发明的基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也落入本发明的保护范围之内。

优选地，本发明所述DNA序列为SEQIDNo:1所示的序列。

优选地，序列表中SEQIDNo:1所示的DNA序列用作水稻根特异表达启动子。

序列表中SEQIDNo:1所示的DNA序列可以提取自水稻属植物，优选为日本晴水稻(OryzasativaLcv.Nipponbare)，本文中称为POsRo4或启动子POsRo4。具体而言，本申请的发明人发现日本晴水稻(OryzasativaLcv.Nipponbare)基因上游包括转录起始位点在内的1593bp的DNA序列，具有驱动目标基因在水稻根中特异性表达的功能，并且分离克隆、并鉴定了该DNA序列的功能。

另一方面，本发明还提供一种包含上述水稻根特异性强表达启动子的表达盒。

另一方面，本发明还提供一组用于扩增所述DNA片段的全长或其任意片段的引物对，其特征在于，所述引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物的DNA序列包含片段：ATTTCCCTTGTCACTCCTCTGG；所述第二引物的DNA序列包含片段：AACGAGGACGGCAAGGACAAGA。

又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体为在植物表达载体pCAMBIA1391的多克隆位点插入所述DNA片段得到的重组质粒，在所述重组表达载体中，所述水稻根特异表达启动子POsRo4连接于载体中待表达的基因序列的上游；优选的，所述待表达的基因为对水稻根有改善功能的基因。通过本发明的启动子驱动基因在根中特异性表达，从而达到改良作物性状的作用。

再一方面，本发明提供上述水稻根特异性强表达启动子在培育转基因植物中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述水稻根特异性强表达启动子连接于载体的待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子序列置于目标基因之前)，从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。

另一方面，本发明提供一种制备转基因水稻的方法，其特征在于，所述方法包括：利用PCR扩增方法对日本晴水稻DNA中权利要求1所述的DNA片段进行扩增；

利用T4连接酶将扩增获得的DNA序列与含有目的基因的预定载体相连接，获得相应重组载体；

利用冻融法将所获得的重组载体转入根癌农杆菌；

采用农杆菌介导的水稻遗传转化方法利用所述根癌农杆菌将权利要求1所述的DNA片段以及目的基因转入水稻细胞；

利用所述水稻细胞培养转基因水稻。

综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻(OryzasativaLcv.Nipponbare)POsRo4基因上游包括转录起始位点在内的1593bp的DNA序列，并将其命名为启动子POsRo4。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒(即重组表达载体)，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行Gus组织化学染色检测发现，转基因植株仅在根部位有Gus表达，从而证明该1593bp的序列具有驱动基因在根部位特异性表达的活性。

本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组植物表达载体，经转化后，在水稻的根部位特异性的驱动靶标基因的表达，增加转基因的效果，改良水稻的特性。

技术效果

本发明所克隆的水稻启动子POsRo4能够调控基因在水稻根中特异性集中表达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，从而培育出理想的转基因植物品种。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为将POsRo4启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A为pCAMBIA1391示意图，图1中B为pCAMBIA1391-POsRo4示意图，其中示出了利用POsRo4启动子驱动位于其下游的Gus基因表达；

图2为对本发明启动子进行酶切验证的结果示意图；

图3为在7天幼苗中通过GUS组织化学染色检测启动子的表达特征(标尺＝5mm)。GUS在叶、茎(鞘)组织中没有表达，在主根中也没有表达，仅在侧根，特别是侧根伸长部分有明显表达，这表明POsRo4启动子在侧根中特异表达。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

含有酶切位点的POsRo4启动子的获得

步骤1、引物的设计

根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(OryzasativaLcv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻POsRo4基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。

本实验例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391(来自于CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物(SEQIDNo:2)5’端带BamHI，酶切位点(GGATCC)，反向引物(SEQIDNo:3)5’端带SmaI，酶切位点(CCCGGG)，引物序列如下：

正向引物：GGATCCATTTCCCTTGTCACTCCTCTGGBamHI

反向引物：GGATCCATTTCCCTTGTCACTCCTCTGGSmaI

由深圳华大基因公司合成。

步骤2、启动子POsRo4的获得

以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子POsRo4，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，循环35次；最后72℃延伸10min。

回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1593bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照冷激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆菌液提质粒，用BamHI和SmaI进行双酶切验证，如图2所示。将经过鉴定的阳性克隆送并Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子POsRo4，其核酸序列如SEQIDNo:1所示。

植物表达载体的构建和农杆菌的转化

从上面“启动子POsRo4的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用BamHI和SmaI酶切，回收启动子POsRo4片段。同时利用BamHI和SmaI对pCAMBIA1391进行线性化处理、回收pCAMBIA1391，将上述的POsRo4片段和pCAMBIA1391片段(pCAMBIA1391中含有Gus基因)用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到启动子POsRo4与Gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391-POsRo4，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)。

利用启动子POsRo4驱动Gus报告基因在水稻中表达

步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化

将成熟水稻种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌的转化。

采用上述“植物表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，获得POsRo4::GUS转基因水稻植株，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照YongboDuan(YongboDuan,ChenguangZhai,etal.Anefficientandhigh-throughputprotocolforAgrobacteriummediatedtransformationbasedonphOsphomannOseisomerasepOsitiveselectioninJaponicarice(OryzasativaL.)[J].PlantCellReport,2012.DOI10.1007/s00299-01201275-3.)等提出的方法。

步骤2、转基因水稻苗的组织器官染色

将7天转基因水稻植株的组织器官，即根、茎(鞘)和叶分别进行GUS染色：将各组织分别浸于GUS染色液中，37℃，过夜24小时，75％乙醇脱色，将组织中的叶绿素脱掉。然后在解剖显微镜下观察并记录GUS染色的结果。结果如图3所示，启动子驱动的GUS在叶、茎(鞘)组织中没有表达，在主根中也没有表达，仅在侧根，特别是侧根伸长部分有明显表达，这表明POsRo4启动子在侧根中特异表达。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (10)

1.一种具有侧根特异性表达特性的DNA片段，其特征在于，所述DNA片段包含：

1)序列表中SEQIDNO：1所示的DNA序列；或者

2)在严格条件下与1)中所述的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；或者

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上的同源性，且具有启动子功能的DNA分子，其中:

SEQIDNO：1中所示序列为:

2.根据权利要求1所述的DNA片段，其特征在于，所述DNA片段提取自水稻属植物，优选为日本晴水稻。

3.根据权利要求1所述的DNA片段，其特征在于，所述DNA片段用作根特异启动子，尤其是侧根特异表达启动子。

4.一组用于扩增权利要求1所述的DNA片段的全长或其任意片段的引物对，其特征在于，所述引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物的DNA序列包含片段：ATTTCCCTTGTCACTCCTCTGG；所述第二引物的DNA序列包含片段：AACGAGGACGGCAAGGACAAGA。

5.一种含有权利要求1所述的DNA片段的重组载体，其特征在于，所述重组表达载体为在植物表达载体的多克隆位点插入权利要求1所述的DNA片段得到的重组质粒，在所述重组表达载体中，所述DNA片段连接于载体中待表达的基因序列的上游。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述待表达基因为对根部位的性状具有改善功能的基因。

7.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1中所述的DNA片段。

8.一种根据权利要求1中任意一项所述的DNA片段在培育转基因植物中的应用，其特征在于，所述应用包括：将根据权利要求1中所述的DNA片段连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用用于改良植物生长特性，所述植物为单子叶植物：水稻、玉米、小麦、大麦、高梁或燕麦，所述待表达基因为对根部位有特定功能的基因。

10.一种制备转基因水稻的方法，其特征在于，所述方法包括：利用PCR扩增方法对日本晴水稻DNA中权利要求1所述的DNA片段进行扩增；

利用T4连接酶将扩增获得的DNA序列与含有目的基因的预定载体相连接，获得相应重组载体；

利用冻融法将所获得的重组载体转入根癌农杆菌；

采用农杆菌介导的水稻遗传转化方法利用所述根癌农杆菌将权利要求1所述的DNA片段以及目的基因转入水稻细胞；

利用所述水稻细胞培养转基因水稻。