CN110819568B - 一种沙棘根瘤内生菌培养基及其制备、分离培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种沙棘根瘤内生菌培养基及其制备、分离培养方法，涉及生物技术领域；培养基原料包括沙棘根茎叶果发酵物，是通过对沙棘叶、沙棘根、沙棘茎和沙棘果进行发酵得到的；制备方法是将沙棘根茎叶进行酶解，再将沙棘果加入水解酪蛋白、KH2PO4和MgSO4制成营养液，将酶解液和营养液通过米曲霉发酵制得；接种时对沙棘根瘤菌挤压涂布的方法进行；通过本发明培养基可以促进沙棘Frankia内生菌的生长，同时对其它土壤根际微生物产生抑制作用，通过根茎叶果的成分进行了酶解和发酵，使Frankia内生菌对营养成分更容易吸收、利用和转化，有效的促进了Frankia内生菌在培养基内的生长代谢。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种沙棘根瘤内生菌培养基及其制备、分离培养方法。
背景技术
Frankia菌是与非豆科植物共生形成根瘤，属于能固定大气氮的放线菌。由于该菌是根瘤内生菌，对其分离比较困难。Callaham等1978年首次从Comptonia peregrina的根瘤中分离出内生菌以来，Frankia菌的分离工作才有了较大的进展。1985年杜大至从中国沙棘的根瘤中首次分离出Frankia sp. HR104。杜大至所选用的培养基为MS培养基修改的CSM-1号培养基和克氏合成一号培养基，在27℃，培养20天。前人对Frankia菌的分离培养所选用的培养基有察氏培养基、葡萄糖天门冬素培养基、苹果酸钙培养基、马铃薯浸汁培养基、克氏合成一号培养基、燕麦粉培养基、甘油苹果酸钙培养基、CMS-1号培养基、QMOD培养基等。Frankia菌的特点是分离困难，并且在人工培养基内生长缓慢，2—12周才能达到稳定期。针对Frankia菌分离和培养难的特点，我们对SM培养基进行了改进，形成了沙棘Frankia菌分离专用的培养基，在该培养基中第一加入了沙棘根茎叶果的成分。李倩2015年发现，土壤中黄酮的主要是由植物的根分泌的。韦小英2016年报道，黄酮可以改变土壤根际微生物的数量比，使细菌与真菌数量的比值和放线菌与真菌数量的比值略有降低。且黄酮处理植株的根际微生物，可使线菌数量明显提高。沙棘内生菌与沙棘根形成的根瘤是一种共生关系，也是长期共进化的结果，因此沙棘黄酮可以促进沙棘根瘤内生菌的生长，而对其它土壤微生物有抑制作用。
发明内容
本发明克服了现有技术的不足，提出一种沙棘根瘤内生菌培养基及其制备、分离培养方法，解决沙棘根部的Frankia内生菌不易分离培养的问题。
为了达到上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的。
一种沙棘根瘤内生菌培养基，原料包括沙棘根茎叶果发酵物；所述沙棘根茎叶果发酵物是通过对沙棘叶、沙棘根、沙棘茎和沙棘果进行发酵得到。
优选的，所述沙棘根茎叶果发酵物包括以下重量份的原料：沙棘叶8-12份、沙棘根3-6份、沙棘茎3-6份、沙棘果3-6份。
更优的，所述的沙棘叶、沙棘根、沙棘茎和沙棘果为干制品。
优选的，具体包括以下步骤：所述沙棘根茎叶果发酵物的原料还包括微量元素储备液和Na2-EDTA储备液，所述微量元素储备液包括H3BO3、ZaMoO4 .2H2O以及钙、铜、锌、锰离子。
优选的，所述沙棘根茎叶果发酵物是通过米曲霉发酵得到。
一种沙棘根瘤内生菌培养基的制备方法，包括以下步骤：
a）沙棘根茎叶酶解液的制备：将沙棘叶、沙棘根、沙棘茎粉碎，加入纤维素酶和果胶酶45-55℃酶解3-5天，酶解过程中每天搅拌一次，制得沙棘根茎叶酶解液。
b）沙棘果营养液的制备：将沙棘果加入水解酪蛋白、KH2PO4 和MgSO4，充分混合，制得沙棘果营养液；水解酪蛋白、KH2PO4 和MgSO4的混合物与沙棘果的重量比为1:8-9。
c）沙棘根茎叶果发酵液的制备：将所述沙棘根茎叶酶解液和沙棘果营养液混合，加入米曲霉，充分搅拌，发酵25-30天，制得沙棘根茎叶果发酵液。
d）分离培养基的制备：将沙棘根茎叶果发酵液加入凝胶制得分离培养基。
进一步的，在制备沙棘果营养液时，原料中添加微量元素储备液和Na2-EDTA储备液，所述微量元素储备液包括H3BO3、ZaMoO4 .2H2O以及钙、铜、锌、锰离子，所述微量元素储备液和Na2-EDTA储备液的混合物与沙棘果的重量比为1:9-10。
更进一步的，所述微量元素储备液和Na2-EDTA储备液的体积比为3:2。
进一步的，所述水解酪蛋白、KH2PO4 和MgSO4的重量比为4-5:1:1。
进一步的，所述沙棘根茎叶果发酵液的发酵温度为28-32℃。
一种沙棘根瘤内生菌分离培养方法，所述对沙棘根瘤内生菌挤压涂布的方法进行接种，具体为将沙棘根瘤捣碎，将捣碎后的沙棘根瘤涂布在所述的沙棘根瘤内生菌培养基上。
本发明相对于现有技术所产生的有益效果为。
1、本发明通过培养基中加入了沙棘根茎叶所含的黄酮，可以促进沙棘Frankia内生菌在分离培养基的生长，同时对其它土壤根际微生物的生长产生了抑制作用。
2、对分离培养基中所加入的根茎叶果的成分进行了酶解和发酵，使Frankia内生菌在分离培养基上对营养成分更容易吸收、利用和转化，有效的促进了Frankia内生菌在培养基内的生长代谢。
3、在发酵的过程中增加包括H3BO3、ZaMoO4 .2H2O以及钙、铜、锌、锰离子在内的微量元素储备液以及Na2-EDTA储备液，是微生物生长所必须的，模拟沙棘Frankia内生菌所处的自然共生环境，促进沙棘Frankia内生菌快速适应人工培养基的环境，提高菌落形成速率。
4、采取了对沙棘根瘤挤压涂布的分离方法，使Frankia内生菌更充分的和分离培养基接触，使其尽快的生长和繁殖，Frankia内生菌在本分离培养基上生长5天即可形成菌落，9天可布满整个培养基的表面。
附图说明
图1为在本发明所述的沙棘根瘤内生菌培养基上接种Frankia内生菌培养5天的菌落分布。
图2为在本发明所述的沙棘根瘤内生菌培养基上接种Frankia内生菌培养7天的菌落分布。
图3为在本发明所述的沙棘根瘤内生菌培养基上接种Frankia内生菌培养9天的菌落分布.
图4为通过本发明培养基培养后分离出的Frankia菌菌丝和孢子电镜下的微观图。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，结合实施例和附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。下面结合实施例及附图详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。
实施例1
一种沙棘根瘤内生菌培养基，包括沙棘根茎叶果发酵物、Na2-EDTA储备液、微量元素储备液。
1、沙棘根茎叶酶解液的制备：（g/L）
（1）将鲜沙棘叶、鲜沙棘根、鲜沙棘茎放入60℃烘箱烘干，粉碎，过80目筛，备用。
（2）将上述过筛的干沙棘叶100g、干沙棘根50g、干沙棘茎50g，加水800ml，加入纤维素酶0.5g，果胶酶0.5g,调节pH至4.0，50℃下酶解3-5天，酶解过程中每天搅拌一次，制得沙棘根茎叶酶解液。
2、沙棘根茎叶果发酵液的制备
（1）将鲜沙棘果60℃烘干，称取烘干的沙棘果50g，粉碎，加入水200ml，再加入水解酪蛋白4g，KH2PO4 1g，MgSO4 1g，微量元素储备液3ml，Na2-EDTA储备液2ml，蔗糖15g，充分混合，制得沙棘果营养液。
（2）上述沙棘根茎叶酶解液和沙棘果营养液混合，加入米曲霉孢子粉1g，充分搅拌，30℃发酵28天，发酵过程中每天搅拌一次，制得沙棘根茎叶果发酵液。
3、分离培养基的制备
（1）将沙棘根茎叶果发酵液加入琼胶18g，充分混合，制得分离培养基。
（2）事先准备好木质捣蒜器，500ml蒸馏水，20个直径10cm的培养皿，洗净，并用报纸包好，和分离培养基一起高压灭菌。
（3）灭菌后，先取出培养皿，在事先已灭过菌的超净工作台上，将灭菌培养皿摆好，然后倒入分离培养基达到1/3高度，不要盖盖，以防盖上结冷凝水。待分离培养基凝固后，再盖上盖子。
（4）将培养皿放入25℃的恒温箱中，培养24h，检查是否有杂菌污染。
（5）取出无污染的培养皿，备用。
4、沙棘根瘤的制备
取新鲜的沙棘根瘤，将根瘤从根上剥离下来，用生理盐水清洗后，在双氧水中浸泡10秒，再用生理盐水洗净，再将根瘤表面用0.1%的氯化汞消毒灭菌5min，用无菌水洗去氯化汞，放入捣蒜器内压碎，备用。
5、接种培养
取出无污染的培养皿，在事先已灭过菌的超净工作台上接种捣碎的沙棘根瘤少许。用玻璃刮铲涂布，盖上盖后，在皿上贴上标签，注明处理和编号，用无菌塑胶封口膜封底。将培养皿倒置，放入25℃培养箱中培养5-9天。
其中微量元素储备液配置方法为：
单位：g/L
微量元素也可以配成50倍的母液，用时换算成用量。可储于0-4℃冰箱中，可使用3个月。
Na2-EDTA储备液配置方法为：先将EDTA-Na2 7.45g，溶于水中，完全溶解后，再加入FeSO4-7H2O 5.57g，完全溶解后，定容1L。储备在0-4℃冰箱中，可使用2个月。用时每升培养基中加入此液2ml。若发现溶液中有絮状体，需重新配制。
实施例2
一种沙棘根瘤内生菌培养基，包括沙棘根茎叶果发酵物、Na2-EDTA储备液、微量元素储备液。
1、沙棘根茎叶酶解液的制备：（g/L）
（1）将鲜沙棘叶400g、鲜沙棘根100g、鲜沙棘茎100g，粉碎，加水800ml，加入纤维素酶0.5g，果胶酶0.5g,调节pH至4.0，50℃下酶解3-5天，酶解过程中每天搅拌一次，制得沙棘根茎叶酶解液。
2、沙棘根茎叶果发酵液的制备
（1）将鲜沙棘果100g粉碎，加入水200ml，再加入水解酪蛋白4g，KH2PO4 1g，MgSO41g，微量元素储备液3ml，Na2-EDTA储备液2ml，蔗糖15g，充分混合，制得沙棘果营养液。
（2）上述沙棘根茎叶酶解液和沙棘果营养液混合，加入米曲霉孢子粉1g，充分搅拌，30℃发酵28天，发酵过程中每天搅拌一次，制得沙棘根茎叶果发酵液。
3、分离培养基的制备
（1）将沙棘根茎叶果发酵液加入琼胶18g，充分混合，制得分离培养基。
（2）事先准备好木质捣蒜器，500ml蒸馏水，20个直径10cm的培养皿，洗净，并用报纸包好，和分离培养基一起高压灭菌。
（3）灭菌后，先取出培养皿，在事先已灭过菌的超净工作台上，将灭菌培养皿摆好，然后倒入分离培养基达到1/3高度，不要盖盖，以防盖上结冷凝水。待分离培养基凝固后，再盖上盖子。
（4）将培养皿放入25℃的恒温箱中，培养24h，检查是否有杂菌污染。
（5）取出无污染的培养皿，备用。
4、沙棘根瘤的制备
取新鲜的沙棘根瘤，将根瘤从根上剥离下来，用生理盐水清洗后，在双氧水中浸泡10秒，再用生理盐水洗净，再将根瘤表面用0.1%的氯化汞消毒灭菌5min，用无菌水洗去氯化汞，放入捣蒜器内压碎，备用。
5、接种培养
取出无污染的培养皿，在事先已灭过菌的超净工作台上接种捣碎的沙棘根瘤少许。用玻璃刮铲涂布，盖上盖后，在皿上贴上标签，注明处理和编号，用无菌塑胶封口膜封底。将培养皿倒置，放入25℃培养箱中培养5-9天。
其中，微量元素储备液配置方法为：
单位：g/L
微量元素也可以配成50倍的母液，用时换算成用量。可储于0-4℃冰箱中，可使用3个月。
Na2-EDTA储备液配置方法为：
先将EDTA-Na2 7.45g，溶于水中，完全溶解后，再加入FeSO4-7H2O 5.57g，完全溶解后，定容1L。储备在0-4℃冰箱中，可使用2个月。用时每升培养基中加入此液2ml。若发现溶液中有絮状体，需重新配制。
图1-4为实施例1分离出Frankia内生菌的培养过程，可以看出通过本发明实施例1的培养基培养出的Frankia内生菌在本分离培养基上生长5天即可形成菌落，9天可布满整个培养基的表面。通过培养基中加入了沙棘根茎叶所含的黄酮，可以促进沙棘Frankia内生菌在分离培养基的生长，同时对其它土壤根际微生物的生长产生了抑制作用。对分离培养基中所加入的根茎叶果的成分进行了酶解和发酵，使Frankia内生菌在分离培养基上对营养成分更容易吸收、利用和转化，有效的促进了Frankia内生菌在培养基内的生长代谢。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施方式仅限于此，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定专利保护范围。
Claims (5)
1.一种沙棘根瘤内生菌分离培养方法，其特征在于，对沙棘根瘤内生菌采用挤压涂布的方法进行接种，具体为将沙棘根瘤捣碎，将捣碎后的沙棘根瘤涂布在沙棘根瘤内生菌培养基上；
所述沙棘根瘤内生菌培养基的原料包括沙棘根茎叶果发酵物；所述沙棘根茎叶果发酵物是通过对沙棘叶、沙棘根、沙棘茎和沙棘果进行发酵得到；
所述沙棘根瘤内生菌培养基的制备方法，包括以下步骤：
a）沙棘根茎叶酶解液的制备：将沙棘叶、沙棘根、沙棘茎粉碎，加入纤维素酶和果胶酶45-55℃酶解3-5天，酶解过程中每天搅拌一次，制得沙棘根茎叶酶解液；
b）沙棘果营养液的制备：将沙棘果、水解酪蛋白、KH2PO4、MgSO4、微量元素储备液和Na2-EDTA储备液充分混合，制得沙棘果营养液；
水解酪蛋白、KH2PO4和MgSO4的混合物与沙棘果的重量比为1:8-9；
所述微量元素储备液包括H3BO3、ZaMoO4.2H2O以及钙、铜、锌、锰离子，所述微量元素储备液和Na2-EDTA储备液的混合物与沙棘果的重量比为1:9-10；
c）沙棘根茎叶果发酵液的制备：将所述沙棘根茎叶酶解液和沙棘果营养液混合，加入米曲霉，充分搅拌，发酵25-30天，制得沙棘根茎叶果发酵液；
d）分离培养基的制备：将沙棘根茎叶果发酵液加入凝胶制得分离培养基。
2.根据权利要求1所述的一种沙棘根瘤内生菌分离培养方法，其特征在于，所述沙棘根茎叶果发酵物包括以下重量份的原料：沙棘叶8-12份、沙棘根3-6份、沙棘茎3-6份、沙棘果3-6份。
3.根据权利要求2所述的一种沙棘根瘤内生菌分离培养方法，其特征在于，所述的沙棘叶、沙棘根、沙棘茎和沙棘果为干制品。
4.根据权利要求1所述的一种沙棘根瘤内生菌分离培养方法，其特征在于，所述微量元素储备液和Na2-EDTA储备液的体积比为3:2。
5.根据权利要求1所述的一种沙棘根瘤内生菌分离培养方法，其特征在于，所述水解酪蛋白、KH2PO4和MgSO4的重量比为4-5:1:1。
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