CN101606487B - 人参不定根组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人参不定根组织培养方法,包括的步骤:人参愈伤组织的诱导,人参愈伤组织的扩增与继代培养,将诱导出的愈伤组织接种于准备好的固体培养基上,加入植物生长调节剂,在无菌、23~25℃及避光条件下培养3~4周;将扩增出的愈伤组织接种于准备好的固体培养基上,加入适当的植物生长调节剂,在无菌、23~25℃及避光条件下培养3~5周后可见到不定根的形成;将已形成的不定根挑出接种于准备好的液体培养基上,加入植物生长调节剂,在无菌、室温及光照条件下培养4~5周。本发明比培养人参细胞更具有实际意义,其生长速率要比原根快很多,并且其活性次生代谢产物的产率高且比较稳定,同时又不受天灾等自然环境的影响,具有工艺过程简单,诱导率高,重复性好,不定根增殖快等特点。
Description
技术领域:
本发明公开了一种人参不定根组织培养方法,属于中药人参组织培养领域。
背景技术:
人参(Panax ginseng)是五加科人参属多年生双子叶植物,以根入药最为常见。现代药理学研究表明,人参具有调节糖代谢、增强免疫力、延缓衰老、抗肿瘤、降血压、预防及治疗心血管疾病、保肝护肝、增强学习能力和记忆能力、益智等作用。由于多年来的过度采挖,人参赖以生存的森林生态环境遭到严重破坏,野生人参资源枯竭,目前用于药用的多为栽培人参。然而人参的栽培生产周期长,占地面积大,且其品质易受气候、栽培条件及病虫害的影响,供应难以满足市场的需求;农残超标、老参地等问题也极大地限制了人工栽培人参的发展前景。人参组织培养方法具有不受生长季节限制、不携带病毒、培养周期短等优点,且易于进行工业化大规模生产,因此具有很大的发展前途。目前我国关于人参组织培养的报道很多,但主要集中于愈伤组织以及悬浮细胞的培养,不定根的培养尚未见报道。
发明内容:
本发明的目的在于提供一种人参不定根组织培养的方法。该方法快速可行,可以提供均一的培养物。工艺简单,成本低廉,重复性好。
本发明在于提供的一种人参不定根组织培养的方法包括的步骤:
步骤一,人参愈伤组织的诱导:将人参根用清水洗净后,置烘箱中烘干。在超净工作台中用酒精喷洒西洋参根表面,火焰灼烧至干。用灭过菌的解剖刀在根表面割一个1~2cm的切口,并从两边断开,最后把内部的组织切成0.5~1cm的小块接到事先准备好的固体培养基上,在无菌、23~25℃及避光条件下培养3~4周后可见愈伤组织的形成;步骤二,人参愈伤组织的扩增与继代培养:将诱导出的愈伤组织接种于准备好的固体培养基上,加入植物生长调节剂,在无菌、23~25℃及避光条件下培养3~4周;步骤三,人参不定根的诱导:将扩增出的愈伤组织接种于准备好的固体培养基上,加入适当的植物生长调节剂,在无菌、23~25℃及避光条件下培养3~5周后可见到不定根的形成;步骤四,人参不定根的扩繁与继代培养:将已形成的不定根挑出接种于准备好的液体培养基上,加入植物生长调节剂,在无菌、室温及光照条件下培养4~5周,即可获得本发明的人参不定根。
本发明利用组织培养方法培养人参不定根,比培养人参细胞更具有实际意义,其生长速率要比原根快很多,并且其活性次生代谢产物的产率高且比较稳定,同时又不受天灾等自然环境的影响。本发明具有工艺过程简单,诱导率高,重复性好,不定根增殖快等特点。
附图说明
图1人参愈伤组织。
图2从人参愈伤组织上诱导不定根。
图3在液体培养基中扩繁的人参不定根。
具体实施方式:
实例一:
用1mol/L的HCl和NaOH溶液将100mL含有1mg/L 2,4-D、0.1mg/L KT、30g/L蔗糖的MS固体培养基调至pH 5.8,在121℃、0.1MPa的压力下灭菌15分钟备用;将东北吉林栽培人参的新鲜根(由中国农科院左家特产研究所提供)用自来水冲洗干净,至于45℃烘箱中烘干,然后在超净台中用75%的乙醇喷洒表面,用酒精灯火焰灼烧至干以消毒灭菌,之后用灭过菌的解剖刀在根表面割一个1cm的切口,并从两边断开,再把内部的组织切成0.5cm左右的小块接到事先准备好的MS固体培养基中,在无菌、23℃及避光条件下培养以诱导愈伤组织,培养4周后可见愈伤组织的形成。用1mol/L的HCl和NaOH溶液将100mL含有1mg/L 2,4-D、0.1mg/L KT、30g/L蔗糖的MS固体培养基调至pH 5.8,在121℃、0.1MPa的压力下灭菌15分钟备用;选择生长良好的愈伤组织,用事先灭菌的解剖刀和镊子接种于准备好的MS固体培养基中,在无菌、23℃及避光条件下进行人参愈伤组织的扩增与继代培养,培养周期为4周。用1mol/L的HCl和NaOH溶液将100mL含有3mg/L IBA、0.1mg/L KT、30g/L蔗糖的MS固体培养基调至pH 5.8,在121℃、0.1MPa的压力下灭菌15分钟备用;选择生长良好的愈伤组织,用事先灭菌的解剖刀和镊子接种于准备好的MS固体培养基上,在无菌、23℃及避光条件下进行人参不定根的诱导,培养4周后可见到不定根的形成。用1mol/L的HCl和NaOH溶液将装在250mL三角瓶中的100mL含有3mg/L IBA、0.1mg/L KT、30g/L蔗糖的MS液体培养基调至pH 5.8,在121℃、0.1MPa的压力下灭菌15分钟备用;选取生长良好的不定根,用事先灭菌的解剖刀和镊子挑出接种于事先准备好的MS液体培养基中,在100rpm速度的摇床上,无菌、室温及避光条件下进行人参不定根的扩繁与继代培养,培养周期为4周,即可获得本发明的人参不定根。如图1-3所示。
实例二:
用1mol/L的HCl和NaOH溶液将100mL含有2mg/L 2,4-D、0.5mg/L KT、30g/L蔗糖的MS固体培养基调至pH 5.9,在121℃、0.1MPa的压力下灭菌20分钟备用;将东北吉林栽培人参的新鲜根(由中国农科院左家特产研究所提供)用自来水冲洗干净,至于50℃烘箱中烘干,然后在超净台中用75%的乙醇喷洒表面,用酒精灯火焰灼烧至干以消毒灭菌,之后用灭过菌的解剖刀在根表面割一个2cm的切口,并从两边断开,再把内部的组织切成1cm左右的小块接到事先准备好的MS固体培养基中,在无菌、24℃及避光条件下培养以诱导愈伤组织,培养3周后可见愈伤组织的形成。用1mol/L的HCl和NaOH溶液将100mL含有2mg/L 2,4-D、0.5mg/L KT、30g/L蔗糖的MS固体培养基调至pH 5.9,在121℃、0.1MPa的压力下灭菌20分钟备用;选择生长良好的愈伤组织,用事先灭菌的解剖刀和镊子接种于准备好的MS固体培养基中,在无菌、24℃及避光条件下进行人参愈伤组织的扩增与继代培养,培养周期为4周。用1mol/L的HCl和NaOH溶液将100mL含有4mg/L IBA、0.3mg/L KT、40g/L蔗糖的MS固体培养基调至pH 5.9,在121℃、0.1MPa的压力下灭菌20分钟备用;选择生长良好的愈伤组织,用事先灭菌的解剖刀和镊子接种于准备好的MS固体培养基上,在无菌、24℃及避光条件下进行人参不定根的诱导,培养4周后可见到不定根的形成。用1mol/L的HCl和NaOH溶液将装在250mL三角瓶中的100mL含有4mg/L IBA、0.3mg/L KT、40g/L蔗糖的MS液体培养基调至pH 5.9,在121℃、0.1MPa的压力下灭菌20分钟备用;选取生长良好的不定根,用事先灭菌的解剖刀和镊子挑出接种于事先准备好的MS液体培养基中,在110rpm速度的摇床上,无菌、室温及避光条件下进行人参不定根的扩繁与继代培养,培养周期为5周,即可获得本发明的人参不定根。
实例三:
用1mol/L的HCl和NaOH溶液将100mL含有4mg/L 2,4-D、1mg/L KT、30g/L蔗糖的MS固体培养基调至pH 6.0,在121℃、0.1MPa的压力下灭菌25分钟备用;将东北吉林栽培人参的新鲜根(由中国农科院左家特产研究所提供)用自来水冲洗干净,至于50℃烘箱中烘干,然后在超净台中用75%的乙醇喷洒表面,用酒精灯火焰灼烧至干以消毒灭菌,之后用灭过菌的解剖刀在根表面割一个2cm的切口,并从两边断开,再把内部的组织切成0.5cm左右的小块接到事先准备好的MS固体培养基中,在无菌、25℃及避光条件下培养以诱导愈伤组织,培养3周后可见愈伤组织的形成。用1mol/L的HCl和NaOH溶液将100mL含有4mg/L 2,4-D、1mg/L KT、30g/L蔗糖的MS固体培养基调至pH 6.0,在121℃、0.1MPa的压力下灭菌25分钟备用;选择生长良好的愈伤组织,用事先灭菌的解剖刀和镊子接种于准备好的MS固体培养基中,在无菌、25℃及避光条件下进行人参愈伤组织的扩增与继代培养,培养周期为4周。用1mol/L的HCl和NaOH溶液将100mL含有5mg/L IBA、0.5mg/L KT、50g/L蔗糖的MS固体培养基调至pH 6.0,在121℃、0.1MPa的压力下灭菌25分钟备用;选择生长良好的愈伤组织,用事先灭菌的解剖刀和镊子接种于准备好的MS固体培养基上,在无菌、25℃及避光条件下进行人参不定根的诱导,培养4周后可见到不定根的形成。用1mol/L的HCl和NaOH溶液将装在250mL三角瓶中的100mL含有5mg/L IBA、0.5mg/L KT、50g/L蔗糖的MS液体培养基调至pH 6.0,在121℃、0.1MPa的压力下灭菌25分钟备用;选取生长良好的不定根,用事先灭菌的解剖刀和镊子挑出接种于事先准备好的MS液体培养基中,在120rpm速度的摇床上,无菌、室温及避光条件下进行人参不定根的扩繁与继代培养,培养周期为5周,即可获得本发明的人参不定根。
Claims (1)
1.一种人参不定根的组织培养方法,其特征在于包括的步骤:
1)人参愈伤组织的诱导:将人参根用清水洗净后,置烘箱中烘干,在超净工作台中用酒精喷洒人参根表面,火焰灼烧至干,用灭过菌的解剖刀在根表面割一个1~2cm的切口,并从两边断开,最后把内部的组织切成0.5~1cm的小块接到事先准备好的固体培养基上,在无菌、23~25℃及避光条件下培养3~4周后可见愈伤组织的形成,本步骤所述固体培养基为含有1mg/L 2,4-D、0.1mg/L KT、30g/L蔗糖的MS固体培养基,灭菌前pH调为5.8;
2)人参愈伤组织的扩增与继代培养:将诱导出的愈伤组织接种于准备好的固体培养基上,在无菌、23~25℃及避光条件下培养3~4周,本步骤所述固体培养基为含有1mg/L2,4-D、0.1mg/L KT、30g/L蔗糖的MS固体培养基,灭菌前pH调为5.8;
3)人参不定根的诱导:将扩增出的愈伤组织接种于准备好的固体培养基上,在无菌、23~25℃及避光条件下培养3~5周后可见到不定根的形成,本步骤所述固体培养基为含有3mg/L IBA、0.1mg/L KT、30g/L蔗糖的MS固体培养基,灭菌前pH调为5.8;
4)人参不定根的扩繁与继代培养:将已形成的不定根挑出接种于准备好的液体培养基中,在无菌、室温及避光条件下培养4~5周,即可获得人参不定根,本步骤所述液体培养基为含有3mg/L IBA、0.1mg/L KT、30g/L蔗糖的MS液体培养基,灭菌前pH调为5.8。
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