FI80723C - Mikrobiologiskt foerfarande foer framstaellning av antracyklinderivat kesarirodin a och b. - Google Patents

Description

1 80723

Mikrobiologinen menetelmä antrasykliinijohdannaisten kesa-rirodiini A ja B valmistamiseksi

Keksintö koskee mikrobiologista menetelmää uusien 5 seuraavassa kesarirodiiniksi tai kesarirodiinien happo- additiosuoloiksi nimitettyjen antrasykliinijohdannaisten valmistamiseksi fermentoimalla mikro-organismia Streptomy-ces purpurascens (HPL Y-11472), DSM 2658 kemiallisten inhibiittorien läsnäollessa.

10 Uusilla yhdisteillä on bakteerienvastainen vaikutus gram-positiivisia bakteereja vastaan ja vaikuttavat lisäksi lukuisiin kasvainlajeihin. Uusilla yhdisteillä on kaavan (I) mukainen yleinen rakenne: 15

O OH

(Ijl II T joh m

20 HO o OH h OR

jossa R on sokeriyhdistelmä Roa-dF-Rod tai Roa-Rod-Rod, 25 jolloin Roa merkitsee rodosamiinia, dF merkitsee deok-sifukoosia ja Rod merkitsee rodinoosia.

Näiden sokerien rakenne on esitetty seuraavissa kaavakuvissa: • ip £> £)

N(CH3)j ^JQ

rodosamiini deoksifukoosi rodinoosi ^ (Roa) (dF) (Rod)

Kesarirodiinien molempia tyyppejä sokeriyhdistel-mien Roa-dF-Rod (A) ja Roa-Rod-Rod (B) mukaisesti nimite- 2 80723 tään kesarirodiiniksi A tai kesarirodiiniksi B. Tämän mukaisesti "kesarirodiini" merkitsee esillä olevassa julkaisussa joko kesarirodiinia A tai B tai molempien kesariro-diinien seosta. Kesarirodiini sisältää sakkaridiosassa 5 dimetyyliaminoryhmän ja voi täten muodostaa happoadditio-suoloja. Niihin happoihin, jotka muodostavat additioreak-tiolla kesarirodiinin kanssa suoloja, kuuluvat esimerkiksi suolahappo, rikkihappo ja viinihappo.

Kesarirodiinien valmistukseen käytettävä mikro-or-10 ganismi Streptomyces purpurascens (HPL Y-11472), DMS 2658 kuuluu sädesienten - Actinomycetales - luokkaan, Strepto-mycetaceae-heimoon ja Streptomyces-sukuun. Mikro-organismia nimitetään seuraavassa "S.purpurascens" OSM 2658:ksi tai "tuottavaksi mikro-organismiksi".

15 Eri Streptomyces-lajit tuottavat antrasykliinianti- biootteja tunnetusti eri määrissä ja näitä antibiootteja on kuvattu alan kirjallisuudessa. Näillä antibiooteilla on suuri merkitys lääketieteessä kasvainten hallinnassa syövän hoidossa sekä bakteerienvastaisinä lääkeaineina. Tähän 20 mennessä on esitetty erilaisia antrasykliinijohdannaisia. Näistä syövän kliinisessä hoidossa on tähän mennessä käytetty daunomysiiniä ja adriamysiiniä.

Rodomysiinejä, isorodomysiinejä ja rodomysiinistä johdettuja antrasykliiniantibiootteja on kuvattu esimer-25 kiksi julkaisussa J. Med. Chem. 20 (1977) 957 - 960.

Aklasinomysiiniä on kuvattu seikkaperäisesti US-patentti-julkaisussa nro 3 988 315 ja julkaisussa J. Antibiotics 28 (1975) 830 ja Oki et ai. 32 (1979 791-812.

Sinerubiineja A ja B kuvataan GB-patenttijulkaisus-30 sa 846 130, US-patenttijulkaisussa 3 864 489 ja julkaisusa Antimicrobial Agents and Chemotherapy (1970) 68, Keller Schierlein et al. Chemical Abstracts 54 (1960) 14661 ja J. Antibiotics 28 (1975) 830.

Yhteenvetoja antrasykliiniantibiooteista on edel-35 leen esitetty julkaisussa Index of Antiobiotics from Acti-nomycetes, toim. Hamao Umezawa, University Park Press, State Collage, Pennsylvania, USA (1976) seuraavasti: 3 80723

Antibiootit sivut

Aklasinomysiinit A-B 101-102 Adriamysiini 124

Karminomysiini I 225 5 Galirubiinit S-D 405-408

Rodomysiinit X-Y 879-880 8-rodomysiinit 881-885 ^-rodomysiinit 886-892

Steffimysiini 945 10 GB-patenttijulkaisussa 2 048 245 kuvataan uutta antrasykliiniglykosidia 13-deoksikarminomysiiniä, siis antrasyklinonia, jonka 7-asemaan on liittynyt monosakkari-di, sekä mikrobiologista menetelmää sen valmistamiseksi.

EP-patenttijulkaisussa 78 447 kuvataan antrasyklii-15 nijohdannaisia β-rodomysinoni-rodosamiini-deoksifukoosi- amisetoosi (RDA), β-rodomysinoni-rodosamiini-deoksifukoo-si-rodinoosi (RDRs) tai β-rodomysinoni-rodosamiini-deoksi-fukoosi (RD), siis 10-hydroksiantrasyklinoniglykosideja ja menetelmää niiden valmistamiseksi.

20 Julkaisussa Topics in Antibiotic Chemistry 2 (1978) 178 kuvataan menetelmää karminomysiinin valmistamiseksi.

Krohn et ai. kuvaavat julkaisussa Chem. Ber. 113 (1980) 2976-93 erilaisten antrasyklinonijohdannaisten valmistusta.

25 Keksinnön mukaiselle menetelmälle kaavan (I) mu kaisten antrasykliinijohdannaisten valmistamiseksi on tunnusomaista, että mikro-organismia Streptomyces purpuras-cens DSM 2658 fermentoidaan tavanomaisella tavalla aerobisissa olosuhteissa elatusaineen läsnäollessa ja fermen-30 toinnin kestettyä 20-36 tuntia lisätään kemiallisena inhibiittorina rauta(III)kloridia, natriumatsidia tai askor-biinihappoa ja muodostuneet yhdisteet eristetään viljely-nesteestä ja myseelistä orgaanisilla liuottimilla ja lopuksi kromatografoimalla tavanomaisella tavalla. Fermen-35 tointi suoritetaan pH-arvossa 6,5 - 8,5 ja lämpötilassa 24-40 °C aerobisissa olosuhteissa elatusaineessa, jossa on hiiltä ja typpeä, ja joka sisältää ravinteina epäorgaani- 4 80723 siä suoloja ja hivenaineita, vaahtoamisen estoaineiden kuten silikoniöljyn tai desmorfeenin läsnä ollessa tai ilman niitä kuitenkin kemiallisten inhibiittoreiden eli estäjien läsnä ollessa ja tuotetut yhdisteet eristetään 5 viljelynesteestä ja sienikasvustosta eli myseelistä seu- raavassa kuvatulla tavalla.

Hiililähteinä voivat olla glukoosi, sakkaroosi, tärkkelys, glyseriini, dekstriini, fruktoosi, sokerisii-rappi, kaurajauhot, maltoosi, laktoosi ja galaktoosi. 10 Edullisena pidettyjä hiililähteitä ovat glukoosi, tärkkelys ja sakkaroosi. Typpilähteinä voivat olla soijapapujauho, hiivajauho, hiivauute, naudanuute, mailasuute, agar, peptoni, kaseiini, puuvillansiemenöljy, kahviherneensie-menjauhe ja epäorgaaniset yhdisteet, kuten ammoniumsuolat 15 tai nitraatit (esim. ammoniumsulfaatti, natriumnitraatti, ammoniumkloridi ja kaliumnitraatti). Edullisena pidettyjä typpilähteitä ovat mallasuute, hiivauute, soijapapujauhe ja kaliumnitraatti. Haluttaessa ravintoaineet voidaan lisätä epäorgaanisina suoloina kuten natriumkloridina, mag-20 nesiumsulfaattina, kaliumkloridina, kaliumvety- ja -dive- tyfosfaattina, kalsiumkloridina, kalsiumkarbonaattina, ammoniumvetyfosfaattina, natriumvety- ja -divetyfosfaat-tina, magnesiumfosfaattina ja kalsiumfosfaattina. Hivenaineina voidaan käyttää rauta-, mangaani-, kupari-, sinkki-25 ja muita raskasmetallisuoloja. Kemiallisina inhibiittorei na voivat toimia kaliumsyanidi, kaliumheksasyaaniferraatti (III), metyleenisininen, trifenyylitetratsoliumkloridi, sulfaniilihappo, sulfaniiliamidi, askorbiinihappo ja sen suolat, natriumatsidi, rauta(III)kloridi, etyleenidiamino-30 tetraetikkahappo, nitrofuratsoni, salinomysiini, ditio- niitti, rotenoni, 2,4-dinitrofenoli, erytromysiini ja di-metyylisulfoksidi. Edullisena pidettyjä inhibiittoreita ovat askorbiinihappo ja sen suolat, natriumatsidi ja rau-ta(III)kloridi.

35 Mikro-organismin S. purpurascens, DSM 2658:n vilje ly voi tapahtua lämpötilassa 24-40 °C ja pH-arvossa 6,5 - 8,5. Edullisesti viljely tapahtuu aerobisissa olosuhteissa 5 80723 lämpötilassa 27 °C ja pH-arvossa 7,0. Kemiallista inhibiittoria, kuten rauta(III)kloridia, natriumatsidia tai askorbiinihappoa voidaan lisätä 20-36 tunnin kuluttua fer-mentoinnin aloittamisesta niin, että loppukonsentraatioksi 5 saadaan 10-80 milligrammaa litraa fermentointilientä kohti. Edullisesti lisätään 27 tuntia kestäneen fermentoinnin jälkeen natriumatsidia niin, että loppukonsentraatioksi saadaan 20 milligrammaa litraa kohti. Fermentointi keskeytetään 48-56 tunnin kuluttua, kun on saatu optimaaliset 10 määrät haluttuja yhdisteitä.

Fermentaatio suoritetaan edullisesti vedenalaisissa olosuhteissa. Fermentoinnin alkaessa voidaan fermenttoriin lisätä vaahtoamisen estoainetta Desmopher®ää aina 0,025 %:n loppukonsentraatioon saakka.

15 Näin muodostuneissa viljelyliemissä sekä myseeli että myös viljelmäsuodos sisältävät kerääntynyttä kesari-rodiinia.

Fermentaation kulku ja antrasykliinijohdannaisten muodostuminen voidaan osoittaa uuttamalla kokonaisliemi 20 (myseeli ja viljelmäsuodos) orgaanisella liuottimena ja mittaamalla absorption intensiteetti aallonpituudella 492 mm ja kromatografoimalla uute piihappolevyillä, sekä osoittamalla bakteerienvastainen vaikutus mikro-organismilla Staphylococcus aureus 209P vastaan. Orgaanisina 25 liuottimina voidaan käyttää kloroformia, etyyliasetaattia, butyyliasetaattia, butanolia, tolueenia ja bentseeniä. Etyyliasetaattia pidetään edullisena.

Kesarirodiineja voidaan ottaa talteen käyttäen mitä tahansa menetelmää, joka soveltuu talteenottamiseen vil-30 jelyliemestä. Eräs näistä menetelmistä, joka on esitetty oheen liitetyssä kaaviossa 1, perustuu uuttamiseen. Kesa-rirodiinia voidaan saada viljelmäsuodoksesta esimerkiksi uuttamalla veteen sekoittamattomalla liuottimena, kuten etyyliasetaatilla, sen jälkeen kun suodoksen pH on saatet-35 tu arvoon 7,5-8,0.

Kesarirodiini voidaan eristää sienikasvustosta eli myseelistä käsittelemällä suodattamalla ja sentrifugoimal- 6 80723 la saatua myseeliä etyyliasetaatilla, kloroformilla, meta-nolilla, etanolilla, asetonilla, butanolilla, metyylietyy-liketonilla, suolahappoliuoksella tai etikkahappoliuoksel-la. Liuottimena käytetään edullisesti asetonia. Uuttamisen 5 jälkeen asetoni poistetaan ja vesipitoisen kerroksen pH saatetaan arvoon 7,5-8,0 ja uutetaan etyyliasetaatilla. Viljelyliemelle voidaan suorittaa myös edelläkuvatut uut-tovaiheet, ilman että myseeli erotetaan.

Viljelmäsuodoksen etyyliasetaattiuutteet ja myseeli 10 yhdistetään tai käsitellään erikseen, konsentroidaan ja sitten puhdistetaan kaavion II mukaisesti.

Kaavio I

Antibioottisen kompleksin eristäminen mikro-organismista S.purpurascens DSM 2658 15

Fermentointiliemi

Myseeli Viljelmäsuodos 20 I.^ Sekoitetaan asetoni asetaattipuskurin kanssa I. pH saatetaan arvoon 7,5 (9:1) pH-arvo 3,5, 2 tunnin ajan 25 II Konsentroidaan ja uutetaan Ilj. Uutetaan etyyliasetaa-etyyliasetaatilla tiliä pH-arvossa 7,5 V J φ

Vesipitoinen Etyyliasetaatti- Vesipitoinen kerros 30 kerros kerros heitetään pois

Haihdutetaan kuiviin

35 Raakauute-fraktio K

7 80723

Kaavio II:

Kesarirodiinin A ja B eristäminen ja puhdistaminen Raakauute: fraktio K

5 I

Ohutkerros-kromatografia silikageelipylväällä(4,5 x 40 cm)

Eluointi liuottimena A

{ ΰ 1 10 Puoliksi puhdas Puoliksipuhdas Fraktio 'X'

fraktio A fraktio B

I. Pestään petrolieetterillä I. Pestään petrolieetterillä 15 II Preparatiivinen ohutker- II Preparatiivinen ohutker-ros-kromatografia/sili- roskromatografia/silika-

kageeli/liuotin A geeli/liuotin A

Φ v

Kesarirodiini A Kesarirodiini B

20

Liuotin A - kloroformi: metanoli: etikkahappo: tislattu vesi: trietanoliamiini (80 : 10 : 10 : 2 : 0,1)

Toinen tapa ottaa kesarirodiini talteen viljelylie-25 mestä perustuu adsorptioon. Kesarirodiinia sisältävälle nestemäiselle aineelle, kuten esimerkiksi viljelmäsuodok-selle tai edellä kuvatulla uuttomenetelmällä saadulle uutteelle suoritetaan pylväskromatografia, nestekromatografia tai jokin muu menetelmä, jossa käytetään sopivaa adsor-30 benttiä kuten aktiivihiiltä, Diaion HP-20R, XADR, alumiini-oksidia, silikageeliä tai Sephadex LH-20R. Kesarirodiinit voidaan eluoida metanolilla tai asetonilla adsorbenteista erilleen. Saadut eluaatit konsentroidaan kuiviin, jolloin raaka kesarirodiini muodostuu oranssinpunaisena jauheena. 35 Raa'at kesarirodiinit voidaan puhdistaa siten, että edellä 8 80723 kuvattu uutto- tai adsorptiotekniikka toistetaan niin usein kuin halutaan. Tällöin voidaan käyttää aina toivomuksen mukaan pylväskromatografiaa, käyttäen jo mainittuja erilaisia absorbentteja, sekä vastavirtajakautumaa tai 5 preparatiivista ohutkerroskromatografiaa ja kiteytystä. Edelleenpuhdistaminen voidaan suorittaa suurtehonestekro-matografiaa apuna käyttäen.

Kuten kaaviossa II on esitetty, saadaan fraktiosta K kolme komponenttia, joista puoliksi puhdas fraktio A 10 puhdistetaan edelleen, jotta saataisiin puhdas yhdiste, jota seuraavassa nimitetään kesarirodiini A:ksi. Fraktio B puhdistetaan edelleen, jotta saataisiin puhdas yhdiste, jota seuraavassa nimitetään kesarirodiini B:ksi. Fraktio ’X' esittää seosta, joka koostuu ylimääräisistä antrasyk-15 liiniyhdisteistä, joita tutkitaan vielä edelleen. Kesari-rodiinien yleinen rakenne on identtinen kaavassa I esitetyn rakenteen kanssa.

Mikro-organismin S.purpurascens, DSM 2658 fermen-tointiliemestä eristetyillä ja kaavioissa I ja II esite-20 tyllä tavalla puhdistetuilla kesarirodiineilla A ja B on seuraavassa esitetyt rakennekaavat (Ia) ja (Ib): 9 80723

O ?H H sH

HO O OHH 0 10

0 ”κηλ /-OJOH

ry HO''-'

Kesarirodiini A

h ?H H» *H

/vVW\'CH!CHi |l ~l f| ,[ J""oh T II |

OH O OHH O

& __o o 1 (Ib) ho'—f

Kesarirodiini B

10 80723 Tässä esitetyillä kaavan (I) mukaisilla kesariro-diiniantibiooteilla on bakteerienvastäinen vaikutus gram-positiivisia bakteereja vastaan ja niillä on fungisidinen vaikutus sekä kasvaintenvastainen vaikutus.

5 Kesarirodiinin bakteerien vastainen vaikutus Määritettiin kesarirodiinin bakteriostaattinen eli bakteerien kasvua estävä vaikutus. Tulokset, jotka on ilmoitettu estovyöhykkeiden halkaisijoina (millimetreissä), saatu aikaan aineella, joka on 1 mg/ml-liuoksena, halkai-10 sijaltaan 6 mm suuruisessa reiässä agarissa, joka sisältää testiorganismia, esitetään taulukoossa I. Kesarirodiinit tehoavat gram-positiivisiin bakteereihin ja sieniin ja niitä voidaan tämän johdosta käyttää antibiootteina hoidettaessa sieni- ja stafylokokki-infektioita, kurkkumätää, 15 keuhkokuumetta jne.

Taulukko I: bakteriostaattinen vaikutus

Mikro-organismi Vyöhykkeen halkaisija (mm) 20 Kesarirodiini(1 mg/ml) _A_B_

Staphylococcus aureus 209P 15 17

Bacillus subtilis 17 17

Escherichia coli 9632 25 Pseudomonas aeruginosa

Proteus vulgaris

Candida albicans 20 20

Kesarirodilnien kasvainten vastainen vaikutus 30 Kesarirodilnien sytostaattisen eli solujen jakautu mista ja kasvua estävän aktiviteetin määritys tapahtui seuraavassa kuvatulla tavalla hiirten L-1210-leukemiaso-luja apuna käyttäen.

(a) Uusiutumistesti 35 Tällä in vitro-menetelmällä on mahdollista, sen 11 80723 jälkeen kun soluja on inkuboltu käyttäen testiaineen eri konsentraatioita määrittää radioaktiivisesta leimatun DNA-esiasteen (esim. 14C-tymidiinin) määrä kasvavassa solussa. Kontrollina käytetään käsittelemättömiä L-1210-soluja, 5 joille suoritetaan sama menetelmä. Menetelmää on kuvattu lyhyesti seuraavassa:

Eksponentiaalisessa kasvuvaiheessa olevia L-1210-soluja (5 x 103/ml RPMI 1640: ssä) inkuboidaan 72 tunnin ajan (37 °C:ssa, 5 % C02, 95 %:n suhteellinen kosteus) 96-10 reikä -mikrotiitterilevyllä testiaineen eri konsentraatioita käyttäen. Kontrolleina käytetään soluja, jotka joutuvat kosketuksiin ainoastaan vasta valmistetun alustan kanssa. Jokaista lääkeaineen konsentraatiota ja kontrollia varten käytetään neljää reikää. 65 tunnin kuluttua lisä-15 tään 50 μΐ 14C tymidiinia (1,5 pCi/ml), solun DNA:n leimaamiseksi. 7 tuntia kestäneen inkuboinnin jälkeen keskeytetään inkubointi, DNA erotetaan 5 %:lla trikloorietik-kahapolla ja pestään metanolilla ja vedellä. Kuivauksen jälkeen 50 °C:ssa määritetään tuikeluku käyttäen 5 ml tui-20 kenestettä.

Tulokset ilmaistaan tuikeindeksin osamääränä testi-aineiden kanssa suoritetun inkuboinnin jälkeen verrattuna kontrolliaineella saatuihin tuloksiin.

Saatujen arvojen perusteella piirretään annosvaiku-25 tuskäyrä ja esitetään graafisesti IC50-arvo, jolla tarkoi tetaan sitä testiaineen konsentraatiota, joka estää leimatun tymidiinin rakenteen 50 %:isesti kontrolliin verrattuna. IC50-arvoja on seuraavassa taulukossa II verrattu adriamysiinin vastaaviin arvoihin.

30 (b) Kantasolutesti (pehmeä-agarilla suoritettu jatkuva koe) Tätä menetelmää käytetään osoittamaan testiaineen vaikutus leukemiasolujen kasvuun useamman sukupolven ajan (koska solusyklin kesto on 10-12 tuntia, voidaan 7 päivää 35 kestävän tutkimuksen aikana tutkia pyöreästi 14 perättäis- 12 80723 tä sukupolvea).

Tässä testissä sytotoksisten aineiden vaikutus perustuu havaittavien kasvupesäkkeiden lukumäärän vähenemiseen käsittelemättömään kontrolliin verrattuna. Käytetään 5 seuraavaa menetelmää:

Kutakin levyä kohti käytetään 500 L 1210-leukemia solua. Kokeet suoritetaan inkuboimalla jatkuvasti testi-aineiden eri konsentraatioita käyttäen, jolloin aine sekoitetaan agarin pintakerrokseen ennen solujen levittämis-10 tä levylle. Levyjä säilytetään lämpökaapissa 7 päivän ajan (37 °C:ssa, 5 % C02 suhteellinen ilman kosteus 95 %). Lopuksi lasketaan niiden muodostuneiden kasvupesäkkeiden lukumäärä, joiden halkaisija on yli 60 pm, käänteismikro-skoopilla. Tulokset ilmaistaan käsitellyillä levyillä muo-15 dostuneiden kasvupesäkkeiden prosenttimääränä käsittele mättömän kontrollin prosenttimäärään verrattuna.

Saatujen arvojen avulla piirretään annosvaikutus käyrä, josta saadaan graafisesti IC50-arvo. Kesarirodii-nien IC50-arvoja verrataan taulukossa II adriamysiinin 20 vastaaviin arvoihin.

Taulukko III: kasvainten vastainen aktiivisuus

Aine_IC50_(pg/ml)_ 25 Uusiutumistesti Kantasolutesti _7 päivän inkubointi

Adriamysiini 6,0 x 10'3 2,2 x 10‘2

Kesarirodiini A 3,1 x 10"2 3,1 x 10-2

Kesarirodiini B 0,1 2,8 x 10'2 30

Kuten edellä on esitetty on kaavan (I) mukaisilla yhdisteillä bakteerienvastäinen, fungisidinen ja syto-staattinen vaikutus, siis terapeuttinen vaikutus, erityisesti ihmisillä ja eläimillä esiintyviin pahanlaatuisiin 35 kasvaimiin.

13 80723

Yhdisteitä ja happoadditiosuoloja voidaan tämän johdosta käyttää lääkeaineina infektiotautien, sienisai-rauksien ja kasvainten hoidossa. Yhdisteet voidaan annostella eri tavoin aina annostusmuodosta riippuen. Tavalli-5 sesti yhdisteisiin sekoitetaan farmaseuttisesti tavanomaisia kantajia tai laimennusaineita. Niinpä ne voidaan annostella esimerkiksi yksinään tai seoksena yhdessä kantajien kuten maltoosin tai laktoosin kanssa tai ei-toksi-sina komplekseina, esimerkiksi deoksiribonukleiinihappo-10 kompleksina.

Tyypillinen antotapa on annostella tislatussa vedessä tai fysiologisessa keittosuolaliuoksessa olevien kaavan (I) mukaisten yhdisteiden liuos injektiona. Liuokset voidaan antaa injektiona intraperitoneaalisesti eli 15 vatsakalvon onteloon, laskimon sisäisesti tai valtimon sisäisesti.

Päivittäinen annos ja kerta-annos voidaan määrittää eläinkokeiden ja myös in-vitro-testien perusteella siten, että kokonaisannos, jota annetaan jatkuvasti tai tietyin 20 aikavälein, ei ylitä aiemmin määrättyä aluetta. Kokonais annos on täten syöpäsairauksissa yhtä hoitosarjaa kohti noin 0,1 - 20 mg, edullisesti 0,5 - 10 mg painokiloa kohti. Tämä annos voidaan annostella 7 päivän aikana vastaaviin murto-osiin jaettuna. Infektio- ja sienitautien hoi-25 dossa tulee kyseeseen annosyksikkönä 0,1 - 10 mg, edullisesti 0,5 - 5 mg painokiloa kohti. Päivittäisenä annoksena voidaan annostella yksinkertainen - kolminkertainen annosyksikkö.

Keksintöä kuvataan seuraavilla esimerkeillä.

30 Esimerkki 1:

Mikro-organismin S.purpurascens DSM 2658 viljely antibioottisesti vaikuttavan kompleksin fermentoimalla tapahtuvaa tuotantoa varten_

Streptomyces purpurascens DSM 2658 pidetään hiiva-35 mallasagarilla, jonka koostumus on seuraava: 14 80723 mallasuutetta 10,0 g hiivauutetta 4,0 g glukoosia 4,0 g maissivesiuutetta 15,0 g 5 tislattua vettä 1 litra pH 7,0

Elatusaine jaetaan koeputkiin ja steriloidaan 20 minuutin ajan 121 °C:ssa. Koeputket jäähdytetään viisto-asennossa vinopinta-agarputkien valmistamiseksi. Vinopin-10 ta-agarputkiin ympätään viljelmää ja inkuboidaan 10-15 päivän ajan 28 °C:ssa, kunnes on havaittavissa hyvä kasvu ja itiöiden muodostus. Vinopinta-agarputkesta otettua tislatussa vedessä olevaa itiösuspensiota ympätään viiteen 500 ml:n suuruiseen Erlenmeyer-kolviin, jotka sisältävät 15 kulloinkin 100 ml ymppäysviljelyalustaa tai kulloinkin 5 litran aspiraattoripulloon, joka sisältää 1 litran samaa ymppäysviljelyalustaa.

Ymppäysvlljelyalustan koostumus glukoosia 15,0 g 20 soijapapujauhoa 15,0 g maissivesiuutetta 5,0 g

CaC03 2,0 g

NaCl 5,0 g tislattua vettä 1 litra 25 pH 7,0

Edellä mainittu alusta jaetaan 100 ml:n määrissä kulloinkin 500 ml:n suuruisiin Erlenmeyer-kolveihin tai 1 litran suuruisissa määrissä kulloin 5 litran imupulloihin ja steriloidaan 20 minuutin ajan 121 °C:ssa. Kolvit/pullot 30 jäähdytetään, niihin ympätään itiösuspensiota ja niitä ravistellaan 72 tunnin ajan 28 °C:ssa pyörivässä ravisteli jassa kierrosnopeuden ollessa 240 kierrosta ja laajuuden 3,75 cm. Hyvin kasvanut ymppiviljelmä ympätään 15 litran lasifermenttoriin, joka sisältää 10 litraa tuotanto-35 alustaa konsentraation ollessa 5 tilavuusprosenttia.

is 80723

Tuotantoalustan koostumus glukoosia 20,0 g mallasuutetta 10,0 g hiivauutetta 4,0 g 5 tislattua vettä 1 litra pH 7,0 0,025 % DesmorfeeniR:ää lisätään vaahtoamisen esto- aineena fermenttorin sisältöön.

Ennen edellä kuvattua alustaa lisätään 10 litraa 10 15 litran fermenttoriin. Alusta steriloidaan epäsuoran ja suoran höyryn avulla 28 minuutin ajan 121 °C:ssa. Fer-menttori jäähdytetään ja siihen siirrostetaan kaksivaihe-ymppiviljelmää (5 tilavuus-%). Fermentointi tapahtuu 27 °C:ssa (±0,51 eC) sekoittaen kierrosnopeuden ollessa 15 170-180 kierrosta 48-56 tunnin ajan. Ilmastusnopeus on 0,6-0,8 vvm. Fermentoinnin aikana inhibiittoria lisätään noin 24-32 tunnin kuluttua kuten seuraavassa kuvataan (esimerkit 6-9).

48-56 tunnin kuluttua fermentointi keskeytetään, 20 kun antibioottisesti vaikuttavan kompleksin konsentraa- tio on 30-50 pg/ml ja viljelyliemen pH on 5,5-6,0. Lingot-tujen solujen tilavuus on tällöin 11-13 ml/100 ml. Esimerkki 2

Mikro-organismin S.purpurascens DSM 2658 viljely 25 antibioottisesti vaikuttavan kompleksin fermentoimalla tapahtuvaa tuotantoa varten_

Viljelmää kasvatetaan samoissa olosuhteissa kuin esimerkissä 1 seuraavia alustoja käyttäen: (1) Ymppäysalustan koostumus: 30 kahviherneen siemenjauhetta 10,0 g dekstroosia 10,0 g

NaCl 5,0 g

CaC03 3,0 g tislattua vettä 1 litra 35 16 80723 PH 7,0 72 tunnin ajan 28 eC:ssa Tuotantoalustan koostumus tärkkelystä 10,0 g 5 glukoosia 10,0 g mallasuutetta 7,5 g peptonia 7,5 g

NaCl 3,0 g

MgS04 · 7H20 1,0 g 10 KH2P04 2,0 g

CuS04.5H20 7,0 mg

FeS04 ♦ 7H20 1,0 mg

MnS04 · 4H20 8,0 mg

ZnS04·7H20 2,0 mg 15 tislattua vettä 1 litra pH 7,0

Fermentoinnin kuluessa lisätään noin 24-32 tunnin kuluttua kuten seuraavassa esitetään kemiallista inhibiittoria (esimerkit 6-9). Fermentointi keskeytetään 48-56 20 tunnin kuluttua, kun antibioottisesti vaikuttavan kompleksin konsentraatio on 20-40 pg/ml ja viljelyliemen pH on 5,8-6,2. Fermentoinnin päättyessä erotettujen solujen tilavuus on 11-13 ml/100 ml.

Esimerkki 3 25 Mikro-organismin S.purpurascens DSM 2658 viljely antibioottikompleksin fermentoimalla tapahtuvaa tuotantoa varten_

Viljelmää kasvatetaan vastaavissa olosuhteissa kuin esimerkissä 1 käyttäen seuraavia alustoja: 30 Ymppäysviljelyalustan koostumus mallasuutetta 10,0 g hiivauutetta 4,0 g glukoosia 4,0 g tislattua vettä 1 litra 35 17 80723 pH 7,0 72 tunnin ajan 28 eC:ssa.

Tuotantoalustan koostumus tärkkelystä 10,0 g 5 glukoosia 10,0 g soijapapujauhoa 15,0 g K2HP04 1,0 g

MgS04.7H20 1,0 g

NaCl 3,0 g 10 CuS04*5H2 7,0 g

FeS04 · 7H20 1,0 mg

MnCl24H20 8,0 mg

ZnS04*7H20 2,0 mg tislattua vettä 1 litra 15 pH 7,0

Fermentoinnin aikana lisätään kemiallista inhibiittoria kuten seuraavassa kuvataan noin 24-32 tunnin kuluttua (esimerkit 6-9). Fermentointi keskeytetään 48-52 tunnin kuluttua.

20 Esimerkki 4

Mikro-organismin S.purpurascens DSM 2658 viljely antibioottisesti vaikuttavan kompleksin fermentoimalla tapahtuvaa tuotantoa varten_

Viljelmää kasvatetaan vastaavissa olosuhteissa kuin 25 esimerkissä 1 käyttäen seuraavia alustoja: Pää-agarin koostumus: kaurajauhoja 20,0 g

FeS04 · 7H20 0,1 mg

FnS04 · 7H20 0,1 mg 30 MnCl2 ♦ 4H20 0,1 mg tislattua vettä 1 litra pH 7,2

Ymppäysviljelyalustan koostumus: glukoosia 10,0 g 35 tärkkelystä 10,0 g ie 80723 soijapapujauhoja 15,0 g

NaCl 3,0 g

MgS04 · 7H20 1,0 g K2HP04 1,0 g 5 CuS04 · 5H20 7,0 mg

FeS04 · 7H20 1,0 mg

MnCl2·4H20 8,0 mg

ZnS04 ♦ 7H20 3,0 mg tislattua vettä 1 litra 10 pH 7,2 72 tunnin ajan 28 °C:ssa.

Tuotantoalustan koostumus: sakkaroosia 20,0 g

CaC03 2,5 g 15 KN03 1,0 g K2HP04 0,5 g

MgS04·7H20 0,5 g

NaCl 0,5 g

FeS04 · 7H20 1,0 mg 20 tislattua vettä 1 litra pH 7,0

Kemiallista inhibiittoria lisätään fermentoinnin aikana noin 24-32 tunnin kuluttua kuten seuraavassa kuvataan (esimerkit 6-9). Fermentointi keskeytetään 48-52 tun-25 nin kuluttua, kun antibioottisesti vaikuttavan kompleksin konsentraatio on 25-40 pg/ml ja viljelyliemen pH vaihtelee välillä 6,3 - 6,4. Fermentoinnin päättyessä erotettujen solujen tilavuus on 5,0-6,0 ml/ 100 ml.

Esimerkki 5 30 Mikro-organismin S.purpurascens DSM 2658 viljely antibioottisesti vaikuttavan kompleksin fermentoimella tapahtuvaa tuotantoa varten_

Viljelmää kasvatetaan vastaavalla tavalla kuten esimerkissä 1 seuraavia alustoja käyttäen: 35 19 80723

Ymppäysvlljelyalustan koostumus glukoosia 20,0 g soijapapujauhoa 10,0 g tislattua vettä 1 litra 5 pH 7,2 72 tunnin ajan 28 eC:ssa Esimerkki 6

Kemiallisen inhibiittorin lisäys

Valmistetaan tislatussa vedessä oleva askorbiini-10 hapon tai sen suolojen konsentroitu liuos (20 mg/ml) ja steriloidaan steriilisuodatusta käyttäen. Liuos lisätään kuten esimerkeissä 1-5 kuvataan fermentointialustaan noin 24 - 32 tunnin kuluttua fermentoinnin aloittamisesta, jolloin saavutetaan loppukonsentraatioksi 20-100 mg/1.

15 Esimerkki 7

Kemiallisen inhibiittorin lisäys

Natriumatsidia lisätään konsentroidussa (20 mg/ml) steriilissä vesipitoisessa liuoksessa fermentointialustaan, kuten esimerkeissä 1-5 kuvataan, noin 24-32 tunnin 20 kuluttua fermentoinnin aloittamisesta, jolloin loppukonsentraatioksi saadaan 10-80 mg ainetta/litra.

Esimerkki 8

Kemiallisen inhibiittorin lisäys:

Rauta(III)kloridia liuotetaan veteen, kunnes kon-25 sentraatio on 20 mg/ml, liuos steriloidaan suodattamalla ja lisätään esimerkeissä 1-6 kuvattuun fermentointialustaan noin 24-32 tunnin kuluttua fermentoinnin aloittamisesta, jotta loppukonsentraatioksi saadaan 10-100 mg ainetta/litra.

30 Esimerkki 9

Kemiallisen inhibiittorin lisäys

Sulfonamidin, kuten sulfaniiliamidin, sulfasetami-din tai sulfonamidin lisääminen tapahtuu lisäämällä steriili konsentroitu (20 mg/ml) vesipitoinen liuos esimer-35 keissä 1-5 kuvattuun fermentointialustaan noin 24-32 tun- 20 80723 nin kuluttua fermentoinnin aloittamisesta, jolloin loppu-konsentraatioksi saadaan 40-200 mg ainetta/litra.

Esimerkki 10

Kesarlrodlinien eristäminen 5 Noin 40 litraa fermentointilientä sentrifugoidaan myseelin ja viljelmäsuodoksen erottamiseksi toisistaan. Kesarirodiinin eristäminen myseelistä ja viljelmäsuodok-sesta on esitetty seikkaperäisesti kaaviossa 1.

(a) Viljelmäsuodoksen pH saatetaan NaHC03:lla 10 7,5:ksi ja suodosta uutetaan kaksi kertaa 20 litralla etyyliasetaattia, yhdistetyt etyyliasetaattiuutteet konsentroidaan sitten vakuumissa kuiviin. Saadaan noin 1,5 g uutetta, jota nimitetään fraktioksi K.

(b) Erotettu myseeli uutetaan kolme kertaa 20 lit-15 ralla asetoni/asetaatti-puskuria (9:1) pH:n ollessa 3,5, yhdistetyt uutteet konsentroidaan vakuumissa asetonin poistamiseksi. Jäljelle jäävän vesipitoisen kerroksen pH saatetaan NaHC03:lla 7,5:ksi ja kerrosta uutetaan kolme kertaa 30 litralla etyyliasetaattia. Yhdistetyt uutteet 20 konsentroidaan vakuumissa kuiviin. Saadaan noin 6,0 g uutetta, jota nimitetään fraktioksi K.

Kesarirodiinia sisältävä uute, so. fraktio K, saatu myseelistä ja viljelmäsuodoksesta, voidaan käsitellä yhdessä tai erikseen. Kesarirodiinin A ja B eristysprosessi 25 on kuvattu kaaviossa II.

(c) 7,5 g uutetta (fraktio K) pannaan 4,5 x 40 cm:n ohutkerroskromatografia-silikageeli-H-(BDH)-pylvääseen ja eluoidaan seuraavalla liuotinseoksella: kloroformi: meta-noli: etikkahappo: tislattu vesi: trietanoliamiini suh- 30 teessä 80: 10: 2: 0,1. Tällä menetelmällä saadaan noin 50 mg puoliksi puhdasta fraktiota A, joka sisältää kesarirodiinia A, ja noin 60 mg puoliksi puhdasta fraktiota B, joka sisältää kesarirodiinia B.

Puoliksi puhtaat fraktiot pestään ensiksi petroli-35 eetterillä ja puhdistetaan sitten edelleen erikseen pre- 2i 80723 paratiivista ohutkerroskromatografiaa käyttäen silikagee-lillä käyttäen apuna liuotinsysteemiä, joka koostuu kloroformi: metanoli: etlkkahappo: tislattu vesi: trietano-liamiinista suhteessa 80: 10: 10: 2,0: 0,1. Saadaan 27 mg 5 kesarirodiini A:ta ja 32 mg kesarlrodiini B:tä.

Kesarlrodllnln A ja B karakterisointi Puhtaat aineet kesarirodiini A ja B analysoidaan kulloinkin kemiallista analyysia ja spektroskooppisia menetelmiä käyttäen.

10 UV-absorptiomaksimin määrittämistä varten ainetta käytetään konsentraatiossa 10-30 mg/litra. Absorptio-spektri rekisteröitiin alueelle 200-800 nm.

Protonin resonanssispektrit (1H-NMR-spektrit) rekisteröitiin HX-270 BRUKER Fourier-Transform magneettisel-15 la resonanssi-spektrometrillä 270 Mhz:ssa.

Näytteen konsentraatio oli 2,6-2,7 mg/0,5 ml 99,8 % CDCl3:ssa, lisätty 0,1 ml 5 %:ista Na2C03 99,5 %:isessa D20:ssa.

Massaspektri määriteltiin MS-902C, AEI-massaspekt-20 rometrillä. (FAB (Fast-Atom-Bombardment)-positiivinen-io- nimenetelmä).

Kesarirodiinin A fysikaalis-kemlalliset ominaisuudet

Ulkonäkö: oranssinpunainen j auhe 25 kemiallinen kaava: C40H53014N

molekyylipaino: 771 UV-spektri: max (a) metanoli: 203, 234, 253, 292, 464, (sh), 478 (sh), 30 492, 512 (sh), 526, 575 nm.

(b) 0,1 N-HC1-metanoli: 203, 234, 253, 292, 464 (sh), 478 (sh), 492, 512 (sh), 526 (sh), 558 (sh) nm.

(c) 0,1 N-NaOH-metanoli: 203, 239, 298, 554, 586 nm.

35 1H-NMR-spektri (CDC13 + 0,1 ml 5 % Na2C03 D20:ssa): 22 80723 7.88 (d, J-7 Hz, 1H), 7,69 (t, J-8 Hz, 1H), 7,29 (d, J= 3

Hz, 1H), 5,49 (d, J-3 Hz, 1H) 5,21 (s,lH), 5,03 (d, J= 3

Hz, 1H), 4,85 (s, 1H), 4,51 (q, J-6 Hz, 1H) 4,21 (q, J=6

Hz, 1H), 4,0 - 4,1 (kompleksi, 2H), 3,72 (s, 1H), 3,65 (s, 5 1H), 3,56 (s, 1H), 3,25 (d, J-20 Hz, 1H), 2,56 (d, J=20

Hz, 1H), 2,34 (bd, J-14 Hz, 1H), 2,15 (s, 6H) 2,0 - 2,2 (kompleksi, 4H), 1,61 - 1,9 (kompleksi, 8H), 1,17 - 1,32 (limittäin menevät dubletit, 6H), 1,14 (d, J=6 Hz, 3H), 1,07 (t, J=7,5 Hz, 3H).

10 Liukoisuus: Kesarirodiini A liukenee metanoliin, asetoniin, etyyliasetaattiin, kloroformiin ja heikkoihin happoihin, mutta heksaaniin ja petrolieetteriin se liukenee huonosti. Se muodostaa metanolissa oranssinpunaisen liuoksen, mutta saa emäksisessä ympäristössä purppuran-15 punaisen värin.

Ohutkerroskromatografia: Kesarirodiinilla A on si-likageelilevyillä eri liuotinsysteemejä käyttäen taulukossa III esitetyt Rf-arvot.

Edellä mainitut tulokset osoittavat, että kesari-20 rodiinilla A on rakennekaava Ia.

Kesarirodiinin B fysikaalis-kemialliset ominaisuudet

Ulkonäkö: oranssinpunainen jauhe kemiallinen kaava: C4oH53013N 25 molekyylipaino: 755 UV-spektrl max (a) metanoli: (b) 0,1 N-HC1-metanoli: 203, 234, 253, 292, 464 (sh), 478 30 (sh), 492, 510 (sh), 526 (sh), 558 (sh) nm.

(c) 0,1 N-NaOH-metanoli: 203, 239, 298, 552, 584 mm. 1H-NMR-spektri (CDC13 + 0,1 ml 5 % Na2C03 D20:ssa) 7.88 (d, J=7 Hz, 1H), 7,7 (t, J-8 Hz, 1H) 7,31 (d, J= 8 35 Hz, 1H), 5,52 (d, J-3 Hz, 1H), 5,21 (s, 1H), 4,95 (s, 1H), 23 80723 4,83 (d, J=3 Hz, 1H), 4,4 (q, 3=6 Hz, 1H), 3,98 4,08 (kompleksi, 2HH), 3,78 (s, 1H), 3,56 (s, 1H), 3,46 (s, 1H), 3,26 (d, J=20 Hz, 1H), 2,58 (d, J= 20 Jz, 1H), 2,25 - 2,38 (kompleksi, 1H), 2,28 (s, 6H), 1,88 - 2,2 (komplek-5 si, 4H), 1,5 - 1,85 (kompleksi, 10H), 1,02 - 1,35 (limittäin menevät multipletit, 12H).

Liukoisuus; Kesarirodiini B liukenee metanoliin, asetoniin, etyyliasetaattiin, kloroformiin ja heikkoihin happoihin, mutta heksaaniin ja petrolieetteriin se liuke-10 nee huonommin. Se muodostaa metanolissa oranssinpunaisen liuoksen, mutta emäksisessä ympäristössä taas saa purppuranpunaisen värin.

Ohutkerroskromatografia: Kesarirodiinilla B on si-likageelilevyillä eri liuotinsysteemejä käytettäessä tau-15 lukossa III ilmoitetut Rf-arvot.

Edellä olevat tulokset osoittavat, että kesarirodiinilla B on rakennekaava Ib.

Taulukko III: Rf-arvot; ohutkerroskromatografia käyttäen 0,2 mm valmislevyjä (silikageeliä alumiinifoliol-20 la) (piihappogeeli 60 F254 (Merck).

Liuotinsysteemi Rf-arvot

Kesarirodiini Kesarirodiini _A_B_

Kloroformi: metanoli 0,44 0,45 25 Kloroformi:metanolietikka- happo: tislattu vesi: trietanoliamiini 0,51 0,75 (80:10:10:2,0:0,1) etyyliasetaatti:metanoli 0,21 0,21 30 (9:1)

Claims (2)

1. 24 80723 Patenttivaatimus Mikrobiologinen menetelmä kaavan (I) mukaisten an-trasykliinijohdannaisten kesarirodiini A ja B sekä niiden 5 fysiologisesti hyväksyttävien happoadditiosuolojen valmistamiseksi O OH *C|H 2C H 3
2. 10 MOCX/oh (i’ HO O OH H or 15 jossa R on sokeriyhdistelmä Roa-dF-Rod tai Roa-Rod-Rod, jolloin Roa merkisee rodosamiinia, dF merkitsee deoksifu-koosia ja Rod merkitsee rodinoosia, tunnettu siitä, että mikro-organismia Streptomyces purpurascens DSM 2658 fermentoidaan tavanomaisella tavalla aerobisissa olo-20 suhteissa elatusaineen läsnäollessa ja fermentoinnin kestettyä 20-36 tuntia lisätään kemiallisena inhibiittorina rauta(III)kloridia, natriumatsidia tai askorbiinihappoa ja muodostuneet yhdisteet eristetään viljelynesteestä ja my-seelistä orgaanisilla liuottimilla ja lopuksi kromatogra-25 foimalla tavanomaisella tavalla. 25 80723 Mikrobiologiskt förfarande för framställning av antracyklinderivater kesarirodin A och B med formeln (I) 5 samt fysiologiskt godtagbara syraadditionssalter av dessa O OH H 2 c H 3 ίο j || if 'l pOH (I) HO O OHh /qr 15 väri R är en sockerkombination Roa-dF-Rod eller Roa-Rod-Rod, varvid Roa anger rodosamin, dF anger deoxifukos och Rod anger rodinos, kännetecknat därav, att mikroorganismen Streptomyces purpurascens DSM 2658 fer-menteras pä i och för sig känt sätt under aeroba för-20 hällanden i närvaro av ett näringsmedium och dä fermenta-tionen pägätt i 20-36 tinunar tillsätts som kemisk inhibitor järn(III)klorid, natriumazid eller askorbinsyra och de bildade föreningarna separeras frän odlingsmediet och my-celet medelst organiska lösningsmedel och därpäföljande 25 kromatografering pä i och för sig känt sätt.