CN104370803B - N,n′‑双吡啶‑4‑甲醛缩连氮的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种N,N′‑双吡啶‑4‑甲醛缩连氮在的制备方法及其应用，属于植物病害防治领域。本发明中利用N,N′‑双吡啶‑4‑甲醛缩连氮，采用菌丝生长速率法，研究其对黄瓜猝倒病菌、水稻稻瘟病菌的抑制效果。将药剂浓度设置为0、2、4、6、8μg/ml五个梯度进行试验，以生长速率法测定菌落抑制效果，通过对菌落直径数据的处理得到病菌的致死中浓度EC₅₀和抑制率。以EC₅₀值的角度进行比较，供试剂N,N′‑双‑4‑吡啶甲醛缩连氮杀菌毒力依次为水稻稻瘟病菌>黄瓜猝倒病菌。实验结果证明，N,N′‑双‑4‑吡啶甲醛缩连氮对两种病菌均有抑制效果，其中对水稻稻瘟病菌的抑制效果较好。

Description

N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于植物病害防治领域，特别涉及一种N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮的制备方法及其应用。

背景技术

黄瓜猝倒病发生在苗期，是世界著名的毁灭性病害。此病菌适应性强、为害重，长期以来对蔬菜生产造成了很大损失，一般苗圃发病率为20-50％，严重的可达80％以上。对于黄瓜猝倒病，科研人员进行了大量研究。从国内外文献报道中，发现有效药剂有甲霜灵、敌克松、敌菌丹、乙锰、瑞毒霉、土菌消等，生产上主要采用甲霜灵拌种和土壤来处理黄瓜苗期猝倒病，但由于抗药性的产生，2001年就有报道甲霜灵防治失败事例，因此生产中迫切需要防治黄瓜苗期猝倒病的新药剂。

稻瘟病早在1637年宋应星著的《天工开物》中，被称为“发炎火”。它与白叶枯和纹枯病并列为水稻三大主要病害。稻瘟病由于其发生的广泛性和毁灭性，给粮食生产带来了巨大的损失。随着水田面积的扩大，不利的气候条件和不合理的栽培措施等，使水稻稻瘟病的危害逐年加重。20世纪90年代以来，我国稻瘟病的年发生面积均在380万hm²以上，年损失稻谷达数亿千克。2005年广西区发生面积超过66.67万hm²，粮食减产7.68亿千克，经济损失达12.5亿元。全国各水稻产区都有发生稻瘟病，尤以山区、丘陵地区发生重，只要条件适宜，容易流行成灾，流行年份一般减产10％～20％，重的减产40％～50％，甚至颗粒无收。目前用于防治稻瘟病菌的药剂主要有：三环唑、富士一号、稻瘟净、异稻瘟净和克瘟散等。但由于发病面积大，病情严重，使用的抗菌剂种类少，稻瘟病菌已经对多数农用杀菌剂产生抗药性了。

当前的化学农药中抗菌品种单一，同时也带来了环境污染和抗药性等一系列问题。所以，迫切需要研制出新型药剂，并尽可能的交替使用作用机理不同的药剂，以减轻病菌抗药性问题的发展。

发明内容

为克服现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮的制备方法。

本发明的另一目的在于提供上述制备方法获得的N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮。

本发明的再一目的在于提供上述获得的N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮在防治植物病害中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮的制备方法，具体步骤如下：

1)准确称取10ml的80％的水合肼于50ml的小烧杯中，加2ml无水乙醇稀释后，移入三颈烧瓶中，获得溶液I；

2)准确称取20mmol的97％的吡啶-4-甲醛溶液于50ml的小烧瓶中，加2ml无水乙醇稀释后，在磁力搅拌下，缓慢滴入步骤1)获得的溶液I；

3)控制温度在50～60℃，在磁力搅拌下，水浴加热回流4h，自然冷却，过滤，得到黄色固体，并用无水乙醇洗涤沉淀3次，真空35℃干燥，得到黄色粉末N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮；

上述的N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮的合成反应式如式Ⅰ所示：

式I。

一种N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮由上述方法制备获得。所述的N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮的分子结构式如图1所示：

上述制备获得的N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮在黄瓜猝倒病的防治中应用。

上述制备获得的N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮在水稻稻瘟病的防治中应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明实验证明，新合成的药剂N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮对水稻稻瘟病、黄瓜猝倒病对应的病菌具有很好的抑制作用，特别是对于水稻稻瘟病菌的抑制效果最好，本发明中的N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮可以很好的应用到水稻稻瘟病和黄瓜猝倒病的防治中。

附图说明

图1为N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮的分子结构示意图。

图2为N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮的晶胞堆积图。

图3为N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮对黄瓜猝倒病菌菌饼直径影响图，其中，a为蒸馏水对照；b为丙酮对照；菌饼直径为3.65㎝；c浓度为2μg/mL，菌饼直径为2.27㎝；d浓度为4μg/mL，菌饼直径为1.85㎝；e浓度为6μg/mL，菌饼直径为1.43㎝；f浓度为8μg/mL，菌饼直径为1.10㎝。

图4为N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮对水稻稻瘟病病菌菌饼直径影响图，其中：a为蒸馏水对照；b为丙酮对照，菌饼直径为3.65㎝；c浓度为2μg/mL，菌饼直径为2.14㎝；d浓度为4μg/mL，菌饼直径为1.88㎝；e浓度为6μg/mL，菌饼直径为1.75㎝；f浓度为8μg/mL，菌饼直径为1.01㎝。

图5为N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮对黄瓜猝倒病菌毒力测定回归曲线图。

图6为N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮对水稻病稻瘟病菌毒力测定回归曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

一、N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮的合成及晶体结构分析

1.N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮的合成

N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮的制备方法，具体步骤如下：

1)准确称取10ml的80％的水合肼于50ml的小烧杯中，加2ml无水乙醇稀释后，移入三颈烧瓶中，获得溶液I；

2)准确称取20mmol的97％的吡啶-4-甲醛溶液于50ml的小烧瓶中，加2ml无水乙醇稀释后，在磁力搅拌下，缓慢滴入步骤1)获得的溶液I；

3)控制温度在55℃，在磁力搅拌下，水浴加热回流4h，自然冷却，过滤，得到黄色固体，并用无水乙醇洗涤沉淀3次，真空35℃干燥，得到黄色粉末N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮。获得的N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮的结构示意图如图1所示。

上述获得N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮的反应式如式Ⅰ所示：

2.N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮晶体的培养

准确称取0.2mmol(0.0412g)N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮，10ml无水甲醇于反应釜中，扭紧，放入恒温干燥箱中，控制温度在90℃，反应48小时，然后每半个小时降温2℃直至40℃左右，放置12小时沉降，取出，过滤，将滤液放入50ml烧杯中，用保鲜膜封口，并用针扎几个小洞，置于室温下待溶剂自然挥发，数天后，得到黄色的晶体，即为N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮单晶。

3.晶体结构分析

X-射线单晶衍射测定N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮单晶的晶体学数据、非氢原子坐标、热参数及晶体结构、晶胞堆积图分别见表1、表2、表3及图1、图2。由测定结果知：N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮晶体属于单斜晶系，晶胞参数a＝3.839(6)nm，b＝10.972(17)nm，c＝12.70(2)nm，α＝90.00°，β＝92.288(17)°，γ＝90.00(10)°，∠C1N1N1＝112.29(14)°的一维链状结构。

表1 N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮的部分晶体学数据

^aR1＝Σ||Fo|–|Fc||/Σ|Fo|.^bwR2＝[Σw(Fo2–Fc2)2/Σw(Fo2)2]1/2.

表2 N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮中非氢原子坐标(×10⁴)和热参数(A²×10³)

表3 N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮的主要键长与键角

二、N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮的应用检测

1.实验菌株

黄瓜猝倒病菌(Bythium deliense Meurs)(由上海农科院生态所提供)；

水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisea,M.grisea)(由湖南农大生物安全科技学院提供；吴志华，水稻稻瘟病菌对六种杀菌剂的抗性测定及抗稻瘟灵机制的初步研究[D]，2011，湖南农业大学，2011年中国硕博士论文全文数据库)；

丙酮(含量≥99.5％分析纯，成都市科龙化工试剂厂生产)；

电热恒温培养箱(型号：HH.B11600-S-II，上海跃进医疗器械厂)，超净工作台(型号：SW-CJ-2FD)，高压灭菌锅(型号：Canon.PowerShot A650 IS)

2实验方法

2.1培养基的制备

PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)(1000mL)：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂15g；马铃薯去皮切小块，煮沸30min，用纱布过滤再加糖及琼脂，溶化后补足水至1000mL；分装，121℃高压灭菌30min后备用。

2.2病原真菌的分离与纯化

在超净工作台中把供试的黄瓜猝倒病菌株、稻瘟病菌株，先在培养皿中PDA培养基上划线接种，置于30℃下恒温培养5～7d后挑取含菌样品再次接种纯化，重复2～3次，得到纯种供试菌。

2.3含药培养基配置

用丙酮作溶剂，以丙酮为空白对照，把供试药剂溶于丙酮，配制成浓度为0.1mg/mL的供试样品母液，将配好的母液与培养基按照1∶100的体积比加入到融化好的PDA培养基中，混合均匀后倒入灭菌的直径为90mm的培养皿中，制成含供试药剂(N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮)系列浓度梯度(0μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL)的培养基平板。

2.4测定项目

采用菌丝生长速率抑制法；用直径为1.00cm的打孔器在上述培养好的菌落上打取菌饼，然后将菌饼转移，倒置在上述含药的培养基平板上。每平板接种3块菌饼，呈“品”字型排列，每种药剂的每个浓度为1个处理，每处理3次重复，30℃培养7天，用“十”字交叉法测定各处理的菌落增长直径。

菌落增长直径(cm)＝菌落生长直径－1.00(菌饼直径)

按以下公式计算药剂对菌丝生长的抑制率。

2.5数据处理

利用Excel表格，将菌丝生长抑制率转换成几率值(y)、药剂浓度(μg/mL)转换成以10为底的对数值(x)，做回归直线，求出毒力回归方程(y＝a+bx)和相关系数(r)，计算N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮对水稻稻瘟病菌菌丝生长抑制的有效中浓度(EC₅₀)，EC₅₀值进行药剂毒力大小比较，以此表示N,N′-双-4-吡啶甲醛连氮对稻瘟病菌抑制作用的强弱。

利用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析检验不同处理间是否存在差异显著性。

3实验结果与分析

3.1N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮对病菌菌丝生长的抑制作用

如图3所示，蒸馏水及丙酮处理下，病菌菌落扩展直径相差不大；药剂处理下菌落直径均随着供试药剂浓度的增大而减小，含8.00μg/mLN,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮的培养基中黄瓜猝倒病菌菌落的大小与对照相比，直径相差2.55cm；与对照相比，8ug/ml浓度下的直径为其的0.30倍。

表4 N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮不同处理菌落扩展直径的平均值

*大写字母表示处理间差异极显著(P＜0.01)；小写字母表示处理间差异显著(P＜0.05)

根据表4，N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮处理下，黄瓜猝倒病菌、水稻稻瘟病菌落直径具有明显的差异，浓度越大，病菌菌落的直径越小，不同浓度间差异极显著。

3.2 N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮对两种病菌菌丝生长的抑制作用

表5为N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮对黄瓜猝倒病菌，水稻稻瘟病菌菌丝生长的抑制率见表1所示：

表5 不同浓度药剂对黄瓜猝倒病菌菌丝的抑制效果

*大写字母表示处理间差异极显著(P＜0.01)；小写字母表示处理间差异显著(P＜0.05)

根据菌落直径计算的抑制率见表5，

由表5可得，在N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮对黄瓜猝倒病病菌的抑制率中，随着浓度的升高抑制率也升高，不同浓度处理组间差异均为极显著。8μg/mL抑制效果最佳；N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮对稻瘟病菌的抑制率变化情况与其对黄瓜猝倒病的效果相似，随着浓度的升高抑制率也升高，浓度在2μg/mL时抑制率最低，8μg/mL抑制效果最佳，各处理间差异极显著

结果表明，供试的N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮对黄瓜猝倒病病菌和水稻稻瘟病病菌的菌丝生长均有一定的抑制作用，但抑制程度略有不同。从抑制率数值来看，供试药品对水稻稻瘟病的抑制效果优于其对黄瓜猝倒病的抑制作用。

3.3N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮对病菌室内的毒力测定

N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮对黄瓜猝倒病病菌、番茄晚疫病和水稻稻瘟病病菌室内毒力测定结果见表6所示：

表6 NN′-双吡啶-4-甲醛缩连氮对两种病菌室内毒力测定结果

由表6可知，N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮对黄瓜猝倒病菌抑制EC₅₀值为20.815；对稻瘟病菌抑制EC₅₀值为2.085。该药剂对稻瘟病菌抑制EC₅₀值较小，由此可得，N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮对稻瘟病抑制效果最好。

3.4N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮毒力回归曲线的绘制

根据表6中的数据，对各药剂处理浓度分别取对数为横坐标，抑制几率值为纵坐标，分别绘制病菌的毒力回归曲线，见图5、图6。

4结论

本实验研究了化学合成药剂N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮对黄瓜猝倒病菌、水稻稻瘟病菌菌丝生长的抑制作用。实验结果表明，N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮对黄瓜猝倒病菌、水稻稻瘟病菌均有抑制作用，但效果各不相同。其中同种浓度下，其对水稻稻瘟病菌的抑制作用均优于黄瓜猝倒病菌的抑制作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮在黄瓜猝倒病的防治中应用。

2.一种N,N′-双吡啶-4-甲醛缩连氮在水稻稻瘟病的防治中应用。