CN101805717B - 一种高效定向筛选作物土传病害生防菌的方法 - Google Patents

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本发明公开了一种高效定向筛选作物土传病害生防菌的方法,属于生物防治领域。本发明首先通过平板对峙培养方法,选择病原菌的拮抗菌;然后利用结晶紫染色方法,筛选具有产生生物膜能力的拮抗菌;再进一步对其进行植酸钙水解能力的筛选。本发明方法针对性强,并且方法简单、效率高、成本低,避免了过多的温室试验和田间试验所造成的人力和财力资源的浪费。

Description

一种高效定向筛选作物土传病害生防菌的方法
技术领域
本发明属于农业生物防治领域,具体地说涉及一种高效定向筛选作物土传病害生防菌的方法。
背景技术
土传病害属于难以防治的植物病害,传统的防治方法主要是培育抗病品种和施用化学农药。但是由于受到土传病害的多样性和抗病品种资源来源的限制,培育抗病品种的应用受到限制;而使用化学农药防治一般效果也不理想,且会造成农药残留和环境污染问题。因此需要寻找新的解决方法。生物防治以其无毒、无害、无污染、不易产生抗药性和高效等优点,在植物病虫害防治中越来越受到人们的重视。
土壤中,特别是植物根际栖息着许多具有生防潜力的微生物资源,利用微生物繁殖速度快的特点,人工大量繁殖后施入土壤中,可以调节根部微生态环境、抑制土传病原真菌的繁殖进而抑制土传病害的发生发展。目前对土传病害的生物防治主要集中于芽抱杆菌、木霉菌及其他有益微生物的利用。
传统的土传病害生防菌的筛选方法一般是经过平板对峙培养、温室育苗筛选和田间试验三步。但是平板对峙法([李社增等.植物病理学报(增刊),2005,35(6):95-98)所选择出的拮抗作用强的菌株田间并不一定表现很好的防治效果。实际上生防菌在应用中会受到许多因子的影响。在作物根部具有较好的定殖能力是土传病害生防菌发挥其防病作用的重要条件之一(David M W等.AnnRev Phytopathol,1988,26:397-407)。Kloepper等(Kloepper J W等.CanJ Mocrobiol,1992,38(6):667-662)认为,植物病害生物防治的第一步是拮抗微生物能在根围成功定殖,拮抗细菌的定殖能力决定着生防作用的大小。生防细菌的定殖能力与其生物膜的形成有关(Kris M等.Science,2008,320:1636-1638)。细菌生物膜是指在多聚糖、蛋白质和核酸等组成的基质内相互粘连粘附于物体表面的细菌群体(Ramadan HH.Curr opinotolaryngol head necksurg,2006,14:183-186)。有些枯草芽孢杆菌可以在植物根际或体表形成生物膜,而在根际附近快速、大量的繁殖和定殖,有效地排斥或杀死作物病原菌在植物根部的定殖与侵染,从而达到防病效果(Harsh Pal Bais等.PlantPhysiology,2004,134:307-319)。杨合同等(杨合同等.山东科学,6(3):5056.)以荧光菌菌株P32处理小麦种子,发现拮抗细菌能在根表面形成一均匀保护层,其厚度约为10个菌体长度左右;没有防病作用的菌株则不产生保护层,仅随机出现微菌落(一个微菌落约10~20个菌体)。说明拮抗细菌在小麦根部的定殖保护了病原菌的侵染位点,减少了侵染机会,起到防病作用。
利用生物膜内物质对某些染料的结合,可以通过染色的办法对生物膜进行定量。最常用的就是结晶紫染色法(O’Toole GA等.Mol Microbiol,1998,28:449-461)。该方法简便快捷,适用于试管及96孔板法造膜。生长于生物膜内的细菌所表现的细胞生理学,与其分散生长于组织内时所表现的生理学不同(Sauer K等.Journal bacterial,2002,184:1140-1154)。在生物膜内,细菌能对营养、代谢排泄物的浓度和细菌群体密度作出反应,调节新陈代谢,并能与邻近细胞相接触,参与细胞之间的交流。细菌形成生物膜后增强了对抗生素的忍耐力。生物膜所具有的有益和有害的活性,使其在工业、医药和农业上具有重要意义。
除了防病作用外,有些生防菌还可以促进植物的生长发育,如有些生防菌能够分泌植酸酶,而植酸酶可水解土壤中的植酸,使之转化成能被植物吸收利用的有效磷,从而促进植物生长。植酸是土壤中有机磷的主要存在方式,约占土壤中有机磷含量的20~50%(Elsorra E等.Microbiology,2002,148:2097~2109)。因此通过植酸的水解试验测定细菌是否能够分泌植酸酶(蔡鸿杰等.天津师范大学学报(自然科学版),2006,26(2):19-22)可作为筛选具有生防潜力的生防菌株的另一个指标。
发明内容
针对现有的生防菌筛选方法中所筛选的拮抗细菌并不一定在田间表现很好的防治效果,即所选拮抗细菌定殖能力差的问题,本发明目的在于提供一种定向高效筛选作物土传病害生防菌的方法。
为实现上述目的,本发明的技术方案如下:
一种高效定向筛选作物土传病害生防菌的方法,包括如下步骤:
(1)通过平板对峙培养方法,选择病原菌的拮抗菌;
(2)将步骤(1)所得的拮抗菌在DSM培养基中培养,然后进行结晶紫染色,选择在液固交界的位置产生明显的紫色条带的菌株;即为能产生生物膜的拮抗菌株;所述的DSM培养基的组成成分及其重量百分比为:牛肉浸膏0.6~1.0%,KCl 0.18~0.12%,MgSO4.7H2O 0.0096~0.00144%,Ca(NO3)2 0.00164~0.00492%,MnCl2 0.0000126~0.0000378%,FeSO4 0.0000152~0.0000456%,其余为水,pH=7.6。
上述高效定向筛选作物土传病害生防菌的方法,包括将上述所选的菌株接种到植酸酶检测培养基上,在35~39℃下培养5~7天,选择能形成透明圈且透明圈较大的菌株,即为具有分解土壤磷能力的生防菌菌株;所述的植酸酶检测培养基的组成成分及其重量百分比为:蔗糖0.1~0.3%,KCl 0.1~0.3%,MnSO40.4~0.8%,NH4NO3 0.1~0.3%,植酸钙6.0~10.0%,MgSO4 0.6~0.8%,Fe2(SO4)30.6~0.8%,琼脂粉2.0~6.0%,其余为水。
上述方法中步骤(1)中所述的平板对峙培养方法,具体包括如下步骤:
(a)菌种活化:将所采集的在低温保存的细菌菌株分别在NA平板培养基上于35℃~39℃活化培养,挑取单菌落在NA斜面培养基上于35℃~39℃扩繁;所述的NA平板或斜面培养基的组成成份及其重量百分比为:牛肉膏0.3~0.8%,蛋白胨0.5~1.5%,NaCl 0.3~0.8%,琼脂粉1.0~2.0%,其余为水;
(b)病原菌培养:将低温保存的土传病害病原菌在PDA平板培养基上于22℃~28℃活化培养;所述的PDA培养基的组成成分及其重量百分比为:土豆10.0~30.0%,葡萄糖2.0~3.0%,琼脂粉1.0~2.0%,其余为水;
(c)平板对峙试验:用打孔器
Figure GSA00000060219400031
在步骤(b)中所培养的土传病害病原菌菌落边缘区域打孔制成菌饼,然后将病原菌菌饼转接在另一个PDA平板培养基中央,再将(a)中活化的细菌菌株点接在距病原菌菌饼20mm处,每皿接种3~4个步骤(a)中活化的菌株;设空白对照:在PDA平板培养基中央只接种病原菌菌饼,不接种任何供试细菌菌株;在22~28℃恒温培养,待空白对照即将长满整个培养皿时,测量病原菌的对照生长量(菌落半径)和处理生长量(接种细菌后的抑制生长半径),用拮抗作用抑菌率表示,选择抑菌率大于50%并且抑菌带大于4.0mm的菌株;拮抗作用抑菌率的计算公式为:
抑菌率%=(对照生长量-处理生长量)/对照生长量×100。
上述方法步骤(2)中所述的结晶紫染色的方法,具体包括如下步骤:
(a)菌种活化:将低温保存的拮抗细菌菌株在NA平板培养基(组成成份及其比例同上)上于35~39℃活化培养,挑取单菌落在NA斜面培养基(组成成份及其比例同上)上于35~39℃扩繁;
(b)菌株液体培养:取扩繁后的待测细菌接种于DSM培养基内于35~39℃培养过夜;第二天按1∶1000的体积比例用DSM培养基稀释;取0.5ml转移到2.0ml离心管中,35~39℃静置培养48h;所述的DSM培养基的组成成分及其重量百分比为:牛肉浸膏0.6~1.0%,KCl 0.18~0.12%,MgSO4.7H2O 0.0096~0.00144%,Ca(NO3)2 0.00164~0.00492%,MnCl2 0.0000126~0.0000378%,FeSO40.0000152~0.0000456%,其余为水,pH=7.6;
(c)结晶紫染色:向步骤(b)的离心管中加入重量体积比0.1~0.3%(w/v)的结晶紫染液100μl,在室温下染色15~25min;然后用清水冲洗离心管至冲洗液无色;选择在与液面交界的位置被染成紫色的菌株,即为能形成生物膜的拮抗细菌。
上述方法中筛选的菌株还要进行生物测定。所述的生物测定包括温室盆栽试验和田间小区试验。
上述生物测定试验包括温室盆栽试验,具体包括如下步骤:
(a)待测细菌菌体悬浮液制备将待测细菌菌株接种在NA平板培养基上,28~34℃恒温培养24h~36h,加入~15ml无菌水,用无菌勺将菌体从NA平板培养基表面刮掉,充分摇匀,制成107~109/ml菌体悬浮液;
(b)土传病害病原菌孢子悬浮液或菌丝体制备将病原菌菌丝块接种到PDA平板中央,25℃下培养3~10d;在菌落边缘区域,用直径3mm打孔器将菌落制成菌片,将菌片加到盛有100ml~150ml PDB培养液的三角瓶中,在25℃、160r/min条件下振荡培养4~7d;然后用无菌纱布过滤,制得病原菌孢子悬浮液(或如果病原菌不产生孢子,将生长成熟的病原菌菌盘在搅拌器内打成匀浆,用菌丝体接种);
(c)温室盆栽试验在待测细菌菌体悬浮液中,将表面灭菌的作物种子浸种12~36h,然后播种于盛有灭菌营养土的营养盒中,设不浸种的种子为空白对照;每处理播种30~50粒种子,每处理设3~4次重复;
土传病原菌的接种方式分为土壤接种法、蘸根接种法和根部切伤接种法。
所述的土壤接种法就是将病原菌的菌丝体或分生孢子在播种前或播种时拌在土壤中。
所述的蘸根接种法是将幼苗的根部稍加损伤,在孢子或菌丝体悬浮液中浸过以后移植。
所述的根部切伤接种法是用剪刀等工具使植株根部受到损伤,然后将病原菌孢子或菌丝体悬浮液灌注在根部附近的土壤中。
具体接种方法根据不同作物不同土传病害病原菌而定;10d~15d调查出苗率;待空白对照发病较重时调查发病情况并统计数据。
上述生物测定中的田间小区试验。包括将待测细菌制成拌种剂或种衣剂,以种子质量5%~10%的细菌拌种剂对作物种子进行拌种或包衣。将供试细菌拌种或包衣的作物种子播入土传病害病圃,设未处理种子为空白对照。小区面积30m2~50m2,每处理重复4次,随机排列。作物生长过程中,可用待测细菌菌体悬浮液灌根或移栽时灌穴。密切关注空白对照发病情况,待空白对照发病较重时调查发病情况并统计数据。作物收获后实际测量小区产量,计算产量。
与现有的平板对峙法来筛选的生防菌的方法相比,本发明具有的优点:(1)针对性强,本发明首先通过平板对峙法筛选出拮抗细菌,然后通过对生物膜的检测筛选在根际定殖能力强的菌株,克服了平板对峙法选出的拮抗细菌定殖能力差、田间防治效果差的缺点;(2)本发明方法简单、效率高、成本低,避免了过多的温室试验和田间试验所造成的人力和财力资源的浪费。
附图说明
图1结晶紫染色法测定细菌生物膜的照片;其中1-7:产生物膜菌株,8-10为不产生物膜菌株。
图2植酸钙水解试验培养皿照片;其中中间点接菌株为NCD-2菌株,产植酸酶水解植酸钙形成大而透明的消解圈,其余周围6个菌株不产植酸酶。
具体实施方式
下面以具体实施例对本发明作进一步的说明,但是不以任何方式构成对本发明的限制。
实施例1应用平板对峙法筛选棉花黄萎病的拮抗细菌
具体包括如下步骤:
(1)菌种活化:将低温保存的细菌NCD-2菌株(保藏编号为:CGMCC1019,见专利号为:ZL200310109619.8的专利)等115株分离自作物田土壤的细菌(河北农林科学院植物保护研究所从全国、主要是在河北省采集分离。部分菌株见表1)在NA平板培养基上于37℃活化培养,挑取单菌落在NA斜面培养基上于37℃扩繁;所述的NA平板培养基组成成份及其比例:牛肉膏0.5%,蛋白胨1.0%,NaCl 0.5%,琼脂粉1.5%,其余为水,pH7.4。
(2)病原菌培养:将河北省农林科学院的植物保护研究所分离保存的棉花黄萎病菌大丽轮枝菌菌株(Verticillium dahliae Kleb)VD-1在PDA平板培养基(组成成分及其重量百分比为:土豆15.0%,葡萄糖2.5%,琼脂粉1.5%,其余为水)上于25℃活化培养。
(3)平板对峙试验:在培养好的VD-1菌落边缘区域,用打孔器打孔制成菌饼,将病原菌菌饼转接在另一个PDA平板培养基中央,再将活化后的115个菌株点接在距病原菌菌饼20mm处,每皿4菌株,设空白对照(不接种任何供试细菌菌株,只接种病原菌)。25℃恒温培养,待空白对照即将长满整个培养皿时,测量病原菌的对照生长量(菌落半径)和处理生长量(接种细菌后的抑制生长半径),用拮抗作用抑菌率表示,选择抑菌率大于50%并且抑菌带大于4.0mm的菌株。计算抑菌率的公式为:
抑菌率(%)=(对照生长量-处理生长量)/对照生长量×100
(4)结果(见表1)供试的115株细菌中有17株细菌对棉花黄萎病菌VD-1的抑菌率在50%以上,并且抑菌带宽度大于4.0mm。其中枯草芽孢杆菌NCD-2菌株对棉花黄萎病菌VD-1抑菌率为58.2%,抑菌带宽度为7.0mm,对棉花黄萎病菌VD-1具有拮抗作用。
表1 对VD-1的拮抗细菌筛选结果
  拮抗细菌   VD-1菌落直径*(mm)   抑菌率(%)   抑菌带(mm)
  CK   19.2A
  CS-27   8.7B   54.7   7.0
  NCD-2   8.0BC   58.2   7.0
  C-309   6.7BCD   65.1   12.0
  CS-5   6.2BCDE   67.6   7.3
  CS-25   6.0BCDE   68.6   6.0
  NCD-25   6.0BCDE   68.7   3.0
  ICB-3   5.7BCDEF   70.4   5.0
  C-148   5.5BCDEF   71.2   12.0
  CS-11   5.3BCDEF   72.0   4.5
  CS-22   5.2BCDEF   72.8   5.8
  ICB-18   5.0BCDEF   73.9   5.0
  LC-1   5.0BCDEF   73.9   5.0
  C-94   4.4CDEF   76.6   7.0
  C-51   4.2CDEF   78.0   8.5
  C-2   4.0DEF   78.9   11.8
  C-28   2.7EF   86.1   12.0
  C-1   2.0F   89.6   10.0
注:本表所列数据经过DUCAN最小极差法统计分析,数据后大(小)写字母表示在p=0.01(0.05)水平的差异显著性。
实施例2 拮抗细菌的生物膜能力的检测试验
按照如下方法进行:
(1)菌种活化:将实施例1中筛选到的17株拮抗细菌在NA平板培养基上分别活化,挑取单菌落在NA斜面培养基上扩繁;
(2)菌株液体培养:用无菌竹签挑取扩繁后的17株拮抗细菌菌株和168菌株分别接种于DSM培养基(其组成成分及其重量百分比为:牛肉浸膏1.0%,KCl 0.12%,MgSO4.7H2O 0.00144%,Ca(NO3)2 0.00492%,MnCl2 0.0000378%,FeSO40.0000456%,其余为水)内于37℃培养过夜。次日按1∶1000的比例用新配制的DSM培养基稀释。取0.5ml转移到新的2.0ml离心管中,37℃静置培养48h。
(3)结晶紫染色:向离心管中加入550μl 0.1~0.3%(w/v)的结晶紫染液,室温下染色20min,然后用清水冲洗离心管至冲洗液无色,在与液面交界的位置,具有产生物膜能力的细菌菌株会形成牢固的被染成紫色的带状生物膜。同等培养条件下,被染成紫色的物质越多,该菌株产生生物膜的能力越强。
(4)结果(图1)17株拮抗细菌中有7株(NCD-2、C-39、NCD-25、C-148、C-94、DMT-36和C-28)在培养基的表层和液固界面形成很强的生物膜,有10株未形成生物膜;结晶紫染色后,17株拮抗细菌中有7株在液固界面产生了紫色的带状物,有10株未产生紫色的带状物。说明这7株菌具有产生生物膜的能力,其中NCD-2菌株产生的紫色带状物颜色较深,带较宽,说明NCD-2菌株产生生物膜能力较强,由此推测NCD-2菌株在土壤根际的定殖能力强。
实施例3 植酸钙水解能力测定试验
具体方法如下:
(1)菌种活化:将低温保存的实施例2中筛选出来的编号为NCD-2和C-39、NCD-25、C-148、C-94、DMT-36、C-28菌株分别在NA平板培养基上活化,挑取单菌落在NA斜面培养基上扩繁;
(2)将上述供试的7株细菌菌株用灭菌牙签分别点接到植酸酶检测培养基(其组成成分及其重量百分比为:蔗糖0.2%,KCl 0.2%g,MnSO4 0.6%,NH4NO30.4%,植酸钙8.0%,MgSO4 0.7%,Fe2(SO4)3 0.7%,琼脂粉4.0%,其余为水;pH7.0)上,37℃培养5d后检测发现,只有NCD-2菌株在植酸酶检测培养基上出现了大而透明的消解圈(图2)。说明NCD-2菌株能够分泌植酸酶具有水解植酸的能力。
实施例4 NCD-2菌株防治棉花黄萎病的温室盆栽试验
具体实施方法如下:
(1)菌体悬浮液制备。将NCD-2菌株接种在NA平板培养基上,30℃恒温培养2d,加入10ml无菌水,用无菌勺将菌体从NA平板培养基表面刮掉,充分摇匀,制成108个/ml的NCD-2菌体悬浮液。
(2)棉花黄萎菌分生孢子悬浮液制备。棉花黄萎菌VD-1菌株在PDA平板培养基上25℃下培养8d。在菌落边缘区域,用直径3mm打孔器将VD-1菌落制成菌片,将菌片加到盛有100ml PDB培养液的三角瓶中,在25℃恒温160r/min条件下振荡培养7d。然后用无菌纱布过滤,制得棉花黄萎菌VD-1分生孢子悬浮液。
(3)盆栽试验。将表面灭菌的棉花种子在NCD-2悬浮液中浸种24h,然后播种于盛有灭菌营养土的营养盒中,将不浸种的棉花种子为对照(CK)。每处理播种30粒种子,每处理设3次重复。15d后调查棉苗数量。待棉苗长出2~3片真叶时,采用黄萎病快速接种技术对棉花幼苗进行接种,所用黄萎菌VD-1的接种浓度为106个/ml孢子悬浮液。在棉花4-5片真叶时,调查记录黄萎病发生情况,按5级分类标准(0级,无病植株;1级,25%叶片发病的植株;2级,25%~50%叶片发病的植株;3级,50%~75%叶片发病的植株;4级,75%以上叶片发病的植株)记录和计算病情指数,并计算供试细菌对棉花黄萎病的相对防病效果。
病情指数=∑(级值×株数)/4×总株数×100
防治效果(%)=(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100
(4)数据统计分析。本实施例有关数据的统计分析采用SAS6.04版本软件(SAS Institute Inc.)进行统计分析。
(5)结果(见表2)表明,NCD-2菌株悬浮液浸种处理后出苗率与对照差异不显著。说明该菌株对棉花出苗是安全的。同时盆栽试验测定结果表明,NCD-2菌株处理极显著地比对照的棉花黄萎病的病情指数低,防治效果达到77.03%,对棉花黄萎病表现较高的防治效果。
表2 NCD-2菌株对棉花出苗的影响和对棉花黄萎病的防治效果表
  处理  出苗率(%)(p=0.05)  病情指数(p=0.05)   防治效果(%)
  NCD-2  77.5a  9.70a   77.03
  CK  73.0a  42.23b   /
实施例5 NCD-2菌株对棉花黄萎病防治效果和对产量影响的田间试验按照如下方法进行:
(1)按照菌液与碳酸钙之间2∶1体积比将实施例4中(1)制备的NCD-2细菌悬浮液(细菌活体浓度108个/ml)与碳酸钙充分混合,得NCD-2菌体包衣剂。以种子量10%的菌体包衣剂对棉花种子进行包衣。将用NCD-2细菌包衣的棉花种子播入营养钵中,每钵3粒,盖土并轻轻压实。播种期比当地棉花正常播种期提前10d。播种后的营养钵放在塑料拱棚中。出苗后1周,每钵中留1棵壮苗。在棉苗有2片真叶时,移栽到大田。移栽时,每穴中灌入实施例4(1)制备的NCD-2细菌悬浮液(细菌活体浓度108个/ml)20ml。以清水包衣种子,穴中灌入清水为对照。每小区15m2,重复3次,随机排列。棉田为河北省农林科学院植物保护研究所的棉花黄萎病病圃。在棉花花铃期,即黄萎病发生高峰时期,调查黄萎病发生情况,并计算病情指数和防治效果。调查标准和数据统计方法与实施例4相同。棉花收获后实际测量小区产量,计算每公顷产量。
(2)结果(见表3)菌株NCD-2处理的病情指数显著低于对照,对棉花黄萎病的防病效果达到78.1%,说明NCD-2菌株对棉花黄萎病具有较好的田间防治效果。同时,NCD-2菌株处理的棉花比对照棉花产量增加14.4%,说明使用NCD-2菌株处理后可显著增加棉花产量。
表3 NCD-2菌株对棉花黄萎病防治的田间试验结果
处理   病情指数(p=0.05) 防治效果(%)   亩产量(千克/公顷)   增产(%)
  NCD-2   11.73a   78.1   4297.5   14.4
  CK   53.56b   /   3754.5   /

Claims (3)

1.一种高效定向筛选作物土传病害生防菌的方法,包括如下步骤:
(1)通过平板对峙培养方法,选择病原菌的拮抗菌;所述的平板对峙培养方法,包括如下步骤:
(a)菌种活化:将所采集的在低温保存的细菌菌株分别在NA平板培养基上于35℃~39℃活化培养,挑取单菌落在NA斜面培养基上于35℃~39℃扩繁;所述的NA平板或斜面培养基的组成成份及其重量百分比为:牛肉膏0.3~0.8%,蛋白胨0.5~1.5%,NaCl 0.3~0.8%,琼脂粉1.0~2.0%,其余为水;
(b)病原菌培养:将低温保存的土传病害病原菌在PDA平板培养基上于22℃~28℃活化培养;所述的PDA培养基的组成成分及其重量百分比为:土豆10.0~30.0%,葡萄糖2.0~3.0%,琼脂粉1.0~2.0%,其余为水;
(c)平板对峙试验:用打孔器在步骤(b)中所培养的土传病害病原菌菌落边缘区域打孔制成菌饼,然后将病原菌菌饼转接在另一个PDA平板培养基中央,再将(a)中活化的细菌菌株点接在距病原菌菌饼20mm处,每皿接种3~4个步骤(a)中活化的菌株;设空白对照:在PDA平板培养基中央只接种病原菌菌饼,不接种任何供试细菌菌株;在22~28℃恒温培养,待空白对照即将长满整个培养皿时,测量病原菌的对照生长量和处理生长量,用拮抗作用抑菌率表示,选择抑菌率大于50%并且抑菌带大于4.0mm的菌株;拮抗作用抑菌率的计算公式为:
抑菌率%=(对照生长量-处理生长量)/对照生长量×100;
(2)将步骤(1)所得的拮抗菌在DSM培养基中培养,然后进行结晶紫染色,选择在液固交界的位置产生明显的紫色条带的菌株;即为能产生生物膜的拮抗菌株;所述的DSM培养基的组成成分及其重量百分比为:牛肉浸膏0.6~1.0%,KCl 0.18~0.12%,MgSO4.7H2O 0.0096~0.00144%,Ca(NO3)20.00164~0.00492%,MnCl20.0000126~0.0000378%,FeSO40.0000152~0.0000456%,其余为水,pH=7.6;
将上述所选的菌株接种到植酸酶检测培养基上,在35~39℃下培养5~7天,选择能形成透明圈且透明圈较大的菌株,即为具有分解土壤磷能力的生防菌菌株;所述的植酸酶检测培养基的组成成分及其重量百分比为:蔗糖0.1~0.3%,KCl 0.1~0.3%,MnSO40.4~0.8%,NH4NO30.1~0.3%,植酸钙6.0~10.0%,MgSO40.6~0.8%,Fe2(SO4)30.6~0.8%,琼脂粉2.0~6.0%,其余为水。
2.按照权利要求1所述的筛选作物土传病害生防菌的方法,其特征在于其步骤(2)中所述的结晶紫染色的方法,包括如下步骤:
(a)菌种活化:将低温保存的拮抗细菌菌株在NA平板培养基上于35~39℃活化培养,挑取单菌落在NA斜面培养基上于35~39℃扩繁;
(b)菌株液体培养:取扩繁后的待测细菌接种于DSM培养基内于35~39℃培养过夜;第二天按1∶1000的体积比例用DSM培养基稀释;取0.5ml转移到2.0ml离心管中,35~39℃静置培养48h;所述的DSM培养基的组成成分及其重量百分比为:牛肉浸膏0.6~1.0%,KCl 0.18~0.12%,MgSO4.7H2O 0.0096~0.00144%,Ca(NO3)20.00164~0.00492%,MnCl20.0000126~0.0000378%,FeSO40.0000152~0.0000456%,其余为水,pH=7.6;
(c)结晶紫染色:向步骤(b)的离心管中加入重量体积比0.1~0.3%的结晶紫染液100μl,在室温下染色15~25min;然后用清水冲洗离心管至冲洗液无色;选择在与液面交界的位置被染成紫色的菌株,即为能形成生物膜的拮抗细菌。
3.按照权利要求2所述的筛选作物土传病害生防菌的方法,其特征在于将筛选的菌株进行生物测定,所述的生物测定包括温室盆栽试验和田间小区试验。
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