WO2018199723A2 - 셀레늄 저항성 신규 미세조류 - Google Patents

셀레늄 저항성 신규 미세조류 Download PDF

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WO2018199723A2
WO2018199723A2 PCT/KR2018/005027 KR2018005027W WO2018199723A2 WO 2018199723 A2 WO2018199723 A2 WO 2018199723A2 KR 2018005027 W KR2018005027 W KR 2018005027W WO 2018199723 A2 WO2018199723 A2 WO 2018199723A2
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sodium selenite
ndg1
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송상선
이은미
이강희
이인수
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한남바이오 주식회사
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • C12N1/125—Unicellular algae isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/89—Algae ; Processes using algae

Definitions

  • the present invention relates to a novel microalgae having a resistance to selenium and a method of culturing the microalgae.
  • Selenium is an essential trace component contained in many enzymes that function in vivo in animals. Selenium is a powerful antioxidant that removes free radicals, such as hydrogen peroxide, which can damage cell membranes, preventing or slowing down the aging and degeneration of body tissues. Glutathione peroxidase containing selenium acts as a catalyst for glutathione, which acts on the scavenging of peroxide or reactive oxygen species in cells.
  • Selenium is found in nature in organic or inorganic form. Inorganic selenium is toxic to most animals with salts such as sodium selenite. L-Selenomethionine, the main source of organic selenium, can be obtained through food in animals, including humans.
  • One method for obtaining organic selenium is to strengthen organic selenium to microorganisms using inorganic selenium, and yeast and bacteria have been produced as selenium-enhanced microorganisms.
  • Chlorella sorokiniana a microalgae
  • Chlorella sorokiniana has a unique color and odor, and the cell division rate is very fast.
  • studies have been reported to increase lipid content of microalgae, to treat livestock wastewater using microalgae, or to remove radionuclides.
  • the inventors have discovered a novel microalgae having resistance to selenium and developed a method of increasing its selenium content.
  • It may be a method of producing selenium-containing chlorella, comprising the step of culturing the chlorella sorokiniana strain having accession number KCTC 13228BP or the chlorella sorokiniana strain having accession number KCTC 13229BP in a culture solution to which selenium salt is added.
  • the term "culture” refers to a series of acts that grow microorganisms under artificially controlled environmental conditions.
  • the method of culturing the chlorella strain may be performed using a method well known in the art.
  • the culture may be chemo-heterotrophic culture.
  • chemically dependent culturing means culturing in the presence of an organic carbon source and / or an inorganic or organic nitrogen source in the absence of light.
  • the selenium salt may be sodium selenite.
  • the selenium salt may be added at an appropriate concentration by a person skilled in the art.
  • the selenium salt may be 1 ⁇ M to 300 ⁇ M, 100 ⁇ M to 300 ⁇ M, 200 ⁇ M to 300 ⁇ M, 1 ⁇ M to 100 ⁇ M, 1 ⁇ M to 70 ⁇ M, 1 ⁇ M to 60 ⁇ M, or 1 ⁇ M to 50 ⁇ M. It can be added to the culture at a concentration of.
  • the selenium salt may be added singly or divided two or more times.
  • the culture temperature may be 20 ° C to 40 ° C or 25 ° C to 35 ° C.
  • the culture pH may be 5 to 8, 5.5 to 8, or 6 to 8.
  • oxygen or an oxygen containing gas may be introduced into the culture. Incubation in the method can be done with agitation by a stirrer.
  • the culture time in the method may be 24 hours to 72 hours, 24 hours to 60 hours, 24 hours to 48 hours, or 24 hours to 36 hours after inoculation of the strain.
  • selenium salt may be added 24 hours to 48 hours after inoculation of the strain.
  • the selenium salt may be added in a single cycle or divided two or more times in a 24-hour to 48-hour difference after inoculation of the strain.
  • the concentration and incubation time of the selenium salt added in the above method may vary depending on the purpose of culture. For example, if the selenium-containing chlorella is to be obtained alive through the above method, the concentration of selenium salt added may be 1 ⁇ M to 60 ⁇ M or 1 ⁇ M to 50 ⁇ M. Alternatively, when the concentration of the added selenium salt is 60 ⁇ M to 300 ⁇ M, the incubation time may be 48 hours or less, 36 hours or less, 24 hours or less, 12 hours or less, or 6 hours or less after the addition of the selenium salt.
  • the culture solution may include a carbon source and a nitrogen source.
  • the culture may further comprise one or more of a potassium source and a phosphorus source.
  • the culture solution may further include one or more of magnesium, calcium, iron, and trace elements.
  • the culture solution may include glucose, NaCl, and yeast extract.
  • the culture may further comprise peptone.
  • Figure 1 shows the results of systematic classification using the collected nucleotide sequence of the algae.
  • Figure 2a shows the result of comparing the sequence of the 18S rRNA sequence of HNU-NDG1 and the existing Chlorella species.
  • Figure 2b shows the results of comparing the sequence of the 18S rRNA sequence of HNU-GSG1 and the existing Chlorella species.
  • Figure 3 shows the results of doubling time analysis of HNU-NDG1 strain on MAE medium.
  • Figure 4a shows the results of live bacteria analysis of Chlorella Sorokinia or HNU-NDG1 after the sodium selenite split treatment.
  • Figure 4b shows the results of live bacteria analysis of chlorella sorokinia or HNU-NDG1 after sodium selenite alone treatment.
  • 5 is a graph showing the results of analysis of organic selenium according to the treatment of sodium selenite in chlorella sorokinya or HNU-NDG1.
  • microalgae Seven microalgae were collected from Chungcheong-do and Suncheon, Jeonnam. All are green spherical strains and show high growth rates on YEP nutrient media. Minimal inhibition concentration (MIC) of sodium selenite was measured on the collected 7 microalgae. Six birds, including HNU-NDG1 and HNU-GSG1, exhibited high resistance up to 40 ppm. In addition, after treatment of sodium selenite by concentration in the collected microalgae and commercial microalgae, the survival inhibition was evaluated by measuring the chlorophyll a content. As a result, five and commercial microalgae including HNU-NDG1 and HNU-GSG1 exhibited high resistance of 40 ppm to sodium selenite.
  • MIC minimal inhibition concentration
  • HNU-NDG1 strain was collected from seawater near Easari Pier in Namdang-ri, Seo-myeon, Hongseong-gun, Chungcheongnam-do.
  • HNU-GSG1 strain is a strain collected from freshwater of Igok Reservoir in Igok-ri, Sari-myeon, Goesan-gun, Chungcheongbuk-do. Both strains showed the highest growth rates on YEP nutrient media.
  • Figure 1 shows the results of systematic classification using the collected nucleotide sequence of the algae.
  • Phylogenetic trees were prepared according to the neighbor-joining method using the Jukes-Cantor model using the 18S rRNA sequences of each microalgae. As shown in FIG. 1, all collected strains were identified as belonging to Chlorella sorokiniana .
  • Chlorella Sorokiana Ana HNU-NDG1 strain was deposited with the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KCTC) on March 21, 2017 and received accession number KCTC 13229BP.
  • Chlorella Sorokiana Ana HNU-GSG1 strain was deposited with the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology on March 21, 2017 and was given accession number KCTC 13228BP.
  • Genomic DNAs of the collected strains were isolated and nucleotide sequences for 18S rRNA were obtained.
  • the sequence of the 18s rRNA of Chlorella soroquinia or HNU-NDG1 and the sequence of the 18s rRNA of HNU-GSG1 were compared with previously known sequences using the BLAST tool of NCBI.
  • Figure 2a shows the result of comparing the sequence of the 18S rRNA sequence of HNU-NDG1 and the existing Chlorella species.
  • 18S rRNA sequence analysis of HNU-NDG1 an 18S rRNA sequence of chlorella sorokiniana or type strain was identified as a sequence showing high homology, but this sequence was not identical to the 18S rRNA sequence of HNU-NDG1.
  • HNU-NDG1 was found to be a genetically different strain from previously known chlorella species.
  • Figure 2b shows the results of comparing the sequence of the 18S rRNA sequence of HNU-GSG1 and the existing Chlorella species.
  • 18S rRNA sequence analysis of HNU-GSG1 showed 90% to 95% homology with the 18S rRNA sequence of Chlorella sorokiniana or the standard strain, but this sequence was not identical to the 18S rRNA sequence of HNU-GSG1.
  • HNU-GSG1 was also identified as a strain that is genetically different from previously known chlorella species.
  • HNU-NDG1 strains were tested for the composition of an industrial culture medium capable of optimal cancer culture (chemo-heterotrophic culture). As shown in Table 1, after inoculating chlorella sorokinya or HNU-NDG1 culture medium in 47 different compositions, cultured for 72 hours at 0.4 vvm, 130 rpm, pH 7.5, and 30 ° C. for 5 hours, viable cell number analysis was performed. Optimal culture medium composition was selected through.
  • the optimum growth was confirmed in the medium composition 5, and this was named as MAE medium (Micro-Algae Enrichment medium).
  • MAE medium Micro-Algae Enrichment medium
  • the doubling time of the HNU-NDG1 and HNU-GSG1 strains on the MAE medium was found to be 6.8 hours.
  • Figure 3 shows the results of doubling time analysis of HNU-NDG1 strain on MAE medium.
  • Example 3 chlorella Sorociana HNU - NDG1 And HNU - Of GSG1 Organic selenium Content analysis
  • the organic selenium content according to the treatment method of sodium selenite was confirmed by analyzing by ICP / MS.
  • Table 2 below shows a method for treating sodium selenite in the production of organic selenium using chlorella sorokinia or HNU-NDG1.
  • sodium selenite was divided into 0.00211 mM, 0.26401 mM, 0.05280 mM, and 0.07920 mM in single or split treatment, respectively. Since algae growth was inhibited by sodium selenite in the preliminary experiments, single treatment at high concentration was performed or the high concentration was divided into two treatments.
  • samples 1 to 4 were divided treatments, immediately after the inoculation of Chlorella soroquiniana (0 hour), after 24 hours of incubation (24 hours), and after 24 hours of addition of sodium selenite. (48 hour) and 48 hours after the addition of sodium selenite (72 hour), samples were taken to determine the number of viable cells and the total number of bacteria. Samples 5 to 8 were treated once, and each sample immediately after inoculation of chlorella sorokiniana (0 hour), after 48 hours of incubation (48 hours), and after 24 hours of addition of sodium selenite (72 hours). was collected and the number of viable cells and total bacteria was measured.
  • Table 3 shows the number of viable cells and total bacteria according to the treatment method of sodium selenite in the production of organic selenium using chlorella sorokinia or HNU-NDG1 (unit: log cells / ml).
  • FIG. 4a shows the results of viable cell analysis of chlorella sorokinya or HNU-NDG1 after sodium selenite fractionation.
  • Figure 4b shows the results of live bacteria analysis of Chlorella Sorokinia or HNU-NDG1 after sodium selenite alone treatment.
  • Sodium selenite split treatment resulted in no significant cell death at low concentrations of 0.00211 mM and 0.05280 mM, even at the split and single treatments, but at high concentrations of 0.26401 mM and 0.07920 mM, they survived 24 hours after treatment, but 48 hours later. All individuals died. In the total bacteria analysis results, it was confirmed that there is no significant difference between each other.
  • the treated sample was repeatedly centrifuged and washed with sterile phosphate buffered saline (PBS) five times to sufficiently wash the sodium selenite remaining in the extracellular membrane. After freeze-drying to prepare a powder, the selenium contained in the body was analyzed by using HPLC ICP / MS for the powder.
  • PBS sterile phosphate buffered saline
  • Table 4 shows the analysis results of organic selenium according to the treatment of sodium selenite in chlorella sorokinya or HNU-NDG1.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of analysis of organic selenium according to the treatment of sodium selenite in chlorella soroquinia or HNU-NDG1.
  • (a) and (b) show a division process and a single process, respectively.
  • HNU-NDG1 the organic selenium content according to the treatment of sodium selenium was also analyzed for chlorella soroquinia or HNU-GSG1.
  • HNU-GSG1 sensitivity to sodium selenite was more sensitive than that of HNU-NDG1.
  • 0.23 mM of sodium selenite was treated in a single and divided treatment, and other experimental methods were performed in the same manner as in NDG1.
  • the organic selenium content in the cell was identified as 8.60 mM and 4.98 mM in the single treatment, and the split treatment was advantageous in increasing the organic selenium content as compared to the single treatment.

Abstract

본 발명은 셀레늄에 대한 저항성을 갖는 신규한 미세조류 및 그의 배양방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 상기 미세조류를 이용하여 셀레늄 함유 배양체를 대량으로 생산할 수 있다.

Description

셀레늄 저항성 신규 미세조류
본 발명은 셀레늄에 대한 저항성을 갖는 신규한 미세조류 및 상기 미세조류의 배양방법에 관한 것이다.
셀레늄은 동물의 생체 내에서 작용하는 여러 효소에 함유되는 필수 미량 성분이다. 셀레늄은 강력한 항산화력으로 세포막 손상을 일으키는 과산화수소와 같은 활성산소를 제거하여 신체 조직의 노화 및 변성을 막거나 그 속도를 지연시킨다. 셀레늄을 함유하는 글루타티온퍼옥시다아제는 세포의 과산화물 또는 활성산소 종의 소거에 작용하는 글루타티온에 대해 촉매로 작용한다.
셀레늄은 자연에서 유기 또는 무기 형태로 발견된다. 무기 셀레늄은소듐셀레나이트와 같은 염으로 대부분의 동물에게 독성을 나타낸다. 유기 셀레늄의 주요 공급원인 L-셀레노메티오닌은 인간을 포함한 동물에서 음식물을 통해 수득될 수 있다. 유기 셀레늄을 수득하기 위한 방법 중 하나는 무기 셀레늄을 이용하여 미생물에 유기 셀레늄을 강화하는 것으로, 효모와 세균이 셀레늄 강화 미생물로 제조된 바 있다.
미세조류(microalgae)인 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana)는 독특한 색상과 냄새를 지니며, 세포 분열 속도가 매우 빠르다. 현재 미세조류의 지질 함량을 증가시키거나, 미세조류를 이용하여 축산폐수를 처리하거나 또는 방사성 핵종을 제거하는 등의 연구가 보고되어 있다. 본 발명자들은 셀레늄에 대한 저항성을 갖는 신규한 미세조류를 발견하고, 이의 셀레늄 함량을 증가시키는 방법을 개발하였다.
본 발명은 셀레늄에 대한 저항성을 갖는 신규한 미세조류 및 셀레늄 함유 미세조류의 생산방법을 제공하는데 목적이 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제는 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따르면, 수탁번호가 KCTC 13228BP인 신규 클로렐라 소로키니아나균주를 제공한다. 또한, 수탁번호가 KCTC 13229BP인 신규 클로렐라 소로키니아나균주를 제공한다.
수탁번호가 KCTC 13228BP인 클로렐라 소로키니아나균주 또는 수탁번호가 KCTC 13229BP인 클로렐라 소로키니아나균주를셀레늄염이 첨가된 배양액에서 배양하는 단계를 포함하는, 셀레늄 함유 클로렐라의 생산방법일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "배양"은, 인공적으로 조절된 환경조건하에서 미생물을 생육시키는 일련의 행위를 의미한다. 상기 클로렐라 균주를 배양하는 방법은 당해 분야에 널리 알려진 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 배양은 화학종속영양(chemo-heterotrophic) 배양일 수 있다. 용어 "화학종속영양" 배양은 광의 부재하에 유기 탄소 공급원 및/또는 무기 또는 유기 질소 공급원의 존재하에 배양하는 것을 의미한다.
상기 방법에서, 상기 셀레늄염은 소듐셀레나이트(sodium selenite)일 수 있다. 상기 셀레늄염은 통상의 기술자에 의해 적절한 농도로 첨가될 수 있다. 예를 들면, 상기 셀레늄염은 1 μM 내지 300 μM, 100 μM 내지 300 μM, 200 μM 내지 300 μM, 1 μM 내지 100 μM, 1 μM 내지 70 μM, 1 μM 내지 60 μM, 또는 1 μM 내지 50 μM의 농도로 배양액에 첨가될 수 있다. 상기 셀레늄염은 단회 첨가 또는 2회 이상 분할 첨가될 수 있다.
상기 방법에서 배양 온도는 20℃ 내지 40℃ 또는 25℃ 내지 35℃일 수 있다. 상기 방법에서 배양 pH는 5 내지 8, 5.5 내지 8, 또는 6 내지 8일 수 있다. 상기 방법에서 배양액에 산소 또는 산소 함유 기체가 도입될 수 있다. 상기 방법에서 배양은 교반기에 의한 교반과 함께 이루어질 수 있다.
상기 방법에서 배양 시간은 상기 균주의 접종 후 24시간 내지 72시간, 24시간 내지 60시간, 24시간 내지 48시간, 또는 24시간 내지 36시간일 수 있다. 상기 방법에서 셀레늄염은 상기 균주의 접종 후 24시간 내지 48시간 차에 첨가될 수 있다. 상기 셀레늄염은 상기 균주의 접종 후 24시간 내지 48시간 차에 단회로 또는 2회 이상 분할하여 첨가될 수 있다.
상기 방법에서 첨가되는 셀레늄염의 농도 및 배양 시간은 배양 목적에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 상기 방법을 통해 셀레늄 함유 클로렐라를 살아있는 상태로 얻고자 할 경우, 첨가되는 셀레늄염의 농도는 1 μM 내지 60 μM 또는 1 μM 내지 50 μM일 수 있다. 또는, 첨가되는 셀레늄염의 농도가 60 μM 내지 300 μM일 경우, 배양 시간은 셀레늄염의 첨가 후 48시간 이하, 36시간 이하, 24시간 이하, 12시간 이하, 또는 6시간 이하일 수 있다.
상기 방법에서 배양액은 탄소 공급원 및 질소 공급원을 포함할 수 있다. 상기 배양액은 칼륨 공급원 및 인 공급원 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 배양액은 마그네슘, 칼슘, 철, 및 미량 원소 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 배양액은 글루코스, NaCl, 및 효모 추출물(yeast extract)을 포함할 수 있다. 상기 배양액은 펩톤을 더 포함할 수 있다.
기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 첨부 도면들에 포함되어 있다.
본 발명의 실시예에 따른 셀레늄 저항성 신규 미세조류를 이용하면, 셀레늄 함유 배양체를 대량으로 생산할 수 있다.
도 1은 수집된 미세조류의 염기서열을 이용한 계통학적 분류 결과를 나타낸다.
도 2a는 HNU-NDG1의 18S rRNA 서열과 기존 클로렐라 종의 서열 비교 결과를 나타낸다.
도 2b는 HNU-GSG1의 18S rRNA 서열과 기존 클로렐라 종의 서열 비교 결과를 나타낸다.
도 3은 MAE 배지 상에서 HNU-NDG1 균주의 doubling time 분석 결과를 나타낸다.
도 4a는 아셀렌산나트륨 분할처리 후 클로렐라 소로키니아나 HNU-NDG1의 생균 분석 결과를 나타낸다.
도 4b는 아셀렌산나트륨 단독처리 후 클로렐라 소로키니아나 HNU-NDG1의 생균 분석 결과를 나타낸다.
도 5는 클로렐라 소로키니아나 HNU-NDG1에서 아셀렌산나트륨의 처리에 따른 유기태 셀레늄의 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
본 발명의 이점 및/또는 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성요소를 지칭한다.
실시예 1: 클로렐라 소로키니아나 균주의 동정 및 서열 분석
1.1. 미세조류의 수집 및 특성 분석
충청도 및 전남 순천에서 7종의 미세조류를 수집하였다. 모두 녹색의 구형 균주이고 YEP 영양배지 상에서 높은 성장률을 나타내었다. 수집된 7종의 미세조류를 대상으로 소듐셀레나이트(sodium selenite)에 대한 최소 억제 농도(minimal inhibition concentration: MIC)를 측정하였다. HNU-NDG1 및 HNU-GSG1를 포함한 6종의 조류가 최대 40 ppm의 높은 저항성을 나타내었다. 또한, 수집된 미세조류 및 시판 미세조류를 대상으로 소듐셀레나이트를농도별 처리한 후 Chlorophyll a 함량을 측정하여 생존 저해능을 평가하였다. 그 결과, HNU-NDG1 및 HNU-GSG1를 포함한 5종 및 시판 미세조류가 소듐셀레나이트에 대하여 40 ppm의 높은 저항성을 나타내었다.
HNU-NDG1 균주는 충청남도 홍성군 서부면 남당리에 위치한 어사리선착장 인근의 해수로부터 수집된 균주이다. HNU-GSG1 균주는 충청북도 괴산군 사리면 이곡리에 소재하고 있는 이곡저수지의 담수로부터 수집된 균주이다. 두 균주는 YEP 영양배지 상에서 가장 높은 성장률을 나타내었다.
도 1은 수집된 미세조류의 염기서열을 이용한 계통학적 분류 결과를 나타낸다. 각 미세조류의 18S rRNA 서열을 이용하여 Jukes-Cantor 모델을 적용한 Neighbour-joining 방법에 따라 계통수(phylogenetic tree)를 작성하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 수집된 균주들은 모두 클로렐라 소로키나아나(Chlorella sorokiniana)에 속하는 것으로 확인되었다.
이 중, 클로렐라 소로키나아나 HNU-NDG1 균주를 한국생명공학연구원(KCTC)에 2017년 3월 21일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC 13229BP를 부여받았다. 또한, 클로렐라 소로키나아나 HNU-GSG1 균주를 한국생명공학연구원에 2017년 3월 21일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC 13228BP를 부여받았다.
1.2. 클로렐라 소로키니아나 균주의 서열 분석
상기 수집된 균주의 게놈 DNA를 분리하고 18S rRNA에 대한 염기서열을 수득하였다. NCBI의 BLAST tool을 이용하여 클로렐라 소로키니아나 HNU-NDG1의 18s rRNA의 서열 및 HNU-GSG1의 18s rRNA의 서열을 각각 기존에 알려진 서열과 비교하였다.
도 2a는 HNU-NDG1의 18S rRNA 서열과 기존 클로렐라 종의 서열 비교 결과를 나타낸다. HNU-NDG1의 18S rRNA 서열 분석 결과, 높은 상동성을 나타내는 서열로 클로렐라 소로키니아나 표준 균주(type strain)의 18S rRNA 서열이 확인되었으나 이 서열은 HNU-NDG1의 18S rRNA 서열과 동일하지는 않았다. 따라서, HNU-NDG1은 기존에 알려진 클로렐라 종과 유전적으로 상이한 균주인 것으로 확인되었다.
도 2b는 HNU-GSG1의 18S rRNA 서열과 기존 클로렐라 종의 서열 비교 결과를 나타낸다. HNU-GSG1의 18S rRNA 서열 분석 결과, 클로렐라 소로키니아나 표준 균주의 18S rRNA 서열과 90% 내지 95%의 상동성을 나타내었으나 이 서열은 HNU-GSG1의 18S rRNA 서열과 동일하지는 않았다. 따라서, HNU-GSG1 또한 기존에 알려진 클로렐라 종과 유전적으로 상이한 균주인 것으로 확인되었다.
실시예 2: 클로렐라 소로키니아나 HNU-NDG1 및 HNU-GSG1의 배양 실험
HNU-NDG1 균주를 대상으로 최적 암배양(chemo-heterotrophic culture)이 가능한 산업용 배양배지 조성에 관한 실험을 수행하였다. 하기 표 1과 같이 47종의 다양한 조성의 배지에 클로렐라 소로키니아나 HNU-NDG1 배양액을 5% 접종 후 0.4 vvm, 130 rpm, pH 7.5, 및 30℃의 조건으로 72시간 동안 배양한 후 생균수 분석을 통하여 최적 배양용 배지 조성을 선정하였다.
Figure PCTKR2018005027-appb-T000001
그 결과, 5번 배지 조성에서 최적의 성장을 확인하고, 이를 MAE 배지(Micro-Algae Enrichment medium)로 명명하였다. 또한, 상기 MAE 배지 상에서 HNU-NDG1 및 HNU-GSG1 균주의 doubling time은 6.8시간으로 확인되었다.
도 3은 MAE 배지 상에서 HNU-NDG1 균주의 doubling time 분석 결과를 나타낸다.
실시예 3: 클로렐라 소로키니아나 HNU - NDG1 및 HNU - GSG1의 유기성셀레늄 함량 분석
소듐셀레나이트의 처리 방식에 따른 유기성셀레늄 함량을 ICP/MS로 분석하여 확인하였다.
하기 표 2는 클로렐라 소로키니아나 HNU-NDG1을 이용한 유기태 셀레늄의 생산에 있어서 소듐셀레나이트의 처리 방법을 나타낸다. 하기 표 2에 기재된 바와 같이, 소듐셀레나이트를 0.00211 mM, 0.26401 mM, 0.05280 mM, 및 0.07920 mM로 나누어 각각 단회 처리하거나 분할 처리하였다. 예비 실험에서 소듐셀레나이트에 의하여 조류의 성장이 억제되었기 때문에 고농도로 단회 처리하거나 고농도를 2회로 분할하여 처리하였다.
Method Sample 0hour 24hour 48hour 72hour Concentration of treated Selenium
Two step 1 Inoculation Sodium selenite 0.00042mM Sodium selenite 0.0017mM Washing & Harvest 0.00211mM
2 Inoculation Sodium selenite 0.05280mM Sodium selenite 0.2112mM Washing & Harvest 0.26401mM
3 Inoculation Sodium selenite 0.02640mM Sodium selenite 0.0264mM Washing & Harvest 0.05280mM
4 Inoculation Sodium selenite 0.03960mM Sodium selenite 0.0396mM Washing & Harvest 0.07920mM
One step 5 Inoculation Sodium selenite 0.0021mM Washing & Harvest 0.00211mM
6 Inoculation Sodium selenite 0.2640mM Washing & Harvest 0.26401mM
7 Inoculation Sodium selenite 0.0528mM Washing & Harvest 0.05280mM
8 Inoculation Sodium selenite 0.0792mM Washing & Harvest 0.07920mM
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 시료 1 내지 4는 분할 처리한 경우로, 클로렐라 소로키니아나의 접종 직후(0 hour), 배양 24시간 경과 후(24 hour), 소듐셀레나이트의 첨가 24시간 경과 후(48 hour), 및 소듐셀레나이트의 첨가 48시간 경과 후(72 hour)에 각각 시료를 채취하여 생균수 및 총균수를 측정하였다. 시료 5 내지 8은 단회 처리한 경우로, 클로렐라 소로키니아나의 접종 직후(0 hour), 배양 48시간 경과 후(48 hour), 및 소듐셀레나이트의 첨가 24시간 경과 후(72 hour)에 각각 시료를 채취하여 생균수 및 총균수를 측정하였다.
하기 표 3은 클로렐라 소로키니아나 HNU-NDG1을 이용한 유기태 셀레늄의 생산에 있어서 소듐셀레나이트의 처리 방법에 따른 생균수 및 총균수를 나타낸다 (단위: log cells/㎖).
Method Sample 0hour 24hour 48hour 72hour
Viable Total Viable Total Viable Total Viable Total
Two step 1 3.84 5.18 6.57 6.87 7.84 7.09 8.14 8.27
2 4.06 5.40 5.79 6.52 7.59 7.85 0* 7.90
3 4.18 5.32 6.43 6.21 7.93 8.03 8.14 8.21
4 4.04 5.26 6.46 6.44 7.86 8.19 0* 8.37
One step 5 3.84 5.18 7.83 8.03 7.94 8.02
6 4.06 5.40 7.69 8.03 0* 7.92
7 4.18 5.32 7.72 7.92 7.97 8.26
8 4.04 5.26 7.81 7.92 0* 8.19
도 4a는 소듐셀레나이트 분할처리 후 클로렐라 소로키니아나 HNU-NDG1의 생균 분석 결과를 나타낸다. 도 4b는 소듐셀레나이트 단독처리 후 클로렐라 소로키니아나 HNU-NDG1의 생균 분석 결과를 나타낸다.
소듐셀레나이트 분할 처리 결과 저농도인 0.00211 mM 및 0.05280 mM에서는 분할 및 단회 처리시에도 균체의 사멸이 크게 이루어지지 않았지만, 고농도인 0.26401 mM 및 0.07920 mM의 경우 처리 후 24시간 차에는 생존하였으나 48시간 경과 후 전 개체가 사멸하였다. 총균 분석 결과에서는 서로 유의적으로 큰 차이를 보이지 않는 것을 확인할 수 있었다.
상기 처리한 시료에 멸균 인산 완충 염수(PBS)를 이용한 원심 분리 및 세척을 5회 반복하여 균체외막에 잔존하는 소듐셀레나이트를 충분히 세척하였다. 이후 동결 건조하여 분말로 제조하였고, 제조 분말에 대하여 HPLC ICP/MS를 이용하여 체내 함유된 셀레늄을 분석하였다.
하기 표 4는 클로렐라 소로키니아나 HNU-NDG1에서 소듐셀레나이트의 처리에 따른 유기태 셀레늄의 분석 결과를 나타낸다.
Treatment Sample Source 72hour Wet Cells Se/Dry Cell mass Adj. Wet Cells(g/l)
Two step 1 Sodium selenite Se: 0.002mM 5.70 0.571mM 12.094
2 Sodium selenite Se: 0.266mM 3.82 52.364mM 7.792
3 Sodium selenite Se: 0.0528mM 7.10 0.372mM 14.20
4 Sodium selenite Se: 0.0792mM 6.95 0.821mM 13.90
One step 5 Sodium selenite Se: 0.002mM 4.40 0.480mM 9.438
6 Sodium selenite Se: 0.266mM 4.54 39.973mM 9.430
7 Sodium selenite Se: 0.0528mM 6.85 0.219mM 13.70
8 Sodium selenite Se: 0.0792mM 6.12 0.593mM 12.24
도 5는 클로렐라 소로키니아나 HNU-NDG1에서 소듐셀레나이트의 처리에 따른 유기태 셀레늄의 분석 결과를 나타내는 그래프이다. 도 5에서 (a) 및 (b)는 각각 분할 처리 및 단회 처리를 나타낸다.
상기 표 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 클로렐라 소로키니아나 HNU-NDG1을 이용한 소듐셀레나이트농도별 분할 및 단회 처리 샘플에 대한 셀레늄 분석 결과, 저농도인 0.002 mM 처리시 분할 처리가 단회 처리 대비 19% 함량이 증가함을 확인할 수 있었으며, 고농도인 0.266 mM 처리의 경우 분할 처리가 단회 처리 대비 31% 증가함을 확인할 수 있었다.
또한, HNU-NDG1에 대하여 전술된 방법을 기반으로 클로렐라 소로키니아나 HNU-GSG1에 대해서도 아셀렌나트륨의 처리에 따른 유기성셀레늄 함량을 분석하였다. HNU-GSG1의 경우, HNU-NDG1에 비하여 소듐셀레나이트에 대한 감수성이 예민하게 나타나 소듐셀레나이트의 처리 농도 0.23 mM을 단회 및 분할 처리하였고, 그 외 실험 방법은 NDG1과 동일하게 진행하였다. 분할 처리시 균 체내 유기태 셀레늄 함량은 8.60 mM로 확인되고 단독 처리의 경우 4.98 mM로 확인되어, 분할 처리가 단회 처리에 비하여 유기태 셀레늄 함량을 높이는데 유리한 것으로 평가되었다.
이로부터 고농도의 소듐셀레나이트가 처리되면 미세조류 클로렐라 소로키니아나 HNU-NDG1 및 HNU-GSG1의 성장을 억제하게 되어 체내 흡수가 되지 않지만, 저농도로 분할 처리하면 생존에 영향을 주지 않고 흡수율을 향상시킬 수 있는 것으로 사료된다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC13228BP
수탁일자 : 20170321
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC13229BP
수탁일자 : 20170321
지금까지 본 발명에 따른 구체적인 실시예에 관하여 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서는 여러 가지 변형이 가능함은 물론이다. 그러므로, 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 안 되며, 후술하는 특허 청구의 범위뿐 아니라 이 특허 청구의 범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.
이상과 같이 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 이는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 따라서, 본 발명 사상은 아래에 기재된 특허청구범위에 의해서만 파악되어야 하고, 이의 균등 또는 등가적 변형 모두는 본 발명 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.

Claims (9)

  1. 수탁번호가 KCTC 13228BP인 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana) 균주.
  2. 수탁번호가 KCTC 13229BP인 신규 클로렐라 소로키니아나균주.
  3. 수탁번호가 KCTC 13228BP인 클로렐라 소로키니아나균주 또는 수탁번호가 KCTC 13229BP인 클로렐라 소로키니아나균주를 셀레늄염이 첨가된 배양액에서 배양하는 단계를 포함하는 셀레늄 함유 클로렐라의 생산방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 배양은 화학종속영양(chemo-heterotrophic) 배양인 것을 특징으로 하는 셀레늄 함유 클로렐라의 생산방법.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 셀레늄염은 소듐셀레나이트인 것을 특징으로 하는 셀레늄 함유 클로렐라의 생산방법.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 셀레늄염은 1 μM 내지 300 μM 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 셀레늄 함유 클로렐라의 생산방법.
  7. 제3항에 있어서,
    상기 셀레늄염은 단회 첨가 또는 2회 이상 분할 첨가되는 것을 특징으로 하는 셀레늄 함유 클로렐라의 생산방법.
  8. 제3항에 있어서,
    상기 배양은 셀레늄염의 첨가 후 48시간 이하로 이루어지는 것을 특징으로 하는 셀레늄 함유 클로렐라의 생산방법.
  9. 제3항에 있어서,
    상기 배양액은 글루코스, NaCl, 및 효모 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 셀레늄 함유 클로렐라의 생산방법.
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