CN108220166B

CN108220166B - 一种提高衣藻生物量及促进衣藻脂质生产的方法

Info

Publication number: CN108220166B
Application number: CN201810127941.XA
Authority: CN
Inventors: 许丽丽; 程祥龙; 涂晓盟; 曹玥; 王全喜
Original assignee: Shanghai Normal University
Current assignee: Shanghai Normal University
Priority date: 2018-02-08
Filing date: 2018-02-08
Publication date: 2021-09-28
Anticipated expiration: 2038-02-08
Also published as: CN108220166A

Abstract

本发明公开了一种提高缺氮培养条件下衣藻生物量的方法，还公开了一种促进衣藻脂质生产的方法。该方法将衣藻与圆褐固氮菌共同培养，包括：步骤1、将衣藻置于TAP培养基中培养；步骤2、将圆褐固氮菌置于氮固定培养基中培养；步骤3、离心收获步骤1中的衣藻，用TAP‑N培养基洗涤除氮；步骤4、待步骤2中的圆褐固氮菌生长至饱和后，离心收获圆褐固氮菌，用TAP‑N培养基洗涤并重悬，使其OD₆₀₀＝1；步骤5、将步骤3中收获的衣藻与步骤4中收获的圆褐固氮菌在TAP‑N培养基中混合均匀，于光照下培养；步骤6、混合培养1‑9天后收获衣藻，用氯仿/甲醇混合物提取脂质。利用圆褐固氮菌来提高衣藻的生物量和脂质的积累是一种有效，快速和经济可行的的策略。

Description

一种提高衣藻生物量及促进衣藻脂质生产的方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种提高缺氮培养条件下衣藻生物量及促进衣藻脂质生产的方法。

背景技术

传统化石燃料的来源是有限的，而且在使用过程中通常会产生二氧化碳和其他气体，因此迫切需要寻找新型的可再生清洁能源资源。生物柴油是一种被认为对环境无害的生物燃料。原料供应和价格是生物柴油应用的关键限制因素，因此寻求廉价可再生原料进行生物柴油研究是实现生物柴油大规模利用的有效途径。

藻类可以通过光合作用将二氧化碳和水转化为氧气和碳水化合物和脂质形式的大分子有机物。在某些胁迫条件下，如高光或营养缺乏，一些藻类可积累大量脂质，如三酰甘油酯。由于微藻生长速度快，脂质含量高，脂质组成优化，被认为是生物柴油生产的理想材料。莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是一种单细胞绿藻，其基因组已被完全测序。它生长快，培养成本低，在缺氮条件下能产生脂质。由于这些原因，它已经被广泛用于脂质生产。与其他微藻一样，缺氮时莱茵衣藻的生长受到抑制，即藻类生物量和脂质积累与缺氮呈负相关，导致其脂质生产效率和积累量低于理论值。理想的生产模式应该是通过培养基中去除氮而藻类生物量不受限制从而增加藻类的脂质积累。

在自然环境中，细菌和藻类具有复杂的生态关系。据报道，一些细菌可以通过代谢互补来促进藻类的生长，提高生物量。Ietswaart等人发现两种专性好氧菌P.vesicularis和Pseudomonas diminuta可以促进斜生栅藻和小球藻的生长。Bell等人报道，与假单胞菌一起培养的中肋骨条藻(Skeletonema costatum)生长得比独立培养时更快，事实上在没有假单胞菌的情况下中肋骨条藻不能存活。Riquelm等人发现冰川中的星杆藻富含假单胞菌，并且发现假单胞菌分泌的糖蛋白也能促进星杆藻的生长。一些海洋微藻和异养细菌共同生长时，会分泌胞外酶或促进彼此生长的特定生长因子，如枯草芽孢杆菌和塔玛亚历山大藻。

为了提高莱茵衣藻的脂质积累，需要寻找一种有效的方法来增加莱茵衣藻在缺氮条件下的生物量。将莱茵衣藻与某些细菌共同培养，或可为提高莱茵衣藻的脂质积累和脂质生产效率提供有效策略。

发明内容

有鉴于现有技术的缺陷，本发明提供了一种提高缺氮培养条件下衣藻生物量的方法以及一种促进衣藻脂质生产的方法。具体的技术方案如下：

本发明在第一方面提供了一种提高缺氮培养条件下衣藻生物量的方法，该方法将衣藻与圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)共同培养。

优选地，上述衣藻为莱茵衣藻cc849。

优选地，上述方法包括以下步骤：

步骤1、将衣藻置于TAP培养基中培养，TAP培养基的配方如下表1所示：

表1、TAP培养基配方

(说明：培养基总体积定容到1000ml。固体培养基另加1％的琼脂，121℃高压灭菌20min，室温冷却，备用。)

步骤2、将圆褐固氮菌置于氮固定培养基中培养，氮固定培养基的配方如下表2所示：

表2、固氮菌培养基配方

(说明：培养基pH＝7.2，固体培养基另加1％琼脂，121℃高压灭菌20 min，室温冷却，备用。)

步骤3、离心收获步骤1中的衣藻，用TAP-N培养基洗涤除氮，TAP-N培养基的配方如下表3所示；

表3、TAP-N培养基配方

(说明：培养基总体积定容到1000 ml。固体培养基另加1％的琼脂，121℃高压灭菌20 min，室温冷却，备用。)

步骤4、待步骤2中的圆褐固氮菌生长至饱和后，离心收获圆褐固氮菌，用TAP-N培养基洗涤并重悬，使其OD₆₀₀＝1；

步骤5、将步骤3中收获的衣藻与步骤4中收获的圆褐固氮菌在TAP-N培养基中混合均匀，于光照下培养。

优选地，上述步骤1中，衣藻的培养条件为：温度25±1℃、光照强度100μE·m^-2·s^-1以及pH＝7。

优选地，上述步骤2中，圆褐固氮菌的培养条件为：温度28±1℃以及pH＝7。

优选地，上述步骤5中，衣藻与圆褐固氮菌的混合比例为1mg叶绿素：20ml；混合培养的光照强度为200μE·m^-2·s^-1，这里所加的衣藻的量是按照叶绿素的重量(叶绿素浓度*衣藻的体积)为标准。

本发明在第二方面提供了一种促进衣藻脂质生产的方法，该方法将衣藻与圆褐固氮菌共同培养。

优选地，上述衣藻为莱茵衣藻cc849。

优选地，上述方法包括以下步骤：

步骤1、将衣藻置于TAP培养基中培养；

步骤2、将圆褐固氮菌置于氮固定培养基中培养；

步骤3、离心收获步骤1中的衣藻，用TAP-N培养基洗涤除氮；

步骤5、将步骤3中收获的衣藻与步骤4中收获的圆褐固氮菌在TAP-N培养基中混合均匀，于光照下培养；

步骤6、混合培养1-9天后收获衣藻，用氯仿/甲醇混合物提取脂质。

优选地，上述步骤5中，衣藻与圆褐固氮菌的混合比例为1mg：20ml；混合培养的光照强度为200μE·m^-2·s^-1。

更优选地，上述步骤5中，混合培养9天后收获所述衣藻。

在一个较优实施例中，步骤5中提取脂质的方法包括以下步骤：

步骤1、于7500g离心10分钟收获衣藻；

步骤2、将步骤1中收获的衣藻用TAP-N培养基再悬浮三次后干燥至恒重，得到干燥的衣藻；

步骤3、将干燥的衣藻与体积比为1：1的氯仿/甲醇混合物混合，于振荡器上震荡30分钟，以8000g离心10分钟；

步骤4、重复步骤3直至上清液为无色，收集所有上清液，旋转蒸发至干燥，得到脂质。

为了提高莱茵衣藻的脂质产量及其生物量，本发明提供的方法在藻类培养基中加入了圆褐固氮菌。莱茵衣藻在与圆褐固氮菌共培养时的最大脂质含量和产量分别为65.85％和387.76mg/L，分别是对照29.11％和65.99mg/L的2.3倍和5.9倍。莱茵衣藻在共培养条件下的最高脂质产量为141.86mg/(L·day)，是对照的7.33mg/(L·day)的19.4倍。此外，与常规的缺氮培养相比，加入到莱茵衣藻中的圆褐固氮菌促进了衣藻中脂类的积累及产率以及衣藻体内蛋白质转化为脂质的效率，衣藻的生长及生物量也得到了提高。因此，利用圆褐固氮菌来提高衣藻的生物量和脂质的积累是一种有效、快速和经济可行的策略。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。所以凡是不脱离本发明所公开的原理下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。

附图说明

图1示出了本发明较优实施例中纯藻及与固氮菌共培养衣藻在缺氮培养0、1、3、5、7和9天的生长情况，(A)OD₇₅₀和(B)叶绿素浓度检测结果；

图2示出了本发明较优实施例中缺氮培养0、1、3、5、7和9天纯藻、纯固氮菌以及藻菌混合培养体系中衣藻的生物量检测结果；

图3示出了本发明较优实施例中缺氮0、1、3、5、7和9天后，纯藻和藻菌共培养体系中衣藻(A)脂类的含量(B)脂类的产量；

图4示出了本发明较优实施例中缺氮0、1、3、5、7和9天后，尼罗红染色的衣藻(A、C、E、G、I)和藻菌共培养体系中的衣藻(B、D、F、H、J)；

图5示出了本发明较优实施例中纯衣藻培养体系与藻菌培养体系中衣藻与脂质代谢相关的基因的表达水平：(A)、ACCase，(B)、DGAT1，(C)、DGTT1，(D)、DGTT2，(E)、DGTT3，(F)、DGTT4，(G)、DGTT5，(H)、PEPC，(I)、PDAT。

具体实施方式

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

1、材料与方法

1.1藻类和细菌菌株的培养条件

莱茵衣藻cc849是一种细胞缺陷型菌株。在25±1℃下，在100μE·m^-2·s^-1的条件下，藻类在Tris-乙酸磷酸盐(TAP)培养基(pH＝7)中生长。细胞密度由750nm处的吸光度(OD₇₅₀)确定。莱茵衣藻叶绿素用酒精提取，即取1ml藻细胞，8000g离心1min，取出上清，加入1ml 95％的酒精重新悬浮沉淀物，然后在室温8000g离心1分钟。提取上清液，在665nm和649nm测量吸光度。

叶绿素浓度(mg/L)＝OD ₆₆₅×6.01+OD ₆₄₉×20.04

将圆褐固氮菌(No1.0233)在28±1℃的氮固定培养基(pH＝7)中培养。细胞密度用600nm处的吸光度(OD₆₀₀)表示。

1.2菌藻共培养生产脂质

培养瓶中的藻细胞通过在4500g和25℃下离心5分钟而收获。通过TAP-N培养基缓慢洗涤藻细胞三次以彻底除去氮。当细菌生长至饱和时，通过在5000g和25℃下离心5分钟收获细菌，然后用TAP-N培养基再悬浮三次。将细菌沉淀用适量的TAP-N培养基重悬，以使其OD₆₀₀＝1。然后将10ml重新悬浮的细菌样品加入500ml烧瓶中。然后加入0.5mg衣藻。最后，将TAP-N培养基补充到烧瓶中。摇晃烧瓶中的样品，使细菌和藻类混合均匀。将烧瓶置于200μE·m^-2·s^-1光下培养。

然后在指定的时间点提取2ml培养液，然后分别在750nm、665nm和649nm测量吸光度，以评估藻类生长。

1.3莱茵衣藻和圆褐固氮菌的显微镜观察

将1ml细胞用尼罗红染料(1mg/mL)染色15分钟。使用配备有数码相机(Nikon DS-Ri1)的共聚焦荧光显微镜(Nikon Eclipse 80i)拍摄在TAP-N培养基中生长的莱茵衣藻细胞的明视野照片。随后，在488nm的激发光下拍摄尼罗红染色后的荧光照片。

1.4脂质的提取和检测

本实施例中采用Bligh和Dyer(1959)总脂质的检测方法，并进行了一些修改。通过7500g离心10分钟提取400ml藻细胞，然后用新鲜的TAP-N培养基再悬浮三次。然后将固体样品放入干燥的称量瓶中。将这些称量瓶的样品在80℃的烘箱中干燥24小时，直到重量不再减少(干重称为DW)。然后将0.2g(重量为W0)的干细胞转移到离心管中。随后，将5ml体积比为1：1的氯仿和甲醇的混合物加入到离心管中。将离心管中的细胞在振荡器上震荡30分钟，然后以8000g离心10分钟。重复所有步骤直到上清液为无色。收集所有上清液(重量标记为W1)，并转移至已知重量的干燥旋转蒸发器中并蒸发至干燥(称重为W2)。

生物量(mg)＝DW

单位生物量(mg/L)＝DW/0.5

脂含量＝(W₂-W₁)/W₀×100％

脂质产量(mg/L)＝W2

脂质生产力(mg/(Lday))＝W2/day

1.5检测蛋白质含量和碳水化合物含量

用BCA方法检测衣藻的蛋白质含量。取5毫升藻细胞，以7500g的速度将其离心10min，并丢弃上清液。然后将1ml 15mm KH2PO4(pH 4.5)和2ml 20％NaOH加入到试管中，然后摇30秒。将试管放入沸水中煮10分钟，然后以7500g的速度将其离心10分钟，提取出上清液，用皮尔斯BCA蛋白试剂盒(Thermo)检测蛋白质含量。采用BSA(牛血清白蛋白)作为标准样品，制作标准曲线。随后，通过在560nm处的酶标仪的吸光度和标准曲线计算蛋白质含量。

通过蒽酮比色法检测莱茵衣藻的碳水化合物含量。将10mg藻粉放入管中，同时加入0.5N H₂SO₄，然后将管在80℃的浴中孵育1小时。最后，将反应物以8000g离心5分钟以收集上清液，并重复步骤一次。提取上清液，在625nm测量吸光度。

1.6RNA提取和实时定量PCR

从0、1、5、9天的样本中取2ml细胞，用QIAGEN Plant Mini Kit提取RNA。单链cDNA由2μg的RNA合成。利用实时定量PCR检测与脂质积累相关的基因转录水平。引物如表4和序列表所示，使用Primer 5设计。实时定量PCR按照SYBR Green实时PCR主混合试剂盒(TOYOBOTM，Japan)的制造商的规定进行。使用Makarova等人报道的方程计算每个cDNA样品的莱茵衣藻的管家基因肌动蛋白的转录水平。在96孔板中进行PCR。每个PCR反应物含有1μL(8ng)cDNA，10μL SYBR Green 2×Master Mix和1μL各引物对(10mM)至最终体积为20μL。PCR如下进行：95℃10分钟，95℃10秒，60℃1分钟和72℃30秒35个循环。用ABI的分离曲线软件分析PCR产物。用

方法计算差异表达基因的倍数变化。

表4、荧光定量PCR的引物

2、检测结果

2.1与圆褐固氮菌共培养的藻类的生长和生物量

脂质的产生与藻类生物量直接相关，因此在缺氮条件下检测了衣藻和与圆褐固氮菌共培养的衣藻的生长情况和生物量的积累。结果表明，纯衣藻和与圆褐固氮菌共培养衣藻的初始OD₇₅₀值都为1.42，缺氮后，纯衣藻OD₇₅₀逐渐下降，最低为0.91，而与圆褐固氮菌共培养的衣藻其OD₇₅₀急剧升高，尤以第9天为最高，达到3.75，为对照值的4.1倍，如图1A所示。与OD₇₅₀的变化一致，衣藻的初始叶绿素含量为9.95mg/mL，缺氮后纯衣藻叶绿素含量略有下降，第9天达到最低为4.85mg/mL，相反，与圆褐固氮菌共培养的衣藻叶绿素含量第3天后显着增加，达到39.13mg/mL，是第9天纯藻的8.1倍，如图1B所示。

发明人对生物量也进行了监测，结果如图2所示。纯衣藻的生物量用藻细胞的干重(DW)标记，共培养衣藻的生物量通过减少纯细菌细胞的重量来计算。结果表明，缺氮导致纯藻生物量下降。然而，与圆褐固氮菌共培养的衣藻的生物量显著增加。如图2所示，纯衣藻的总生物量从95.00mg下降到第9天的最小值90.01mg。与圆褐固氮菌混合的衣藻的总生物量显著增加并且达到最高265mg，这是对照水平的2.9倍。随着总生物量的变化，纯衣藻和混合圆褐固氮菌的样品的初始单位生物量均为211mg。对照的单位生物量略有下降，在第9天下降到最低200.00mg，而混合圆褐固氮菌的衣藻的总生物量增加到最高588mg，也是对照水平的2.9倍。

2.2与圆褐固氮菌共培养的藻类的总脂质含量，脂质产量和脂质产率

为了分析圆褐固氮菌对缺氮培养基中莱茵衣藻的脂质产生的影响，将藻细胞预培养至饱和，然后转移至含有圆褐固氮菌(OD₆₀₀＝1)的缺氮培养基中。纯藻类培养作为对照。在特定时间点提取样品以评估脂质含量，脂质产量和脂质产率。许多报道表明，缺氮促进了许多微藻的脂质积累。与其他研究结果一致，缺氮后，衣藻的脂质含量，脂质产量和脂质产率逐渐增加，而混合圆褐固氮菌的藻类的脂质含量，脂质产量和脂质产率则显著增加，如图3所示。与圆褐固氮菌共培养的衣藻的最大脂质含量从最初的28.00％增加到第9天最高的65.85％，是纯衣藻(29.11％)的2.3倍，如图3A所示。相应地，与圆褐固氮菌共培养的衣藻在第9天的最大脂质产量和产率分别分别为387.76mg/L和141.86mg/L，是对照组的5.97倍和19.4倍，对照组为65.97mg/(L·Day)和7.33mg/L，如图3B所示。另外，通过荧光显微镜观察藻细胞，尼罗红荧光显示，在第1、3、5、7和9天，共培养衣藻脂质体中的脂质颗粒比富含氮的培养基中的纯衣藻更大且数量更多，如图4所示。

据报道，即使在没有某些营养物如氮的情况下，莱茵衣藻也能积累脂质。因此，在本发明中，当培养至饱和时，将样品转移至缺氮培养基以诱导脂质的积累。然而，以前的一些研究表明，营养素缺乏会刺激脂质的生成，但是会以牺牲生长为代价，这表明生物量会和脂质产量呈负相关。同样，在本发明中，纯莱茵衣藻的生物量在缺氮培养基中较低，但与圆褐固氮菌共培养后显着增加，如图2所示。这样，与莱茵衣藻增加的生长和生物量一致，莱茵衣藻在共培养物中的脂质含量，脂质生产和脂质生产力也明显增加。与圆褐固氮菌共培养的莱茵衣藻增加的生长和生物量的增加是共同培养的莱茵衣藻增加的脂质含量、脂质产量和脂质产率的重要原因。

2.3在缺氮条件下，圆褐固氮菌对莱茵衣藻细胞生化成分的影响

在缺氮培养时分析藻细胞的组分。总细胞组成分析表明第0天(TAP培养基中)纯衣藻细胞含有15％脂质，11％碳水化合物和59％蛋白质。有趣的是，氮消耗导致纯莱茵衣藻的脂质含量从15％增加到24％，而莱茵衣藻在共培养中的脂质含量显着增加，在第9天达到57％，是纯莱茵衣藻的2.2倍。相反，纯莱茵衣藻的蛋白质含量从初始值59％下降到40％，莱茵衣藻在共培养中的蛋白质含量在第9天下降到13％，倍数变化为4.5倍。与脂质含量的变化一样，纯衣藻碳水化合物含量从最初的11％增加到22％，莱茵衣藻在共培养中的脂质含量增加到25％，是纯衣藻的1.1倍。总之，纯衣藻和共培养藻的脂质和碳水化合物含量都逐渐增加，缺氮后蛋白质含量都降低，因此缺氮可能导致藻类中的蛋白质转化为脂质或碳水化合物。添加固氮菌后衣藻的脂质和碳水化合物含量明显高于不加固氮菌的衣藻，而蛋白质含量则低于纯衣藻。这些变化在第9天显著。这表明圆褐固氮菌促进了藻类中蛋白质向脂质或碳水化合物的转化。

2.4缺氮条件下与圆褐固氮菌共培养的衣藻中脂质合成相关基因的表达

为了探讨添加圆褐固氮菌后衣藻脂质产量提高的原因，发明人比较了第0天(在TAP培养基中)，第1天(脂质产生的起始点)，第5天(脂质产生的指数增长期)和第9天(脂质生成的稳定期)脂质代谢的关键基因的转录水平。

乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)是催化合成脂肪酸的第一步，在脂肪酸生物合成和分解代谢中起重要作用的关键限速酶。这里分析了共同培养和对照中莱茵衣藻ACC基因的表达水平。结果表明，共培养莱茵衣藻和纯培养表达水平都随着油脂产量的增加而增加，共培养时莱茵衣藻ACC的表达量高于对照。将莱茵衣藻加入藻培养物中导致相对于对照值的氮缺乏培养基的显着增加，并且在共培养物中莱茵衣藻的表达峰值水平是对照水平的1.5倍。脂质含量，脂质产生和脂质生产力在第9天达到峰值，如图3所示。ACCase可将乙酰辅酶A和二氧化碳转化为丙二酰辅酶A，并催化脂肪酸生物合成途径的第一反应。在本发明中，莱茵衣藻在共培养和纯莱茵衣藻中ACCase的表达水平均高于在富营养培养基中培养的纯莱茵衣藻，与圆褐固氮菌共培养的莱茵衣藻的表达水平高于对照，如图5A所示。

二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)通过二酰基甘油与酰基-CoA的反应来催化甘油三酯(TAG)的生物合成，并且它是肯尼迪途径中唯一参与TAG生物合成的催化酶。该酶被认为是脂质生物合成的重要调节剂，涉及脂质代谢和脂质沉积。DGAT有两种亚型，其中DGAT1广泛地作用于甘油三酯的代谢，而DGAT2则在氮限制条件下对TAG的积累起作用。在莱茵衣藻中，DGAT2由莱茵衣藻的5个基因编码组成，DATT1，DATT2，DATT3，DATT4，DATT5。在氮剥夺条件下评估了莱茵衣藻在共培养和纯藻中的每个基因的表达水平。结果显示共培养样品与对照样品之间差异较大。实时荧光定量PCR结果显示，共同培养的莱茵衣藻和纯藻中DGAT1的表达水平在第1天降低，到第5天增加。加入圆褐固氮菌后，DGAT1的表达水平增加(第九天测定)，如图5B所示。DGTT1的表达水平在第1天显着增加，然后从第1天到第9天逐渐降低，并在第9天达到最低水平，如图5C所示。DGTT2、DGTT4的表达水平均在莱茵衣藻在共培养和纯藻中的含量从第1天到第9天下降，在第9天达到最低，而莱茵衣藻在共培养中的含量高于对照，1.5倍和1.3倍的对照水平，如图5D、5F所示。相反，在共培养的莱茵衣藻中，DGTT3和DGTT5的表达水平从第1天增加到第9天，在第9天达到峰值，如图5E、5G所示。所有6个DGAT基因在莱茵衣藻在共培养中的含量均高于对照控制。很可能是由于添加圆褐固氮菌导致DGAT基因表达水平的增加。Miller等人调查了在缺氮条件下光合异养莱茵衣藻的转录组学分析。在他们的研究中，DGTT1表达显著增加，其他DGAT基因的表达变化甚微。在Msanne等人的一项研究中，DGTT1和DGTT3因为氮饥饿表达水平大幅增加。有趣的是，与目前的工作不同，DGTT4也有很高的表达量。将圆褐固氮菌加入藻培养物中导致DGAT1，DATT1，DATT2，DATT3，DATT4和DATT5的表达水平显着增加，这表明DGAT基因的表达水平增加可能有助于氮饥饿下与圆褐固氮菌共培养的莱茵衣藻脂质的合成。这是导致培养物中加入圆褐固氮菌之后，莱茵衣藻增加的脂质积累的另一个重要的可能原因。

酶磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)参与光合作用和光呼吸的调节。它也参与了氨基酸代谢的补充。它催化草酰乙酸形成丙酮酸，然后进入蛋白质代谢途径。如PEPC2基因表达的结果所示，发明人还在莱茵衣藻PEPC2中检测到编码PEPC的基因。在本发明中，PEPC2的表达水平是在营养缺乏的条件下测定的。结果表明，在营养缺乏的条件下，与圆褐固氮菌共培养和纯藻的PEPC2表达水平从第1天到第9天减少。尤其是，与圆褐固氮菌共培养的莱茵衣藻的基因表达水平下降得快于纯藻。这表明，氮消耗导致抑制PEPC2的表达。添加圆褐固氮菌后，PEPC2的表达受到更严重的抑制，如图5H所示。

磷酰二酰甘油酰基转移酶(PDAT)是一种酰基辅酶A非依赖性酶，可将酰基从磷脂的sn-2位置转移到二酰甘油的sn-3位置。PDAT1在莱茵衣藻的脂质合成中起重要作用。在本发明中，共同培养的莱茵衣藻和纯莱茵衣藻的表达水平都随着脂质产量的增加而增加。特别地，莱茵衣藻在共培养中的表达水平高于对照。也就是说，在藻类培养基中添加圆褐固氮菌导致PDAT1基因的表达水平在氮气培养基的消耗中显着增加。在共同培养的莱茵衣藻中PDAT1基因表达的最低水平是对照水平的1.5倍，如图5I所示，这是脂质含量，脂质产量和脂质生产率最高的时候(图3)。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110> 上海师范大学

<120> 一种提高衣藻生物量及促进衣藻脂质生产的方法

<130> 2018

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

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<210> 2

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

gtcagagcca agtgctggac 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

tccacctcct tgtcgaactc 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

tgccagatgg aaggtggagt g 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

gtaagcatgt gcggtgaagg g 21

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

gccgtcacag ggcttgggag aa 22

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

tccgcctgtg cctctgacgg 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

agcacaaagc cgtgtcgatg 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

ttgcccagga tgtcgatgtg 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

cgtgaacccc cgtagaaaag 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 20

cggagacagt cgtcaagcag 20

Claims

1.一种促进缺氮培养条件下衣藻脂质生产的方法，其特征在于，所述方法将衣藻与圆褐固氮菌共同培养，所述衣藻为莱茵衣藻cc849。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1、将所述衣藻置于TAP培养基中培养；

步骤2、将圆褐固氮菌置于氮固定培养基中培养；

步骤3、离心收获所述步骤1中的所述衣藻，用TAP-N培养基洗涤除氮；

步骤4、待所述步骤2中的所述圆褐固氮菌生长至饱和后，离心收获所述圆褐固氮菌，用所述TAP-N培养基洗涤并重悬，使其OD₆₀₀＝1；

步骤5、将所述步骤3中收获的所述衣藻与所述步骤4中收获的所述圆褐固氮菌在所述TAP-N培养基中混合均匀，于光照下培养；

步骤6、混合培养1-9天后收获所述衣藻，用氯仿/甲醇混合物提取脂质。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤1中，所述衣藻的培养条件为：温度25±1℃、光照强度100μE·m^-2·s^-1以及pH＝7。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2中，所述圆褐固氮菌的培养条件为：温度28±1℃以及pH＝7。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤5中，所述衣藻与所述圆褐固氮菌的混合比例为1mg：20ml；混合培养的光照强度为200μE·m^-2·s^-1。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤6中，混合培养9天后收获所述衣藻。

7.根据权利要求2-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤6中，提取脂质的方法包括以下步骤：

步骤1、于7500g离心10分钟收获所述衣藻；

步骤2、将所述步骤1中收获的所述衣藻用所述TAP-N培养基再悬浮三次后干燥至恒重，得到干燥的衣藻；

步骤3、将所述干燥的衣藻与体积比为1：1的所述氯仿/甲醇混合物混合，于振荡器上震荡30分钟，以8000g离心10分钟；

步骤4、重复所述步骤3直至上清液为无色，收集所有上清液，旋转蒸发至干燥，得到所述脂质。