CN103710280A - 一种规模化培养发状念珠藻细胞的方法 - Google Patents

一种规模化培养发状念珠藻细胞的方法 Download PDF

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贾士儒
肖玉朋
戴玉杰
郑行
吕和鑫
岳利芳
李清亮
韩培培
谭之磊
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Abstract

本发明涉及一种规模化培养发状念珠藻细胞的方法，藻种室内培养一定量的发状念珠藻，将藻种室培养的发状念珠藻藻液按体积比1:1到1:5接种至户外已经加入营养盐的管式光生物反应器中，同时补加适量营养盐；户外按1:1-1:5的比例进行逐级放大培养，放大的同时补加营养盐，最终采收。本发明对传统培养蓝藻的BG11培养基进行了改进，使培养的发状念珠藻生长速度更快，结果表明，该方法简单实用，发状念珠藻生长速率快，操作可控，不易发生污染，可以实现对发状念珠藻细胞的稳定地连续生产。

Description

一种规模化培养发状念珠藻细胞的方法
技术领域
本发明属于微藻培养技术领域，尤其是一种规模化培养发状念珠藻细胞的方法。 
背景技术
发状念珠藻（Nostoc flagelliforme）俗名发菜，是一种极端陆生固氮蓝细菌，具有很高的经济价值，其热水浸提物——发菜多糖具有抗癌和抗病毒活性。天然条件下野生发菜生长速度缓慢，远不能满足市场的需求，无节制的乱采滥挖导致了严重的土壤沙漠化。自2000年起，我国政府出于保护发菜资源和生态环境的目的，全面禁止发菜的采收和销售。因此，为实现发菜这种资源的可持续利用，必须探索人工培养技术，以进行发菜的工业化生产，满足市场需求。 
发状念珠藻人工培养主要集中在两个方面：固态培养和细胞液体悬浮培养。发菜细胞液体悬浮培养能够提高发状念珠藻的生长速度，培养条件容易控制，并在培养过程中同时积累胞外多糖和荚膜多糖。 
目前，实现光合自养发菜细胞较大规模培养的方法主要是开放池式培养系统和气升式封闭培养系统，但规模都较小，仅限于实验室中培养研究。 
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处在于，提供一种生长速度更快、方法简单实用、操作可控的规模化培养发状念珠藻细胞的方法，本方法采用户外条件下管式光生物反应器规模化培养发状念珠藻。 
本发明实现目的的技术方案如下： 
一种规模化培养发状念珠藻细胞的方法，步骤如下 
⑴培养发状念珠藻种子液； 
⑵将培养的发状念珠藻种子液按体积比1:1到1:3接种至户外光生物反应器中； 
⑶户外光生物反应器按比例为1:1—1:5进行放大培养，最终采收。 
2、根据权利要求书1所述的规模化培养发状念珠藻细胞的方法，其特征在 于：所述培养基配方为：无水氯化钙0.02-0.03g/L；七水硫酸镁0.8-1.0g/L；硝酸钠1.0-1.5g/L；七水硫酸亚铁0.005-0.01g/L；九水硅酸钠0.5-0.6g/L；磷酸二氢钾0.1-0.2g/L；碳酸氢钠0.5-2.0g/L；EDTA二钠0.01-0.02g/L。 
而且，所述培养基用水为经膜过滤的地下井水。 
而且，所述分阶段培养的步骤如下： 
第一阶段：藻种室内罐径为30cm，高120cm的气升式光生物反应器，外置光源，光照强度3000lux，25℃，接种密度10%条件下培养发状念珠藻细胞60L，经过培养至密度为OD4200.8； 
第二阶段：将在藻种室内培养的发状念珠藻细胞浓缩收集后接种到户外自然光下，管径为φ50的150L管式光生物反应器中补充培养基继续培养，控制温度≤30℃，光照强度控制在40000lux以下，通过二氧化碳在线控制仪控制pH为8.0-9.0，经培养，培养浓度至OD420值0.9； 
第三阶段：将150L管式光生物反应器中培养的发状念珠藻藻液转移到户外管径为φ110的500L管式光生物反应器中，同时补加150L培养时1/3的营养盐，控制温度≤30℃，光照强度控制在60000lux以下，通过二氧化碳在线控制仪控制pH为8.0-9.0，经培养至细胞浓度为OD420值0.9； 
第四阶段：将500L管式光生物反应器中培养的发状念珠藻藻液转移到户外管径为φ150的1000L管式光生物反应器中，同时补加500L培养时1/3的营养盐，控制温度≤30℃，光照强度控制在80000lux以下，补充培养基，通过二氧化碳在线控制仪控制pH为8.0-9.0，经培养至细胞浓度为OD420值0.9； 
第五阶段：将1000L管式光生物反应器中培养的发状念珠藻藻液转移至沉淀池进行沉淀去掉上清液，藻泥洗涤2～3次，对洗涤完毕的藻泥收集进行喷雾干燥，收集藻粉； 
所述步骤一至步骤五采用的培养基为：无水氯化钙，0.027g/L；七水硫酸镁0.8g/L；硝酸钠1.5g/L；七水硫酸亚铁0.01g/L；九水硅酸钠0.6g/L；磷酸二氢钾0.15g/L；碳酸氢钠1.0g/L；EDTA二钠0.02g/L。 
而且，所述培养液中通入食品级二氧化碳调节其pH值，使其维持发状念珠藻生长的pH值为8.0-9.0。 
本发明的优点和积极效果如下： 
1、本发明得到的发状念珠藻细胞可以用作开发保健品，制成传统发菜食品以及提取发菜多糖用于医药或保健品等用途。 
2、本发明首次采用管式光生物反应器将微藻进行户外培养，以前都是实验室人造光源下的小规模培养，光生物反应器具有单位体积藻液受光面积大、藻细胞分布均匀、光和效率较高、不易污染、温度、pH等条件容易控制且维护成本低等优点。 
3、本发明对传统培养蓝藻的BG11培养基进行了改进，转移的户外培养，利用自然界光源，使培养的发状念珠藻生长速度更快，通过实地验证结果表明，本方法简单实用，发状念珠藻生长速率快、操作可控、不易发生污染，可以实现对发状念珠藻细胞的稳定地连续生产。 
具体实施案例 
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。 
一种规模化培养发状念珠藻细胞的方法，步骤如下： 
⑴室内恒温恒光照强度下培养发状念珠藻；⑵将室内培养的发状念珠藻液按体积比1:1到1:3接种至户外光生物反应器中；⑶户外光生物反应器按比例为1:1—1:5进行放大培养，最终采收。 
所采用的培养基配方为改良的BG11培养基配方为：无水氯化钙，0.02-0.03g/L；七水硫酸镁0.8-1.0g/L；硝酸钠1.0-1.5g/L；七水硫酸亚铁0.005-0.01g/L；九水硅酸钠0.5-0.6g/L；磷酸二氢钾0.1-0.2g/L；碳酸氢钠0.5-2.0g/L；EDTA二钠0.01-0.02g/L；培养基用水为经膜过滤的地下井水。通过向培养液中通入食品级二氧化碳调节其pH值，使其维持发状念珠藻生长的最适pH值。 
具体步骤如下 
以下步骤采取的培养基为：无水氯化钙，0.027g/L；七水硫酸镁0.8g/L；硝酸钠1.5g/L；七水硫酸亚铁0.01g/L；九水硅酸钠0.6g/L；磷酸二氢钾0.15g/L；碳酸氢钠1.0g/L；EDTA二钠0.02g/L；培养基用水为经膜（膜的孔径）过滤的地下井水。上述培养基未添加微量元素。以下各步骤均采用上述培养基。 
第一阶段：藻种室内罐径为30cm，高120cm的气升式光生物反应器，外置光源，光照强度3000lux，25℃，接种密度10%条件下培养发状念珠藻细胞60L，经过八天培养，细胞密度为OD4200.8； 
第二阶段：将在藻种室内培养的发状念珠藻细胞浓缩收集后接种到户外自然光下，管径为φ50的150L管式光生物反应器中补充培养基继续培养，控制温度≤30℃，光照强度控制在40000lux以下，通过二氧化碳在线控制仪控制pH为8.0-9.0，经六天培养，培养浓度至OD420值0.9； 
第三阶段：将150L管式光生物反应器中培养的发状念珠藻藻液转移到户外管径为φ110的500L管式光生物反应器中，同时补加150L培养时1/3的营养盐，控制温度≤30℃，光照强度控制在60000lux以下，通过二氧化碳在线控制仪控制pH为8.0-9.0，经八天培养至细胞浓度为OD420值0.9； 
第四阶段：将500L管式光生物反应器中培养的发状念珠藻藻液转移到户外管径为φ150的1000L管式光生物反应器中，同时补加500L培养时1/3的营养盐，控制温度≤30℃，光照强度控制在80000lux以下，补充培养基，通过二氧化碳在线控制仪控制pH为8.0-9.0，经五天培养至细胞浓度为OD420值0.9； 
第五阶段：将1000L管式光生物反应器中培养的发状念珠藻藻液转移至沉淀池进行沉淀去掉上清液，藻泥洗涤2～3次; 
对洗涤完毕的藻泥收集进行喷雾干燥，收集藻粉； 
清洗管式光生物反应器。 

Claims (5)

1.一种规模化培养发状念珠藻细胞的方法，其特征在于：步骤如下
⑴培养发状念珠藻种子液；
⑵将培养的发状念珠藻种子液按体积比1:1到1:3接种至户外光生物反应器中；
⑶户外光生物反应器按比例为1:1—1:5进行放大培养，最终采收。
2.根据权利要求书1所述的规模化培养发状念珠藻细胞的方法，其特征在于：所述培养基配方为：无水氯化钙0.02-0.03g/L；七水硫酸镁0.8-1.0g/L；硝酸钠1.0-1.5g/L；七水硫酸亚铁0.005-0.01g/L；九水硅酸钠0.5-0.6g/L；磷酸二氢钾0.1-0.2g/L；碳酸氢钠0.5-2.0g/L；EDTA二钠0.01-0.02g/L。
3.根据权利要求书2所述的规模化培养发状念珠藻细胞的方法，其特征在于：所述培养基用水为经膜过滤的地下井水。
4.根据权利要求书1所述的规模化培养发状念珠藻细胞的方法，其特征在于：所述分阶段培养的步骤如下：
第一阶段：藻种室内罐径为30cm，高120cm的气升式光生物反应器，外置光源，光照强度3000lux，25℃，接种密度10%条件下培养发状念珠藻细胞60L，经过培养至密度为OD4200.8；
第二阶段：将在藻种室内培养的发状念珠藻细胞浓缩收集后接种到户外自然光下，管径为
Figure FDA0000412654920000012
的150L管式光生物反应器中补充培养基继续培养，控制温度≤30℃，光照强度控制在40000lux以下，通过二氧化碳在线控制仪控制pH为8.0-9.0，经培养，培养浓度至OD420值0.9；
第三阶段：将150L管式光生物反应器中培养的发状念珠藻藻液转移到户外管径为
Figure FDA0000412654920000011
的500L管式光生物反应器中，同时补加150L培养时1/3的营养盐，控制温度≤30℃，光照强度控制在60000lux以下，通过二氧化碳在线控制仪控制pH为8.0-9.0，经培养至细胞浓度为OD420值0.9；
第四阶段：将500L管式光生物反应器中培养的发状念珠藻藻液转移到户外管径为
Figure FDA0000412654920000013
的1000L管式光生物反应器中，同时补加500L培养时1/3的营养盐，控制温度≤30℃，光照强度控制在80000lux以下，补充培养基，通过二氧化碳在线控制仪控制pH为8.0-9.0，经培养至细胞浓度为OD420值0.9；
第五阶段：将1000L管式光生物反应器中培养的发状念珠藻藻液转移至沉淀池进行沉淀去掉上清液，藻泥洗涤2～3次，对洗涤完毕的藻泥收集进行喷雾干燥，收集藻粉；
所述步骤一至步骤五采用的培养基为：无水氯化钙，0.027g/L；七水硫酸镁0.8g/L；硝酸钠1.5g/L；七水硫酸亚铁0.01g/L；九水硅酸钠0.6g/L；磷酸二氢钾0.15g/L；碳酸氢钠1.0g/L；EDTA二钠0.02g/L。
5.根据权利要求4所述的规模化培养发状念珠藻细胞的方法，其特征在于：所述培养液中通入食品级二氧化碳调节其pH值，使其维持发状念珠藻生长的pH值为8.0-9.0。
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