CN115975811A - 一种念珠藻及其培养方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种念珠藻及其培养方法和应用，所述念珠藻于2022年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.45180。本发明的念珠藻生长快速，获得的生物量高，能够适应较宽泛的盐浓度和不同培养基，并且在含有较高浓度的氮源培养基中并通入CO2的培养条件下，生长尤其快速，能在短期内累积大量生物量。本发明的念珠藻具有很高的蛋白含量，因此，具有作为高蛋白食品添加剂和饲料添加剂的潜力。此外，本发明的藻株富含多种高附加值产物，包括蔗糖、藻蓝蛋白以及α‑亚麻酸和/或亚油酸等多不饱和脂肪酸，因此，该藻株还可用于生产这些高附加值产物。
Description
技术领域
本发明涉及应用微藻领域，更特别地，涉及一种高产蔗糖、多不饱和脂肪酸并高产蛋白质及藻蓝蛋白的念珠藻及其培养方法和应用。
背景技术
生物质原料的紧缺是全球面临的重要挑战，微藻是一类既不“与人争粮”，又不“与粮争地”的光合微生物，可以通过光合作用固碳，并完成向糖类、蛋白、藻蓝蛋白及多不饱和脂肪酸等绿色生物产品的转化输出，具有绿色、低碳、环保、可持续的优势。
蔗糖是由1个分子的葡萄糖和1个分子的果糖组成的一种双糖。经过几百年人类的食用证明，蔗糖是安全的食品和营养型甜味剂。20世纪80年代蔗糖被美国食品药物管理局(FDA)认为是安全的食品而编入目录。另外，蔗糖可以作为微生物的营养，还是酒精、酵母、柠檬酸、乳酸、甘油、醇类、药品等的原料，在食品、发酵及工业领域具有重要的作用。
在大自然中，蔗糖通常来自糖料作物甜菜或甘蔗。近年来研究发现，有一部分蓝藻可以合成包括蔗糖、海藻糖、甘油葡萄糖苷和甘氨酸甜菜碱等相容性物质来维持细胞渗透压的稳定。在过去科学文献报道中，仅有部分天然蓝细菌具有合成蔗糖的能力，但是蔗糖合成能力非常低，研究报道显示，野生型集胞藻PCC 6803在0.6M NaCl盐胁迫时，蔗糖产率仅为10mg/L/OD730，而野生型聚球藻PCC 7942蔗糖产率可达25mg/L/OD730。因此，通过开发具有高产糖的蓝细菌种质资源，可以有效提高蔗糖的合成效率，大幅降低细胞培养成本。具备产糖能力的蓝细菌还在太空领域具有应用潜力，例如可以在太空重建蔗糖合成的生态系统，维持氧气和食物供应，有望破解太空生存难题，并在改良太空土壤、太空废弃物利用等方面发挥价值。
蓝细菌还可以合成亚油酸及亚麻酸等多不饱和脂肪酸。例如，螺旋藻中含有较高含量的γ-亚麻酸。而α-亚麻酸(α-linolenic acid，ALA)是全顺式9,12,15-十八碳三烯酸，属于ω-3系列多不饱和脂肪酸，属于人体必需脂肪酸，是二十碳五烯酸(eicosapentaenoicacid，EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)的前体。由于ALA对心脑血管健康和机体发育具有重要作用，具有比γ-亚麻酸更高的营养价值，因此可天然合成ALA的藻类在保健品领域具有极高的市场前景，这些富含ALA的藻粉成分在动物饲料和鱼类养殖等领域具有应用价值。
藻蓝蛋白是主要存在于蓝细菌等藻类中的一种少见的天然营养素，具有很高的商业价值。藻蓝蛋白的应用很广泛,它是稀有的天然蓝色色素，在食品和化妆品领域具有广阔应用潜力，还可以用作医药保健食品，还可用作生物细胞荧光探测剂等。然而多数蓝细菌的藻蓝蛋白含量并不高，据报道，目前藻蓝蛋白含量最高的是螺旋藻，其藻蓝蛋白含量在20％左右，其次为念珠藻，其余蓝细菌的藻蓝蛋白含量均低于10％。
但是，目前分离到的具备多不饱和脂肪酸合成能力并高产蔗糖和藻蓝蛋白的蓝细菌种质资源较为匮乏。
发明内容
发明人从野外采集藻样，经培养分离，得到一株生长快速并且具有较宽的盐浓度适应性和培养基适应性的蓝细菌藻株，该藻株具有很高的蛋白含量，并且高产蔗糖、藻蓝蛋白以及高产α-亚麻酸(ALA)和亚油酸(linoleic acid，LA)等多不饱和脂肪酸。该藻株在光镜下为念珠状的丝状蓝藻，藻丝单列，呈深蓝色。藻细胞多为为卵圆形到球形，直径3.0-4.5μm；藻丝中部存在较大的异质细胞，直径5-6μm。对其16S rDNA进行测序，如SEQ ID NO:1所示。根据其形态和16S rRNA基因序列分析，将其归为念珠藻属，命名为念珠藻NK2-40，拉丁学名为Nostoc sp.NK2-40。
基于以上发现，本发明提供了一种念珠藻(Nostoc sp.)，所述念珠藻于2022年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.45180。
本发明还提供了上述念珠藻在生产蔗糖中的应用。
本发明还提供了上述念珠藻在生产藻蓝蛋白中的应用。
本发明还提供了上述念珠藻在生产多不饱和脂肪酸中的应用。
在一个具体实施方案中，所述多不饱和脂肪酸为α-亚麻酸和/或亚油酸。
本发明还提供了上述念珠藻在制备高蛋白或高蔗糖的食品添加剂或饲料添加剂中的应用。
本发明还提供了上述念珠藻在太空构建蔗糖合成的生态系统中的应用。
本发明还提供了一种培养上述念珠藻的方法，包括将所述念珠藻接种于培养基中进行光合培养的步骤。
在一个具体实施方案中，所述培养基BG11培养基、海水培养基或海水培养基，所述培养基中外加了0-0.6M的氯化钠。
在一个具体实施方案中，所述培养基中外加了硝酸钠做额外氮源。
在一个具体实施方案中，培养环境中通入了含有3％-100％的CO2的气体。
本发明的念珠藻生长快速，获得的生物量高，能够适应较宽泛的盐浓度和不同培养基，并且在含有较高浓度的氮源培养基中并通入CO2的培养条件下，生长尤其快速，能在短期内累积大量生物量。本发明的念珠藻具有很高的蛋白含量，因此，具有作为高蛋白食品添加剂和饲料添加剂的潜力。此外，本发明的藻株富含多种高附加值产物，包括蔗糖、藻蓝蛋白以及ALA和LA等多不饱和脂肪酸，因此，该藻株还可用于生产这些高附加值产物。
本发明的藻株作为一株高效光合可持续合成蔗糖的菌株，在进一步的优化后，有望进行蔗糖的商业化生产及其他相关应用。例如，该藻株的细胞培养物在食品、饲料、生物原料、生物燃料、药品等方面的实际应用价值。例如，此藻株在光合细胞工厂构建等方面的潜在应用价值。例如，该藻株在太空探索等方面的潜在应用价值，可在太空构建蔗糖合成的生态系统，维持氧气和食物供应，还可在改良太空土壤、太空废弃物利用等方面发挥价值。
微生物保藏
本发明所述的藻株从中国青海省天然盐湖的生物垫中分离获得，经16SrRNA基因测序和形态学鉴定，该藻株属于蓝藻门念珠藻属。2022年6月6日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.45180，命名为念珠藻NK2-40，拉丁学名为Nostoc sp.NK2-40。
附图说明
图1为Nostoc sp.NK2-40的光学显微镜照片。
图2为Nostoc sp.NK2-40在装有BG11培养基的三角瓶中的生长曲线。
图3为Nostoc sp.NK2-40在BG11和Zarrouk培养基中通空气或通3％在CO2培养的生长曲线。
图4为Nostoc sp.NK2-40在加有不同浓度的氯化钠的BG11培养基中培养7天后的OD730统计图。
图5为Nostoc sp.NK2-40和螺旋藻在加了额外的氯化钠和/或硝酸钠的Zarrouk培养基中的生长曲线。
图6为Nostoc sp.NK2-40在BG11培养基和Zarrouk培养基中培养3天后的生物量统计，以及螺旋藻在Zarrouk培养基中培养3天后的生物量统计图(A)；以及Nostoc sp.NK2-40和螺旋藻在Zarrouk培养基(额外添加硝酸钠和/或氯化钠)中培养6天后的生物量统计图。
图7为Nostoc sp.NK2-40藻细胞中的成分统计图。
图8为通空气培养(A)和通CO2培养(B)的Nostoc sp.NK2-40的藻蓝蛋白含量统计图。
图9为Nostoc sp.NK2-40在含有不同浓度的氯化钠的Zarrouk培养基中的生长曲线(A)、细胞内的蔗糖累积含量(B)、细胞内的蔗糖产量(C)和细胞外的蔗糖含量(D)统计图。
图10为Nostoc sp.NK2-40的脂肪酸峰图(A)和脂肪酸含量统计图(B)。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1、NK2-40的获得
发明人从野外采集藻样，经培养分离，得到一株高产蔗糖的蓝细菌藻株。如图1所示，该藻株在光镜下为念珠状的丝状蓝藻，藻丝单列，呈深蓝色。藻细胞多为为卵圆形到球形，直径3.0-4.5μm；藻丝中部存在较大的异质细胞，直径5-6μm。
对其16S rDNA进行测序，如SEQ ID NO:1所示。将该序列在NCBI数据库中进行比对，结果显示，其与念珠藻属比较接近，因此将该藻株定为念珠藻属。
该微藻已于2022年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.45180，命名为念珠藻NK2-40，拉丁学名为Nostoc sp.NK2-40。
2.Nostoc sp.NK2-40的培养
1)将藻株接种至含有BG11培养基的250mL三角瓶中，接种浓度为OD730＝0.2，于30±2℃下进行光照同期培养，光强为100μmol photons m-2s-1，对每株藻种设置三个平行重复样，调节通气的速率保持一致。在此过程中，每天定时定量测定OD730，绘制生长曲线。
2)使用规格为100mL的柱式光反应器，加入80mL的Zarrouk培养基，初始接种浓度约为OD730＝0.1。培养过程中通3％二氧化碳(V/V)，持续光照培养(光强约150μmol photonsm-2s-1)，培养温度30±2℃。设置3个平行，每天取样测定OD730，绘制生长曲线。
3)使用规格为580×30mm的柱式光反应器，分别加入250mL的Zarrouk或250mL的BG11培养基对所述藻株进行培养，初始接种浓度约为OD730＝0.1～0.5。培养过程中通3％二氧化碳(V/V)，持续光照培养(光强约150μmol photons m-2s-1)，培养温度30±2℃。每组设置3个平行，每天取样测定OD730，绘制生长曲线。
以上培养结果如图2和3所示，NK2-40在BG11培养基中通入空气培养的条件下，生长良好，于培养1天后进入对数期，5天后达到平台期，0D730为1.5左右。在100mL柱式光反应器中通入3％CO2的条件下，在培养第3天时，OD730可达2.93，这表明NK2-40不仅可以采用BG11培养基进行培养，还可以较好地适应成分更为丰富的Zarrouk培养基。采用250mL柱式光反应器培养使藻株生长加快，在Zarrouk培养基中通3％的CO2培养3天后OD730达6.5左右，采用BG11培养基中通3％的CO2培养3天后的OD730也提高到4.7左右。这表明在通CO2的条件下培养，无论在BG11还是Zarrouk中的OD730均得到了提高，并且250mL长柱式反应器中的生长优于100ml柱式光反应器中的生长。
4)盐胁迫的影响
将NK2-40接种于装有BG11(添加了不同浓度的NaCl)的三角瓶中，于30℃下振荡培养，光强20～50μmol photons m-2s-1培养7天后测定OD730，结果如图4所示，在加有0-0.6MNaCl的培养基中，NK2-40生长较好，并且，在0.1M和0.3M NaCl的培养基中培养的NK2-40的OD730显著高于不加NaCl的培养基，但在加有0.9M及以上浓度NaCl的培养基中NK2-40不生长。这说明，NK2-40具有一定的喜盐特性(0-0.6M NaCl浓度下生长较好)，但是高盐(≥0.9MNaCl)抑制其生长。
5)培养基中额外加入氮源的影响
用250mL柱式光生物反应器培养藻株，温度30℃，通入3％CO2，光强100μmolphotons m-2s-1，对每株藻种设置三个平行，调节通气的速率保持一致，额外加2.5g/L NaNO3作为N源。每天取样测OD730，绘制生长曲线。结果如图5所示，藻株1天即进入对数期，至第3-4天OD730约为5，但不再进入平台期，生长期继续延长，至培养6天后OD730约为7.94±0.43。这表明，采用Zarrouk培养基额外补加氮源培养NK2-40可以进一步优化生长，并且使生长期延长。
6)生物量
将上文中培养的NK2-40培养物离心收集藻细胞，于真空冷冻仪冻干后测定藻细胞干重。培养3天后，如图6A所示，NK2-40的藻细胞干重分别达到1.8g/L(BG11培养基+3％CO2)和2.3g/L(Zarrouk培养基+3％CO2)，同等条件下使用Zarrouk培养基+3％CO2培养的螺旋藻的干重生物量为2.4g/L。因此，藻株的生物量累积速度与螺旋藻相当。
在另一个批次的实验中，培养6天后，如图6B所示，NK2-40的藻细胞干重分别达到2.95g/L(Zarrouk培养基+3％CO2)、3.76g/L(Zarrouk培养基+3％CO2+2.5g/L硝酸钠)、4.06g/L(Zarrouk培养基+3％CO2+0.3M氯化钠)和4.16g/L(Zarrouk培养基+3％CO2+2.5g/L硝酸钠+0.3M氯化钠)。
以上结果表明，NK2-40具备较强的光驱固碳生长能力，该藻株在离子成分差异较大的培养基组分(BG11和Zarrouk培养基)中均可良好生长，具备宽泛的培养基适应能力，对盐浓度具有一定的耐受性，并且其生物量累积与螺旋藻相当，因此具有较广阔的应用前景。
3.藻细胞营养成分分析
将NK2-40在BG11中、30℃下培养3-5天，收集藻细胞，冷冻干燥后分别采用氯仿-甲醇法抽提、甲酯化处理并结合GC-MS测定、凯氏定氮法、苯酚-硫酸法测定其中的总脂、总蛋白和总碳水化合物(糖类)含量。结果如图7所示，其中的蛋白含量占细胞干重的67.5％，碳水化合物含量12.2％，脂类占比3.8％。可见该藻株不仅具有较快的生长速度和较高的生物量，同时还具备较高的蛋白含量，在微藻蛋白、食用蛋白及饲料用蛋白等领域具有应用潜力。
4.NK2-40生产藻蓝蛋白
采用BG11培养基和Zarrouk培养基分别培养NK2-40，结果如图8所示，通空气培养时(图8A)，BG11培养培养的NK2-40的藻蓝蛋白含量较高，约为25％左右，Zarrouk培养培养的NK2-40的藻蓝蛋白含量为20％左右；通入3％的CO2培养时(图8B)，BG11培养培养的NK2-40的藻蓝蛋白含量大幅降低，约为10％左右，Zarrouk培养培养的NK2-40的藻蓝蛋白含量仍然为20％左右。在优化条件后，NK2-40的藻蓝蛋白含量可高达37％。
以上实验说明，NK2-40的藻蓝蛋白含量远高于普通的蓝细菌(通常低于10％)。同时采用螺旋藻作为对照，在所述条件下培养的NK2-40的藻蓝蛋白含量高于螺旋藻。可见该藻株还具有较高的藻蓝蛋白含量，此特点在藻蓝蛋白开发领域具有较好的价值。
5.NK2-40在盐胁迫条件下高产蔗糖
1)采用BG11培养基培养NK2-40生产蔗糖
采用BG11培养基并添加不同浓度的氯化钠培养NK2-40，培养至第7天，进行采收，采用赛默飞离子色谱5000+进行测定，蔗糖产量结果显示，NK2-40可以在BG11中生长并合成蔗糖，并且以胞内合成蔗糖为主。在BG11中添加0.6M NaCl培养时的蔗糖产量(盐胁迫培养第7天103.83±9.73mg/L/OD730)。此产量较模式蓝细菌集胞藻PCC 6803和聚球藻UTEX 2973野生型的蔗糖产量都要高。
2)采用Zarrouk培养基培养NK2-40生产蔗糖
将NK2-40接种于装有添加了不同浓度NaCl的Zarrouk培养基的250mL柱式光反应器中，于30±2℃下通气培养，光强150-300μmol photons m-2s-1，每日取样测定OD730，分别再培养4、6、8天后测定蔗糖含量，所得生长曲线和蔗糖含量如图9所示，所述藻株在Zarrouk培养基中实现快速生长，第8天最高吸光度OD730可达10(图9A)。随着盐离子浓度增加，其生物量逐渐降低，但蔗糖合成量逐渐增高。NK2-40蔗糖合成都在胞内，胞外检测含量极低，可忽略不计。在不添加盐离子的Zarrouk培养基中胞内蔗糖总量大约有286mg/L。在添加0.1MNaCl盐离子后胞内蔗糖产量为328mg/L。在添加0.3M NaCl盐离子后蔗糖产量为592mg/L。在添加0.6M NaCl盐离子后蔗糖产量为631mg/L或100mg/L/OD730(图9B和C)。上述培养条件下，蔗糖均主要位于胞内(图9D)。以上结果显示，Zarrouk中合成蔗糖较BG11中的产量更高，同时发现Zarrouk中的蔗糖产量是BG11中的8.6倍；并且该藻株在不加盐和加盐后均能够积累蔗糖，但加盐胁迫后蔗糖的积累量得到提高，使蔗糖合成翻倍。单位体积内，NK2-40在Zarrouk培养基蔗糖合成总量比集胞藻PCC 6803高出63倍。
以上结果说明，所述藻株不仅具备天然高效的蔗糖合成能力，在Zarrouk培养基中加入0.6M NaCl盐胁迫培养后，可进一步提高蔗糖的产量。因此，该藻株在进一步的优化后，有望进行蔗糖的商业化生产及其他相关应用，还包括细胞培养物的实际应用及光合产糖细胞工厂构建、太空探索及生态系统重建等方面的潜在应用价值。
6.NK2-40产多不饱和脂肪酸ALA和LA
将BG11培养的藻细胞离心收集并冻干，获得干燥的藻粉。取200mg藻粉对细胞组分进行总脂抽提并进行甲酯化处理后，依据GC-MS方法对其中的脂肪酸组分和含量进行解析。结果如图10所示，NK2-40的总脂的脂肪酸主要由少量的十四酸(C14:0)、大量的十六酸(C16:0)和少量的十八酸(C18:0)；此外还含有多种不饱和脂肪酸，包括顺9-十六碳一烯酸(C16:1,9Z)、顺11-十六碳一烯酸(C16:1,11Z)和少量油酸，较高含量的亚油酸(LA)和α-亚麻酸(ALA)等多种脂肪酸组分。
其中ALA含量达7.97mg/g干重，LA含量达2.94mg/g，分别占总脂含量的7.7％和20％，并且ALA的含量占细胞总干重的0.8％左右，其占比与螺旋藻的γ-亚麻酸含量(约1％)相同，在未经改造的天然菌株中含量较高。所不同的是，螺旋藻产γ-亚麻酸，而NK2-40产α-亚麻酸营养价值更高。
以上实验说明NK2-40含有较高含量的多不饱和脂肪酸，尤其是α-亚麻酸，因此，可用来生产相应的多不饱和脂肪酸，同时其细胞培养物可直接用作动物饲料或鱼类饵料等用以提高动物或鱼类等的肉类价值，或者将藻细胞直接作为补充人体的多不饱和脂肪酸的食物或添加剂。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种念珠藻(Nostoc sp.)，所述念珠藻于2022年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.45180。
2.权利要求1所述的念珠藻在生产蔗糖中的应用。
3.权利要求1所述的念珠藻在生产藻蓝蛋白中的应用。
4.权利要求1所述的念珠藻在生产多不饱和脂肪酸中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述多不饱和脂肪酸为α-亚麻酸和/或亚油酸。
6.权利要求1所述的念珠藻在制备高蛋白或高蔗糖的食品添加剂或饲料添加剂中的应用。
7.权利要求1所述的念珠藻在太空构建蔗糖合成的生态系统中的应用。
8.一种培养权利要求1所述的念珠藻的方法，其特征在于，包括将所述念珠藻接种于培养基中进行光合培养的步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述培养基为BG11培养基或Zarrouk培养基，所述培养基中外加了0-0.6M的氯化钠和/或外加了硝酸钠做额外氮源。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，培养环境中通入了含有3％-100％的CO2的气体。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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