CN102260686A - 提高小球藻中总油脂、亚油酸或α-亚麻酸的含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了GmDof4基因在提高小球藻油脂含量中的应用。该基因来源于大豆(Glycine max)，编码含有锌指结构的转录因子。GmDof4基因转化小球藻可以提高亚油酸(LA)和α-亚麻酸(ALA)含量，同时提高藻株的总油脂含量。本发明可应用于采用基因工程技术以藻类表达体系生产多不饱和脂肪酸和生物柴油。

Description

提高小球藻中总油脂、亚油酸或α-亚麻酸的含量的方法

技术领域

本发明涉及植物编码基因在小球藻中的应用。具体地，涉及将一个来源于大豆(Glycine max)的具有完整阅读框架的基因GmDof4构建成小球藻表达载体，并转入小球藻，使小球藻的亚油酸(LA)和α-亚麻酸(ALA)含量，及总油脂含量显著提高。

技术背景

微藻的光合作用效率高，生长周期短，单位面积年产量是粮食的几十倍乃至上百倍，而且微藻脂类含量在10％～70％，这是陆地植物远远达不到的。它具有产能大、无污染、可再生、易培养、含有较多的脂类物质等优点。它生长和繁殖在水域中，不会引起与农业、牧业用地竞争的矛盾。由于以上多方面的优势，微藻被认为是当今最有开发前途的能源之一^[1]。本发明使用的小球藻是一种单细胞真核藻类，繁殖速度快，以无性生殖方式进行繁殖，可以进行光自养培养和无光照的异养培养，可规模化生产，本实验室有成熟的培养、筛选和转化技术^[2]。

基因工程技术已被广泛应用于作物改良，并取得了许多显著的成效，而通过基因工程技术提高真核藻类总的油脂含量的研究很少有报道^[3]。Jarvis等曾将硅藻C.cryptica的acc1基因转入硅藻C.cryptica和Navicula saprophila过表达，在mRNA水平上均检测到该基因的过量表达，但两种转基因硅藻的油含量并没有显著增加，这是首次尝试利用基因工程技术提高硅藻含油量的研究，然而未达到理想结果^[4]。目前提高藻类油脂含量的最有成效的手段，是通过调控培养过程、培养条件、营养成分等手段提高藻类的油含量^[5-6]。然而在这些手段中都不可避免的产生一个问题，那就是提高含油量要以生物量的降低为代价，当生物量增加时，油脂的含量就会比较低^[7-8]。而基因工程技术有望解决这个问题。目前尚未检索到利用基因工程手段提高藻类油脂含量并且总生物量不减少的成功报道。

转录调控是许多生物学调控的关键步骤，转录因子可调控特定代谢途径中的一系列相关基因的表达，使得该代谢途径从整体水平上发生改变。Dof转录因子是植物特有的一类转录因子，因其具有一个单锌指结构，因此被称为Dof(DNAbinding with one finger)。在多种植物特异性启动子中都发现Dof蛋白结合元件，研究表明Dof转录因子在植物生长发育过程中参与多种生物学过程，如光应答和碳氮代谢、种子发育和萌发、植物激素应答、光敏色素应答和防卫反应等。大豆来源的GmDof4基因转入拟南芥后，通过调控一系列酶的活性提高了种子的油脂含量^[9]。目前尚未检索到利用大豆编码的Dof基因转化藻类并提高油脂含量的研究。

多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFAs)是指含有两个或两个以上双键且碳链长为18～22个碳原子的直链脂肪酸，主要包括亚油酸(Linoleic Acid，LA，18:2Δ^9，12)、γ-亚麻酸(γ-Linolenic Acid，GLA，18:3Δ^6，9，12)、花生四烯酸(Arachidonic Acid，AA，20:4Δ^{5，8，11，14})、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid，EPA，20:5Δ^{5，8，11，14，17})、二十二碳六烯酸(Decosahexaenoic Acid，DHA，20:5Δ^{4，7，10，13，16，19})等。其中，亚油酸及亚麻酸被公认为人体必需脂肪酸(Essential fatty acids，EFA)，可进一步衍化成具有不同功能的高度不饱和脂肪酸，如AA、EPA、DHA等^[10]。藻类含有丰富的多不饱和脂肪酸，主要包括亚油酸(Linoleic acid，LA，18:2Δ^9，12)、γ-亚麻酸(γ-Llinolenic Acid，GLA，18:3Δ^6，9，12)等。本发明发现GmDof4使小球藻的亚油酸(LA)和α-亚麻酸(ALA)含量，及总油脂含量显著提高。

发明内容

本发明的一个目的是提供基因GmDof4用于提高小球藻中总油脂、亚油酸或α-亚麻酸的含量的应用。

脂肪酸的检测主要采用GC-MS(气相色谱-质谱联用技术)来完成。其原理是通过GC(气相色谱)将不同的脂肪酸组分分离，然后通过MS(质谱)检测器分别对每种组分进行质谱定性分析，从而确定每一种组分的成分及含量的比较成熟的联用分析技术。

索氏抽提法(Soxhlet extractor method)是公认测定油脂含量的经典方法，目前被国内外普遍采用。利用溶剂回流及虹吸原理，使固体物质连续不断地被纯溶剂萃取，最后萃取出的物质富集在烧瓶中。

具体地，在一个方面，本发明涉及GmDof4基因在提高小球藻中总油脂、亚油酸或α-亚麻酸的含量的应用。

在另一个方面，本发明提供一种提高小球藻中总油脂、亚油酸或α-亚麻酸的含量的方法，其特征在于将GmDof4基因转化到小球藻中。

在本发明的应用及方法的一个具体实施方案中，GmDof4基因是大豆来源的。更优选地，GmDof4基因的序列为SEQ ID NO：1所示的序列，其编码的蛋白序列为SEQ ID NO：2所示的序列。

在另一个具体的实施方案中，所述GmDof4基因包含在植物表达载体中。所述表达载体可以是引导外源基因在植物中表达的任一种表达载体。优选地，所述表达载体可以是植物表达载体pBIN19、pBI121、pBI221，pCambia 1300，pGreen。优选地为pGreen0029。

本发明的载体也可含有适当的启动子。在本发明中可使用任何一种强启动子。这些启动子包括但不限于花椰菜花叶病毒(CaMV 35S)、Ubiqutin、Actin启动子。它可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。

本发明的表达载体可通过使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体，直接的DNA转化，微注射，电穿孔等方式导入植物细胞。

在又一个具体的实施方案中，所述小球藻选自椭圆小球藻(Chlorellaellipsoidea))。

在本发明中，GmDof4基因在提高小球藻中总油脂、亚油酸或α-亚麻酸的含量的同时，转GmDof4藻株的生长量与非转基因藻株相比没有显著差异。

附图说明

图1  含GmDof4基因的载体pEB-GmDof4。

图2  含nos终止子的载体图构建过程。

图3  空载(UN_CK)植物表达载体图构建过程。

图4  基因GmDof4的植物表达载体图构建过程。

图5  转基因藻株的PCR检测。M：Marker，1-3：阳性藻株，CK：阴性对照。

图6  转基因藻株的RT-PCR检测。M：Marker，1-3：阳性藻株，CK：阴性对照。

图7  转基因藻株的Southern检测。1：Dof4-1-2(Hind III和XbaI)，2：Dof4-1-2(Hind III和Nco I)，3：Dof4-3-2(Hind III和Xba I)，4：Dof4-3-2(Hind III和Nco I)，5：UN_CK-1-1(Hind III和Xba I)，6：UN_CK-1-1(Hind III和Nco I)。

图8  转基因藻株和对照生长曲线。

图9  T1代转基因藻株脂肪酸GC-MS测定结果比较。

图10  T2代转基因藻株脂肪酸GC-MS测定结果比较。

SEQ ID NO：1. GmDof4核苷酸序列。

SEQ ID NO：2. GmDof4氨基酸序列。

SEQ ID NO：3  GmDof4基因的cDNA片段克隆所用正向引物。

SEQ ID NO：4  GmDof4基因的cDNA片段克隆所用反向引物。

SEQ ID NO：5  nos终止子片段克隆所用正向引物。

SEQ ID NO：6. nos终止子片段克隆所用反向引物。

SEQ ID NO：7  ubi启动子片段的克隆所用正向引物。

SEQ ID NO：8. ubi启动子片段的克隆所用反向引物。

SEQ ID NO：9  从pEB-GmDof4载体中扩增基因GmDof4的正向引物。

SEQ ID NO：10.从pEB-GmDof4载体中扩增基因GmDof4的反向引物。

具体实施方式

下面参考实施例和附图详细描述本发明。本领域的普通技术人员可以理解的是，下述实施例是举例说明的目的，其不应以任何方式解释为对本发明的限制。本发明的保护范围由后附的权利要求所限定。

实施例一、GmDof4基因的获得

大豆cDNA的制备及GmDof4 DNA片段的克隆

以大田种植的大豆(Glycine max)活体植株为材料，取其幼嫩叶片(约100mg)，置于液氮中研磨至材料完全破碎，加入TRIzol(购自Invitrogen公司)室温放置5分钟。加入氯仿抽提两次，取上清，用异丙醇沉淀总RNA，空气干燥后，溶于DEPC H₂O。以试剂盒(FSK-100，TOYOBO Co.，LTD.)自带的polyT进行逆转录获得cDNA，并进行RT-PCR(具体操作参见FSK-100，TOYOBO Co.，LTD.)。

RT-PCR反应体系如下

进行下列操作

取适量上述逆转录产物，使用高保真酶Pfu(购自北京全式金生物技术有限公司)以引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4进行PCR扩增。

PCR反应体系如下：

PCR反应条件如下：

RT-PCR产物电泳(1％琼脂糖凝胶浓度)后切胶回收目的片段(GmDof4，约0.9kb)，直接连入(不需要酶切)pEASY-Blunt载体(购自全式金公司)，测序验证其序列为SEQ ID NO：1，所表达的蛋白序列为SEQ ID NO：2，命名为pEB-GmDof4，其载体图见图1。

实施例二、GmDof4基因小球藻载体的构建

1.以pGreen0029(购自the John Innes Centre)为基础载体，构建含Ubiquitin启动子和nos终止子的对照载体pG29-UN-CK。

用高保真酶Pfu从载体pGreen0029上扩增nos终止子，用引物SEQID NO：5(正向引物)和SEQ ID NO：6(反向引物)。

PCR反应体系如下：

PCR反应条件如下：

扩增产物直接使用限制性内切酶Not I和Sac I进行双酶切，与同样双酶切的pGreen0029连接，构建中间载体pGreen0029-nos(图2)，测序验证。

用高保真酶Pfu(来源同上)从含Ubi启动子的载体(pC1303，购自Cambia公司)上扩增Ubi启动子，所用引物SEQ ID NO：7(正向引物)和SEQ ID NO：8(反向引物)。

PCR反应体系如下：

PCR反应条件如下：

扩增产物直接使用限制性内切酶Hind III和BamH I进行双酶切，与同样双酶切的pGreen0029-nos连接，构建含Ubiquitin启动子和nos终止子的对照载体pGreen0029-Ubi-Nos(简写UN-CK)，测序验证，其载体图见图3。

2.GmDof4基因植物表达载体的构建

用高保真酶Pfu(来源同上)从含有基因GmDof4的载体pEB-GmDof4中扩增GmDof4，使用引物为SEQ ID NO：9(正向引物)和SEQ ID NO：10(反向引物)，反应体系和反应条件参见实施例一，利用Spe I、Not I酶切位点，双切后获得GmDof4基因，定向克隆于经同样酶切的小球藻中间表达载体UN-CK，获得小球藻表达质粒p29-UN-Dof4，转化大肠杆菌DH-5α(购自北京全式金生物技术有限公司)，随机挑取单克隆，经PCR验证(使用引物为SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10，反应体系和反应条件参见实施例一)，载体构建程序见图4。

实施例三、转GmDof4基因的小球藻的获得及检测

1.小球藻的转化

所用小球藻为椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea，来自中国科学院水生生物研究所)，参照文献^[2]培养小球藻至适宜的生长状态，离心收集藻细胞后进行高渗处理，采用上述文献^[2]相同的电激转化条件对椭圆小球藻进行电激，将电激后小球藻细胞涂于含30mg/L G418固体培养基(参照文献^[2]培养基的组成)中培养，约4～6周后检测平板上长出的藻落。

2.对转基因藻株进行PCR检测

挑取平板上的单藻落细胞接种于15mg/L G418液体培养基(参照文献^[2])中培养2周(浓度达到约为1×10⁸个/mL)，5000r/min离心10min收集藻细胞，在液氮中将细胞磨碎，参照文献^[2]中的方法提取小球藻总DNA，得到的DNA溶于灭菌的双蒸水中放置-80℃保存。

用高保真酶Pfu(来源同上)扩增基因GmDof4，所用引物SEQ ID NO：9(正向引物)和SEQ ID NO：10(反向引物)，反应体系和反应条件参见实施例一，图5为部分转基因藻株PCR检测结果，共获得了56个T1代转基因阳性藻株，编号为Dof4-1，-2，-3…直到Dof4-56。T1代指抗性藻落划线，长出单藻落，取单藻落点板繁殖后第一次成长为直径0.5cm的大藻类群；T2代指T1代的大藻落群划线、点板后再次繁殖成为直径0.5cm的大藻落群，例如下面用到的T2代藻株Dof4-1-2是T1代藻株Dof4-1的后代，T2代藻株Dof4-3-2是T1代藻株Dof4-3的后代。

3.对转基因藻株进行RT-PCR检测

挑取PCR检测阳性的藻株单藻落细胞，培养收集方法同上，RNA提取的方法参见实施例一，以试剂盒(FSK-100，TOYOBO Co.，LTD.)自带的Random primer进行逆转录获得cDNA，并进行RT-PCR(具体操作参见FSK-100，TOYOBO Co.，LTD.)。

RT-PCR反应体系如下

进行下列操作

取适量上述逆转录产物以引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4进行PCR扩增，反应体系和反应条件参见实施例一，图6为部分转基因藻株RT-PCR检测结果。

4.对转基因藻株进行Southern检测

Southern杂交是分子生物学的经典实验方法，其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段。本实验操作及所用试剂主要参考文献^[11]。

4.1探针标记

使用引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4从载体pEB-GmDof4(图1)PCR扩增基因GmDof4，反应体系和反应条件参见实施例一，探针标记使用Random Primer DNA Labeling Kit ver.2.0(TAKARABIOTECHNOLOGY(DALIAN)CO.，LTD.Code D6045)。PCR产物纯化回收后取10ng-1μg作为模板放于0.2mL离心管中，加Random Primer 2μL，ddH₂O补齐16μL，95℃变性5min，立即置冰浴5min。

在另一个1.5mL离心管中加入：

(上述试剂均在DNA Labeling Kit ver.2.0中)

将变性模板DNA加入到上管中，室温或37℃1hr。

4.2小球藻总DNA提取和酶切

挑取转GmDof4单藻落细胞和对照(转UN-CK的藻落细胞)分别接种于15mg/L G418液体培养基(参照文献^[2])中培养2周，5000r/min离心10min收集藻细胞，在液氮中将细胞磨碎，参照文献^[2]中的方法提取小球藻总DNA，获得的DNA用限制性内切酶酶进行酶切。Dof4-1-2，一组用Hind III和Xba I双酶切，另一组用Hind III和Nco I双酶切；Dof4-3-2一组用Hind III和Xba I双酶切，另一组用Hind III和Nco I双酶切；UN_CK-1-1一组用Hind III和Xba I双酶切，另一组用Hind III和Nco I双酶切。限制性内切酶均购自Takara公司。

反应体系：100μL反应体系中包括DNA 10～20μg、buffer 10μL、限制性内切酶4μL，其余用ddH₂O补平。

反应条件：37℃过夜，补加1μL酶继续酶切3-5小时，然后1％琼脂糖电泳检测酶切效果，DNA需切成弥散的一条带，没有主带。酶切体系加ddH₂O至体积200μL，加等体积氯仿抽提后乙醇醇沉，70％乙醇洗，晾干后加水不超过50μL，65℃热10min备用。

4.3胶的制备及转膜

配制0.8％的琼脂糖凝胶，加入酶切回收产物50μL，在1×TAE电泳缓冲液中，30V电压下电泳至溴酚蓝到胶下端，用ddH₂O将胶洗两遍，浸于数倍体积的碱性缓冲液中轻摇15min，换一次碱性缓冲液浸泡并轻轻摇荡20min。同时剪一张比凝胶大1mm的尼龙膜(CAT.No：RPN303B，Amersham Biosciences UK Limited)，预先在双蒸水中浸泡使其湿透，浸润后的尼龙膜浸入碱性转移缓冲液中至少15min。在0.4M的NaOH和1M NaCl碱性转移缓冲液条件下，用真空转膜仪(美国伯乐Bio-rad 785型真空转印仪)将琼脂糖凝胶上的DNA转到带正电荷的尼龙膜上，转膜条件为真空度50m bar转1h-2h。转膜完成后将膜浸泡于中和缓冲液II中室温15min。置于滤纸上晾干，紫外交联(1.245J/cm)8min，80℃烘烤1h，最后将尼龙膜立即用于杂交或用保鲜膜包好放在-20℃冰箱待用。

4.4预杂交及杂交

在杂交瓶中加入杂交液10-20mL(0.5M Na₃PO₄(pH7.2)，1mM EDTA(pH8.0)，7％SDS)，将膜的背面贴紧杂交瓶壁，正面朝向杂交液，注意不要产生气泡，放入杂交炉中，使杂交体系升到65℃。预杂交2-3h后，倒出预杂交的杂交液，换入5mL左右的杂交液。在上述制作的探针中加0.4N的NaOH使其变性，迅速加到杂交瓶中，65℃杂交过夜。

4.5洗膜与压片

取出尼龙膜在65℃依次使用下列条件洗膜：

2×SSC，0.5％SDS，15min

1×SSC，0.5％SDS，15min

0.5×SSC，0.1％SDS，15min

在洗膜的过程中，不断振摇，并保持膜一直是湿润的状态，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。期间洗膜2次后用monitor检测杂交信号的强弱，降低到20μGy/h左右时即可。洗完的膜用滤纸吸干膜表面的水分，并用保鲜膜包裹。

将膜正面向上，放入暗盒中(加双侧增感屏)，在暗室的红光下，在膜的正面向上贴覆一张X光片，合上暗盒，置于-80℃低温冰箱中曝光。根据信号强弱决定曝光时间，一般时间在2天左右。

4.6显影及定影

从-70℃中取出的暗盒在显影室打开后，取出X光片，显影液中浸泡1min，期间不断晃动光片，取出沥掉一些水分，浸到定影液中1min，ddH₂O冲洗两遍并照相，见附图7。点样顺序如下：1：Dof4-1-2(Hind III和Xba I)，2：Dof4-1-2(Hind III和Nco I)，3：Dof4-3-2(Hind III和XbaI)，4：Dof4-3-2(Hind III和Nco I)，5：UN_CK-1-1(Hind III和Xba I)，6：UN_CK-1-1(Hind III和Nco I)。

4.7结果分析

从质粒载体图4的酶切位点可以分析出，在插入小球藻基因组的片段上有一个Hind III的酶切位点，而没有Xba I和Nco I的酶切位点。使用Hind III分别和Xba I、Nco I组合进行双酶切，在转化藻株的酶切产物中一端是固定的，另一端是随机的。因此可以认为Southern杂交出的条带数等同于去除内源基因后的转基因拷贝数。图7中的泳道5和6是对照藻株，没有条带说明没有杂交到内源的基因，泳道1和2各有两个条带，说明在藻株Dof4-1-2的基因组里面插入了两个拷贝的GmDof4基因。泳道3和4各有一个主条带，说明在藻株Dof4-3-2的基因组里面只插入了一个拷贝的GmDof4基因。

实施例四、小球藻的生长曲线

实施例三中分子检测为阳性藻株的后代dof4-1-2和dof4-3-2，以及对照载体转化藻株CK-1-1，参照文献^[2]在15mg/L G418液体培养基中扩大培养，同时野生藻(WT)在不含抗生素的液体培养基中扩大培养。使用50mL三角瓶培养4-6天后，按干重约0.2g/L的起始浓度在150mL新培养基中扩大培养，每天同一时间取样测定生物量，连续8天记录，测定结果见表1。

依据测定结果，制作转基因藻和野生藻的生长曲线，见图8。

在图8中可以发现小球藻从第6天开始进入平台期(生长量达到动态平衡)，到第8天藻的生物量开始下降。使用SPSS软件(IBM公司)对测定的藻生物量分别进行Student-Newman-Keuls检验。检验结果表明转基因藻和对照(野生藻及对照载体转化藻株CK-1-1)的生物量没有显著性差异(P＞0.05)。

实施例五、GmDof4基因提高小球藻不同脂肪酸含量的GC-MS分析

实施例三中分子检测为阳性的藻株，参照文献^[2]在30mg/L G418固体培养基上连续划板、点板进行纯化，在15mg/L G418液体培养基中扩大培养。使用50mL三角瓶培养4-6天后，按干重0.1g/L的起始浓度在150mL新培养基扩大培养，7天后离心收集藻细胞使用GC-MS测定各脂肪酸组分含量变化。

1.脂肪酸的提取

离心收集生长达到平台期的小球藻(OD540＝16)，用去离子水洗涤，-80℃冷冻干燥，冻干后在85℃烘箱过夜烘干，在研钵中研磨成均匀的细粉。称取50mg小球藻粉，加入80μL的十七烷酸(HeptadecanoicAcid，d17:0，购自Sigma公司，溶于甲醇浓度100μM/mL)作为脂肪酸含量测定的内参。5mL 5％KOH-CH₃OH，70℃水浴5h后加入HCl酸化至其pH值达2.0。再加入4mL 14％BF₃-CH₃OH(购自Aldtich公司)溶液，70℃水浴1.5h。加入2mL 0.9％NaCl溶液，混匀后静止片刻。加入2mL氯仿∶正己烷(V/V 1∶4)抽提，吸取抽提液，N₂吹干。最后溶于150μL乙酸乙酯。

2.终产物GC-MS检测分析实验

所用GC-/MS仪为TurboMass(PerkinElmer公司)，柱子：BPX-70，30m×0.25mm×0.25vm，柱温120℃，气化室温度230℃。取1μL终产物上样，分流比10∶1。

3.GC-MS结果分析

分析结果表明，在获得的T1代藻落中Dof4-1藻株的C18:1(亚油酸，LA)和C18:2(α-亚麻酸，ALA)分别比对照提高31％和25％，Dof4-3藻株的C18:2比对照提高74％(图9)，差异显著(P＜0.01)。

这两个藻株的T2代C18:1均比对照提高80％以上，Dof4-1-2的C18:2比对照提高45％以上，Dof4-3-2的18:2提高70.37％，该藻株在纯化二代中不饱和脂肪酸含量均高于对照(图10)，差异显著(P＜0.01)。

实施例六、GmDof4基因提高小球藻总油脂含量的分析

本实验使用藻株及培养方法同上实施例五，总油脂含量分析方法为索氏抽提法参见文献^[12]。索氏提取器是由提取瓶、提取管、冷凝器三部分组成的，提取管两侧分别有虹吸管和连接管。提取时，将待测样品包在脱脂滤纸包内，放入提取管内。提取瓶内加入石油醚，加热提取瓶，石油醚气化，由连接管上升进入冷凝器，凝成液体滴入提取管内，浸提样品中的脂类物质。待提取管内石油醚液面达到一定高度，溶有粗脂肪的石油醚经虹吸管流入提取瓶。流入提取瓶内的石油醚继续被加热气化、上升、冷凝，滴入提取管内，如此循环往复，使固体物质不断为纯的溶剂所苹取、将萃取出的物质富集在烧瓶中。

首先将收集的藻离心，置于玻璃平皿中90℃-110℃过夜烘干，加入液氮研磨成均匀的粉末。使用低沸点有机溶剂(乙醚)将藻粉末浸润而将油脂浸出来，烘干称重计算油脂含量。离心收集生长达到平台期的小球藻(OD540＝16)，用去离子水洗涤，-80℃冷冻干燥，冻干后在85℃烘箱过夜烘干，在研钵中研磨成均匀的细粉。称取0.5g小球藻粉，使用索氏提取器(货号：ST-80，购自北京赛福莱博科技有限公司)检测藻株油脂总含量。附表统计显示转基因藻株均比对照有较大提高。其中T1代转GmDof4藻株中，Dof4-1藻株比对照提高21.64％，Dof4-3藻株比对照提高27.86％(表2)，差异显著(P＜0.01)。T2代转GmDof4藻株Dof4-1-2比对照提高28.49％，藻株Dof4-3-2油脂含量比对照提高38.12％(表3)，差异显著(P＜0.01)。

表1转基因藻和对照组生长量测定

注：单位为g/L

表2转Dof4 T1藻株含油量测定

表3转Dof4 T2藻株含油量测定

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Claims (8)

1.GmDof4基因在提高小球藻中总油脂、亚油酸或α-亚麻酸的含量的应用。

2.提高小球藻中总油脂、亚油酸或α-亚麻酸的含量的方法，其特征在于将GmDof4基因转化到小球藻中。

3.权利要求1的应用或权利要求2的方法，其中所述GmDof4基因来自大豆(Glycine max)。

4.权利要求1的应用或权利要求2的方法，其中所述GmDof4基因的序列为SEQ ID NO：1所示的序列，其编码的蛋白序列为SEQ ID NO：2所示的序列。

5.权利要求1的应用或权利要求2的方法，其中所述GmDof4基因包含在植物表达载体中。

6.权利要求5的应用或方法，其中所述表达载体选自植物表达载体pBIN19、pBI121、pBI221，pCambia 1300，pGreen。优选地为pGreen0029。

7.权利要求6的应用或方法，其中所述载体包含启动子，所述启动子选自花椰菜花叶病毒启动子CaMV 35S、Ubiqutin启动子、或Actin启动子。

8.权利要求1的应用或权利要求2的方法，其中所述小球藻选自椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)。

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