CN114480130A - 一株富含油脂的链带藻及其培养应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株富含油脂的链带藻及其培养应用，该藻株为链带藻HCS‑BY1，其分类命名为链带藻（Desmodesmus abundans），已于2020年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19982。本发明提供的链带藻固氮效率高，所获取生物质中富含油脂；特别是同时具备耐受NOx和SOx的功能。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和生物能源领域，具体涉及一种富含油脂的链带藻及其培养应用。
背景技术
进入21世纪以来，经济的发展与能源的消耗存在着密切的关系，能源安全问题是各国战略性的问题，寻找一种清洁、经济、高效、可再生的新能源成为了当前急需解决的问题。其中生物能源一直作为一个重要储备技术方向，各个国家都对此保持着兴趣。在诸多的生物质能源中，微藻是重要的可再生资源。它们具有分布广泛、生物量大、光合作用效率高、环境适应能力强、生长周期短、生物量产量高等特点。其细胞中含独特的初级或次级代谢产物，化学成分复杂。微藻的太阳能转化效率可达到3.5%，是生产药品、精细化工品和新型燃料的潜在资源，从微藻中得到的脂肪酸可转化成脂肪酸甲脂，即生物柴油。因此微藻油脂作为原料可以生产生物柴油，常被认为是第三代生物燃料的理想原料。
通过选育优良藻株、优化培养条件、改进培养工艺、设计高性能光生物反应器均可以提高微藻油脂的产量，高油脂产量是实现微藻生物柴油产业化的关键。目前，选育性能优越的藻株是开展产油微藻生理研究和产业化培养的基础。
但是在实际应用中，当环境中CO2体积分数大于5v%时，大部分微藻的生长将受到抑制，影响固碳效率；而且采用化石燃料废气中往往含有高浓度的SOx、NOx等气体，也会抑制微藻生长和降低固碳效率。
CN201110427579.6 公开了一株栅藻藻株(Desmodesmus sp.) ENN2203A，该栅藻藻株具有耐高温、易收集的特点，环境适应性强，适于高密度养殖，可用于含氮磷污水的污处理，可用于二氧化碳减排，用于生物柴油生产或用于水产品饵料或动物饲料等。该藻株在培养过程中，通过向培养液中通入1.5-2%的二氧化碳和空气的混合气体，培养进行到第16天，最终干重达到10.93g/L。但是，该藻株耐受CO2浓度较低，而且不具备NOx耐受性。
CN106467897A公开了一种富含油脂的栅藻及其培养应用，该藻株为MH-04，其分类命名为栅藻（Desmodesmus sp.），已于2015年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.10764。该栅藻能够耐受高浓度的CO2和SO2，可利用含CO2和SO2的废气或烟气进行光照自养生长获取生物质，固碳效率高，所获取的生物质中富含油脂，能够进行生物柴油的生产。
上述专利公开的微藻是针对耐高温、耐受SO2等性能选育的微藻，用于其它方面时效果并不理想，因此还需选育具备更过其他功能的微藻，或者选育具备多功能的微藻，以使其更适于工业应用。因此需要开发性能更好，更适于工业应用的藻种。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种富含油脂的链带藻及其培养应用。本发明提供的链带藻固氮效率高，所获取生物质中富含油脂；特别是同时具备耐受NOx和SOx的功能。
本发明提供的富含油脂的链带藻HCS-BY1，其分类命名为链带藻（Desmodesmus abundans），已于2020年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 19982。
本发明提供的链带藻HCS-BY1在显微镜下藻细胞呈绿色，常聚集成群，单个细胞呈卵形，细胞壁平滑，内有色素体，每个细胞含有一个蛋白核，单个细胞长约5-6μm，宽约2-3μm。
本发明提供的链带藻HCS-BY1能够耐受CO2的浓度可达40v%。
本发明提供的链带藻HCS-BY1能够耐受NOx的浓度可达0.07v%，耐受SO2的浓度可达0.05v%。
本发明提供的链带藻HCS-BY1的18S rDNA基因测序分析结果见序列表。根据序列比对，链带藻HCS-BY1与已公布的链带藻藻株的18SrDNA数据存在差异。
本发明提供的链带藻HCS-BY1的培养方法，在光生物反应器中，利用淡水培养基培养，具体如BG11培养基、SE培养基或D1培养基等，通入CO2含量为1.0v%-40v%的气体培养。进一步的，通入气体中同时含有NOx和SO2，NOx的浓度可达0.07v%，SO2的浓度达0.05v%。培养条件为：光照强度1500-20000Lux，pH值为6-11，温度为15-35℃，光照周期为24h，光暗时间比为14:10。培养结束，收获微藻细胞。经检测，藻细胞干重达到8g/L以上，细胞总脂含量占细胞干重的45%以上。
本发明的链带藻HCS-BY1在固定CO2中的应用。该藻株能够利用CO2进行光照自养生长，耐受CO2的浓度达40v%，具有较高的CO2固定效率。
本发明的链带藻HCS-BY1在生产微藻油脂中的应用。该藻株在适宜的生长条件下进行光照自养生长获取富含油脂的藻细胞，藻细胞干重达8g/L以上，细胞总脂含量可占细胞干重的45%以上。
本发明的链带藻HCS-BY1在净化含CO2、NOx和SO2废气或烟气中的应用。废气或烟气中CO2浓度≤40v%，NOx的浓度≤0.07v%，SO2的浓度≤0.05v%。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明选育的富含油脂的链带藻HCS-BY1能够耐受高浓度的CO2，可以利用CO2进行自养生长，固碳效率高，缓解目前工业社会带来的温室效应问题。
（2）该藻株同时具备耐受NOx和SOx的功能。在废气中同时存在CO2、NOx和SOx时，能够避免微藻利用废气生长时其中污染物对微藻光合作用的抑制，维持微藻的正常生长。
（3）该藻株的生长速率快，生长周期短，最终生物量较高，藻细胞干重达8g/L以上，细胞总脂含量占细胞干重的45%以上，适于生产生物柴油。
生物材料保藏说明
本发明提供的链带藻HCS-BY1（Desmodesmus abundans），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号：CGMCC No. 19982；保藏日期：2020年5月12日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均从常规生化试剂商店购买得到。本发明中，v%为体积分数。
实施例1 分离和驯化筛选获得链带藻HCS-BY1
（1）出发藻株的获得：2016年10月从吉林省珲春市珲春河取回水样150mL，将水样用纱布过滤，除去大的杂质，取过滤后的水样50ml接种到200mL的BG11培养基中进行富集培养，培养的光照强度为5000Lux，温度为25℃，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，培养约半个月后，培养基呈现绿色。将富集培养的水样稀释至10-5倍，在无菌条件下涂布到BG11固体平板上培养，培养的光照强度为5000Lux，温度为25℃，培养约10天后平板上出现绿色的单藻落，挑取单藻落在摇瓶上培养，培养温度为25℃，光照强度为5000Lux，培养8天后，显微镜观察确定是否为纯藻种，若不是纯种，重复上述步骤，直到确定为纯培养藻株为止。经过反复培养，获得纯藻株编号为HCS-B1。
（2）CO2的驯化培养：将步骤（1）中的摇瓶培养的纯藻种接入微藻通气培养装置中进行驯化培养，光照强度为5000Lux，温度为25℃，通入的气体中CO2的含量从5v%逐级提高至40v%，每次提高5v%，培养8天后结束，反复驯化培养3次。
（3）将步骤（2）中驯化培养的藻液采用平板划线的方式培养获得纯藻种，培养步骤同（1）。
（4）NOx和SO2的驯化培养：将步骤（3）藻株的对数生长期的藻液通入CO2含量为20v%的混合气，光照强度为5000Lux，温度为25℃，混合气中注入NO、SO2气体对藻种进行NOx的耐受性培养，培养过程中混合气中NO的含量从0.01%逐级提高到0.08%，培养过程中每天提高0.01%；SO2的含量从0.005%逐级提高到0.04%，培养过程中每天提高0.005%，培养结束后，反复驯化培养3次，收获耐受NOx和SO2的藻液。
（5）将步骤（4）驯化得到的藻液采用平板划线的方式获得纯藻落，培养步骤同（1），培养结束后，挑选较大的藻落进行摇瓶培养，获得目的藻株命名为HCS-BY1。
实施例2 藻株的鉴定
将获得HCS-BY1藻细胞的DNA的提取采用CTAB法，并采用18S rDNA基因克隆，将得到的3个阳性克隆送至上海生工公司测序。18S rDNA基因测序分析结果见序列表。将18S rDNA序列登录到Genbank数据库进行Blast比对，结果显示与Desmodesmus abundans有最大的相似性，其BLASTn值为2517，Max index值为98.9%，可以确定HCS-BY1为链带藻（Desmodesmus abundans）。
实施例3链带藻HCS-BY1的应用
将对数生长期的HCS-BY1的藻液接种在BG11培养基中进行培养，BG11培养基的配方见表1和表2，培养在光生物反应器中进行，接种后培养液的OD690为0.22。从反应器底部通入CO2含量为40v%的烟气，其中NO含量0.07v%，SO2含量为0.05v%。培养过程中光照强度为8000Lux，培养温度为28℃，pH值控制在7-8，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，培养时间为8天处于稳定期。结束培养，离心收集藻液，在-60℃条件下真空冷冻干燥至恒重后测量藻粉干重，计算生物质产量，并采用正己烷：乙酸乙酯法测得总脂含量。经检测，HCS-BY1藻株的生物质产量为8.39g/L，细胞总脂含量占细胞干重的49.79%。
表1 BG11培养基
*表2表1中A5+Co solution的组成
实施例4 HCS-BY1和HCS-B1的培养效果比较
将对数生长期的HCS-BY1和HCS-B1的藻液分别接种在BG11培养基进行培养，培养在光生物反应器中进行，接种后的培养液的OD690为0.22。根据试验需要，组配不同含量的CO2、NO和SO2混合气，然后从反应器底部通入。培养过程中光照强度为8000Lux，温度为28℃，pH值控制在7-8之间，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，培养时间为8天，培养结束后收集藻细胞，测定细胞干重，并用正己烷：乙酸乙酯法测得细胞总脂含量。结果如表3。
表3 HCS-BY1和HCS-B1培养结果对比
从表3可以看出，本发明筛选的HCS-BY1比初始藻株HCS-Y1对CO2、NO和SO2有更好的耐受性。在NO和SO2存在下，该藻株与初始藻株相比，对NO的脱除率提升至40%以上，但对SO2二者均没有脱除效果。
比较例1
同实施例3，不同在于采用CN106467897A公开的栅藻MH-04（Desmodesmus sp.），保藏编号为CGMCCNo.10764，培养8天结束。经检测，栅藻MH-04藻株的生物质产量为4.63g/L，细胞总脂含量占细胞干重的20.73%。
序列表
<110> 中国石油化工股份有限公司
中国石油化工股份有限公司大连石油化工研究院
<120> 一株富含油脂的链带藻及其培养应用
<130> 新专利申请
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1423
<212> DNA
<213> 链带藻HCS-BY1(Desmodesmus abundans)
<400> 1
gtagtcatat gcttgtctca aagattaagc catgcatgtc taagtataaa ctgcttatac 60
tgtgaaactg cgaatggctc attaaatcag ttatagttta tttggtggta ccttcttact 120
cggaataacc gtaagaaaat tagagctaat acgtgcgtaa atcccgactt ctggaaggga 180
cgtatatatt agataaaagg ccgaccggac tttgtccgac ccgcggtgaa tcatgatatc 240
ttcacgaagc gcatggcctt gtgccggcgc tgttccattc aaatttctgc cctatcaact 300
ttcgatggta ggatgatctg tagccatggt ggtaacgggt gacggaggat tagggttcga 360
ttccggagag ggagcctgag aaacggctac cacatccaag gaaggcagca ggcgcgcaaa 420
ttacccaatc ctgatacggg gaggtagtga caataaataa caataccggg cattttatgt 480
ctggtaattg gaatgagtac aatctaaatc ccttaacgag gatccattgg agggcaagtc 540
tggtgccagc agccgcggta attccagctc caatagcgta tatttaagtt gttgcagtta 600
aaaagctcgt agttggattt cgggtgggtt tcagcggtcc gcctatggtg agcactgctg 660
tggccttcct tactgtcggg gacctgcttc tgggcttcat tgtccgggac agggattcgg 720
catggttact ttgagtaaat tagagtgttc aaagcaggct tacgccgtga atactttagc 780
atggaataac acgataggac tctgccctat tctgttggcc tgtaggagtg gagtaatgat 840
taagaggaac agtcgggggc attcgtattt cattgtcaga ggtgaaattc ttggatttat 900
gaaagacgaa ctactgcgaa agcatttgcc aaggatgttt tcattaatca agaacgaaag 960
ttgggggctc gaagacgatt agataccgtc gtagtctcaa ccataaacga tgccgactag 1020
ggattggcgg acgtttttgc atgactccgt cagcaccttg agagaaatca aagtttttgg 1080
gtttcggggg gagtatggtc gcaaggctga aacttaaagg aattgacgga atttcaccac 1140
caggcgtgga gccgacggct taatttgact caacacggga aaacttacgg ttcacagaca 1200
taggaaggat tgacagattg agagctcttt cttgattcta tgggtggtgg tgcatggccg 1260
ttcttagttg gtgggttgtc ttgtcaggtt gattccggta acgaacgaga cctcagcctt 1320
taaatagtca cagtcgcttt ttgcgggtgg tttgacttct tagagggaca gttggcgttt 1380
agtcaacgga agtatgaggc aataacaggt ctagttagtc tcc 1423
Claims (12)
1.一株富含油脂的链带藻，该藻株为链带藻HCS-BY1，其分类命名为链带藻（Desmodesmus abundans），已于2020年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 19982。
2.根据权利要求1所述的链带藻，其特征在于：该藻株在显微镜下藻细胞呈绿色，常聚集成群，单个细胞呈卵形，细胞壁平滑，内有色素体，每个细胞含有一个蛋白核，单个细胞长约5-6μm，宽约2-3μm。
3.根据权利要求1所述的链带藻，其特征在于：该藻株能够耐受CO2的浓度达40v%，能够耐受NOx的浓度达0.07v%，耐受SO2的浓度达0.05v%。
4.一种权利要求1所述的链带藻的培养方法，其特征在于：在光生物反应器中，利用BG11培养基、SE培养基或D1培养基，通入CO2含量为1.0v%-40v%的气体培养。
5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于：通入气体中同时含有NOx和SO2，NOx的浓度达0.07v%，SO2的浓度达0.05v%。
6.根据权利要求4或5所述的培养方法，其特征在于：培养条件为：光照强度1500-20000Lux，pH值为6-11，温度为15-35℃，光照周期为24h，光暗时间比为14:10。
7.权利要求1所述的链带藻HCS-BY1在固定CO2中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：该藻株耐受CO2的浓度达40v%，固碳效率高。
9.权利要求1所述的链带藻HCS-BY1在生产微藻油脂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：该藻株在适宜的生长条件下进行光照自养生长获取富含油脂的藻细胞，藻细胞干重达8g/L以上，细胞总脂含量占细胞干重的45%以上。
11.权利要求1所述的链带藻HCS-BY1在净化含CO2、NOx和SO2废气或烟气中的应用。
12.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：废气或烟气中CO2浓度≤40v%，NOx的浓度≤0.07v%，SO2的浓度≤0.05v%。
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