CN112795485A - 一种提高微藻油脂含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高微藻油脂含量的方法，是在光生物反应器中加入微藻培养基和栅藻HY‑D3种子液，并通入CO2；同时在培养体系中加入凯氏拟小球藻FSH‑Y3进行微藻培养。本发明方法提高了微藻培养体系对高浓度CO2的固碳效率，微藻油脂的收获量明显提高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和生物能源领域，具体涉及一种提高微藻油脂含量的方法。
背景技术
在诸多的生物质能源中，微藻是重要的可再生资源。它们具有分布广泛、生物量大、光合作用效率高、环境适应能力强、生长周期短、生物量产量高等特点。其细胞中含独特的初级或次级代谢产物，化学成分复杂。微藻的太阳能转化效率可达到3.5%，是生产药品、精细化工品和新型燃料的潜在资源，从微藻中得到的脂肪酸可转化成脂肪酸甲脂，即生物柴油。因此利用微藻油脂作为原料生产的生物柴油是目前最有可能满足世界运输所需燃料的可再生能源。
随着世界经济的发展，大量的化石能源的使用和消耗，导致能源的短缺和环境的日益恶化，特别是CO2的急剧增加引起的温室效应越来越严重。微藻的生长周期短、光合效率高，CO2固定效率高，一定条件下可达陆生植物的10倍以上，不仅可以减少CO2排放，同时也降低了培养成本；除CO2外，废气中的一些SOx、NOx等成分也随着微藻的代谢被净化处理，有效减少有害气体排放。
CN20110144545.6公开了一株栅藻（Scenedemus sp.）藻株，该藻株的生长可利用人工培养基或经适当处理的废水生长，其特点是油脂产率高于目前大多数分藻株，该藻株应用领域包括CO2的固定，废水的净化，油脂、蛋白质、色素、淀粉、多糖、核酸的生产。
CN107177505A公开了一株栅藻（Scenedesmus sp.）HCS-02，能够耐受较低的培养温度，培养温度区间大，易于开放式养殖。在不同培养条件下均呈现较快的生物质积累速度，所获取的生物质中富含淀粉、油脂，能够处理后用作饲料或进行生物柴油的生产。但该微藻不耐受SO2，如果通入气体中含SO2，会抑制微藻生长和降低固碳效率。
在实际应用中，当环境中CO2体积分数大于5v%时，大部分微藻的生长将受到抑制，固碳效率低；同时一般微藻在中性条件下适宜生长，在偏酸性或者偏碱性的条件下不利于微藻的生长，而微藻利用CO2一般是以溶解在水中的HCO3 -离子形式存在的，二氧化碳在中性环境下溶解度低，不利于藻类吸收利用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种提高微藻油脂含量的方法。本发明方法提高了微藻培养体系对高浓度CO2的固碳效率，微藻油脂的收获量明显提高。
本发明提供的提高微藻油脂含量的方法，包括如下内容：在光生物反应器中加入微藻培养基和栅藻（Scenedesmus acutus）HY-D3种子液，并通入CO2气体；同时在培养体系中加入凯氏拟小球藻（Parachlorella kessleri）FSH-Y3进行微藻培养。其中栅藻HY-D3的保藏编号为CGMCC No. 15298；凯氏拟小球藻FSH-Y3的保藏编号为CGMCC No. 9238。
本发明中，所述的栅藻（Scenedesmus acutus）HY-D3已经于2018年2月5日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No. 15298，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明中，所述的微藻培养基采用本领域技术人员熟知的BG11、SE、BBM等培养微藻的液体培养基。
本发明中，所述的栅藻HY-D3种子液的制备方法为：将栅藻HY-D3接种至微藻培养基，在pH值7～9，温度为20～30℃，光照周期24h，光暗时间比为14:10，光照强度为2000～20000Lux条件下，振荡培养至对数生长期，制得栅藻HY-D3种子液。
本发明中，所述的光生物反应器中加入的栅藻HY-D3种子液与微藻培养基的体积比为1:20～1:5。
本发明中，通入CO2气体，CO体积含量为5%～45%，优选为10%～30%。所述CO2气体可以是含SO2和CO2的废气或烟气，其中SO2体积含量不高于0.06%。
本发明中，所述的凯氏拟小球藻（Parachlorella kessleri）FSH-Y3已经于2014年5月26日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.9238，在CN106467896A中已申请公开，并提交了保藏及存活证明。
本发明中，所述的凯氏拟小球藻（Parachlorella kessleri）FSH-Y3种子液的制备方法为：将微藻培养基的pH调节为10～12，在温度为20～30℃，光照周期24h，光暗时间比为14:10，光照强度为2000～10000Lux条件下，振荡培养至对数生长期，制得凯氏拟小球藻FSH-Y3种子液。
本发明中，凯氏拟小球藻FSH-Y3种子液的加入量按照FSH-Y3种子液与微藻培养基的体积比为1:40～1:20加入。优选的，每隔24～72h向光生物反应器中分批次加入FSH-Y3种子液，每次加入量按照总加入量取平均值。
本发明中，控制整个微藻培养体系的温度为20～35℃，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，光照强度为2000～20000Lux。培养至生长稳定期结束，通过离心、沉降等方式收获微藻细胞，测定细胞干重和油脂含量，细胞干重可达到10g/L以上，油脂含量可达到细胞干重的45%以上。
与现有技术相比，本发明可以带来以下有益效果：
（1）本发明在栅藻HY-D3培养过程中加入凯氏拟小球藻FSH-Y3，两种藻的混合培养能够增加培养体系中CO2的溶解度，提高微藻对高浓度CO2的耐受性和固碳效率，微藻油脂的收获量明显提高。
（2）在栅藻HY-D3培养过程中，随着培养的进行pH呈升高趋势，栅藻HY-D3的耐受能力不稳定，在此条件下通过加入凯氏拟小球藻FSH-Y3种子液，有助于促进栅藻HY-D3耐力提升，藻细胞中油脂可以稳定积累，最终提高油脂产量。
（3）本发明栅藻HY-D3能耐受高浓度SO2，避免了微藻利用废气生长时高浓度SO2对微藻光合作用的抑制。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均从常规生化试剂商店购买得到。
本发明中，wt%为质量含量。气体脱除率=（反应器进口的气体浓度-反应器出口气体浓度）/反应器进口气体浓度×100%。
本发明所述栅藻HY-D3是发明人分离筛选出的新菌种，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No. 15298；保藏日期：2018年2月5日。栅藻HY-D3能够耐受高浓度的SO2，可以利用废气中的CO2进行自养生长，固定CO2，缓解目前工业社会带来的温室效应问题。在显微镜下藻细胞呈绿色，常聚集成群，群体常见的为4～8个细胞的组成，群体细胞排列成一直线。单个细胞为长圆形、卵形，单个细胞呈卵形，细胞壁平滑，内有色素体，每个细胞含有一个蛋白核，单个细胞长约3～6μm，宽约2～3μm。群体两侧细胞的上下两端，各具1长或直或略弯曲的剌，中间部分细胞的两端及两侧细胞的侧面游离部上，均无棘剌。4细胞的群体宽10～24微米，剌长10～13微米。
本发明微藻种子液的制备过程如下：微藻培养采用BG11培养基，培养基配方如表1和表2所示。
表1 BG11培养基
*表2 表1中A5+Co solution的组成
首先按照表1和表2制备BG11液体培养基，将培养凯氏拟小球藻FSH-Y3的培养基的pH调节为10，将培养栅藻HY-D3的培养基的pH调节为8.0，然后将凯氏拟小球藻FSH-Y3、栅藻HY-D3分别接种于上述培养基中。在恒温光照摇床中培养，培养温度为25℃，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，光照强度为5000Lux，120rpm振荡培养至对数生长期，获得凯氏拟小球藻FSH-Y3种子液、栅藻HY-D3种子液，将上述种子液在15℃弱光下保存备用。
实施例1
在20L光生物反应器中加入8L BG11微藻培养基和400mL栅藻HY-D3种子液，并通入CO2体积含量为5%-45%的气体；同时一次性加入300mL的凯氏拟小球藻FSH-Y3种子液。控制整个过程中微藻培养体系的温度为25℃，光照强度为10000Lux，光照周期为24h，光暗时间比为14:10。培养7天后结束培养，离心收集藻液，在-60℃条件下真空冷冻干燥至恒重后测量藻粉干重，计算生物质产量，并采用正己烷:乙酸乙酯法测得总脂含量。所得结果如表3所示。
表3 微藻培养结果
实施例2
在20L光生物反应器中加入8L BG11微藻培养基和400mL栅藻HY-D3种子液，并通入CO2体积含量为5%-45%的气体；随着培养的进行，每隔24h加入50mL的凯氏拟小球藻FSH-Y3种子液。控制整个过程中微藻培养体系的温度为25℃，光照强度为10000Lux，光照周期为24h，光暗时间比为14:10。培养7天后结束培养，离心收集藻液，在-60℃条件下真空冷冻干燥至恒重后测量藻粉干重，计算生物质产量，并采用正己烷:乙酸乙酯法测得总脂含量。所得结果如表4所示。
表4 微藻培养结果
实施例3
在20L光生物反应器中加入8L BG11微藻培养基和栅藻400mL HY-D3种子液，并通入CO2体积含量为5%-45%的气体；随着培养的进行，每隔48h加入100mL的凯氏拟小球藻FSH-Y3种子液。控制整个过程中微藻培养体系的温度为25℃，光照强度为10000Lux，光照周期为24h，光暗时间比为14:10。培养7天后结束培养，离心收集藻液，在-60℃条件下真空冷冻干燥至恒重后测量藻粉干重，计算生物质产量，并采用正己烷:乙酸乙酯法测得总脂含量。所得的结果如表5所示。
表5 微藻培养结果
实施例4
在20L光生物反应器中加入8L BG11微藻培养基和400mL栅藻HY-D3种子液，并通入CO2体积含量为5%-45%的烟气，烟气中SO2体积含量为0.03%；同时一次性加入300mL的凯氏拟小球藻FSH-Y3种子液。控制整个过程中微藻培养体系的温度为25℃，光照强度为10000Lux，光照周期为24h，光暗时间比为14:10。培养7天后结束培养，离心收集藻液，在-60℃条件下真空冷冻干燥至恒重后测量藻粉干重，计算生物质产量，并采用正己烷:乙酸乙酯法测得总脂含量。所得结果如表6所示。
表6 微藻培养结果
实施例5
在20L光生物反应器中加入8L BG11微藻培养基和800mL栅藻HY-D3种子液，并通入CO2体积含量为5%-45%的烟气，烟气中SO2体积含量为0.03%。随着培养的进行，每隔48h加入100mL的凯氏拟小球藻FSH-Y3种子液。控制整个过程中微藻培养体系的温度为25℃，光照强度为10000Lux，光照周期为24h，光暗时间比为14:10。培养7天后结束培养，离心收集藻液，在-60℃条件下真空冷冻干燥至恒重后测量藻粉干重，计算生物质产量，并采用正己烷:乙酸乙酯法测得总脂含量。所得的结果如表7所示。
表7 微藻培养结果
比较例1
在20L光生物反应器中加入8L BG11微藻培养基和400mL凯氏拟小球藻FSH-Y3种子液，并通入CO2体积含量为5%-45%的气体，培养7天后结束。经检测，生物量为2.8-3.3g/L，油脂含量为30.3%-32.7%。
比较例2
在20L光生物反应器中加入8L BG11微藻培养基和800mL凯氏拟小球藻FSH-Y3种子液，并通入CO2体积含量为5%-45%的烟气，烟气中SO2体积含量为0.03%。由于凯氏拟小球藻FSH-Y3不能耐受烟气中SO2，微藻不能正常生长，生物量低于1.0g/L，SO2去除率低于10%。
比较例3
培养过程同实施例2，不同在于：采用栅藻HCS-02种子液代替栅藻HY-D3种子液，培养7天后结束。经检测，生物量为1.5-4.1g/L，油脂含量为30.1%-35.7%，并无提高效果。
比较例4
培养过程同实施例4，不同在于：采用栅藻HCS-02种子液代替栅藻HY-D3种子液，培养7天后结束。经检测，由于栅藻HCS-02不能耐受SO2，微藻不能正常生长，生物量低于0.5g/L，SO2去除率低于10%。
比较例5
培养过程同实施例5，不同在于：采用栅藻MH-04种子液代替栅藻HY-D3种子液，培养7天后结束。经检测，生物量为3.9-4.9g/L，油脂含量为35.5%-40.1%，SO2去除率低于60%。
Claims (11)
1.一种提高微藻油脂含量的方法，其特征在于包括如下内容：在光生物反应器中加入微藻培养基和栅藻（Scenedesmus acutus）HY-D3种子液，并通入CO2气体；同时在培养体系中加入凯氏拟小球藻（Parachlorella kessleri）FSH-Y3进行微藻培养；其中栅藻HY-D3的保藏编号为CGMCC No. 15298；凯氏拟小球藻FSH-Y3的保藏编号为CGMCC No. 9238。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的微藻培养基采用BG11、SE、BBM培养微藻的液体培养基。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的栅藻HY-D3种子液的制备方法为：将栅藻HY-D3接种至微藻培养基，在pH值7～9，温度为20～30℃，光照周期24h，光暗时间比为14:10，光照强度为2000～20000Lux条件下，振荡培养至对数生长期，制得栅藻HY-D3种子液。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于：所述的光生物反应器中加入的栅藻HY-D3种子液与微藻培养基的体积比为1:20～1:5。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：通入CO2气体中，CO2体积含量为5%～45%，优选为10%～30%。
6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于：所述CO2气体是含SO2和CO2的废气或烟气，其中SO2体积含量不高于0.06%。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的凯氏拟小球藻FSH-Y3种子液的制备方法为：将微藻培养基的pH调节为10～12，在温度为20～30℃，光照周期24h，光暗时间比为14:10，光照强度为2000～10000Lux条件下，振荡培养至对数生长期，制得凯氏拟小球藻FSH-Y3种子液。
8.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于：凯氏拟小球藻FSH-Y3种子液的加入量按照种子液与微藻培养基的体积比为1:40～1:20加入。
9.根据权利要求1、7或8所述的方法，其特征在于：每隔24～72h向光生物反应器中分批次加入FSH-Y3种子液，每次加入量按照总加入量取平均值。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：控制整个微藻培养体系的温度为10～30℃，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，光照强度为2000～20000Lux。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：培养至生长稳定期结束，通过离心或沉降方式收获微藻细胞。
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