CN117887582A - 一株油球藻及其培养应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株富含油脂的油球藻（Graesiella emersonii）SZLSi‑3，已于2021年04月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22392。本发明提供的油球藻利用CO2生长，能够获得富含油脂的生物质，同时具备耐低温和耐受NOx性能。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和生物能源领域，具体涉及一种富含油脂的油球藻的及其培养应用。
背景技术
进入21世纪以来，经济的发展与能源的消耗存在着密切的关系，能源安全问题是各国战略性的问题，寻找一种清洁、经济、高效、可再生的新能源成为了当前急需解决的问题，其中生物能源一直作为一个重要储备技术方向，各个国家都对此保持着兴趣。在诸多的生物质能源中，微藻具有光合作用效率高、生长速率快、生物质产量高、环境适应能力强等优点，有综合利用价值，且不与粮争地，不与人争粮，从微藻中得到的脂肪酸可转化成脂肪酸甲脂，即生物柴油，因此富含油脂的微藻常被认为是第三代生物燃料的理想原料。
微藻细胞在生长过程中积累油脂、淀粉、蛋白、色素等成分，某些藻类中淀粉和糖原含量占细胞干重的30%，也有一些藻类在特定培养条件下油脂含量可高达80%。微藻的太阳能转化效率可达到3.5%，是生产药品、精细化工品的潜在资源，如何有效的筛选获得具有高油脂含量、环境适应能力强、可规模化培养且成本较低的新藻种，便成了各国工作者研究的重点。
CN105543099A公开了一株油球藻（Graesiella sp.）WBG-1的分离筛选方法和应用。该藻株生长快、对pH变化适应性强，还具有细胞大、易沉降、抵抗原生动物吞食等适合进行大规模培养的特性。所述油球藻（Graesiella sp.）WBG-1在低氮培养条件下细胞中积累大量油脂，可以作为微藻生物柴油原料，在高氮培养条件下细胞中积累大量蛋白质，可用于微藻蛋白质的生产，在较高pH条件下培养，能够高效率地固定外源二氧化碳，可以应用于烟道气二氧化碳的生物固定。该藻株在不同的培养条件下能够积累油脂、蛋白质，同时在较高的pH能够有效的固定二氧化碳。该藻株是在自然光照和温度条件下培养，日平均气温21.8～30.5℃，在寒冷天气效果不佳甚至会死亡；而且当烟气中含有NOx等有毒有害物质时，采用烟气培养效果下降甚至会导致藻细胞死亡。
温度对微藻的生长和繁殖的影响比较大，通常微藻的最适宜生存温度是15-35℃，温度过低会导致微藻生长缓慢甚至停止生长，而且在冬天寒冷的天气下，微藻生长需要耗能比较多。因此，选育耐低温、耐高pH、耐NOx、耐SOx等的多功能性微藻，使其更适于工业应用将具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一株富含油脂的油球藻及其培养应用。本发明提供的油球藻利用CO2生长，能够获得富含油脂的生物质，同时具备耐低温和耐受NOx性能。
本发明提供了一株富含油脂的油球藻（Graesiella emersonii）SZLSi-3，已于2021年04月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 22392。
本发明提供的油球藻SZLSi-3在显微镜下藻细胞为绿色，细胞为球形或椭球型，细胞直径为6-8μm，细胞内有色素，细胞表面无鞭毛。
本发明提供的油球藻SZLSi-3能够耐受的CO2浓度可达40v%，能够耐受的NOx的浓度可达0.09v%，能够耐受的低温低至5℃。
本发明提供的油球藻SZLSi-3的18s rDNA基因测序分析结果见序列表。根据序列比对，本发明的油球藻SZLSi-3与已公布的油球藻的18s rDNA存在一定差异。
本发明还提供了一种油球藻（Graesiella emersonii）SZLSi-3的培养方法，在光生物反应器中，利用淡水培养基培养，通入CO2含量为1.0v%-40v%，优选5v%-30v%的气体。培养条件为：光照强度1500-20000Lux，pH值为6.0-8.5，温度为5-35℃，优选5-15℃，光照周期为24h，光暗时间比为14:10-10:14。培养至稳定期结束，收获微藻细胞。经检测，藻细胞干重达6.5g/L以上，细胞总脂含量占细胞干重的40%以上。
本发明培养方法中，所述的淡水培养基可以为BG11培养基、SE培养基或D1培养基等中的任意一种。
本发明培养方法中，进一步的，通入气体中同时含有NOx，NOx的浓度不高于0.09v%。
本发明的油球藻SZLSi-3在固定CO2中的应用。该藻株能利用CO2进行光照自养生长，能够耐受的CO2浓度可达40v%，具有较高的CO2固定效率，固定效率可达60%以上。
本发明的油球藻SZLSi-3在生产微藻油脂中的应用。该藻株在适宜的生长条件下进行光照自养生长获取富含油脂的藻细胞，藻细胞干重达6.5g/L以上，细胞总脂含量可占细胞干重的40%以上，能够作为生物燃料及其他油脂产品的生产原料。
本发明的油球藻SZLSi-3在净化含CO2和NOx的废气或烟气中的应用。废气或烟气中的CO2浓度≤40v%，NOx的浓度≤0.09v%。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明选育的油球藻（Graesiella emersonii）SZLSi-3，能够利用CO2在自养条件高效生长，固碳效率高，缓解目前工业社会所带来的CO2温室效应问题。
（2）油球藻（Graesiella emersonii）SZLSi-3同时具备耐低温的功能。该藻株耐低温能力强，在5-15℃下，仍能保持正常的生长速率，在冬季养殖时降低培养成本，解决了微藻生产受季节性限制的问题。
（3）油球藻（Graesiella emersonii）SZLSi-3同时具备耐受并脱除NOx的功能。在废气中同时存在CO2和NOx时，能够避免微藻利用废气生长时NOx对微藻光合作用的抑制，维持微藻的正常生长，而且能够脱除部分NO。
（4）该藻株所得产品的经济性高，经过6天培养后，藻细胞干重达6.5g/L以上，细胞总脂含量占细胞干重的40%以上，适于生产生物柴油。
生物材料保藏说明
本发明提供的油球藻（Graesiella emersonii）SZLSi-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号：CGMCC No. 22392；保藏日期：2021年04月23日；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明及其效果做进一步详细说明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均从常规生化试剂商店购买得到。本发明中，v%为体积分数。
实施例1 分离和驯化筛选获得油球藻SZLSi-3
（1）出发藻株的获得：2015年10月从抚顺市辽宁石油大学东湖取回水样150mL，将水样用纱布过滤，除去大的杂质，取过滤后的水样50mL接种到200mL的BG11培养基中进行富集培养，培养的光照强度为5000Lux，温度为15℃，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，培养约半个月后，培养基呈现绿色。将富集培养的水样稀释至10-5倍，在无菌条件下涂布到BG11固体平板上培养，培养的光照强度为5000Lux，温度为15℃，培养约10天后平板上出现绿色的单藻落，挑取单藻落在摇瓶上培养，培养温度为15℃，光照强度为5000Lux，培养8天后，显微镜观察确定是否为纯藻种，若不是纯种，重复上述步骤，直到确定为纯培养藻株为止。经过反复培养，获得纯藻株编号为SZL-3。
（2）CO2的驯化培养：将步骤（1）中摇瓶培养的纯藻种接入微藻通气培养装置中进行驯化培养，光照强度为5000Lux，温度为10℃，通入的气体中CO2的含量从5v%逐级提高至40v%，每次提高5v%，培养8天后结束，反复驯化培养3次。
（3）将步骤（2）中驯化培养的藻液采用平板划线的方式培养获得纯藻种，培养步骤同（1）。
（4）NOx的驯化培养：将步骤（3）对数生长期的藻液通入CO2含量为20v%的混合气，光照强度为5000Lux，温度为10℃，混合气中注入NO气体对藻种进行NOx的耐受性培养，培养过程中混合气中NO的含量从0.01%逐级提高到0.09%，培养过程中每天提高0.01%，培养结束后，反复驯化培养3次，收获耐受NOx藻液。
（5）将步骤（4）中驯化培养的藻液采用平板划线的方式培养获得纯藻种，培养步骤同（1）。培养结束后，挑选较大的藻落进行摇瓶培养，获得目的藻株命名为SZLSi-3。
实施例2 藻株的鉴定
将获得的微藻SZLSi-3藻细胞的DNA提取采用CTAB法，并采用18s rDNA基因克隆，将得到的3个阳性克隆送至上海生工公司测序。18s rDNA基因测序分析结果见序列表。将18s rDNA序列登录到Genbank数据库进行Blast比对，结果显示与Graesiella emersonii有最大的相似性，其BLASTn值为2375，Max index值为99.92%，可以确定SZLSi-3为油球藻（Graesiella emersonii）。
实施例3油球藻SZLSi-3的应用
将对数生长期的油球藻SZLSi-3的藻液接种在BG11培养基中进行培养，BG11培养基的配方见表1和表2，培养在光生物反应器中进行，接种后培养液的OD690为0.27。从反应器底部通入CO2含量为40v%的烟气，其中NO含量0.09%。培养过程中光照强度为8000Lux，培养温度为15℃，pH值控制在7-8，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，培养时间为6天，结束培养，离心收集藻液，在-60℃条件下真空冷冻干燥至恒重后测量藻粉干重，计算生物质产量，并采用正己烷：乙酸乙酯法测得总脂含量。经检测，SZLSi-3藻株的生物质产量为6.89g/L，细胞总脂含量占细胞干重的 42.39%。
表1 BG11培养基
*表2 表1中A5+Co solution的组成
实施例4 SZL-3和SZLSi-3的培养效果比较
将对数生长期的SZL-3和SZLSi-3的藻液分别接种在BG11培养基进行培养，培养在光生物反应器中进行，接种后的培养液的OD690为0.31。根据试验需要，组配不同含量的CO2和NO混合气，然后从反应器底部通入。培养过程中光照强度为8000Lux，温度为15℃，pH值控制在7-8，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，培养时间为7天，培养结束后收集藻细胞。在-60℃条件下真空冷冻干燥至恒重后测量藻粉干重，计算生物量，并用正己烷：乙酸乙酯法测得细胞总脂含量。结果如表3所示。
表3
从表3可以看出，随着气体中CO2含量的增加，本发明选育的SZLSi-3比初始藻株SZL-3对CO2具有更稳定的耐受性，生物量和总脂含量均较高。在NO浓度不高于0.09v%条件下，几乎不影响微藻的正常生长和油脂积累，且具有一定的NO脱除率。
实施例5 SZLSi-3和SZL-3的培养温度比较
将对数生长期的SZLSi-3和SZL-3的藻液分别接种在BG11培养基进行培养，培养在光生物反应器中进行，接种后的培养液的OD690为0.25。从反应器底部通入CO2含量为10v%的烟气，其中NO含量0.05v%。培养过程中光照强度为8000Lux，pH值控制在7-8，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，培养时间为87天。培养结束后离心收集藻细胞，在-60℃条件下真空冷冻干燥至恒重后测量藻粉干重，计算生物量，并用正己烷：乙酸乙酯法测得细胞总脂含量。结果如表4所示。
表4
从表4可以看出，本发明SZLSi-3比初始藻株SZL-3具有更好低温耐受性。
比较例1
同实施例3，不同在于采用CN107177505A公开的栅藻HCS-02（Scenedesmus sp.），保藏编号为CGMCC No. 10766，培养8天结束。经检测，生物质产量为3.1g/L，细胞总脂含量占细胞干重的 20.78%。由于该微藻不能耐受NO，因此培养效果不佳。
比较例2
同实施例3，不同在于采用CN109576158A公开的小球藻SF-B1，保藏编号为CGMCCNo. 11005，培养8天结束。经检测，生物质产量为4.5g/L，细胞总脂含量占细胞干重的21.65%。由于该微藻不耐受低温，因此培养效果不佳。
Claims (14)
1.一株富含油脂的油球藻，为油球藻（Graesiella emersonii）SZLSi-3，已于2021年04月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22392。
2.根据权利要求1所述的油球藻，其特征在于：在显微镜下藻细胞为绿色，细胞为球形或椭球型，细胞直径为6-8μm，细胞内有色素，细胞表面无鞭毛。
3.根据权利要求1所述的油球藻，其特征在于：油球藻SZLSi-3能够耐受的CO2浓度达40v%，能够耐受的NOx的浓度达0.09v%，能够耐受的低温低至5℃。
4.一种油球藻（Graesiella emersonii）SZLSi-3的培养方法，其特征在于：在光生物反应器中，利用淡水培养基培养，通入CO2含量为1.0v%-40v%，优选5v%-30v%的气体。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：培养条件为：光照强度1500-20000Lux，pH值为6.0-8.5，温度为5-35℃，优选5-15℃，光照周期为24h，光暗时间比为14:10-10:14。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：培养至稳定期结束，收获微藻细胞；经检测，藻细胞干重达6.5g/L以上，细胞总脂含量占细胞干重的40%以上。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的淡水培养基为BG11培养基、SE培养基或D1培养基中的任意一种。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：通入气体中同时含有NOx，NOx的浓度不高于0.09v%。
9.权利要求1所述的油球藻SZLSi-3在固定CO2中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：该藻株能利用CO2进行光照自养生长，能够耐受的CO2浓度达40v%，具有较高的CO2固定效率，固定效率达60%以上。
11.权利要求1所述的油球藻SZLSi-3在生产微藻油脂中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：该藻株在适宜的生长条件下进行光照自养生长获取富含油脂的藻细胞，藻细胞干重达6.5g/L以上，细胞总脂含量可占细胞干重的40%以上。
13.权利要求1所述的油球藻SZLSi-3在净化含CO2和NOx的废气或烟气中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于：废气或烟气中的CO2浓度≤40v%，NOx的浓度≤0.09v%。
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