KR101562790B1 - 미세조류 콜로니 배양용 배지 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

미세조류 콜로니 배양용 배지 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 배양 미세조류의 지수기(exponential phase) 동안의 배양액으로부터 유래한 조정 배지(conditioned medium)를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 미세조류 콜로니 수 또는 콜로니 크기 증진용 배지 조성물, 상기 배지 조성물을 함유하는 고체 배지 및 상기 고체 배지에 미세조류를 도말하여 배양하는 것을 특징으로 하는 미세조류 콜로니 수 또는 콜로니 크기 증진 방법에 관한 것이다.

Description

미세조류 콜로니 배양용 배지 조성물 및 이의 용도{Medium composition for culture of microalgae colony and uses thereof}
본 발명은 미세조류 콜로니 배양용 배지 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 배양 미세조류의 지수기(exponential phase) 동안의 배양액으로부터 유래한 조정 배지(conditioned medium)를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 미세조류 콜로니 수 또는 콜로니 크기 증진용 배지 조성물, 상기 배지 조성물을 함유하는 고체 배지 및 상기 고체 배지에 미세조류를 도말하여 배양하는 것을 특징으로 하는 미세조류 콜로니 수 또는 콜로니 크기 증진 방법에 관한 것이다.
미세조류 기반의 바이오디젤 생산 공정을 상업화시키기 위해서는 미세조류의 성장속도 및 지질 함량을 증진시키는 것이 중요하다. 현존하는 미세조류를 바탕으로 상업화를 위한 경제성을 맞추기 어렵기 때문에, 고지질 고성장의 스마트(smart) 미세조류를 개발하는 것이 중요하다. 하지만, 클라미도모나스 레인하르티(Chlamydomonas reinhardtii)와 같은 모델 균주로 연구되고 있는 미세조류 이외에 유전공학적인 측면에서 미세조류 균주개량을 하기가 쉽지 않다. 그 한 가지 이유는 미세조류는 박테리아와 달리 콜로니를 형성하는 기간이 많이 소요되며 균주에 따라서 콜로니 형성이 어려운 종도 있기 때문이다. 이렇게 콜로니 형성에 어려움을 가지면, 형질전환된 돌연변이 균주를 스크리닝하기가 쉽지 않다.
해수종인 나노클로롭시스 살리나(Nannochloropsis salina)는 고지질의(oleaginous) 미세조류로서 상업적으로 이용가치가 매우 높은 미세조류이다. 형질전환 기술의 개발로 나노클로롭시스 살리나의 균주개량이 성공적으로 이루어진다면, 상업적으로 경제성을 가진 미세조류로서의 이용 가능성이 높아진다. 그러기 위해서 현재 나노클로롭시스 살리나의 다양한 형질전환 기술 개발이 필요하다.
따라서 본 발명에서는 형질전환 기술의 기본이 되는, 나노클로롭시스 살리나의 단일 콜로니를 빠르고 큰 크기의 형태로 얻기 위한 연구를 위해, 나노클로롭시스 살리나를 배양했던 조정 배지(conditioned media)를 이용하여 아가 플레이트(agar plate)를 제조하였고, 이 아가 플레이트에 나노클로롭시스 살리나를 도말하여 콜로니의 성장 변화를 관찰하였다.
한편, 한국공개특허 제2011-0062979호에는 'Nannochloropsis EP1 미세조류 배양용 배지 조성물 및 상기 미세조류의 용도'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2012-0110295호에는 '조류 배양용 배지 조성물 및 조류 배양 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 미세조류 콜로니 배양용 배지 조성물 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 나노클로롭시스 살리나를 배양하던 배양액을 재사용한 조정 배지를 다양한 비율로 혼합하여 아가 플레이트를 만들고, 상기 아가 플레이트에 나노클로롭시스 살리나를 도말하여 배양시킨 결과, 특정 비율의 조정 배지가 혼합된 아가 플레이트에서 나노클로롭시스 살리나의 콜로니 숫자가 증가하거나 또는 크기가 커지는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 배양 미세조류의 지수기(exponential phase) 동안의 배양액으로부터 유래한 조정 배지(conditioned medium)를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 미세조류 콜로니 수 또는 콜로니 크기 증진용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 배지 조성물을 함유하는 고체 배지를 제공한다.
또한, 본 발명의 상기 고체 배지에 미세조류를 도말하여 배양하는 것을 특징으로 하는 미세조류 콜로니 수 또는 콜로니 크기 증진 방법을 제공한다.
본 발명에서는 콜로니 형성이 어렵고 콜로니 성장 기간이 오래 걸리는 특성을 가진 미세조류 나노클로롭시스 살리나를 조정 배지를 함유하는 배지를 사용하여 배양한 결과, 콜로니 개수 증가 및 크기의 증가 효과를 확인하였다. 본 발명의 배지 조성물은 미세조류 연구에 있어서 형질전환 균주의 스크리닝을 용이하게 할 수 있고 시간과 경비를 절감할 수 있으므로, 산업적으로 매우 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
도 1은 조정 배지의 비율에 따른 콜로니 크기를 분석한 결과이다.
도 2는 조정 배지가 0%(A) 및 30%(B) 들어간 노블 아가 플레이트에서 배양한 나노클로롭시스 살리나의 콜로니 크기를 비교한 사진이다.
도 3은 조정 배지가 혼합된 아가의 종류와 시간에 따른 콜로니 크기 변화를 분석한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 배양 미세조류의 지수기(exponential phase) 동안의 배양액으로부터 유래한 조정 배지(conditioned medium)를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 미세조류 콜로니 수 또는 콜로니 크기 증진용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 미세조류 콜로니 수 또는 콜로니 크기 증진용 배지 조성물에 있어서, 상기 조정 배지(conditioned medium)는 미세조류 배양 중 흡광도 측정을 통해 지수기 단계의 배양 배지를 수거하여 여과한 배지를 희석용매를 사용하여 10%(v/v) 단위로 일련의 희석을 통해 준비한 희석액인 것으로, 바람직하게는 1/10~8/10의 희석액일 수 있고, 더욱 바람직하게는 1/10~7/10의 희석액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 1/10 희석액의 의미는 여과한 원액 배지 1 부피에 희석용매 9 부피비로 희석한 조정 배지를 뜻하는 것으로, 10%(v/v)와 동일한 의미로 사용되었다.
본 발명에 따른 미세조류 콜로니 수 증진용 배지 조성물은 전술한 5/10~6/10의 희석액인 조정 배지를 함유하는 것일 수 있고, 바람직하게는 6/10의 희석액인 조정 배지를 함유하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에 따른 미세조류 콜로니 크기 증진용 배지 조성물은 전술한 2/10~4/10의 희석액인 조정 배지를 함유하는 것일 수 있고, 바람직하게는 3/10의 희석액인 조정 배지를 함유하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 미세조류 콜로니 크기 증진용 배지 조성물은 추가적으로 바다 소금(sea salt)을 포함할 수 있는데, 미세조류의 성장에 영향을 미치지 않는 최소 농도 이상을 포함할 수 있고, 바람직하게는 10~40g/ℓ 농도의 바다 소금을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 12~30g/ℓ 농도의 바다 소금을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 일 구현 예에 따른 미세조류 콜로니 수 또는 콜로니 크기 증진용 배지 조성물에 있어서, 상기 배지 조성물은 질산나트륨(NaNO3), 인산나트륨이수화물(NaH2PO4·2H2O), f/2 비타민 및 f/2 미량 금속을 추가로 함유할 수 있고, 바람직하게는 질산나트륨(NaNO3) 350~400㎎/ℓ, 인산나트륨이수화물(NaH2PO4·2H2O) 4~8㎎/ℓ, 비타민B12(시아노코발라민, cyanocobalamin) 0.1~2㎍/ℓ, 바이오틴 0.1~2㎍/ℓ, 티아민염산(thiamine·HCl) 0.05~0.2㎎/ℓ, 염화제2철육수화물(FeCl3·6H2O) 3.0~3.5㎎/ℓ, Na2EDTA·2H2O 4~5㎎/ℓ, 황산구리오수화물(CuSO4·5H2O) 9~11㎍/ℓ, 몰리브덴산나트륨이수화물(Na2MoO4·2H2O) 6~7㎍/ℓ, 황산아연칠수화물(ZnSO4·7H2O) 20~30㎍/ℓ, 염화코발트육수화물(CoCl2·6H2O) 5~15㎍/ℓ 및 염화망간사수화물(MnCl2·4H2O) 150~200㎍/ℓ를 추가로 함유할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 미세조류 콜로니 수 또는 콜로니 크기 증진용 배지 조성물에 있어서, 상기 미세조류는 나노클로롭시스 살리나(Nannochloropsis salina), 나노클로롭시스 가디타나(Nannochloropsis gaditana), 나노클로롭시스 그라뉼라타(Nannochloropsis granulata), 나노클로롭시스 림네티카(Nannochloropsis limnetica), 나노클로롭시스 오세아니카(Nannochloropsis oceanica), 나노클로롭시스 오큘라타(Nannochloropsis oculata) 등의 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.)일 수 있으며, 바람직하게는 나노클로롭시스 살리나(Nannochloropsis salina)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 미세조류 콜로니 수 또는 콜로니 크기 증진용 배지 조성물을 함유하는 고체 배지를 제공한다. 상기 미세조류 콜로니 수 또는 콜로니 크기 증진용 배지 조성물을 이용하여 고체 배지를 제조하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 일예로 고체 배지의 제조는 조정 배지는 멸균하지 않고, Bacto 및 Noble 아가만 물에 섞어 멸균한 후 특정 비율의 조정 배지와 혼합하여 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 고체 배지에 미세조류를 도말하여 배양하는 것을 특징으로 하는 미세조류 콜로니 수 또는 콜로니 크기 증진 방법을 제공한다. 본 발명의 상기 고체 배지는 미세조류 콜로니 수 또는 콜로니 크기 증진용 배지 조성물을 함유하고 있으므로, 상기 고체 배지에 미세조류를 스트리킹(streaking) 또는 스프레딩(spreading)의 방법으로 도말하여 배양하면 미세조류의 콜로니 수 또는 콜로니 크기가 증진되는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 조정 배지( conditioned media )를 이용한 고체 배지의 제조
NCMA(National Center for marine algae and microbiota)로부터 구매한 나노클로롭시스 살리나(Nannochloropsis salina) CCMP 1176 균주를, 30g/ℓ의 바다 소금(sea salt, Sigma, 미국)을 포함하는 f/2 배지(Guillard, 1975, culture of marine invertebrate animals p.26-60)에 질산염을 750㎎/ℓ가 되도록 첨가한 변형 f/2 배지에 접종하고 2% 이산화탄소를 0.5vvm으로 공급하면서 배양하였다. 초기 미세조류 접종 농도는 750nm에서 흡광도(OD) 0.2 값을 기준으로 하여 접종하였고, 1주일 배양 후 흡광도를 측정하여 OD750=2.6의 지수기(exponential phase) 단계인 미세조류 배양액을 수확하였다. 수확한 배양액은 원심분리기를 사용하여 상온에서 7,000rpm의 속도로 10분 동안 처리하고 상등액을 0.22㎛ 바틀 탑 필터로 여과하여 조정 배지(conditioned media)를 얻었다. 얻어진 조정 배지는 3차 증류수로 80에서 40%(v/v, 조정배지/증류수)까지 희석하고, 30% 이하의 희석에는 바다 소금과 3차 증류수를 이용하여 최종 바다 소금의 농도가 12g/ℓ가 되도록 조정하고, 이 희석액에 375㎎/ℓ 질산나트륨(NaNO3), 6㎎/ℓ 인산나트륨이수화물(NaH2PO4·2H2O), f/2 비타민 원액 및 f/2 미량 금속 원액을 정량 넣어 주었다. 대조구로 사용한 조정배지 0% 희석액의 경우는 30g/ℓ로 용해된 3차 증류수에 상기 조성물들을 첨가한 것을 사용하였다. 본 발명에 사용한 비타민 원액과 미량 금속 원액의 구성은 하기 표 1과 같다.
f/2 비타민 및 미량 금속 용액 조성
성분 최종농도

f/2 비타민 용액
 Vitamin B12 (cyanocobalamin) 0.5㎍/ℓ
Biotin 0.5㎍/ℓ
Thiamine· HCl 0.1mg/ℓ




f/2 미량 금속 용액


 FeCl3·6H2O 3.15mg/ℓ
Na2EDTA·2H2O 4.36mg/ℓ
CuSO4·5H2O 9.8㎍/ℓ
Na2MoO4·2H2O 6.3㎍/ℓ
ZnSO4·7H2O 22.0㎍/ℓ
CoCl2·6H2O 10.0㎍/ℓ
MnCl2·4H2O 180㎍/ℓ
그 후 상기 용액에 아가를 섞어 아가 플레이트(agar plate) 배지를 제조하였다. 고체 배지의 제조는 조정 배지는 멸균하지 않고, Bacto 및 Noble 아가(BD bioscience, 미국)만 물에 섞어 멸균한 후 특정 비율의 조정 배지와 혼합하여 제조하였다.
실시예 2. 미세조류 콜로니 크기 및 개수 분석
상기의 방법을 통해 제조한 고체 배지에 나노클로롭시스 살리나(Nannochloropsis salina) CCMP 1176 균주를 50~60개 정도 도말하고, 25℃, 120μmol/m2/s의 광량 조건으로 배양하였다.
2-1. 콜로니 크기 분석
배양 19일, 24일 및 30일 후에 콜로니 크기를 관찰하였다. 현미경 사진으로 가능한 모든 콜로니의 이미지를 취한 후, 크기를 측정하여 상·하위 20%를 제거하고 나머지의 평균값을 구하였다.
그 결과, 조정 배지가 20~40% 사용된 조건의 배지에서 콜로니의 크기가 다른 조건의 배지보다 크게 확인되었다(도 1). 특히, 도말 후 30일 뒤에는 Noble 아가의 30% 조정 배지 조건에서는 콜로니가 2mm 이상의 크기로 성장하였으며, 이는 동일 아가의 조정 배지가 하나도 포함되지 않은 조건(0%)보다 3.8배 이상 큰 결과이다(도 2). 또한, 도말 후 배양기간 30일이 지나는 동안 20~40%의 조정 배지를 함유한 배지 조건에서 콜로니의 지속적인 성장이 일어나는 것을 확인하였다. 이때, Bacto 아가보다 Noble 아가 조건에서 콜로니의 성장률이 더욱 좋은 것으로 확인되었다(도 3).
2-2. 콜로니 개수 분석
하기 표 2는 도말 후, 배양 19일째에 조정 배지 비율별 및 사용된 아가의 종류별로 나노클로롭시스 살리나의 콜로니 개수를 확인한 결과이다.
조정 배지 비율 및 아가 종류에 따른 콜로니 개수 분석
조정 배지 비율 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80%
Bacto agar 25 54 46 24 43 68 75 51 60
Noble agar 46 37 26 12 32 55 64 60 40
50% 이상의 조정 배지를 사용한 경우는 80% 조정 배지 비율의 Noble 아가 조건만 제외하고, 모두 50개 이상의 콜로니가 성장하였다. 그 중에서도 60% 조정 배지 조건에서 Bacto 아가에서는 75개의 콜로니가, Noble 아가에서는 64개의 콜로니가 확인되어 다른 조건의 배지 보다 가장 높은 성장률을 보였다. 하지만 50% 이하의 조정 배지를 사용한 경우에는 Bacto 아가의 10% 조정 배지 조건을 제외하고는 50개 이하의 콜로니가 관찰되었다. 특히 콜로니 크기가 가장 크게 확인되었던 30% 조정 배지 조건에서는 두 종류의 아가 조건 모두에서 가장 적은 수의 콜로니가 확인되었다.
상기의 결과를 통해, 나노클로롭시스 살리나 콜로니의 빠른 성장 속도와 오랜 생존율 유지를 위한다면 30% 조정 배지의 Noble 아가 조건, 반면 콜로니의 생존율을 높여 많은 개수의 콜로니를 원한다면 60% 조정 배지의 Bacto 아가 조건이 유리함을 알 수 있었다.

Claims (10)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 배양 나노클로롭시스 살리나(Nannochloropsis salina)의 지수기(exponential phase) 동안의 배양액으로부터 유래한 조정 배지(conditioned medium)의 6/10 희석액인 조정 배지를 함유하는 것을 특징으로 하는 나노클로롭시스 살리나 콜로니 수 증진용 고체 배지.
  4. 배양 나노클로롭시스 살리나(Nannochloropsis salina)의 지수기(exponential phase) 동안의 배양액으로부터 유래한 조정 배지(conditioned medium)의 3/10 희석액인 조정 배지를 함유하는 것을 특징으로 하는 나노클로롭시스 살리나 콜로니 크기 증진용 고체 배지.
  5. 제4항에 있어서, 상기 나노클로롭시스 살리나 콜로니 크기 증진용 고체 배지는 바다 소금(sea salt)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 나노클로롭시스 살리나 콜로니 크기 증진용 고체 배지.
  6. 제3항에 있어서, 질산나트륨(NaNO3), 인산나트륨이수화물(NaH2PO4·2H2O), f/2 비타민 및 f/2 미량 금속을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 나노클로롭시스 살리나 콜로니 수 증진용 고체 배지.
  7. 제4항에 있어서, 질산나트륨(NaNO3), 인산나트륨이수화물(NaH2PO4·2H2O), f/2 비타민 및 f/2 미량 금속을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 나노클로롭시스 살리나 콜로니 크기 증진용 고체 배지.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항의 고체 배지에 나노클로롭시스 살리나(Nannochloropsis salina)를 도말하여 배양하는 것을 특징으로 하는 나노클로롭시스 살리나 콜로니 수 또는 콜로니 크기 증진 방법.
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