KR101674553B1

KR101674553B1 - 유산균의 고농도 배양을 위한 배지 조성물

Info

Publication number: KR101674553B1
Application number: KR1020140166710A
Authority: KR
Inventors: 정은지; 문대원; 오준석; 장지훈
Original assignee: 주식회사 토비코
Priority date: 2014-11-26
Filing date: 2014-11-26
Publication date: 2016-11-11
Also published as: KR20160063118A

Abstract

본 발명은 유산균의 고농도 배양을 위한 배지 조성물에 관한 것이다.

Description

유산균의 고농도 배양을 위한 배지 조성물{A MEDIUM COMPOSITION FOR HIGH CONCENTRATION CULTURE OF LACTIC ACID BACTERIA}

최근 들어 장내 유익균의 기능, 즉 장내의 산도를 내려 장의 운동을 촉진시켜 음식물의 소화와 영양소의 흡수를 돕고, 유해물질의 생성을 억제함과 동시에 분해하며, 비타민 및 아미노산을 합성하고, 병원균의 장관감염을 방어하며, 면역력을 높이는 등의 중요한 역할 수행에 주목하여, 유산균을 분리하여 건강기능식품이나 의약품으로서 제품화하려는 다양한 노력이 활발히 진행되고 있다. 요구르트 및 치즈에 함유된 건은 동물성 유산균이며, 된장이나 김치 등 식물성 발효식품에 포함된 유산균을 식물성 유산균이라 한다. 둘다 유산균으로 불리지만 동물성인 것과 식물성인 것에는 상당히 다른 특징이 있다. 식물성 유산균은 동물성 유산균에 비하여 원래 영양분이 부족한 곳에서 생존을 해 온 이유로 서양인에 비하여 장이 긴 동양인에게 적합한 균으로 알려져 있다. 또한 내산성, 내담즙성이 동물성 유산균에 비하여 우수하여 섭취시 살아서 장까지 도달하는 비율이 높고, 면역활성이 우수한 것으로 알려져 있다. 한편, 웰빙에 관심이 높은 현대인의 경우보다 건강에 좋은, 보다 안전한 식품에 높은 선도를 보이고 있다. 따라서 식물성 유산균에 관한 관심이 높아지고 그와 관련된 제품도 많이 나오고 있다.

프로바이오틱스란 체내에 들어가서 건강에 좋은 효과를 주는 살아있는 균으로 정의되며, 생균으로 100,000,000 CFU/g 이상 함유되어야 한다. 프로바이오틱스는 유익한 유산균 증식, 유해균 억제 또는 배변활동 원활에 도움을 준다. 프로바이오틱스 산업은 지속적인 성장세로 산업화에 있어서 균주 분리 및 동정 그리고 기능성도 중요하지만 생산의 고효율화, 안전성이 중요하다. 그러므로 프로바이오틱스나 원료 유산균을 생산하기 위해서는 최적 조성을 가진 배지 개발이 중요하며, 안전한 식품원료로 구성된 한 유산균주의 영양 요구성이나 생육 특성에 따라 최적화가 필요하다.

유산균 관련 제품 및 프로바이오틱스를 생산하기 위한 유산균의 배양에는 다양한 조성을 가진 배양 배지가 사용되고 있으나 대부분 배양 효율, 경제성 등을 고려하여 대상 유산균이 동물성인지, 식물성인지 고려하지 않고 동물성 성분이 함유된 천연 성분, 혹은 필요 성분만을 추출한 합성 성분의 배양 배지가 사용되고 있는 실정이다. 그러나 논란이 되고 있는 광우병의 발생원인을 고려해 보아도 식물 유래 유산균은 식물성 성분만이 첨가된 환경에서 배양하여 사용함이 잠재된 위험성을 제거하는데 최선의 선택이라고 할 수 있다. 하지만 현재까지는 식물성 유산균의 배양에서 그 제품화 과정의 부형제까지 모든 성분을 식물성 성분으로 구성하는 사례는 전무하며, 그러한 과정을 거쳐 생산된 제품도 없는 실정이다.

기존에 유산균 배양을 위해 일반적으로 사용되는 MRS medium은 고가이며, 논란이 되고 있는 광우병 등으로 배지 원료의 잠재적인 위험성이 있다. 하여 안전성이 입증된 식품 원료들을 바탕으로 동물성 성분보다는 식물성 성분을 위주로 구성하여 개발이 필요하다.

관련 선행특허로 대한민국특허공개번호 제1020140071981호는 락토바실러스 속 김치 유산균의 배양 배지에 관한 것과 대한민국특허공개번호 제1020140064354호로 유산균 배양용 배지 및 그 배지를 이용한 고농도 유산균 배양 방법에 관한 것이다.

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 면역활성 및 기타 기능성을 가지는 유산균의 고농도 배양을 위한 산업용 배양 배지 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 식품 원료 조성물을 이용하여 장내 유해한 미생물을 억제하고 면역활성이 높고, 내산성과 내담즙성이 우수하며 기타 기능성 등을 가진 유산균의 고농도 배양이 가능한 최적 배양 배지 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 전통 발효 식품에서 분리한 유산균에 대한 최적의 배양 배지를 개발하기 위하여 포도당, 소이펩톤, 효모추출물, 초산나트륨, 제2인산칼륨, 트윈80, 황산마그네슘, 황산망간, 무수구연산 등을 함유하는 액체 배양 배지를 제조하되, 포도당, 소이펩톤, 효모추출물, 초산나트륨, 제2인산칼륨, 트윈80, 황산마그네슘, 황산망간, 구연산 등의 함량을 달리해가며 총 27가지의 액체 배양 배지를 제조하고, 유산균 배양에 일반적으로 사용되는 MRS broth 대비 상기 분리·동정하고 기능성을 입증한 락토바실러스 플란타룸 DK119를 적용하여 최적의 배지를 선발하고자 하였다.

그 결과 최대 생균수 증가율이 대조구인 MRS broth에 비해 낮은 것에서부터 최대 76%까지 높은 다양한 배지 조성을 확인하였다.

최종 최적 배지로는 포도당의 함량은 1.5 내지 3.0%(w/v), 대두펩톤의 함량은 0.5 내지 1.5%(w/v), 효모 추출물의 함량은 0.5 내지 1.5%(w/v), 초산나트륨의 함량은 0.5%(w/v), 제2인산칼륨의 함량은 0.1 내지 0.3%(w/v), 폴리소르베이트 80은 0.05 내지 0.2%(w/v), 황산마그네슘의 함량은 0.01 내지 0.05%(w/v), 황산망간의 함량은 0.005 내지 0.01%(w/v), 구연산의 함량은 0.1 내지 0.2%(w/v) 및 정제수를 포함하는 조성을 특징으로 한다.

본 발명의 구현예에 있어서, 상기 유산균은 생균으로 락토바실러스 플란타룸인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

락토바실러스 플란타룸 DK119에 최적화된 배지이지만 락토바실러스 플란타룸 DK119가 아닌 다른 유산균도 배양가능한지 적용해보았다.

유산균으로는 락토바실러스 플란타룸 JSA22균주 및 이를 포함하는 조성물 특허출원 제1020140116367호와 특허 제 1020120132034호 세포외 다당생성 활성을 나타내는 프로바이오틱 락토바실러스 브레비스 JSB22균주를 적용하였다.

본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 전통발효식품에서 분리균주인 락토바실러스 플란타룸 균주를 최적화 배양 배지에 적용시켜 상업적 활용이 가능하도록 하고자 하였으며, 세포외 다당생성 활성을 나타내는 프로바이오틱 락토바실러스 브레비스 JSB22(특허 등록 제 101444216 호), 락토바실러스 플란타룸 JSA22균주 등 기능성 유산균의 대량생산이 가능한 식용 배양 배지를 제공하였다.

도 1은 전통발효식품에서 분리균주인 Lactobacillus plantarum DK119를 MRS 배지와 본 특허에서 개발한 JMO배지에서 배양시, 생균수 및 비용 개선효과 도면
도 2는 유산균 6종에 대한 JMO 배지와 MRS 배지에서의 생육 비교 도면

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1. 최적 배지 성분 조성 스크리닝

단국대 김철현 교수 연구팀에게 분양받은 Lactobacillus plantarum DK119 (폐사 특허균주, 출원번호 10-2013-0124227, 대한민국 수원시 소재 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC)에 2013년 9월 4일에 기탁번호 KACC91781P로 기탁했다.)의 최적 배지 탐색을 하였다. 선발 유산균인 DK119에 배지 최적화를 위해 기존 MRS medium (Difco, USA)와 유사하되, 최대한 식물성 성분화를 조건으로 배지 성분을 스크리닝하였다. 표 1과 2에서는 대체할 수 있는 원료 중심 그리고 식용가능한 성분으로 대체하였으며, 표 3에서는 대체성분들이 최대효과를 낼 수있는 조성비를 스크리닝하였다.

이들의 pH 및 O.D value를 통해 고효율 배지들을 스크리닝하여 균수를 측정하였다.

본 발명의 pH 및 O.D 값은 식품첨가물공전의 일반시험법의 pH 측정법 및 흡광도 측정법에 따라 (610nm)에서 측정하였다.

요약하면, OD (optical density) value는 spectrophotometer(JENWAY 6300, CM6 3LB, England) 로 측정하였으며, pH는 pH meter(Jenway 3510pH meter, CM6 3LB, England)로 측정하였다.

생균수 측정은 각각의 조성으로 구성된 배지에 Lactobacillus plantarum DK119를 접종 후, 30~300개 정도의 집락이 생장하도록 멸균생리수로 십배수 희석법에 따라 희석하였으며, 그 희석액 0.1mL를 취하여 MRS 한천평판배지에 도말 한 후 37℃에서 24hr, 배양하였다. 배양 후 나타난 집락수를 세어 mL당 총 생균수로 계수하였다.

성분명	함량(%)
성분명	1	2	3	4	5	6	7	8	9
Glucose(원료급)	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	3.0	3.0	2.0	2.0
Proteose PeptoneNo.3	1.0	1.0	1.0		1.0
Soy Peptone(원료급)				1.0		1.0	1.0	1.0	1.5
Yeast extract(시약급)	0.5	0.5		0.5	0.5
Yeast extract(원료급)			0.5			0.5	0.5	1.0	1.0
Beef extract	1.0	1.0	1.0	1.0
Sodium acetate(원료급)	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
DipotassiumPhosphate	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2		0.2	0.2
Ammoniumcitrate	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2			0.2
Tween 80	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1		0.1	0.1
MagnesiumSulfate (MgSO4.7H2O)	0.010	0.010	0.010	0.010	0.010	0.010	0.010	0.010	0.010
ManganeseSulfate (MnSO4.4H2O)	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005

표 1은 배지 구성물을 스크리닝하기 위한 표이다.

성분명	함량(%)
성분명	10	11	12	13	14	15	16	17	18
Glucose(원료급)	2.0	2.0	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5
Soy Peptone(원료급)	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
Yeast extract(시약급)				1.0	1.0	1.0	1.0
Yeast extract(원료급)	1.0	1.0	1.0					1.0	1.0
Sodium acetate(원료급)	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
Dipotassium Phosphate	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2			0.2
Dipotassium Phosphate(원료급)							0.2	0.2
Ammonium citrate		0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
Tween 80	0.1		0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
Magnesium Sulfate	0.010	0.010	0.010		0.010		0.010	0.010	0.010
Manganese Sulfate	0.005	0.005	0.005	0.005			0.005	0.005	0.005
Potassium citrate						0.2
Sodiumcitrate Dihydrate							0.2
Citric acid Monohydrate							0.2	0.2
Ammonium phosphate Monohydrate								0.2

표 2는 또 다른 배지 구성물을 스크리닝하기 위한 표이다.

성분명	함량(%)
성분명	19	20	21	22	23	24	25	26	27
Glucose(원료급)	2.5	2.5	3.0	2.5	3.0	2.5	3.0	2.5	2.5
Soy Peptone(원료급)	1.0	1.0	1.0	0.5	1.0	0.5	0.5	0.5	0.5
Yeast extract(원료급)	1.0	1.0	1.0	1.5	1.0	1.5	1.5	1.5	1.5
Sodium acetate(원료급)	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
Dipotassium Phosphate (원료급)	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
Tween 80	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
Magnesium Sulfate	0.010	0.010	0.010	0.010	0.010	0.010	0.010	0.010	0.010
Manganese Sulfate	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005
Sodium citrate Dihydrate	0.2	0.1			0.1	0.2	0.2		0.1
Citric acid Monohydrate		0.1			0.1			0.2	0.1

표 3은 또 다른 배지 구성물을 스크리닝하기 위한 표이다.

표 1에서는 기존 MRS medium인 1번 조성을 기준으로 시약급인 배지 성분을 식품 원료급으로 대체하여 스크리닝하였고 그 pH와 OD value 결과는 표 4에 나타내었다.

성분 1이 MRS medium 조성에서 beef extract를 yeast extract로 대체하였으며, proteose peptone No.3을 soy peptone으로 대체하였으며, 구성비도 균주에 맞게 변경하였다.

표 2에서 제시한 성분표는 최대한 식물성 성분화를 조건으로 배지 성분을 식용가능한 성분으로 대체하여 스크리닝한 결과 표 5와 같다.

표 3에서는 표 1과 표 2를 바탕으로 실시한 결과 표 4와 표 5에서 대체한 성분들이 최대효과를 낼 수있는 조성비를 스크리닝하였다(표 6).

	1	2	3	4	5	6	7	8	9
OD	7.299	5.664	5.391	5.973	5.682	5.247	0.425	5.524	6.380
pH	3.68	3.74	3.77	3.82	3.73	3.77	4.79	3.79	3.82

표 4는 상기 표 1의 구성물들의 pH, 및 OD 값이다.

	10	11	12	13	14	15	16	17	18
OD	4.612	0.529	6.825	6.652	4.609	4.489	6.717	5.718	5.791
pH	3.75	4.90	3.73	3.75	3.96	3.98	3.73	3.68	3.69

표 5는 상기 표 2의 구성물들의 pH, 및 OD 값이다.

	19	20	21	22	23	24	25	26	27
OD	5.854	5.733	6.071	6.223	6.493	6.584	6.393	6.339	6.568
pH	3.64	3.67	3.67	3.75	3.71	3.74	3.76	3.69	3.71

표 6은 상기 표 3의 구성물들의 pH, 및 OD 값이다.

실시예 2. 최적 배지 성분 조성 선별

앞서 제시한 표 1, 2 및 3의 조성비로 스크리닝한 결과 표 4, 5 및 6를 얻었고 이를 기준으로 생균수를 측정하였다.

생균수 측정은 각각의 조성으로 구성된 배지에 Lactobacillus plantarum DK119를 접종 후, 30~300개 정도의 집락이 생장하도록 멸균 생리수로 십 배수 희석법에 따라 희석하였으며, 그 희석액 0.1mL를 취하여 MRS 한천평판배지에 도말 한 후 37℃에서 24hr, 배양하였다. 배양 후 나타난 집락수를 세어 mL당 총 생균수로 계수하였다.

표 7과 같이 MRS 배지 조성인 1번 배지와 16,17,18,19,20 배지에서 DK119 배양 후 생균수 비교시 배지 19가 생균수가 가장 높고 MRS 배지인 배지 1보다도 높았다.

이러한 결과를 바탕으로 배지 19 선별하였다.

또 식용으로는 사용이 불가능한 구연산 암모늄(Ammonium citrate)을 대신하여 식용 가능한 구연산칼륨(potassium citrate), 구연산 나트륨(sodium citrate dihydrate),함수 구연산(citric acid monohydrate) 등으로 대체한 결과, 구연산 암모늄(Ammonium citrate)을 첨가하지 않아 발생하는 침전물 문제 등을 식품의 pH조절, 수소이온농도 조절로 식품첨가제로 사용되는 함수 구연산(citric acid monohydrate)을 첨가함으로써 해결되었다(표 8).

표 8에서 침전물이 발생하지 않는 조성 배지와 균수를 바탕으로 선발된 배지를 높은 균수를 보인 배지 19를 기준으로 하여 주요 구성 성분 및 함수 구연산, 구연산나트륨 구성성분비 변화를 주어 실험한 결과 19의 균수와 큰 차이없이 경제적인 배지인 26이 유사한 균수 효과를 볼 수 있었다. 제조 단가대비 생산효율이 월등히 좋았다. 식용이 가능하고 DK119에 최적화된 경제적인 고농도 배양 배지를 개발하였다(표 9).

	1	16	17	18	19	20
Cell number(CFU/mL)	6.02E+09	7.37E+09	7.17E+09	6.72E+09	7.90E+09	7.13E+09

표 7은 스크리닝 배지 I에서 Lactobacillus plantarum DK119의 성장을 나타낸 표이다.

	18	21	22	23	24	25
Cell number(CFU/mL)	5.77E+09	6.42E+09	7.68E+09	7.32E+09	6.25E+09	6.90E+09

표 8은 스크리닝 배지 II에서 Lactobacillus plantarum DK119의 성장을 나타낸 표이다.

	19	22	26	27
Cell number( CFU / mL )	4.68E+09	5.20E+09	4.67E+09	5.05E+09

표 9는 스크리닝 배지 III에서 Lactobacillus plantarum DK119의 성장을 나타낸 표이다.

실시예 3. JMO 배지와 MRS 배지 생장력 및 비용 비교

도 1에서 알 수 있는 바와 같이, BD사 MRS broth보다 비교적 저렴한 MB cell사의 MRS broth로 생산시, 700만원 이상의 비용이 발생되었고, 본 발명에서 제조한 배지(이하, 'JMO'라함)로 생산시 24배나 저렴하고 균수도 MRS 배지에서 4.77×10⁹ CFU/mL인 반면에 JMO에서는 조금 더 높은 균수인 7.20×10⁹ CFU/mL를 나타냄. 가격은 저렴하고 생균수는 높은 저비용 고효율의 배지를 개발하였다.

4. 유산균 통용 상용화 배지

락토바실러스 플란타룸 DK119 균주에 최적화한 배지를 다른 유산균에도 통상적으로 사용가능한지 여부를 알아보기 위해 실험하였다.

		Enterococcus faecium I1			Lactobacillus plantarum JSA22			Lactobacillus brevis JSB22
medium	time	OD	pH	cell number	OD	pH	cell number	OD	pH	cell number
MRS	0hr	0.070	6.24	4.88E+07	0.081	6.24	3.97E+07	0.068	6.25	5.38E+07
MRS	24hr	6.472	3.82	5.38E+09	7.795	3.84	3.42E+09	6.836	3.83	5.85E+09
JMO	0hr	-0.041	5.29	3.32E+07	-0.018	5.27	3.73E+07	-0.035	5.29	3.40E+07
JMO	24hr	5.407	3.72	4.57E+09	7.295	3.70	4.87E+09	5.472	3.75	4.68E+09

표 10은 MRS/JMO 배지Ⅰ에서 프로바이오틱 배양의 성장 패턴 분석 표이다.

		Lactobacillus plantarum JSB39			Lactococcus lactis I13			Leuconostoc lactis I15
medium	time	OD	pH	cell number	OD	pH	cell number	OD	pH	cell number
MRS	0hr	0.078	6.24	3.65E+07	0.022	6.31	9.83E+06	0.090	6.16	8.07E+07
MRS	24hr	7.617	3.80	4.90E+09	7.521	3.79	4.27E+09	6.911	3.85	4.38E+09
JMO	0hr	0.040	5.27	3.95E+07	-0.074	5.31	3.01E+06	-0.008	5.25	5.67E+07
JMO	24hr	6.915	3.71	3.50E+09	6.452	3.69	2.80E+08	5.512	3.85	2.63E+09

표 11은 MRS/JMO 배지 II에서 프로바이오틱 배양의 성장 패턴 분석 표이다.

도 2에서 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 최적화 배지인 JMO medium와 MRS medium에 Enterococcus faecium I1, Lactobacillus plantarum JSA22, Lactobacillus brevis JSB22, Lactobacillus plantarum JSB39, Lactococcus lactis I13, Leuconostoc lactis I15 6종의 유산균을 각각의 배지에 적용하여 배양한 결과 대체로 비슷한 균수를 나타냈다.

이를 생장률로 환산하였을 때 Enterococcus faecium I1, Lactobacillus plantarum JSA22, Lactobacillus brevis JSB22균주가 JMO 배지에서 생장률이 조금 더 높았다. Lactococcus lactis I13을 제외하고는 Lactobacillus plantarum JSB39, Leuconostoc lactis I15가 MRS 배지 생장률이 약간 높으나 큰 차이는 없었다.

본 발명인 JMO 배지에서 상기 6종의 유산균을 배양시, 3종의 유산균이 MRS 배지보다 JMO 배지에서 생장률이 높았으며, Lactococcus lactis I13을 제외하고 JMO 배지에서 생장률이 낮은 나머지 2종의 유산균 또한 MRS배지보다는 생장률 낮으나 그 수치는 0.3 내지 1.55 % 정도의 차이로 유사한 균수가 나타남에 있어서 산업용 생산배지로는 적합하다고 판단되어 진다.

Claims

배지 구성성분으로 포도당 1.5 내지 3.0%(w/v), 대두 펩톤 0.5 내지 1.5%(w/v), 효모 추출물 0.5 내지 1.5%(w/v), 초산나트륨 0.5%(w/v), 제2인산칼륨 0.2%(w/v), 트윈 80 0.1%(w/v), 황산마그네슘 0.01%(w/v), 황산망간 0.005%(w/v), 및 구연산을 구연산 나트륨(sodium citrate dihydrate) 또는 함수 구연산(citric acid monohydrate)의 형태로 0.2%(w/v)를 함유하는 락토바실러스 플란타룸 배양용 배지 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 배지는 배지 구성성분으로 포도당 2.5%(w/v), 대두 펩톤 0.5%(w/v), 효모 추출물 1.5%(w/v), 초산나트륨 0.5%(w/v), 제2인산칼륨 0.2%(w/v), 트윈 80 0.1%(w/v), 황산마그네슘 0.01%(w/v), 황산망간 0.005%(w/v), 및 구연산을 구연산 나트륨(sodium citrate dihydrate) 또는 함수 구연산(citric acid monohydrate)의 형태로 0.2%(w/v)를 함유하는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 락토바실러스 플란타룸 균주는 락토바실러스 플란타룸 DK119 또는 락토바실러스 플란타룸 JSA22 균주인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.