用于沙区土壤改良的微生物组合物、微生物制剂以及方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域,具体而言,涉及一种用于沙区土壤改良的微生物组合物、微生物制剂以及方法。
背景技术
如何提升土壤肥力是当前人类与土壤改良斗争的重要技术难题之一。与土壤施肥、种植苗木和物理重构技术相比,微生物土壤改良法作为一种新型土壤改良技术,具有污染性小、价格低廉、耗时短暂、适应性强、工程量小等优点,被国际上公认为是未来从根本上修复土壤生态系统最有发展潜力的一种措施。然而,目前关于微生物改良沙区土壤的研发仍处于探索阶段,已有的相关技术研发针对添加肥料来刺激微生物生长代谢,初步证实了微生物土壤改良技术在改善土壤理化特性等方面的积极意义。
目前,芽孢杆菌属细菌联合培养在沙区土壤改良中的应用还未有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于沙区土壤改良的微生物组合物。该微生物组合物能够良好的使沙粒团聚并保持相对稳定,可有效的改善土壤理化特性。
本发明的另一目的在于提供一种用于沙区土壤改良的微生物制剂。该微生物制能够良好的使沙粒团聚并保持相对稳定,可有效的改善土壤理化特性。
本发明的另一目的在于提供一种沙区土壤改良的方法。采用该方法能够使沙粒团聚并保持相对稳定,可有效的改善土壤理化特性。
本发明是这样实现的:
第一方面,本发明提供了一种用于沙区土壤改良的微生物组合物,其含有:枯草芽孢杆菌、莫海威芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌。
优选地,枯草芽孢杆菌、莫海威芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌之间的活菌数比例为1:(0.5-0.6):(0.7-0.8);
优选地,枯草芽孢杆菌的活菌数为109-1010CFU,莫海威芽孢杆菌的活菌数为109-1010CFU,解淀粉芽孢杆菌的活菌数为109-1010CFU;
优选地,枯草芽孢杆菌、莫海威芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌之间的用量比为2-4:4-6:4-6,优选为3:5:5。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述枯草芽孢杆菌的保藏编号为CGMCCNO.17601。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述枯草芽孢杆菌的 16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述莫海威芽孢杆菌的保藏编号为CGMCCNO.17602。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述莫海威芽孢杆菌的 16S rDNA序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述解淀粉芽孢杆菌的保藏编号为CGMCCNO.17604。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述解淀粉芽孢杆菌的 16S rDNA序列如SEQ ID NO.3所示。
上述枯草芽孢杆菌CGMCC NO.17601、莫海威芽孢杆菌 CGMCC NO.17602、解淀粉芽孢杆菌CGMCC NO.17604已于2019 年4月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所。
上述枯草芽孢杆菌CGMCC NO.17601已于2019年4月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,分类学命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),保藏编号为:CGMCC NO.17601。
上述莫海威芽孢杆菌CGMCC NO.17602已于2019年4月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,分类学命名为莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis),保藏编号为:CGMCC NO.17602。
上述解淀粉芽孢杆菌CGMCC NO.17604已于2019年4月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,分类学命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),保藏编号为: CGMCC NO.17604。
第二方面,本发明提供了一种用于沙区土壤改良的微生物制剂,其含有上述的微生物组合物或通过对上述的微生物组合物进行发酵培养所得到的发酵产物。
第三方面,本发明提供了一种沙区土壤改良的方法,其包括:
将上述的微生物组合物进行发酵培养;
将发酵培养得到的发酵产物喷洒至沙区表面。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,按每平方米喷洒 1×108-1×1010CFU的量喷洒上述微生物制剂。
第四方面,本发明提供了上述微生物制剂的制备方法,该微生物制剂是通过对上述的微生物组合物进行发酵培养所得到的发酵产物,所述微生物制剂的制备方法包括:将枯草芽孢杆菌、莫海威芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌共同接种于培养基进行发酵培养。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述培养基含有:酵母粉、葡萄糖以及MgSO4,pH 8.2-8.5;
优选的,所述培养基含有:18-22g/L酵母粉、28-32g/L葡萄糖、 8-12g/L MgSO4。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,培养的条件如下:在 28-32℃,200-300rpm的条件下培养16-20h。
本发明具有以下有益效果:
本发明提供的微生物组合物,其含有枯草芽孢杆菌、莫海威芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌,这三种菌联合发挥作用,能够产生多种水解酶类、发挥固氮作用和产生大量的胞外多糖,将该微生物组合物施用于沙区,不仅能够良好的使沙粒团聚并保持相对稳定的状态,同时还可以有效的改善土壤理化特性,可广泛应用于沙区土壤恢复,有利于实现沙区的可持续性发展。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例中菌株(B3/B5)在培养基上的水解图;其中:a为B5菌株和联合培养菌株在淀粉酶选择性平板上的水解圈;b 为B5菌株和联合培养菌株在蛋白酶选择性平板上的水解圈;c为B3 和联合培养菌株在纤维素酶选择性平板上的水解圈。
图2为B8菌株在无氮培养基上的菌落形态图。
图3为本发明实施例中不同菌株(B3/B5/B8)及其联合培养时的胞外多糖产量结果。
图4为不同菌株(B3/B5/B8)在LB固体培养基上的菌落形态图,图中:a为枯草芽孢杆菌B3菌株;b为莫海威芽孢杆菌B5菌株;c 为解淀粉芽孢杆菌B8菌株。
图5为本发明实施例中使用不同菌株(B3/B5/B8)的16S rDNA 序列所作的系统发育树结果;其中,a为枯草芽孢杆菌B3菌株,b 为莫海威芽孢杆菌B5菌株,c为解淀粉芽孢杆菌B8菌株。
图6为本发明实施例中菌株联合(B3、B5和B8)施用到沙区对沙粒聚集的效果图,图中,a代表施加联合培养菌株发酵液半年后沙区表面效果图;b代表施加联合培养菌株发酵液半年后形成的结皮图片。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
芽孢杆菌属细菌的分离筛选及鉴定
(1)样品采集:
2018年6月29日采集腾格里沙漠沙坡头人工固沙植被区的生物土壤结皮。
(2)培养基:
a)LB培养基:胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L,蒸馏水1000mL,pH7.0-7.2(固体培养基时加入2%的琼脂粉)。
b)淀粉酶选择性培养基:淀粉2g/L,牛肉膏5g/L,葡萄糖5g/L,胰蛋白胨10g/L,氯化钠5g/L,琼脂粉20g/L,蒸馏水1000mL, pH 7.0-7.2。
c)蛋白酶选择性培养基:酪蛋白5g/L,葡萄糖10g/L,酵母粉10 g/L,磷酸氢二钾1g/L,磷酸二氢钾0.5g/L,硫酸镁0.1g/L,琼脂粉20g/L,蒸馏水1000mL,pH 7.0-7.2。
d)纤维素酶选择性培养基:羧甲基纤维素钠20g/L,葡萄糖5 g/L,胰蛋白胨2.5g/L,磷酸氢二钠2.5g/L,磷酸二氢钠1.5g/L,琼脂粉20g/L,蒸馏水1000mL,pH 7.0-7.2。
(3)菌种初筛:
准确称取1g生物土壤结皮样品添加到9mL无菌生理盐水中,涡旋仪充分混匀;80℃水浴10min除去非芽孢细菌体;按照1%的接种量接种于LB培养基中,30℃培养48h后于LB固体平板上进行稀释涂布;挑取不同形态的菌落进行划线纯化,编号保存。
(4)菌种复筛:
a)将上述纯化菌株接种到LB培养基中,30℃摇床培养48h;
b)使用牛津杯法分别在淀粉酶选择性培养基、蛋白酶选择性培养基及纤维素酶选择性培养基上测量纯化菌株的淀粉酶、蛋白酶及纤维素酶活性,结果显示:B5菌株的淀粉酶活性和蛋白酶活性最高,B3 菌株的纤维素酶活性最高(参见附图1)。
c)选择无氮培养基评估菌株固氮能力,仅B8菌株具有固氮能力 (参见附图2)。
d)取3mL发酵液加入到离心管中,10000rpm,4℃离心20min 收集上清液;将2mL的上清液中添加6mL 95%的冰乙醇,剧烈震摇至絮状沉淀后放置于4℃冰箱中过夜;10000rpm,4℃离心5min 收集沉淀,将沉淀使用75%的乙醇洗涤三次;室温下晾干,加入2mL无菌水制成粗多糖溶液;通过苯酚-硫酸法对以上粗多糖溶液进行测量,三株菌的胞外多糖产量均较高,其中,B3发酵产生的胞外多糖为4.41±1.63g/L,B5发酵产生的胞外多糖为5.80±1.33g/L,B8发酵产生的胞外多糖为6.13±0.23g/L(参见附图3)。
e)选择B3、B5和B8菌株进行芽孢杆菌属细菌的联合培养。三菌(B3、B5和B8菌株)联合发酵的发酵液中的淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶的降解能力均有所增加,且三菌(B3、B5和B8菌株)联合发酵产生的胞外多糖(16.48±1.14g/L)也显著的高于单株发酵菌株的胞外多糖产量。
(5)菌种鉴定:
a)形态观察:
使用接种环挑取上述菌体制作涂片,并进行革兰氏染色和芽孢染色,观察其为革兰氏阳性的芽孢杆菌;其在LB固体培养基上生长24 h的形态具体参见附图4。其中B3菌株菌落较大,淡黄色或褐色,表面典型的粗糙不规则,有很多隆起和皱褶;B5菌株菌落为乳白色或淡黄色,表面呈圆形或粗糙不规则,有隆起和皱褶;B8菌株菌落呈乳白色,圆形,边缘有细齿,中间隆起,表面光滑。
b)分子生物学鉴定:
使用索莱宝细菌DNA提取试剂盒对上述菌株(B3、B5和B8菌株)的DNA进行提取,使用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)扩增16S rDNA基因片段并测序, B3菌株的16S rDNA的序列如SEQ ID No.1所示;B5菌株的16S rDNA的序列如SEQ ID No.2所示;B8菌株的16S rDNA的序列如 SEQ ID No.3所示。将测得基因序列提交到NCBI数据库进行比对(参见附图5),发现与B3亲缘关系最近的是枯草芽孢杆菌Z36 (MG470688.1);与B5亲缘关系最近的是莫海威芽孢杆菌261AG9 (KF811046.1);与B8亲缘关系最近的是解淀粉芽孢杆菌265XY3 (KF954553.1),同源性均未达到100%,说明上述3种菌株具有独立的分类学地位。
因此,本发明所提供的芽孢杆菌属B3、B5和B8菌株分别属于枯草芽孢杆菌、莫海威芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌,均是新发现的菌株,上述三种菌株于2019年4月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3 号;其中,枯草芽孢杆菌B3菌株的保藏编号为CGMCC NO.17601;莫海威芽孢杆菌B5菌株的保藏编号为CGMCC NO.17602;解淀粉芽孢杆菌B8菌株的保藏编号为CGMCC NO.17604。
实施例2:
芽孢杆菌属细菌联合培养的多糖产生能力测定
a)将上述芽孢杆菌属菌株B3、B5和B8菌株分别接种到LB培养基中,30℃摇床(230rpm)培养12h,备用。
b)联合培养:将上述种子液按照枯草芽孢杆菌B3 3%、莫海威芽孢杆菌B5 5%和解淀粉芽孢杆菌B8 5%转接到联合培养基(含工业酵母粉2%,工业葡萄糖3%,MgSO4 1%,pH 8.2-8.5)中,在30℃, 230rpm的条件下培养18h作为发酵液,备用;
菌株B3单独培养:将上述菌株B3的种子液按照13%的接种量转接到上述联合培养基中,在30℃,230rpm的条件下培养18h作为发酵液,备用;
菌株B5单独培养:将上述菌株B5的种子液按照13%的接种量转接到联合培养基中,在30℃,230rpm的条件下培养18h作为发酵液,备用;
菌株B8单独培养:将上述菌株B8的种子液按照13%的接种量转接到联合培养基中,在30℃,230rpm的条件下培养18h作为发酵液,备用。
c)分别取3mL发酵液加入到离心管中,10000rpm,4℃离心20 min收集上清液;将2mL的上清液中添加6mL 95%的冰乙醇,剧烈震摇至絮状沉淀后放置于4℃冰箱中过夜;10000rpm,4℃离心5min 收集沉淀,将沉淀使用75%的乙醇洗涤三次;室温下晾干,加入2mL无菌水制成粗多糖溶液。
d)通过苯酚-硫酸法对以上粗多糖溶液进行测量,结果如图3所示,B3发酵产生的胞外多糖为4.41±1.63g/L,B5发酵产生的胞外多糖为5.80±1.33g/L,B8发酵产生的胞外多糖为6.13±0.23g/L,三菌(B3、B5和B8菌株)联合发酵产生的胞外多糖为16.48±1.14g/L。三株菌单独培养时的胞外多糖产量均较高,联合培养条件下能显著性的提高其胞外多糖产量。
本发明所提供的芽孢杆菌属细菌(B3、B5和B8菌株)联合培养时能够产生大量的胞外多糖,能够高效的使沙粒团聚并保持相对稳定的状态。因此,上述三种菌株的组合物可广泛应用于沙区土壤改良前的进行沙区表面固定的这一必要步骤。
实施例3:
芽孢杆菌属细菌联合培养的土壤改良
a)将上述芽孢杆菌属菌株(B3、B5和B8菌株)分别接种到LB 培养基中,30℃摇床(230rpm)培养12h作为种子液。
b)将上述种子液按照枯草芽孢杆菌B3 3%、莫海威芽孢杆菌B5 5%和解淀粉芽孢杆菌B8 5%转接到联合培养基(工业酵母粉2%,工业葡萄糖3%,MgSO4 1%,pH 8.2-8.5)中,在30℃,230rpm的条件下培养18h作为发酵液,备用。
c)通过稀释涂布法测得有效活菌数分别为枯草芽孢杆菌B3 2.16 ×109CFU/mL、莫海威芽孢杆菌B5 1.19×109CFU/mL和解淀粉芽孢杆菌B8 1.61×109CFU/mL。将其发酵液的总有效活菌数稀释至1.0 ×106CFU/mL,按1.0×109CFU/m2的量均匀喷洒到沙区表面。
d)结果如图6所示,可以看出,在半年后沙区表面能够形成7cm 厚左右的沙粒聚集体(图6-b)。由此说明,本发明提供的枯草芽孢杆菌B3、莫海威芽孢杆菌B5和解淀粉芽孢杆菌B8联合,可以用于沙区土壤改良,起到良好的防沙固沙效果。
同时土壤肥力(容重、有机碳、全氮、机械组成等)指标明显改善。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院寒区旱区环境与工程研究所、宁夏回族自治区草原工作站(宁夏回族自治区草原监理中心)
<120> 用于沙区土壤改良的微生物组合物、微生物制剂以及方法
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1452
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
accgatggcg gcagctataa tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt 60
tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg 120
gaaaccgggg ctaataccgg atgcttgttt gaaccgcatg gttcaaacat aaaaggtggc 180
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cgtaaagggc tcgcaggcgg ttccttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg 600
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aagtgacaga tt 1452
<210> 2
<211> 1453
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gaaagtggcg gcagctaata atgcaagtcg agcggacaga tgggagcttg ctccctgatg 60
ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct gtaagactgg gataactccg 120
ggaaaccggg gctaataccg gatgcttgtt tgaaccgcat ggttcaaaca taaaaggtgg 180
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caccaaggca acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac 300
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