CN1928098A - 一种精制番茄红素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种精制番茄红素的工艺，特别涉及利用现代生物工程技术发酵生产与纯化番茄红素的方法。其目的在于采用三孢布拉氏霉菌(Blakeleatrispora)发酵生产番茄红素，并通过破壁技术释放出胞内物，纯化结晶得番茄红素。我们采用三孢布拉霉菌以补料分批发酵方式发酵生产的番茄红素，微波辐射破壁后，用90－95％的乙醇并以微波辅助进行萃取，加入蛋白酶、纤维素酶、果胶酶与淀粉酶彻底清除萃取液中的杂质，并采用分子筛吸附法对番茄红素进一步纯化，将热饱和溶液冷却析出番茄结晶，最后对结晶后的番茄红素进行微胶囊化。通过本发明优化了三孢布拉氏霉菌发酵的部分条件，番茄红素产量得到了进一步提高。
Description
技术领域
本发明涉及一种精制番茄红素的工艺，特别涉及利用现代生物工程技术发酵生产与纯化番茄红素的方法。
背景技术
番茄红素(Lycopene)是一种类胡萝卜素，分子式为C40H56，分子量为536.88，纯品为针状深红色晶体。番茄红素在分子结构上有11个共轭双键和2个非共轭双键组成的直链型碳氢化合物。
番茄红素是胡萝卜素的异构体，由于它没有β-胡萝卜素那样的β-芷香环结构，所以不具有维生素A原活性。但它具有最强的抗氧化活性，其淬灭单线态氧的速率常数是维生素E的100倍，清除自由基的功效远胜于其他类胡萝卜素和维生素E，是目前自然界中被发现的最强抗氧化剂之一。
番茄红素普遍存在于一般食用水果与食品中，但番茄含量最高，在其叶绿体中，番茄红素与蛋白质形成光合成色素蛋白质复合体附着在叶绿体膜上，至番茄成熟时，叶绿体中番茄红素形成折皱状晶体。人体的各种器官和组织中也广泛存在番茄红素，它是人体血浆中最主要且含量最高的类胡萝卜素。植物中的番茄红素几乎都是反式的，而在动物体内存在的番茄红素则是以顺式异构体为优势，反式番茄红素生理活性较顺式异构体高，而顺式番茄红素易溶于胆酸微粒并可优先融合乳糜微粒，故易为人体吸收及利用。
番茄红素具有多种生物学作用，如猝灭单线态氧、清除自由基、诱导细胞间连接通讯、调控肿瘤增殖等。番茄红素具有比其它类胡萝卜素更强的清除猝灭单线态氧的能力；它强有力的清除自由基的能力，对预防前列腺癌、结肠癌和子宫癌等具有显著的相关作用；番茄红素具有延缓衰老的作用，主要表现在人体器官中的番茄红素含量与大多数退化性疾病呈负相关；番茄红素对氧化胁迫介导的皮肤损害有保护效应；番茄红素可令不育男子的精子数目增多，精子的活跃性增强，从而医治不育问题。番茄红素作为天然色素已在全世界范围内被广泛接受，目前主要用于几个方面：(1)用于防止紫外线灼伤，保护皮肤的产品；(2)用于延缓衰老的产品；(3)用于类胡萝卜素复合产品；(4)应用于预防前列腺癌的产品；(5)用于食品、药品、化妆品的着色剂。
目前，获得番茄红素常用的有以下几种方法：有机溶剂提取法、超临界CO2萃取法、HPLC法、酶工程法、化学合成方法等。
采用有机溶剂提取法，以常用的非极性萃取剂氯仿与弱极性萃取剂乙醇为代表的有机溶剂提取法研究的最多。因番茄红素是油溶性色素，氯仿作为浸取剂溶解色素能力较强，其自身性质与其它溶剂相比更加稳定，当料液质量比为1∶5，浸提时间为7h，浸提温度为35℃时，浸取效果最好；同时，适当增加浸提次数及搅拌速度也可以提高番茄红素的提取量。而乙醇脱水处理后提取的最优佳工艺为：乙醇浸泡处理3次、料液比为1∶5，二氯甲烷在30℃振荡提取45min，番茄红素得率为85.7％。《番茄红素提取工艺的初步研究，邓宇，杨燕等，<化工科技，02，第10(1)期，P11，>》、《乙醇处理对番茄红素提取的影响姜雨，赵广华等，腰三角形<食品科技，04，第8期，P49>》。采用有机溶剂提取法，产品质量较差，纯度低，有异味和溶剂残留。
采用超临界CO2提取西红柿皮中番茄红素的工艺中，有四个因素较为重要：萃取压力(7.5～30.0Mpa)，温度(40～50℃)，CO2流速(5～50kg/h)，萃取时间(0.5～4.0h)，得到最佳工艺(得率90％)为温度40～50℃，压力为15～20Mpa，流速为20kg/h，萃取1～2小时。《番茄果实中番茄红素的超临界二氧化碳提取，惠伯棣，朱雨杰等，<现代仪器使用与维修，99·第一期>》。采用超临界CO2提取西红柿皮中的番茄红素，条件极为苛刻，不宜作为首选。
HPLC法是一种较为方便的番茄红素提取法，一般是将所有的类胡萝卜素经过高压液相色谱柱而将番茄红素分离出来，但成本昂贵。
酶工程法主要是利用西红柿皮自身酶反应来提取西红柿红素，在碱性条件下促使西红柿皮中的果胶酶和纤维素酶反应，分解果胶和纤维素使得番茄红素的蛋白质复合物从细胞中溶出，所得色素为水分散性色素，酶制剂影响提取效果顺序从大到小为复合酶＞纤维素酶＞果胶酶。单一用纤维素酶作外加酶时，最佳工艺条件为加入纤维素酶0.1％，酶作用时问2.5h，提取时间3.5h；单一用果胶酶作外加酶时，最佳工艺条件为加入果胶酶0.1％；酶作用时间2.5h，提取时间3.5h；用复合酶作外加酶时，最佳工艺条件为加入纤维素酶0.07％，果胶酶0.04％，酶作用时间2.5h，提取时间4h。《酶法提取番茄红素的研究》，赵功玲，娄天军，<食品工业科技，03-第4期，P61>。酶参与生化反应的环境为碱性，而番茄红素在碱性条件下极不稳定；再者，利用西红柿皮自身的酶系统进行分解果胶、纤维素等，其因其浓度较小，很难将底物分解完全，从而便番茄红素的得率大大降低。
化学合成法生产的番茄红素纯度较高。罗氏公司所采用的合成番茄红素工艺是由三苯基(3，7，11-甲基-2，4，6，10-十二四烯基)-氯化磷与2，7-二甲基-2，4，6-辛三烯二醛用甲醇钠一甲醇在2-丙醇中进行wittig烯化反应，制得番茄红素，收率65％。此外wegner等也完成由三苯基(3，7，11-三甲基-2，4，6，10-十二四烯基)-甲磺化磷与2，4，6-辛三烯二醛经wittig烯化反应得到番茄红素的下艺开发，并在欧洲提出专利申请1999年10月获批准。但随着人们对自身生活质量要求的逐渐提高，化学合成番茄红素受到冷落。《番茄红素的提取与合成工艺研究进展》，李士雨，李子颖，<中草药，第34卷，第1期，03年1月>。
在各国学者的不断努力下，又开发出许多高科技的生产技术。日本KirinBrewerrv公司采用代谢工程技术，即通过DNA重组技术改变细胞的代谢系统生产番茄红素。Kajivara等从产生虾黄素的酵母Pharff iarhosoayrna和雨生红球藻中分离出cDNA编码异戊烯焦磷酸藻酯(IPP)异构酶，将编码IPP异构酶cDNA转入E.codi菌株JM101能增加番茄红素的产量3.4-4.5倍。
欧共体很早就允许使用番茄红素，但由于其在各植物体内含量均较低(西红柿中平均只含有20mg/100g)，番茄红素因而一直未能大规模商业化生产，也难以满足市场的需求。在发现番茄红素的特殊生理功能后，以色列率先开发番茄红素产品，他们以通过基因工程获得的高番茄红素含量的杂交西红柿为原料，在生产各种西红柿加工制品的同时，利用有机溶剂萃取残渣中的番茄红素，但因转基因食品的认可问题，规模化推广未能实现。
三孢布拉氏霉菌是生产番茄红素的首选菌株。现已知该发酵菌株有正、负两种，一种为诱导菌，另一种为生产菌，当在麦芽汁琼脂培养基上培养48小时时，会形成2-4厘米的不均匀的菌斑，正菌株和负菌株只是在培养和形态上稍微有差异，正菌株菌丝呈灰色，负菌株菌丝呈黄色到褐色。
由丝状真菌三孢布拉氏霉菌(Blakeslea crispora)生物合成β-胡萝卜素的过程中，通过pH控制环化即可合成番茄红素。Gavilou等在三孢布拉氏霉菌的生长介质中加入工业番茄废水，发现抑制了β-胡萝卜素的生产并刺激番茄红素的合成。Obata等通过对蜂房芽孢杆菌DC-1在6-7klx光照下培养生产番茄红素。Matsmural等开发了能积聚番茄红素螺旋藻的生产方法，通过发酵并在培养基中加入尼古丁200-500mmol/L生产番茄红素，该方法成本较低。《ObataH，Kawahara H，Masamufi I，et al.Production of carotenoid analog[P].，Japan：，TP9000293，97-01-07.》、《Matsumura H，Kusakabc E.Productionof spirulina accumulacing lycopcnc[P].，Japan：，TP9313167，97-12-09.》
发明内容
本发明利用下述技术方案实现了解决目前技术中存在的问题。
我们采用微波辐射破壁，温度为40-55℃，处理完毕，菌丝体基本破壁死亡。接着，我们采用湿法的高速珠磨机进一步破坏菌丝体的细胞壁，解决菌丝浓度过高的问题，此过程中需连续使用该法，菌丝体经5分钟可破碎，破碎率可达98％以上，菌丝体碎片大小为10-25微米。
我们用90-95％的乙醇并以微波辅助进行萃取，温度为35-45℃，PH7.0，常压，萃取2-4次。采用乙醇萃取的关键环节是浓度、温度、PH的调节，本发明模拟各种条件的组合最后确定了番茄红素得率提高的这个最佳萃取条件。
为彻底清除萃取液中的杂质，我们加入蛋白酶(主要是内切蛋白酶)、纤维素酶、果胶酶与淀粉酶来处理萃取液，蛋白酶水解三孢布拉氏霉菌产生的蛋白质，纤维素酶与果胶酶处理其中的纤维素与果胶物质，淀粉酶用来水解残留的淀粉。酶解过程结束后，回收乙醇。
我们采用了分子筛吸附法对番茄红素进一步纯化，分子筛孔径要小于番茄红素分子的直径。吸附后，将热饱和溶液冷却析出结晶，因一次结晶番茄红素的晶格中会包含杂质，我们对番茄红素重结晶，最后加热干燥析出番茄红素产品。最后，番茄红素结晶度为75％，纯度＞98.5％。
对结晶后的番茄红素进行微胶囊化，喷雾干燥法制备番茄红素微胶囊的壁材，采用具有较好溶解性、成膜性、干燥性和低粘度的食用明胶和蔗糖的混合物，同时制备芯材的油相溶液采用乙酸乙酯。我们的方案为明胶和蔗糖以3-4∶12-16的质量比混合。这样，包理效率最好，可高达95％。喷雾干燥适宜的工艺条件为：进风温度为180℃-200℃，出风温度在80℃至100℃之间，进料温度50℃-60℃，进料速度(泵速)为40-50档，吹风速度为50-60档，压力适中即可。经喷雾干燥制备的微胶囊产品，大大提高了番茄红素的贮存稳定性；在微胶囊化过程中添加抗氧化剂异VC钠可起到保护番茄红素的作用，提高其稳定性。经过微胶囊化后，番茄红素的稳定性明显提高。保存至3周后其保留率仍在70％以上，而未微囊化的番茄红素在3周后就绝大部分已经氧化，保留率仅为10.43％。番茄红素微胶囊的溶解度达到88.7％以上，这说明微胶囊的水溶性较好，所选壁材遇水易释放芯材。喷雾干燥后色素损失率在11.46％-27.27％，平均损失率为19.93％，说明在喷雾干燥过程后其色素的保留率约80.07％左右。
我们采用三孢布拉霉菌正、负菌株单菌落发酵生产的番茄红素，以补料分批发酵方式(即在发酵的不同时间不断加入培养基，使培养基的量逐渐增大)，发酵液培养基为玉米淀粉50-60％、糖浆(蜜糖)5-10％、葡萄糖10-18％、玉米蛋白粉(或黄浆粉)8-18％、植物油3-5％、(NH4)2SO4 3-6％、NaCl1-3％等，发酵液初始浓度为25g/L，终始浓度一般为200g/L。发酵时间固定在60-80小时内，发酵温度维持在30-40℃，通气为0.2-0.3L/min。生物量达到40-50克/升，番茄红素产量达到1.0克/升。通过本发明优化了部分培养条件，番茄红素产量得到了进一步提高。
附图说明
图1工艺流程示意图
具体实施方式
参照图1，本发明具体实施方式如下：将三孢布拉氏霉菌(Blakelea trispora)原菌种(来自北京颐和天韵新技术研究所，正、负两菌株)单菌落菌株接种到250mL摇瓶中，接种量为10％，装液量为40mL/(250mL)，28℃，转速为200转/分，培养120h。将摇床后的菌株接种到种子罐，种子培养60-70小时，使其浓度达到200g/L，发酵温度维持在30-40℃，通气为-0.6L/min。种子培养完毕，将其接种到发酵液，发酵液初始浓度为25g/L，终始浓度一般为200g/L。发酵时间固定在60-80小时内，发酵温度维持在30-40℃，通气为0.2-0.3L/min。采用补料分批发酵，补料的间歇时间按发酵液的浓度定夺，在发酵液30-40小时前，一般为补料2-4次，后期一般补料1-2次。发酵完成后，采取离心方法将发酵液中过多的水分脱去，然后微波破壁，温度50℃，接着，采用湿法的高速珠磨机进一步破坏菌丝体的细胞壁，持续5分钟。然后热风干燥脱水取得固形物，用90-95％的乙醇并以微波辅助进行萃取，温度为35-45℃，PH7.0，常压，萃取2-4次，交叉过滤。在上述过滤液中，加入蛋白酶(主要是内切蛋白酶)、纤维素酶、果胶酶与淀粉酶，处理萃取液，完毕后，回收乙醇。接着，采用分子筛吸附法对番茄红素进一步纯化，吸附后，对番茄红素层进行反复清洗，最后加热干燥以析出其结晶体，结晶度为75％，纯度＞98.5％。对结晶后的番茄红素利用喷雾干燥法进行微胶囊化，明胶和蔗糖以3-4∶12-16的质量比混合成微胶囊的壁材，喷雾干燥进风温度为180-200℃，出风温度在80℃至100℃之间，进料温度50-60℃，进料速度(泵速)为40-50档，吹风速度为50-60档，压力适中即可。在微胶囊化过程中添加抗氧化剂异VC钠以防番茄红素遭破坏。
实施例1：种子培养
在250mL摇瓶中，采用种子液培养基，在28℃，接种量为10％，装液量为40mL/(250mL)，转速为200转/分，发酵时间为120h，番茄红素的产量可达到20g/L。种子液培养基：
酵母浸提物：5g(浙江德清东成药业有限公司，规格：培养基专用，总氮60-75％，氨基氮5-8％，盐小于1)
麦芽浸提物：20g(陕西宏达植物化工有限公司，规格：4∶1提取物)
葡萄糖8g(沈阳市试剂五厂，规格：AR/500g)
蔗糖：12g(沈阳市试剂五厂，规格：AR试剂级1)
蒸馏水：1000ml pH调至7.0
将摇床后的菌株接种到种子罐，种子液配方：
玉米浆：50-55％(河北健民淀粉糖业有限公司，蛋白质含量≥42％，水份≤8％，总磷(D.S)％＞1.0)
蔗糖：24-28％(同实例1) 葡萄糖：18％(同实例1)
(NH4)2SO4：2-4％(沈阳市试剂五厂，规格：AR试剂级)
NaCl：1.5-3.5％(沈阳市试剂五厂，规格：AR试剂级)
PH调至7.0
种子培养60-70小时，使其浓度达到200g/L，发酵温度维持在30-40℃，通气为0.4-0.6L/min。种子培养完毕，将其接种到发酵液。
实施例2：发酵
发酵液培养基(干物质重)：
玉米淀粉：50-60％(河北健民淀粉糖业有限公司，规格符合GB12309-90)
糖浆(蜜糖)：5-10％(上海达盛食品有限公司，规格：麦芽糖≥55％)
葡萄糖：10-18％(同实例1)
玉米蛋白粉(或黄浆粉)：8-18％(河北健民淀粉糖业有限公司，规格：粗蛋白湿基＞60％)
植物油：3-5％(德州大王集团蛋白食品有限公司，规格：来自大豆)
(NH4)2SO4：3-6％(同实例1) NaCl：1-3％(同实例1)
PH调至7.0
发酵液初始浓度为25g/L，终始浓度一般为200g/L。发酵时间固定在60-80小时内，发酵温度维持在30-40℃，通气为0.2-0.3L/min。
发酵类型补料分批发酵，即在发酵的不同时间不断加入培养基，使培养基的量逐渐增大。补料的间歇时间按发酵液的浓度定夺，在发酵液30小时前，一般为补料3次，后期一般补料1-2次。
补料成分为：
玉米淀粉：50-60％(同发酵液培养基)
糖浆(蜜糖)：20-25％(同发酵液培养基)
玉米蛋白粉：5-10％(同发酵液培养基)
(NH4)2SO4：3-5％(同实例1)
按5g/L的浓度稀释。
发酵液的预处理包括离心脱水和微波破壁过程。
发酵完成后的发酵液是一种混合物，一般为番茄红素、残余培养基、菌丝体及其它代谢产物。为彻底得到番茄红素纯物质，必须经过各种处理过程，首先，将发酵液中过多的水分脱去，这里采取离心方法。
为使菌丝体的多层细胞壁破碎，让胞内内含物释放出来，该工艺采取微波破壁方法。微波破壁，温度为45-55℃，处理完毕，菌丝体基本破壁死亡。接着，我们采用湿法的高速珠磨机进一步破坏菌丝体的细胞壁，解决菌丝浓度过高的问题，此过程中需连续使用该法，菌丝体经5分钟可破碎，破碎率可达98％以上，菌丝体碎片大小为10-25微米。
实施例3：萃取
预处理结束后，进行热风干燥脱水，以取得固形物便于萃取。
对脱水后的固形物进行萃取，用90-95％的乙醇并辅助以微波进行萃取，温度为35-45℃，PH7.0，常压，萃取2-4次。
为彻底清除萃取液中的杂质，以便于得到番茄红素的结晶体，在萃取完成后，加一交叉过滤的工艺，目的是将过多的菌丝体等杂质预先清除，以防番茄红素又重新吸附在菌丝体的表面。
在上述过滤液中，加入蛋白酶(主要是木瓜蛋白酶，广州市酶制剂厂，活性单位：100000IU)、纤维素酶(北京酶制剂总厂，活性单位：10000IU)、果胶酶(北京酶制剂总厂，活性单位：50000IU)与淀粉酶(广州市酶制剂厂，活性单位：50000IU)，处理萃取液。蛋白酶水解三孢布拉氏霉菌产生的蛋白质，纤维素酶与果胶酶处理其中的纤维素与果胶物质，淀粉酶用来水解残留的淀粉。
酶解过程结束后，回收乙醇。
回收乙醇完成后，将浓缩物置于蒸馏水中，反复清洗，并采用分子筛吸附法对番茄红素进一步纯化，分子筛孔径要小于番茄红素分子的直径。吸附后，对番茄红素层进行反复清洗，最后加热干燥以析出其结晶体，结晶度为75％，纯度＞98.5％。
采用三孢布拉氏霉菌正、负菌株发酵生产番茄红素，产量可达到2g/L。
实施例4：微胶囊化
对结晶后的番茄红素进行微胶囊化，喷雾干燥法制备番茄红素微胶囊的壁材，采用具有较好溶解性、成膜性、干燥性和低粘度的食用明胶和蔗糖的混合物，同时制备芯材的油相溶液采用乙酸乙酯(沈阳市试剂五厂，规格：CP化学纯)。最佳方案为明胶(漯河市五龙明胶有限公司，规格：食用骨胶)和蔗糖(同实例1)以3-4∶12-16的质量比混合。这样，包理效率最好，可高达95％。
喷雾干燥适宜的工艺条件为：进风温度为180-200℃，出风温度在80℃至100℃之间，进料温度50-60℃，进料速度(泵速)为40-50档，吹风速度为50-60档，压力适中即可。
经喷雾干燥制备的微胶囊产品，大大提高了番茄红素的贮存稳定性；在微胶囊化过程中添加抗氧化剂异VC钠可起到保护番茄红素的作用，提高其稳定性。经过微胶囊化后，番茄红素的稳定性明显提高。保存至3周后其保留率仍在70％以上，而未微囊化的番茄红素在3周后就绝大部分已经氧化，保留率仅为10.43％。
番茄红素微胶囊的溶解度达到88.7％以上，这说明微胶囊的水溶性较好，所选壁材遇水易释放芯材。
喷雾干燥后色素损失率在11.46％-27.27％，平均损失率为19.93％，说明在喷雾干燥过程后其色素的保留率约80.07％左右。
Claims (10)
1.一种精制番茄红素的方法。其特征在于采用三孢布拉氏霉菌(Blakeleatrispora)发酵生产番茄红素，并通过破壁技术释放出胞内物，纯化结晶得番茄红素。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于：所述破壁技术为微波破壁、高速珠磨之一或其组合。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于：可对结晶物进行微囊化处理。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于：三孢布拉氏霉菌株发酵是采用补料分批发酵方式优化三孢布拉氏霉菌株的扩繁条件。
5.根据权利要求1-4中之一所述的方法，其特征在于：三孢布拉氏霉菌株发酵的补料成分包括：玉米淀粉50-60％、糖浆20-25％、玉米蛋白粉5-10％、(NH4)2SO43-5％，按5g/L的浓度稀释。在发酵开始后30-40小时前，一般为补料2-4次，后期一般补料1-2次。
6.根据权利要求1的方法，其特征在于：发酵液的预处理采取了离心脱水、微波破壁和高速珠磨破壁相结合的方法。
7.根据权利要求1的方法，其特征在于：用90-95％的乙醇并辅助以微波对脱水后的固形物进行萃取，温度为35-45℃，PH7.0，常压，萃取2-4次；萃取完毕，采取交叉过滤方法，预先清除过多的菌丝体等杂质，以防番茄红素又重新吸附在菌丝体的表面；并采用蛋白酶(主要是木瓜蛋白酶)、纤维素酶、果胶酶与淀粉酶处理萃取液以使其清澈。
8、根据权利要求1的方法，其特征在于：采用分子筛吸附法对番茄红素进一步纯化，此后，反复清洗番茄红素层，最后加热干燥析出番茄红素结晶，结晶度为75％，纯度＞98.5％。
9.根据权利要求1的方法，其特征在于：采取微胶囊化方法处理番茄红素结晶后，采用具有较好溶解性、成膜性、干燥性和低粘度的食用明胶和蔗糖的混合物，同时制备芯材的油相溶液采用乙酸乙酯。其中明胶和蔗糖以3-4∶12-16的质量比混合。
10.根据权利要求1或9的方法，其特征在于：微胶囊化方法处理番茄红素结晶时，喷雾干燥适宜的工艺条件为：进风温度为180℃-200℃，出风温度在80℃至100℃之间，进料温度50℃-60℃，进料速度(泵速)为40-50档，吹风速度为50-60档。
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