CN101993827A - 一株促进桉树光合作用的功能内生真菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株促进桉树光合作用的功能内生真菌及其应用，所述功能内生真菌为青霉(Penicilliumsp.)菌株7，所述菌株7的保藏号为CGMCCNo.4055。本发明涉及的菌株是从观恩桉和尾巨桉植株中分离纯化得到的，经接种于桉树，根据光合作用的各项指标综合评判，进一步证实其对光合作用具有促进作用以及实际对桉树的干物质的增效作用，该促进光合作用的功能内生真菌可应用于生产。该菌株对于促进植株的光合作用和增加桉树的干物质积累具有极显著效果。同时在桉树组培苗生根、炼苗中均有明显作用。

Description

一株促进桉树光合作用的功能内生真菌及其应用 

技术领域

本发明涉及一株青霉菌株及其应用。 

背景技术

植物内生菌的研究始于19世纪末，Vogl从黑麦草Lolium temulentum L.种子中分离出第一株内生菌^[1]。但真正开始大量研究植株中的内生菌起始于上世纪八十年代，主要是在温带地区、亚热带地区和热带地区的植被中开展研究。 

前人从大部分植物中都能分离出内生菌，因此可以推测内生菌在植株中是普遍存在的。在全世界范围内至少在80多个属290多种的禾本科农作物中发现了内生菌^[2]。目前从植物中分离的内生菌根据其具有的独特功能可以分为：固氮菌、固钾菌、固磷菌等植物促生菌^[3-4]、具有抗病虫害的生防菌^[5-8]和具有促进植物对不良环境的修复能力的抗性菌（Lodewyckx et al,2002）。在促进光合作用方面的内生菌报道极少，仅有在水稻上发现一种具有光合作用能力的内生菌，它也被证明是豆荚Aeschynomene^[9]茎瘤中固氮菌Bredyrhizobium的一个株系。在桉树内生真菌的研究主要集中在外生菌根（ECM）和VA菌根真菌的研究方面^[10]。桉属树种在自然界中既有外生真菌又有内生真菌，这在国内外均被证实，但内生真菌的自然感染率不高。弓明钦等^[11]（1992）进行桉树幼苗菌根接种及生长效应的研究中应用漏斗孢球囊霉（Glomus Mosseae）和地表球囊霉（G. epigaeum）两种菌进行高生长和直径生长比较。陈应龙^[10]（1998）用外生真菌彩色豆马勃和苏格兰球囊霉混合接种对尾叶桉的高生长、直径生长、干重的比较研究。前人的研究中应用菌株，多为外生真菌，同时也没有从促进光合作用的根本因素去寻找内生真菌，提高其科学性和可靠性^[12]。桉树的ECM菌根真菌主要包含担子菌亚门（Basidiomycotina）、子囊菌亚门（Ascomycotina）和接合菌亚门（Zygomycotina）等，VA菌根真菌主要包含接合菌亚门球囊霉目（Glomales）。能促进光合作用的内生菌方面尚未见报道。 

发明内容

本发明的目的在于提供一株能促进桉树光合作用的功能内生真菌及其应用。 

本发明提供的一株能促进桉树光合作用的功能内生真菌，所述功能内生真菌为青霉（Penicillium sp.）菌株7，所述菌株7的保藏号为CGMCC No.4055，该菌株的分离、纯化包括： 

A、材料：采集野外邓恩桉和尾巨桉植株直径0.5cm以下的根、直径0.5cm以下的茎段和成熟叶；

B、消毒：叶片消毒采用70％酒精浸泡40s、0.1％升汞浸泡90s，茎段消毒采用70％酒精浸泡30s、0.1％升汞浸泡60s，根部消毒采用70％酒精浸泡50s、0.1％升汞浸泡120s；

C、分离：将经严格表面消毒的野外邓恩桉、尾巨桉植株的根、茎段和成熟叶接入真菌固体培养基进行内生真菌的繁殖；

固体培养：使用改良马丁固体培养基，配方为蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、琼脂14.0g/L、其它为无菌水，pH值6.4±0.2，培养温度为28℃，培养方式为平板培养，培养时间为48h；

D、将分离繁殖出的不同种类的内生真菌接入平板培养基进行纯化，经过2-3次点接法纯化、转接后得到单一菌种的的所述功能内生真菌即青霉（Penicillium sp.）菌株7；

所述点接法纯化：将消毒后的接种环轻微点击菌体表面，然后将其点击接种面，该方法较传统的点植培养法更易控制接种量，从而提高对内生真菌的接种效率与检出率。

本发明的青霉（Penicillium sp.）菌株7的应用如下： 

（1）菌液制备：将上述的菌株接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28℃，培养时间48～72h，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1.0至9.0×10⁶cfu/ml即为成品备用；所述液体培养基为改良马丁培养基,配制为：蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH值6.4±0.2。

（2）应用方法：将制备的菌液用于林地浇根、组培进入炼苗期前蘸根或组培过程的切芽阶段转入生根培养基前蘸芽。 

所述林地浇根为将浓度9.0×10⁶cfu/ml的菌液，按每株100ml在林地浇于每株桉树的根际。 

所述组培进入炼苗期前蘸根是将浓度为5.0×10⁶cfu/ml菌液在组培进入炼苗期前蘸根1-5min。 

所述组培过程的切芽阶段转入生根培养基前蘸芽是在组培过程的切芽阶段转入生根培养基前，将浓度为3.0×10⁶cfu/ml的菌液浸蘸芽基部1-5min，然后接入生根培养基继续培养。 

本发明的青霉（Penicillium sp.）菌株7形态特征如下： 

在平面培养基上按常规方法培养，观察其形态。培养基的正面其菌落呈灰绿色，背面黄褐色，单个圆形；菌丝体有隔，分化出分生孢子梗，孢子为无色；末端生小梗，小梗直立，呈刷状，单胞，卵圆形，表面光滑；分生孢子梗自菌丝单个地发生，在顶部附近分枝，形成典型的帚状特征结构。

参照真菌鉴定手册将菌株7鉴定为青霉属(Penicillium)。 

本发明的青霉（Penicillium sp.）菌株7，已经于2010年7月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No. 4055。 

本发明涉及的菌株是从观恩桉和尾巨桉植株中分离纯化得到的，经接种于尾巨桉组培苗，根据光合作用的各项指标综合评判，进一步证实其对光合作用具有促进作用以及实际对桉树的干物质的增效作用，该促进光合作用的功能内生真菌可应用于生产。通过菌液浇施的方法将菌接种于尾巨桉幼苗，接种30天后用GFS-3000气体交换－荧光测量系统进行光合作用各项指标的测定。光响应研究表明：最大大净光合速率Pmax为16.37 CO₂umol.m^-2.s^-1，比对照高59.6％。光饱和点为1408.65umol.m^-2.s^-1，比对照高30.2％。光补偿点只有14.55umol.m^-2.s^-1，低于对照32.6％。表观量子效率α达到0.033，高于对照43.5％。暗呼吸速率Rd达到0.73，高于对照12.3％。CO2响应试验表明：最大净光合速率为36.0CO₂u mol.m^-2.s^-1，比对照高89％。CSP为1601.89umol.mol^-1，高于对照10.5％。温度响应试验表明：最大光合速率为15.3 CO₂umol ^. m^-2. s^-1，高于对照37.8％。通过接种后植株的光响应、CO2响应和温度响应研究，得出该菌种在各个响应研究中光合作用能力均较大程度高于对照，接种30d后每株尾巨桉幼苗干重比对照增加29.46%，表明其对于促进植株的光合作用和增加桉树的干物质积累具有极显著效果。同时在桉树组培苗生根、炼苗中均有明显作用。 

具体实施方式

本发明一株能促进桉树光合作用的功能内生真菌（Penicillium sp.），所述功能内生真菌为青霉（Penicillium sp.）菌株7，该菌株的分离、纯化包括： 

A、材料：采集野外邓恩桉和尾巨桉植株直径0.5cm以下的根、直径0.5cm以下的茎段和成熟叶；

B、消毒：叶片消毒采用70％酒精浸泡40s、0.1％升汞浸泡90s，茎段消毒采用70％酒精浸泡30s、0.1％升汞浸泡60s，根部消毒采用70％酒精浸泡50s、0.1％升汞浸泡120s；

C、分离：将经严格表面消毒的野外邓恩桉、尾巨桉植株的根、茎段和成熟叶接入真菌固体培养基进行内生真菌的繁殖；

固体培养：使用改良马丁固体培养基，配方为蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、琼脂14.0g/L、其它为无菌水，pH值6.4±0.2，培养温度为28℃，培养方式为平板培养，培养时间为48h；

D、将分离繁殖出的不同种类的内生真菌接入平板培养基进行纯化，经过2-3次点接法纯化、转接后得到单一菌种的的所述功能内生真菌即青霉（Penicillium sp.）菌株7；

本发明的青霉（Penicillium sp.）菌株7的应用如下：

A、菌液制备：将上述的菌株接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28℃，培养时间48～72h，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1.0至9.0×10⁶cfu/ml即为成品备用；所述液体培养基为改良马丁培养基,配制为：蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH值6.4±0.2。

B、应用方法： 

1、组培繁殖中的应用

应用1：取浓度为5.0×10⁶cfu/ml的菌液，在组培进入炼苗期前蘸根1-5min。可提高炼苗移栽成活率10%以上。

应用2：在组培过程的切芽阶段转入生根培养基前，将浓度为3.0×10⁶cfu/ml的菌液浸蘸芽基部1-2、 

2、根际土壤浇施应用

试验材料：尾巨桉组培苗3229，苗木于2009年3月盆栽于福建农林大学森林生态研究所田间试验地。用直径15cm，高14cm的塑料盆子栽种，所用土壤为黑色泥碳土，腐殖质丰富，疏松多孔，经过严格蒸汽消毒灭菌待用。经过称量每盆放入相等质量的5kg泥土。

根际土壤浇施：苗木经过一个月的恢复性生长，在桉树根际施入菌株浓度为5.0×10⁶cfu/ml的菌液50ml，重复3次，用蒸馏水溶液处理作为空白对照。 

接种后30天后进行光合作用等指标的测定,检测方法和结果如下： 

2.1菌株浇施后的尾巨桉的光合特征分析

在田间用GFS-3000气体交换－荧光测量系统对菌株接种后的桉树以及对照植株进行分析，选择中上部向阳枝条上成熟新梢生理成熟的、叶龄一致的3～4片叶子，进行光合测定，其中包含：光响应曲线、CO₂响应曲线、温度响应曲线。每个处理测量3株，每株测量3～5片叶子，取其平均值。

光响应曲线的测定：将光源设定一系列光合有效辐射梯度：0、50、100、150、200、400、600、800、1000、1200、1400、1600、1800umol·m^-2·s^-1，用GFS-3000气体交换－荧光测量系统进行光响应测定。 

CO₂响应曲线的测定：将CO2浓度设定一系列梯度：10、50、100、150、200、250、400、600、800、1000、1200、1400、1600、1800、2000umol·mol^-1，用GFS-3000光合测定系统进行不同CO₂浓度响应测定。 

温度响应曲线的测定：将叶室温度设定一系列梯度：18、21、24、27、30、33、36、39℃，用GFS-3000光合测定系统进行温度响应的测定。 

数据处理：将GFS-3000光合仪所测量的数据输入电脑，应用SPSS软件和EXCEL表格进行数据的处理分析。应用叶子飘构建的新模型来拟合所测得的光响应数据，CO₂浓度响应的拟合方法同光响应模型的拟合方法。 

2.2 光合速率对光强的试验 

将光源设定一系列光合有效辐射梯度：0、50、100、150、200、400、600、800、1000、1200、1400、1600、1800umol·m^-2·s^-1，用GFS-3000气体交换－荧光测量系统进行光响应测定。

试验所描述的光响应曲线反映了在较低光合有效辐射10umol.m^-2.s^-1-200umol.m^-2.s^-1时，净光合速率Pn直线上升，且上升速度较快。在辐射区间200umol.m^-2.s^-1-800umol.m^-2.s^-1内，净光合速率骤然上升，上升速度明显加快，几乎呈直线状态。当光强大于800umol ^. m^-2. s^-1，净光合速率上升逐渐趋于平缓，可能是由于光抑制的结果。光抑制是植物的光合作用受外在因素制约的一种现象，它最为明显的特征是引起表观量子效率的降低。光合速率在光强达到1000umol ^. m^-2. s^-1～12000umol ^. m^-2. s^-1时出现下降。 

将所测的数据光合速率和光合有效辐射的数据根据光响应模型进行拟合，如表1所示，R²的数值均大于0.99，表明了拟合均达到极显著的效果。拟合结果得到菌株处理即接种菌株后的桉树叶的光补偿点、最大光合速率、光饱和点和暗呼吸速率等相关光合参数；在低光合有效辐射（0-200umol ^. m^-2. s^-1）下，将光合速率和光合有效辐射的成对值进行直线回归，可以得到菌株的表观量子效率即回归方程的斜率。 

最大净光合速率Pmax是最大光合速率和呼吸速率的差值，它反映了植物利用光能的最大能力。由表1可以看出，菌株处理的最大净光合速率为16.37 CO₂umol ^. m^-2. s^-1，而对照为10.26CO₂umol ^. m^-2. s^-1，菌株高于对照59.6％。 

光饱和点（LSP）可以反映植物利用强光的能力，数值越高表明植物所能利用到的光强上限越高，也在较强光照条件下不易发生光抑制，这也从另一方面反映了植株利用光能的能力。由表1可知，菌株处理的光饱和点为1408.65umol ^. m^-2. s^-1，对照为1081.67umol ^. m^-2. s^-1，菌株高于对照30.2％。 

光补偿点（LCP）是植物利用弱光能力的重要指标，数值越小表明利用弱光的能力越强，在一定程度上增加的植物光合作用的时间，有利于植物干物质的积累，它也是植物耐阴性的一个重要指标。由表1可知，菌株处理的光补偿点只有14.55umol ^. m^-2. s^-1，对照为21.58umol ^. m^-2. s^-1，低于对照32.6％。 

表观量子效率（α）是光合作用组织吸收一个光量子所固定的CO₂分子数或所释放的O₂分子数。表观量子效率也是代表植物利用弱光能力的一个重要指标，它在一定程度上反映了植物吸收和转化光能的色素蛋白复合体的多少。由表1可知，菌株处理的α达到0.033，高于对照43.5％。 

暗呼吸速率（Rd）是植株在光强为零时的净光合速率。由表1可知，菌株达到0.73，高于对照12.3％。植株的暗呼吸速率越高，表明其在低光照条件下利用光能的能力越高，有利于植物在阴暗条件下干物质的积累。 

表1 菌株光响应特征参数值 

 

2.3 二氧化碳响应的试验

CO₂响应曲线的测定：将CO₂浓度设定一系列梯度：10、50、100、150、200、250、400、600、800、1000、1200、1400、1600、1800、2000umol ^. mol^-1，用GFS-3000光合测定系统进行不同CO₂浓度响应测定。

本发明通过桉树在菌株的影响下和不同二氧化碳浓度下光合速率的变化，进一步验证菌株在高浓度二氧化碳环境中的生长生理特征，佐证在特定条件下菌株对桉树生长的促进作用。 

接种菌株的桉树叶经不同CO₂浓度处理后，桉树净光合速率－CO₂浓度响应曲线与对照具有一定的相似性：0～250umol ^. mol^-1的CO₂浓度范围内，净光合速率呈现直线上升趋势，上升趋势较缓慢；250～800umol ^. mol^-1的CO₂浓度范围内，净光合速率也几乎呈现直线上升趋势，上升趋势明显加强；800～2000umol ^. mol^-1的CO₂浓度范围内，净光合速率上升曲线明显变缓慢；1400～1800umol ^. mol^-1的CO₂浓度范围内出现最大净光合速率。这表明前期由于受到二氧化碳浓度增加的影响，植株的光合作用明显得到了加强，当CO₂浓度达到其所能承受的最大值，光合速率达到了最大，后面随着CO₂浓度的增加，产生了CO₂抑制光合作用的现象，净光合速率呈现下降的趋势。 

将所测数据光合速率Pn与CO₂ 浓度的成对值应用叶子飘的二氧化碳响应模型进行拟合，可以得到菌株处理的CO₂饱和点、最大光合速率、CO₂补偿点等相关光合参数；在低CO₂浓度（0-250umol ^. mol^-1）下，将光合速率Pn和CO₂ 浓度的成对值进行直线回归，可以得到菌株处理的羧化效率即回归方程的斜率。 

如表2所示，菌株处理的最大净光合速率为36 CO₂umol.m^-2.s^-1，对照为19.05CO₂u mol ^. m^-2. s^-1，菌株处理高于对照89％，表明菌株对桉树光合作用能力产生了促进作用。CO₂饱和点（CSP）反映了植物利用高浓度CO₂的能力。菌株处理的CSP1601.89umol ^. mol^-1，菌株高于对照10.5％。这表明菌株处理仍具有较高的利用高浓度CO₂浓度的能力。CO₂补偿点（CCP）是代表了植物利用低浓度CO₂的能力，数值越小代表了其利用低浓度CO₂能力越强。菌株处理的CCP为57.44umol ^. mol^-1，对照为58.02umol ^. mol^-1，菌株低于对照6.98%。 

表2 菌株CO2响应特征参数值 

 

2.4 温度响应的试验

温度响应曲线的测定：将叶室温度设定一系列梯度：18、21、24、27、30、33、36、39℃，用GFS-3000光合测定系统进行温度响应的测定。

温度是影响和制约植物光合作用的重要因素之一。菌株处理对于不同温度所产生光合速率的变化趋势基本一致。在较低温度状态下，净光合速率随着温度的上升呈现上升的趋势。但温度达到最适温度，净光合速率呈现最大值。随着温度的继续上升，光合作用产生了抑制现象，呈现下降的趋势。菌株处理的最大光合速率为15.3 CO₂umol ^. m^-2. s^-1，高于对照37.8％。这表明桉树较适合较高的环境温度，该菌还有利于提高其光合速率。 

本发明发现一株能促进桉树光合作用的内生真菌，将该株桉树内生真菌菌株采用菌液浇施的方法接种于尾巨桉幼苗。通过接种后植株的光响应、CO₂响应和温度响应试验，得出菌株处理在各个响应实验中光合作用能力均较大程度高于对照，表明其对于促进植株的光合作用具有很大作用，从而进一步证实得到该株内生真菌能促进桉树光合作用。 

同时对接种后桉树的单株干重进行测定，结果菌株于尾巨桉组培苗30d后的植株的干重为4.57g/株，为最重，而对照处理为3.53g/株。接种菌株后植株的干重增加29.46%，效果十分显著。 

  

参考文献

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[12]谯天明等.四川桉树内生菌根真菌的研究[J].四川林业科技,2001,22(3):6-9.

Claims (7)

1.一株促进桉树光合作用的功能内生真菌，其特征在于：所述功能内生真菌为青霉（Penicillium sp.）菌株7，所述菌株7的保藏号为CGMCC No.4055。

2.一种如权利要求1所述的功能内生真菌的分离纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）材料：采集野外邓恩桉和尾巨桉植株直径0.5cm以下的根、直径0.5cm以下的茎段和成熟叶；

（2）消毒：叶片消毒采用70％酒精浸泡40s、0.1％升汞浸泡90s，茎段消毒采用70％酒精浸泡30s、0.1％升汞浸泡60s，根部消毒采用70％酒精浸泡50s、0.1％升汞浸泡120s；

（3）分离：将经严格表面消毒的野外邓恩桉、尾巨桉植株的根、茎段和成熟叶接入固体培养基进行内生真菌的繁殖；

（4）固体培养：使用改良马丁固体培养基，配方为蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、琼脂14.0g/L、其它为无菌水，pH值6.4±0.2，培养温度为28℃，培养方式为平板培养，培养时间为48h；

（5）纯化：将分离繁殖出的不同种类的内生真菌接入平板培养基进行纯化，经过2-3次点接法纯化、转接后得到单一菌种的所述功能内生真菌。

3.一种如权利要求1所述的功能内生真菌的应用菌液的制备方法，其特征在于：将所述的菌株接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28℃，培养时间48～72h，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1.0至9.0×10⁶cfu/ml，备用；

所述液体培养基配制为：改良马丁培养基,其中蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH值6.4±0.2。

4.一种如权利要求3所述的应用菌液的用途，其特征在于：所述菌液用于林地浇根、组培进入炼苗期前蘸根或组培过程的切芽阶段转入生根培养基前蘸芽。

5.根据权利要求4所述的应用菌液的用途，其特征在于：所述林地浇根为将浓度9.0×10⁶cfu/ml的菌液，按每株100ml在林地浇于每株桉树的根际。

6.根据权利要求4所述的应用菌液的用途，其特征在于：所述组培进入炼苗期前蘸根是将浓度为5.0×10⁶cfu/ml菌液在组培进入炼苗期前蘸根1-5min。

7.根据权利要求4所述的应用菌液的用途，其特征在于：所述组培过程的切芽阶段转入生根培养基前蘸芽是在组培过程的切芽阶段转入生根培养基前，将浓度为3.0×10⁶cfu/ml的菌液浸蘸芽基部1-5min，然后接入生根培养基继续培养。