CN114602968A - 氮肥-菌剂协同强化重金属污染土壤植物修复效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种氮肥‑菌剂协同强化重金属污染土壤植物修复效率的方法，包括：将印度芥菜种植于配施了硝态氮基肥的Cd、Zn和Pb复合重金属污染土壤中，在印度芥菜生长过程中，向所述Cd、Zn和Pb复合重金属污染土壤中接种菊微小杆菌(Exiguobacterium indicum)菌液。本发明通过硝态氮肥协同菊微小杆菌可钝化植物抗副球菌素蛋白的表达，大幅度提高印度芥菜对Cd、Zn和Pb的提取效率，该技术有望为植物修复复合重金属污染土壤研究提供新的方法。

Description

氮肥-菌剂协同强化重金属污染土壤植物修复效率的方法

技术领域

本发明涉及土壤修复技术领域，具体涉及一种菊微小杆菌(Exiguobacteriumindicum)协同硝态氮肥钝化超积累植物印度芥菜抗副球菌素蛋白强化复合重金属污染土壤植物修复效率的方法。

背景技术

近年来，土壤重金属污染问题日益突出，严重威胁到生态系统安全与人类健康，极大制约了资源和经济可持续发展。有数据显示土壤重金属镉(Cd)、铅(Pb)和锌(Zn)点位超标率分别为7.0％、1.5％和0.9％。

传统的土壤修复方法常存在破坏土壤肥力、经济效益差及易引起二次污染等不足，如何经济有效地修复重金属污染土壤仍是当今环境保护的技术难题。

植物修复作为一种新兴的土壤修复技术，具有成本低、无二次污染等特点，是目前土壤修复重金属污染领域的研究热点。然而，其应用却受到超积累植物普遍生物量低和生长周期长等因素的制约。强化植物修复效率是推动污染土壤植物修复行业发展的关键。

近年来微生物联合植物修复作为一种强化植物修复技术，充分发挥植物与微生物修复技术的优势，已逐渐成为人类研究重点。如土壤根际微生物分泌的酒石酸可通过与Cd形成可溶性Cd-酒石酸复合物的形式高效促进Cd的溶解，土壤中Cd²⁺的有效态含量的增加使东南景天根和地上部Cd积累量分别提高75％和35％(Tao等，Journal of hazardousmaterials,2020,383:121177)；在种植芒草的复合重金属土壤中接种假单胞菌AGB-1(Pseudomonas koreensis AGB-1)可释放质子和有机酸，从而显著降低土壤pH，使得土壤中有效态As、Cd、Cu、Pb和Zn都增加3倍以上，芒草对上述几种重金属的积累有不同程度的增加(Babu等，Journal of Environmental Management,2015,151:160-166)；接种产表面活性剂的伯克霍尔德氏菌Z-90(Burkholderia sp.Z-90)，5d后其对土壤中Zn、Pb、Cd、Cu和As的去除效率分别达44.0％、32.5％、37.7％、24.1％和31.6％(Yang等，Journal of HazardousMaterials,2016:145-152)；芽孢杆菌属MN3-4(Bacillus sp.MN3-4)能通过产生胞外聚合物(EPS)将Pb²⁺隔离在植物细胞外或外聚物直接吸收Pb²⁺的方式限制Pb²⁺进入植物细胞以减少或消除Pb²⁺对植物的毒性，使印度芥菜根长增加了161.02％，芥菜对Pb的吸收率提高了5倍以上(Shin等，Journal of Hazardous Materials,2012,199:314-320)；嗜麦芽寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp)则能将有毒的Se(IV)还原为Se(0)，有效降低金属的毒性，从而影响植物对重金属的吸收(Di等，Environment International,2005,31(2):233-241)。

值得注意的是，上述微生物-植物联合修复技术研究中所采用的菌剂大多是通过分泌有机酸、氨基酸或生物表面活性剂等方式增加土壤中重金属的生物有效性，或是通过与金属发生络合反应、氧化还原反应等方式提高植物的修复效率。上述菌剂如假单胞菌AGB-1、伯克霍尔德氏菌Z-90(Burkholderia sp.Z-90)、芽孢杆菌属MN3-4及嗜麦芽寡养单胞菌属等虽然可以有效促进植物修复效率，但是也存在土壤酸化等土壤生理生化破坏等问题。

以不改变土壤性质为前提，强化植物根系自身吸收重金属的方法具有更好的应用潜力。

发明内容

针对上述技术问题以及本领域存在的不足之处，本发明提供了一种氮肥-菌剂协同强化重金属污染土壤植物修复效率的方法，通过接种菊微小杆菌钝化植物抗副球菌素蛋白的表达，并配施硝态氮进一步降低其表达量，以促进超积累植物印度芥菜对Cd、Zn和Pb的吸收和积累。本发明方法成本低、安全且无二次污染，并能极大程度增强印度芥菜对Cd、Zn和Pb的积累，是提高植物修复效率的有效手段。

具体技术方案如下：

一种氮肥-菌剂协同强化重金属污染土壤植物修复效率的方法，包括：将印度芥菜种植于配施了硝态氮基肥的Cd、Zn和Pb复合重金属污染土壤中，在印度芥菜生长过程中，向所述Cd、Zn和Pb复合重金属污染土壤中接种菊微小杆菌(Exiguobacterium indicum)菌液。

本发明研究发现，在Cd、Zn和Pb的复合重金属污染土壤中配施硝态氮肥，协同接种菊微小杆菌，可通过钝化植物抗副球菌素蛋白的表达，显著强化超积累植物印度芥菜对Cd、Zn和Pb的积累。

印度芥菜在Cd、Zn和Pb复合重金属污染土壤的生长过程中，采用本发明方法能显著促进印度芥菜对土壤内Cd、Zn和Pb的吸收与积累。

与未做处理的对照相比，硝态氮协同菊微小杆菌可使印度芥菜Cd、Zn和Pb单株积累量则增加343％-456％。

因此，本发明方法对重金属污染土壤的植物修复效率的强化作用具有可行性。

并且，本发明进一步研究发现配施尿素(酰胺态氮)对菊微小杆菌而言无此特别的强化效果，配施铵态氮肥较仅接菌虽有明显效果，但远不及配施硝态氮肥效果理想。这说明配施硝态氮肥在菊微小杆菌强化印度芥菜修复效率时是一个关键的条件。

在一优选例中，所述的氮肥-菌剂协同强化重金属污染土壤植物修复效率的方法，所述菊微小杆菌为德国微生物菌种保藏中心保藏号为DSM 28408的菊微小杆菌。

在一优选例中，所述的氮肥-菌剂协同强化重金属污染土壤植物修复效率的方法，所述菊微小杆菌(Exiguobacterium indicum)菌液接种至印度芥菜根部土壤表层深0.4～0.6cm处。

在一优选例中，所述的氮肥-菌剂协同强化重金属污染土壤植物修复效率的方法，所述菊微小杆菌(Exiguobacterium indicum)菌液细胞浓度为1×10⁷～1×10⁸CFU mL^-1。

在一优选例中，所述的氮肥-菌剂协同强化重金属污染土壤植物修复效率的方法，每次接种菊微小杆菌(Exiguobacterium indicum)菌液的体积为20～30mL/50株印度芥菜。

在一优选例中，所述的氮肥-菌剂协同强化重金属污染土壤植物修复效率的方法，每周接种一次菊微小杆菌(Exiguobacterium indicum)菌液，共接种4次。

在一优选例中，所述的氮肥-菌剂协同强化重金属污染土壤植物修复效率的方法，所述Cd、Zn和Pb复合重金属污染土壤中含水量保持在60％～70％。

在一优选例中，所述的氮肥-菌剂协同强化重金属污染土壤植物修复效率的方法，印度芥菜生长周期内控制光周期12h/20～26℃/d，光照强度50～60μmol photons m^-2s^-1。

在一优选例中，所述的氮肥-菌剂协同强化重金属污染土壤植物修复效率的方法，所述硝态氮基肥的配施量为150～250mg N/kg土壤。

在一优选例中，所述的氮肥-菌剂协同强化重金属污染土壤植物修复效率的方法，所述硝态氮基肥为Ca(NO₃)₂。

与现有技术相比，本发明具有如下显著的技术效果：

1、当未配施氮肥时，菊微小杆菌可使印度芥菜体内重金属(Cd、Zn和Pb)积累量较对照增加169％-181％。

2、硝态氮肥协同菊微小杆菌可使印度芥菜体内重金属(Cd、Zn和Pb)积累量较仅接种菊微小杆菌处理增加64％-98％，较未做处理的对照增加343％-456％，而配施尿素或铵态氮肥等其他氮肥无此强化效果或效果显著不如配施硝态氮。这说明，配施硝态氮肥在菊微小杆菌强化印度芥菜修复效率时是一个关键的条件。

综上所述，本发明通过硝态氮肥协同菊微小杆菌可钝化植物抗副球菌素蛋白的表达，大幅度提高印度芥菜对Cd、Zn和Pb的提取效率，该技术有望为植物修复复合重金属污染土壤研究提供新的方法。

附图说明

图1为不同处理下印度芥菜体内抗副球菌素蛋白表达量相对值变化；

图2为不同处理下印度芥菜体内重金属积累量较未处理对照的增加百分比。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的操作方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本试验植株为典型超积累植物印度芥菜(Brassica juncea)，购自渡口人家种子超市(中国，广东，惠州)。试验土壤采自中国浙江省上虞区废弃铅锌矿周边地区表层(0-20cm)，经自然风干后按每盆0.4kg称重装入直径为11cm，高9cm的塑料花盆中待用。试验菌株为菊微小杆菌(德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)，保藏号为DSM 28408)。将菌株于10g L^-1蛋白胨、5g L^-1牛肉膏和10g L^-1NaCl，pH 7.2的Luria-Bertani's(LB)液体培养基中恒温震荡培养3d(150r min^-1，温度30℃)，随后3000×g离心10min后用无菌0.9％生理盐水洗涤两次，采用稀释平板计数法得到浓度为1×10⁸CFU mL^-1的细菌悬浮液。

于播种前按照0和200mg N/kg土壤含量施入Ca(NO₃)₂与土壤混合均匀。将50粒相同大小的印度芥菜种子均匀撒入每盆试验土壤中，于第7d向土壤中接种30mL 10⁸CFU mL^-1的细菌悬液。同时，设接入30mL无菌水的对照。每隔7d接种一次，共处理4周。本试验于人工气候室中进行，条件如下：温度20-25℃，相对湿度60％-70％，光周期12h/d，光照强度50～60μmol photons m^-2s^-1。植物生长期间，每隔1d补充50mL去离子水于托盘底部，使土壤保持适当的持水能力。

4周后，收获植物。将植物与土壤分离，用自来水冲洗根系表面粘附的泥土，将植物组织分装于玻璃称量瓶中，置于烘箱内杀青后于80℃下烘至恒重。对烘干后的样品称重后，用优级纯HNO₃于180℃将其消解至溶液澄清。消解液定容至20mL后过0.22μm滤膜，用微波等离子体原子发射光谱仪MP-AES(4210，Agilent Technologies，USA)测定消解液中Cd、Zn和Pb含量。计算单株印度芥菜体内Cd、Zn和Pb积累量及增加百分比。

实施例1

土壤Cd、Zn和Pb含量分别为9.7、204和2275mg kg^-1，按照上述方法，施入菊微小杆菌，不施用氮肥即Ca(NO₃)₂加入量为0N/kg，结果如表1、表2和图1、图2。

表1 配施菊微小杆菌对印度芥菜体内抗副球菌素蛋白表达量的影响

表2 配施菊微小杆菌对印度芥菜提取Cd、Zn和Pb的影响

实施例2

土壤Cd、Zn和Pb含量分别为9.7、204和2275mg kg^-1，在配施菊微小杆菌的同时施用硝态氮Ca(NO₃)₂(200mg N/kg)，其余同实施例1。所得结果如表3、表4和图1、图2，其中以只施用硝态氮Ca(NO₃)₂(200mg N/kg)和实施例1作为对比。

表3 硝态氮-菌剂协同对印度芥菜体内抗副球菌素蛋白表达量的影响

表4 硝态氮肥-菌剂协同对印度芥菜提取Cd、Zn和Pb的影响

实施例3

土壤Cd、Zn和Pb含量分别为9.7、204和2275mg kg^-1，在配施菊微小杆菌的同时施用铵态氮硫酸铵(NH₄)₂SO₄(200mg N/kg)，其余同实施例1。所得结果如表5、表6和图1、图2，其中以只施用铵态氮硫酸铵(200mg N/kg)和实施例1作为对比。

表5 铵态氮-菌剂对印度芥菜体内抗副球菌素蛋白表达量的影响

表6 铵态氮肥-菌剂对印度芥菜提取Cd、Zn和Pb的影响

实施例4

土壤Cd、Zn和Pb含量分别为9.7、204和2275mg kg^-1，在配施菊微小杆菌的同时施用尿素CO(NH₂)₂(200mg N/kg)，其余同实施例1。所得结果如表7、表8和图1、图2，其中以只施用尿素(200mg N/kg)和实施例1作为对比。

表7 尿素-菌剂对印度芥菜体内抗副球菌素蛋白表达量的影响

表8 尿素-菌剂对印度芥菜提取Cd、Zn和Pb的影响

实施例5

土壤Cd、Zn和Pb含量分别为5.1、286.6和1126.4mg kg^-1，其余同实施例2。所得结果如表9。

表9 硝态氮肥-菌剂协同对印度芥菜提取Cd、Zn和Pb的影响

此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种氮肥-菌剂协同强化重金属污染土壤植物修复效率的方法，其特征在于，包括：将印度芥菜种植于配施了硝态氮基肥的Cd、Zn和Pb复合重金属污染土壤中，在印度芥菜生长过程中，向所述Cd、Zn和Pb复合重金属污染土壤中接种菊微小杆菌(Exiguobacteriumindicum)菌液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菊微小杆菌为德国微生物菌种保藏中心保藏号为DSM 28408的菊微小杆菌。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菊微小杆菌(Exiguobacteriumindicum)菌液接种至印度芥菜根部土壤表层深0.4～0.6cm处。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菊微小杆菌(Exiguobacteriumindicum)菌液细胞浓度为1×10⁷～1×10⁸CFU mL^-1。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，每次接种菊微小杆菌(Exiguobacteriumindicum)菌液的体积为20～30mL/50株印度芥菜。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，每周接种一次菊微小杆菌(Exiguobacterium indicum)菌液，共接种4次。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Cd、Zn和Pb复合重金属污染土壤中含水量保持在60％～70％。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，印度芥菜生长周期内控制光周期12h/20～26℃/d，光照强度50～60μmol photons m^-2s^-1。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硝态氮基肥的配施量为150～250mgN/kg土壤。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硝态氮基肥为Ca(NO₃)₂。

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