CN105219650A

CN105219650A - 一种橘绿木霉菌及其应用

Info

Publication number: CN105219650A
Application number: CN201410289107.2A
Authority: CN
Inventors: 干华磊; 吴紫燕; 黄杰锋; 陈娟; 王承芳; 谢俊; 旷文丰; 毛伟力
Original assignee: SHANGHAI WANLIHUA BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI WANLIHUA BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2014-06-24
Filing date: 2014-06-24
Publication date: 2016-01-06
Anticipated expiration: 2034-06-24
Also published as: CN105219650B

Abstract

本发明公开一种橘绿木霉菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC？No.8722。所述橘绿木霉菌株通过自身产生的真菌细胞壁降解酶溶解病原菌细胞壁，并渗透进入其细胞中形成大量的分枝和有性结构，使病原真菌生长受抑制而死亡。本发明提供的橘绿木霉菌株可以高效抑制辣椒猝倒病的病原真菌，减少辣椒猝倒病的发生，替代化学农药用于抑制辣椒猝倒病的同时，还可以起到保护环境的作用。

Description

一种橘绿木霉菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种对辣椒苗期猝倒病具有高拮抗作用的木霉菌。

背景技术

辣椒猝倒病是一种主要危害幼苗的病害，其症状主要为：出苗前的危害可导致烂种、死苗；幼苗出土后危害幼苗茎基部，产生水渍状斑，病部逐渐缢缩呈细线状。后期幼苗倒伏，湿度大时，病部密生白色棉絮状物。该病除危害辣椒茄科蔬菜外，瓜类、莴苣、芹菜、白菜、甘蓝、萝卜、洋葱等蔬菜幼苗均能受害。该病的病原为瓜果腐霉菌Pythiumaphanidermatum(Eds.)Fitzp.，属鞭毛菌亚门真菌，是蔬菜苗期猝倒病的病原菌，该病一直以来在蔬菜育苗过程中经常发生，并对蔬菜的育苗造成较大危害。

为防止该真菌病害，目前通常使用的是化学农药杀菌剂，在中国专利CN01107887.1中披露了一种组分组成(以重量份数计)为：噻枯唑1-20％、恶霉灵1-20％、铜盐1-20％、助剂2-10％的复配农药，同时防治细菌性病原和对由腐霉菌、镰刀菌引起的作物苗期病害，其中其对黄瓜细菌性叶枯病和番茄细菌性斑疹病的防治效果可达85-90％；中国专利CN103109831A中，配制了一种含有吡唑醚菌酯与咪唑菌酮的杀菌组合物，用以防治小麦、棉花、葡萄、烟草、草坪、向日葵、玫瑰、马铃薯和番茄等各种蔬菜的各种霜霉病、晚疫病、疫霉病、猝倒病、黑斑病、斑腐病等，该复配杀菌剂具有明显的增效作用，延缓了要害抗药性的产生，并取得了较好的防治效果。虽然这些药物在一定程度上扩大了药物的使用范围，并增强了药效，降低了药剂使用量，但它们仍属于化学农药，长期使用对环境造成的污染仍然不可忽视，且采用化学农药杀菌剂时各种植物病原菌对化学农药产生耐药性、抗药性，增加了防治的难度，甚至造成防治失败。此外，化学农药因其不具有选择性，对有益的生物也会造成威胁。而且，很多化学农药是不可降解或难于降解的，容易在动植物体内积累而造成污染物的富集。

生物农药是指利用生物活体或其代谢产物对害虫、病原、杂草、线虫、鼠类等有害生物进行防治的一类农药制剂，或者是通过仿生合成具有特异作用的农药制剂，主要包括生物化学农药(信息素、激素、植物调节剂、昆虫生长调节剂)和微生物农药(真菌、细菌、昆虫病毒、原生动物，或经遗传改造的微生物)两个部分。

我国生物农药按照成分和来源可分为微生物活体农药、微生物代谢产物农药、植物源农药、动物源农药四个部分。按照防治对象可分为杀虫剂、杀菌剂、除草剂、杀螨剂、杀鼠剂、植物生长调节剂等。按照利用对象而言一般分为直接利用生物活体和利用源于生物的生理活性物质两大类，前者包括细菌、真菌、线虫、病毒及拮抗微生物等，后者包括农用抗生素、植物生长调节剂、性信息素、摄食抑制剂、保幼激素和源于植物的生理活性物质等。

生物农药与化学农药相比，主要有以下几个方面的有点：(1)选择性强，只对病虫害有作用，一般对人、畜等比较安全；(2)对环境影响小，主要利用了微生物的代谢产物杀虫、防病，未添加生态系统以外的其它物质；(3)生产成本低廉，目前国内生产加工生物农药，主要利用可再生资源。

发明内容

本发明的目的在于提供一种产孢量多、高效防治辣椒猝倒病的木霉菌株，以解决目前防治辣椒猝倒病的化学农药量多且农药会对环境产生影响的问题。

本发明提供的木霉菌株属于橘绿木霉(Trichodermacitrinoviride)菌株，具有防治辣椒猝倒病的特性。该菌株于2014年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCCNo.8722。

橘绿木霉菌株具有以下性质：

本发明橘绿木霉菌株的分生孢子阶段为半知菌门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，木霉属，其有性态是属于子囊菌门子囊菌纲。

菌株培养特性：

本发明橘绿木霉菌株在PDA培养基上黑暗条件下25℃～35℃培养64小时，菌落半径为60～68mm；40℃培养64小时，菌落半径为45mm。在PDA上，大多数菌株的菌落表面产生分生孢子处没有游离的气生菌丝。分生孢子产生方式多变，20℃～25℃时几乎不产生分生孢子，而35℃～40℃时产生大量分生孢子。分生孢子呈黄绿色至深绿色，有时产生黄色色素；20℃时黄色素产量很少，而35℃和40℃时产量很大；分生孢子簇缺乏，产生的分生孢子簇细小，直径小于0.5mm。

本发明的橘绿木霉菌株的液体培养法为，在培养瓶中加入培养液并接种孢子悬浮液，在35℃环境下振荡培养，4天后便可收获大量的孢子。在孢子中添加等体积比的硅藻土抽滤并干燥可长久保存。

菌株微观形态特性：

参照图1～图3，本发明橘绿木霉菌株的分生孢子簇缺乏，即使产生分生孢子簇，也很细小，直径小于0.5mm。分生孢子梗没有可育的延伸结构，分生孢子梗主要产生于气生菌丝上，是一长的轴状结构，至顶均可育。瓶梗单生于主轴上，在第一个侧向短分支前面，距离大约为45μm；瓶梗在侧向分枝的顶端行呈漩涡状排列；主轴的宽度为2.0～3.2μm，最宽处的宽度为2.5～3.5μm，基部宽度为1.5～2.5μm，长度与宽度的比例为1.5～3.1，母细胞的宽度为2.0～3.2μm。瓶梗多数为间生。分生孢子绿色，长方形至椭圆形，大小为3.0～3.5×2.0～2.8μm，长度与宽度比例为1.4～2.0，光滑。有的菌株不产生厚垣孢子，有的则产生大量的厚垣孢子，端生或间生，球形至亚球形，直径为4.5～9.2μm。没有共无性阶段。

系统发育学鉴定：

通过PCR(PolymeraseChainReaction，多聚酶链式反应)对本发明橘绿木霉菌株进行系统发育学的鉴定，确定橘绿木霉菌株的进化关系。

将引物ITS4和ITS5扩增到ITS1-5.8S-ITS2区序列得到的序列段，通过NCBIGenBank建立的DNA序列数据库中数据进行比对，该序列段与橘绿木霉的相似度达到100％。

ITS序列如下：

AATCTGTTGCCTCGGCGGGATTCTCTGCCCCGGGCGCGTCGCAGCCCCGGATCCCATGGCGCCCGCCGGAGGACCAACTCAAACTCTTTTTTCTCTCCGTCGCGGCCTACGTCGCGGCTCTGTTTTATTTTTGCTCTGAGCCTTTCTCGGCGACCCTAGCGGGCGTCTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCCTCACCGGGCCGCCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGGCC

提供采用引物Ef728和Tef1αR扩增Tef1α序列得到的序列段，通过NCBIGenBank建立的DNA序列数据库中数据进行比对，Tef1α序列与棘孢木霉的相似度达到100％。

Tef1α序列如下：

ATGAATTTTGATATTTTTCCTCCCATCCGAAGTCATTGTGCACGACAATTCACTCNAATTTTCATGCCAAATTTCTTGGAATGGTTGCCACCCCGCTTTCTCTTCCTACCCCTCCTTTGGCGCACACGCAAAAATTTTTTGCTGCCTTGGATGATTTAAGTGGGGCATTGACCGCAACTCCGCCACTACCCTCGACTTACAATCTGTGTGACCATCGGTGTCAGCATTGTGATTCATCTTGCTCATTTTTGTTTCAATCTCGCTAACCATGCTTCGCTTTATAGGAAGCCGCCGAACT

重寄生性

木霉菌对病原菌主要通过拮抗作用、竞争作用、重寄生作用、诱导抗性和促生作用来防治猝倒病的发生。重寄生性是木霉菌对病原菌的主要作用方式，通过在橘绿木霉菌株自身产生的真菌细胞壁降解酶，如几丁质酶、葡聚糖酶等，溶解病原菌细胞壁并渗透进入其细胞中形成大量的分枝和有性结构，使病原真菌生长受抑制而死亡。

防治辣椒椒猝倒病的制剂

本发明提供的用于防治辣椒猝倒病的制剂，所述制剂中包括上述的橘绿木霉菌。

所述制剂的剂型可为泡腾粒剂、乳油、水分散粉剂、悬乳剂、微乳剂、可溶粉剂、可湿性粉剂、油剂中的任意一种。

优选地，所述制剂中还可以包括助剂。

所述的助剂可以选自填料、润湿剂、分散剂、乳化剂、助悬剂、增稠剂、固着剂中的一种或多种。

填料可选自如高岭土、硅藻土、滑石粉或白陶土中的一种或几种。

润湿剂又称渗透剂，所述润湿剂可选用丁基萘磺酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基苯磺酸钙、苯乙烯基苯基聚氧乙烯醚、木质素磺酸盐、异丙基萘磺酸钠、烷基芳基磺酸钠等中的一种或多种。

分散剂可选用磷酸酯、磺酸盐类、烷基萘磺酸盐缩聚物、羧酸盐高分子、聚羧酸盐高分子改性树脂、烷基硫酸盐、改性烷基磺酸盐、烷基萘磺酸缩聚物钠盐、萘磺酸盐(缩聚物)类、萘磺酸盐甲醛缩合物、烷基酚聚氧乙烯醚、甲醛缩合物磺酸盐、木质素磺酸盐、马来酸-丙烯酸共聚物钠盐、烷基磺基琥珀酸盐等中的一种或是多种。

乳化剂可选用十二烷基苯磺酸钙、三苯乙基苯酚聚氧乙烯醚、烷基酚甲醛树脂聚氧乙烯醚、脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚、蓖麻油聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、辛基酚聚氧乙烯醚、脂肪醇聚氧乙烯聚氧丙烯醚、脂肪醇聚氧乙烯醚改性物、脂肪胺聚氧乙烯醚、烷基芳基聚氧乙烯聚氧丙烯醚、油酸聚氧乙烯醚、苯乙基苯酚聚氧乙烯醚、壬基酚磷酸酯等中的一种或多种。

助悬剂可选用磷酸酯、磺酸盐类、烷基萘磺酸盐缩聚物、羧酸盐高分子、聚羧酸盐高分子改性树脂、烷基硫酸盐、改性烷基磺酸盐、烷基萘磺酸缩聚物钠盐、萘磺酸盐(缩聚物)类、聚羧酸盐高分子分散剂、多苯乙烯苯醚磷酸酯分散剂、萘磺酸盐甲醛缩合物、烷基酚聚氧乙烯醚甲醛缩合物磺酸盐、木质素磺酸盐、白炭黑、硅酸镁铝等中的一种或多种。

增稠剂可选用黄原胶、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、阿拉伯树胶、明胶、环氧大豆油等中的一种或多种。

固着剂可选用如聚乙烯醇、明胶或淀粉中的一种或几种。

本发明提供的橘绿木霉菌株可以高效抑制辣椒猝倒病的病原真菌，减少辣椒猝倒病的发生，替代化学农药用于抑制辣椒猝倒病的同时，还可以起到保护环境的作用。

附图说明

图1是本发明提供的橘绿木霉菌株在PDA培养基上25℃黑暗7d的菌落形态图。

图2是本发明提供的橘绿木霉菌株的分生孢子梗、瓶梗直、安瓿形图。

图3是本发明提供的橘绿木霉菌株的分生孢子。

具体实施方式

通过借助以下实施例将更详细说明本发明。以下实施例仅是说明性的，应该明白，本发明并不受这些实施例的限制。

菌株筛选

称取1g土样于10ml水中，在涡旋仪上混匀后进行梯度稀释至10^-5，取1ml加入到木霉菌选择性培养基TSM培养基的表面，均匀涂布，该培养基在25℃静置培养5-7天。根据平皿上筛选到的真菌菌落的形态、颜色、大小挑选出木霉菌菌落并转移至PDA培养基，进行纯化、培养及进一步鉴定。

TSM培养基配方(单位为g/l)：MgSO₄·7H₂O0.2g、KH₂PO₄0.9g、KCl0.15g、NH₄NO₃1.0g、葡萄糖3g、氯霉素0.25g、甲基磺0.3g、五氯硝基苯0.2g，玫瑰红0.15g、琼脂20g。

菌株培养

在每250mL三角瓶中加100mL的PDB培养液，每瓶内接种孢子悬浮液1mL。在32℃温度下、150r/min振荡下培养菌株，第5天便可收获大量的橘绿木霉菌株孢子。在孢子中添加等体积的硅藻土，抽滤粉碎干燥备用。图1和图2是橘绿木霉菌株的菌落形态图和分生孢子梗、瓶梗直、安瓿形图。

PDB培养基配方(单位为g/l)：马铃薯200g、葡萄糖20g、蒸馏水1000mL，自然pH。

辣椒猝倒病的大田防治：

将橘绿木霉菌株制剂、百菌清、多菌灵和代森锰锌对辣椒猝倒病进行防治，试验地选择为上年发病较严重的辣椒种植地，实验期间共处理3次，第一次为播种前拌土处理；第二次为出芽后1～2天灌根处理；第三次为叶片生长完成后喷洒叶片处理。

对病害严重度分级调查。对每小区采用随机取样，每点调查100株。采用定株调查法在每小区调查中间2垄，从每垄的第3株开始调查，统计每个处理的发病幼苗数目，并计算防治效果，经过统计得到以下表1数据：

表1各处理对辣椒猝倒病防治效果表

处理方式	发病数	防治效果
			百菌清	10	82％
橘绿木霉菌株	12	79.3％
			多菌灵	9	84.5％
代森锰锌	14	75.9％
			空白对照	58	--

从表1可以看出，空白对照处理与全部药物处理之间存在显著性差异。其中橘绿木霉菌制剂和各化学药物处理的防治效果无显著性差异，橘绿木霉菌制剂可以代替化学农药用于辣椒猝倒病的防治中。

辣椒猝倒病平皿对峙试验：

对橘绿木霉菌与辣椒猝倒病进行平板对峙试验，以测试橘绿木霉菌对辣椒猝倒病的抑菌效果。图3是橘绿木霉菌株的分生孢子。

将橘绿木霉和病菌菌株用打孔器打成5mm²行的菌丝饼，分别接入9cm的PDA培养基的两端，以只接种病原菌、不接种橘绿木霉菌为对照，并测量菌落直径计算抑菌率。实验结束后，计算得出对辣椒猝倒病的抑菌率为95.63％。

根据以上试验可以证明，以本发明所提供的橘绿木霉菌株可以有效抑制辣椒猝倒病的发生，可以作为目前常用化学农药农药的替代物，对环境不会造成影响。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.一种橘绿木霉菌(Trichodermacitrinoviride)，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNo.8722，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.根据权利要求1所述的橘绿木霉菌，其特征在于，所述橘绿木霉菌能够代谢得到真菌细胞壁降解酶。

3.根据权利要求2所述的橘绿木霉菌，其特征在于，所述真菌细胞壁降解酶包括几丁质酶、葡聚糖酶中的一种或两种。

4.一种如权利要求1所述的橘绿木霉菌的应用，其特征在于，用于防治辣椒猝倒病。

5.一种防治辣椒猝倒病的制剂，其特征在于，所述的制剂中包含有如权利要求1所述的橘绿木霉菌。