CN113714272A

CN113714272A - 一种土壤层挥发性有机物多级接种微生物调控方法

Info

Publication number: CN113714272A
Application number: CN202010963522.7A
Authority: CN
Inventors: 王雷; 席北斗; 刘健聪; 李翔; 徐剑锋; 王金生; 闫政; 李彤彤; 杨茹月; 王杨杨; 刘慧�
Original assignee: Chinese Research Academy of Environmental Sciences
Current assignee: Chinese Research Academy of Environmental Sciences
Priority date: 2020-05-24
Filing date: 2020-09-14
Publication date: 2021-11-30
Anticipated expiration: 2040-09-14
Also published as: CN113714272B

Abstract

本发明公开了一种土壤层挥发性有机物多级接种微生物调控方法，所述方法包括以下步骤：步骤1，向挥发性有机物污染土壤中施加菌剂I；步骤2，在步骤1处理后的土壤上种植修复植物，施加菌剂II。本发明公开的土壤层挥发性有机物多级接种微生物调控方法，操作简单，成本低廉，不会对土壤造成二次污染，能够在较短时间内将土壤中挥发性有机物的含量降低至较低水平，降解率高。

Description

一种土壤层挥发性有机物多级接种微生物调控方法

技术领域

本发明涉及土壤修复技术领域，具体涉及一种土壤层挥发性有机物多级接种微生物调控方法。

背景技术

土壤是人类社会生产活动的重要物质基础，是不可缺少、难以再生的自然资源。随着经济发展与城市化的加速，工矿企业导致的场地污染十分严重，由于产业结构与城市布局的变化与调整，化工、冶金等污染企业的搬迁、倒闭，导致污染场地不断产生。土壤持久性有机污染物污染问题已成为我国典型的环境问题，主要因为持久性有机污染物具有毒性、持久性、生物蓄积性和长距离迁移性，影响着农产品品质，甚至通过食物链对人体健康产生威胁。

其中，挥发性有机污染物通过直接施用、污水灌溉、大气沉降等多种途径进入土壤，并能够重新挥发至大气并长距离迁移。当挥发性有机污染物挥发至大气后，不仅造成全球性的大气污染、加大修复难度，而且导致人类直接暴露在污染大气中，严重威胁人体健康。因此，对挥发性有机物污染土壤的修复成为解决目前环境问题的重要方向。

现有技术中，针对土壤有机物污染的治理方法主要有还原法、臭氧氧化法、动植物修复法、抽真空法、淋洗法、固化法、热脱附法、微波法等。这些方法虽然能在一定程度上对挥发性有机物污染土壤进行修复，但总体存在修复效率低、修复成本高、易破坏土壤结构等问题。

因此，有必要提供一种修复效率高、易于实现的土壤层挥发性有机物去除方法。

发明内容

为了克服上述问题，本发明人进行了锐意研究，结果发现：在挥发性有机物污染土壤中，通过施加菌剂I-种植植物-施加菌剂II的方式，对污染土壤进行原位多级接种微生物修复，能够快速、高效的去除土壤中的挥发性有机物，减少污染物向大气中的挥发及随植物进入食物链的风险，且不会对土壤结构进行破坏，从而完成了本发明。

具体来说，本发明的目的在于提供一种土壤层挥发性有机物多级接种微生物调控方法，其中，所述方法包括以下步骤：

步骤1，向挥发性有机物污染土壤中施加菌剂I；

步骤2，在步骤1处理后的土壤上种植修复植物，施加菌剂II。

其中，步骤1中，所述菌剂I包括地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和木霉菌。

其中，所述菌剂I按照包括以下步骤的方法制备：

步骤1-1，将不同菌进行活化、扩大培养；

步骤1-2，制备不同菌的菌悬液；

步骤1-3，将菌悬液进行培养，制备得到菌剂I。

其中，所述菌剂I与生物炭共同施加，

所述生物炭为富铁生物炭，优选为由红壤地区生长的富铁植物高温热解得到。

其中，基于1重量份的生物炭，加入15～25体积份的菌剂I，二者混合后共同培养。

其中，步骤II中，所述修复植物选自水稻、黑麦草、玉米、紫花苜蓿和高羊茅草中的一种或多种。

其中，所述修复植物的种植密度为1500～3500株每平方米。

其中，在种植修复植物后5～10天，施加菌剂II。

其中，所述菌剂II包括黄孢原毛平革菌和幼套球囊霉。

其中，所述菌剂II以孢子悬浮液的形式施加。

本发明所具有的有益效果包括：

(1)本发明提供的土壤层挥发性有机物多级接种微生物调控方法，操作简单，成本低廉，不会对土壤造成二次污染，安全性高；

(2)本发明提供的土壤层挥发性有机物多级接种微生物调控方法，可以有效减少挥发性有机物由土壤向大气中的挥发，有效进行原位修复；

(3)本发明提供的土壤层挥发性有机物多级接种微生物调控方法，能够在较短时间内将土壤中挥发性有机物的含量降低至较低水平，降解率高。

具体实施方式

下面通过优选实施方式和实施例对本发明进一步详细说明。通过这些说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。

在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

本发明提供了一种土壤层挥发性有机物多级接种微生物调控方法，所述方法包括以下步骤：

步骤1，向挥发性有机物污染土壤中施加菌剂I；

步骤2，在步骤1处理后的土壤上种植修复植物，施加菌剂II。

在本发明中，所述挥发性有机物优可以为氯苯、挥发性卤代烃等，优选为氯苯，如二氯苯、三氯苯或六氯苯。

以下详细描述本发明所述土壤层挥发性有机物多级接种微生物调控方法：

步骤1，向挥发性有机物污染土壤中施加菌剂I。

根据本发明一种优选的实施方式，所述菌剂I包括地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和木霉菌。

在进一步优选的实施方式中，所述菌剂I为菌悬液，

其按照包括以下步骤的方法制备：

步骤1-1，将不同菌进行活化、扩大培养。

在本发明中，所述地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和木霉菌均为市售可得的菌株。

采用常规方法将菌株活化后进行扩大培养，其中，所述地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌分别采用LB培养基培养，木霉菌采用PDA培养基培养。

所述LB培养基和PDA培养基采用常见的配方，如：LB培养基的成分为：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，去离子水定容至1000mL，pH为7.2；PDA培养基的成分为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，去离子水定容至1000mL，pH为7.2。

步骤1-2，制备不同菌的菌悬液。

将上述不同培养基在恒温条件(25～30℃)下培养到稳定期，收集菌体，采用灭菌处理后的NaCl溶液洗涤菌体并重悬，获得不同菌的菌悬液。

步骤1-3，将菌悬液进行培养，制备得到菌剂I。

根据本发明一种优选的实施方式，将地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和木霉菌按菌悬液体积比为(1～3)：(1.5～3.5)：(1～3)：10混合，优选按菌悬液体积比为(2～3)：(2～3.5)：(1.5～3)：10混合，

然后培养，得到菌剂I。

其中，优选所述培养在如下成分的培养基中进行：

(NH₄)₂SO₄ 3.5g，KH₂PO₄ 0.6g，MnSO₄·H₂O 0.16g，Na₂HPO₄ 0.5g，FeCl₃ 0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.4g，ZnSO₄ 0.15g，CoCl₂ 0.2g，MgSO₄·H₂O 0.3g，用去离子水定容至1000mL，调pH至7.2。

在进一步优选的实施方式中，所述菌剂I中活性菌的数量不低于2.0×10⁷cfu/mL，优选不低于2.5×10⁷cfu/mL，

且OD600在0.8～1.0。

根据本发明一种优选的实施方式，所述菌剂I与生物炭共同施加，优选将菌剂I附着在生物炭上施加。

本发明人研究发现，选取生物炭作为微生物载体，能为微生物附着提供空间，有效提高微生物的活性和降解土壤有机物的能力。

在进一步优选的实施方式中，所述生物炭为富铁生物炭，优选为由红壤地区生长的富铁植物高温热解得到。

在更进一步优选的实施方式中，所述生物炭按照包括以下步骤的方法制备得到：

步骤i，栽培富铁植物。

其中，所述富铁植物优选选自水稻、苎麻、鸢尾、美人蕉、油菜和商陆中的一种或多种。

优选地，富铁植物为美人蕉和/或商陆，如美人蕉。

步骤ii，收割富铁植物，炭化。

其中，优选收割富铁植物后，用去离子水清洗，于稀盐酸中浸泡，再将富铁植物风干，使得植物含水量16％～18％。，然后切碎，优选在85～95℃下干燥3～4h。

根据本发明一种优选的实施方式，在马弗炉内炭化，初始炉温为200摄氏度，然后以4～8℃/min的速率程序升温至650～750℃，保温60～80min，然后自然冷却至室温，粉碎备用。

本发明人研究发现，采用上述条件制备的富铁生物炭，有利于提高生物炭修复挥发性有机物污染土壤的效率。

根据本发明一种优选的实施方式，基于1重量份的生物炭，加入15～25体积份的菌剂I，置于30℃、120r/min的振荡器上振荡培养24h。

优选地，基于1重量份的生物炭，加入18～22体积份的菌剂I。

其中，1重量份为1g，1体积份为1mL。

在本发明中，优选可将振荡培养后的生物炭-菌剂I复合物过滤，然后用无菌水充分清洗后进行真空冷冻干燥处理。

在进一步优选的实施方式中，将制备的生物炭-菌剂I复合物按照土壤干重的1％～3％的添加量添加至挥发性有机物污染的土壤中。

步骤2，在步骤1处理后的土壤上种植修复植物，施加菌剂II。

根据本发明一种优选的实施方式，所述修复植物选自水稻、黑麦草、玉米、紫花苜蓿和高羊茅草中的一种或多种，

优选选自黑麦草、紫花苜蓿和高羊茅草中的一种或多种，如黑麦草。

在进一步优选的实施方式中，所述修复植物的种植密度为1500～3500株每平方米，优选为1800～3000株每平方米。

根据本发明一种优选的实施方式，在种植修复植物后5～10天，施加菌剂II。

在进一步优选的实施方式中，所述菌剂II的施加位置为距离土壤表层12～18cm的位置。

根据本发明一种优选的实施方式，所述菌剂II包括黄孢原毛平革菌和幼套球囊霉。

在进一步优选的实施方式中，所述菌剂II为孢子悬浮液。

其中，所述孢子悬浮液采用现有技术中常用的方法制备得到，黄孢原毛平革菌和幼套球囊霉均可购买得到。

在更进一步优选的实施方式中，所述黄孢原毛平革菌孢子悬浮液的浓度为1.5×10⁶～2.5×10⁶个/mL，优选为1.8×10⁶～2.2×10⁶个/mL；

所述幼套球囊霉的孢子悬浮液的浓度为2.8×10⁶～4.2×10⁶个/mL，优选为3.2×10⁶～3.8×10⁶个/mL。

优选地，所述黄孢原毛平革菌孢子悬浮液和幼套球囊霉的孢子悬浮液的体积比为(2～6)：8，优选为(3～5)：8。

本发明人研究发现，将上述组成的菌剂II施加至土壤中适当位置，有利于促进修复植物的生长，且能提高土壤中挥发性有机物的去除效率。

根据本发明一种优选的实施方式，所述菌剂II的施加量为每千克土壤(干重)接种150～300mL菌剂II，优选每千克土壤(干重)接种180～250mL菌剂II。

优选地，菌剂II分1～2次接种。

本发明人研究发现，按照上述方式施加菌剂II，能够有效提升土壤中挥发性有机物的去除率。

优选地，对种植的修复植物(如：黑麦草)进行正常的田间管理，包括浇水、施肥、除草。经过50～80天的生长，进行收割。

实施例

以下通过具体实例进一步描述本发明，不过这些实例仅仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1

(1)污染土壤的制备：

选取某地无污染的农田黑土作为供试土壤，采样深度为1～20cm，土壤经自然风化，过磨细，过4mm筛，灭菌备用；

将对二氯苯溶于丙酮，拌入供试土壤中，制得对二氯苯质量浓度为1.947μg/g的污染土壤。

(2)按照下述步骤对土壤进行处理：

菌剂I的获得：

购得市售地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和木霉菌，活化后，采用LB培养基(组成为：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，去离子水定容至1000mL，pH为7.2)扩大培养地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌；采用PDA培养基(组成为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，去离子水定容至1000mL，pH为7.2)扩大培养木霉菌；

将上述培养基在恒温条件(30℃)下下培养到稳定期，收集菌体，采用灭菌处理后的NaCl溶液洗涤菌体并重悬，获得不同菌的菌悬液；

将地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和木霉菌按菌悬液体积比为2.5:3:2:10混合，在基础培养基(组成为：(NH₄)₂SO₄ 3.5g，KH₂PO₄ 0.6g，MnSO₄·H₂O 0.16g，Na₂HPO₄ 0.5g，FeCl₃ 0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.4g，ZnSO₄ 0.15g，CoCl₂ 0.2g，MgSO₄·H₂O 0.3g，用去离子水定容至1000mL，调pH至7.2)中培养至活性菌的数量不低于2.0×10⁷cfu/mL，OD600在0.8～1.0，获得菌剂I。

富铁生物炭的制备：

在红壤中种植美人蕉，将栽培得到的美人蕉整株拔出，使用去离子水洗净，在0.01M稀盐酸中浸泡1小时，风干至含水量为16％，切碎，在90℃下干燥3.5h；

在马弗炉中，初始炉温为200摄氏度，然后以6℃/min的速率程序升温至690℃，保温65min，然后自然冷却至室温，粉碎成粒径小于2.0mm的颗粒备用。

将富铁生物炭和菌剂I按1:20(m/V)的比例混合，置于30℃、120r/min的振荡器上振荡培养24h；过滤，用无菌水充分清洗后进行真空冷冻干燥，获得生物炭-菌剂I复合物，按照土壤干重的1％添加量加入污染土壤中。

然后在土壤中按照2000株每平方米的密度种植黑麦草，种植8天后，在距离土壤表层15cm的位置施加菌剂II，

购得黄孢原毛平革菌和幼套球囊霉，活化后制备孢子悬浮液，使得黄孢原毛平革菌孢子悬浮液的浓度为2.0×10⁶个/mL，幼套球囊霉的孢子悬浮液的浓度为3.5×10⁶个/mL，将二者按体积比为4:8混合，获得菌剂II。每千克土壤(干重)接种200mL菌剂II，分2次接种。

黑麦草种植80天后，收割。

采用气象色谱仪测定土壤中对二氯苯的含量，结果显示：经过修复的土壤，其中对二氯苯的含量下降至0.053μg/g。

实施例2

(1)污染土壤的制备：

将1,2,4-三氯苯溶于丙酮，拌入供试土壤中，制得1,2,4-三氯苯质量浓度为50.49μg/g的污染土壤。

(2)按照下述步骤对土壤进行处理：

菌剂I的获得：

将地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和木霉菌按菌悬液体积比为3:2.5:2.5:10混合，在基础培养基(组成为：(NH₄)₂SO₄ 3.5g，KH₂PO₄ 0.6g，MnSO₄·H₂O 0.16g，Na₂HPO₄ 0.5g，FeCl₃ 0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.4g，ZnSO₄ 0.15g，CoCl₂ 0.2g，MgSO₄·H₂O 0.3g，用去离子水定容至1000mL，调pH至7.2)中培养至活性菌的数量不低于2.5×10⁷cfu/mL，OD600在0.8～1.0，获得菌剂I。

富铁生物炭的制备：

在红壤中种植美人蕉，将栽培得到的美人蕉整株拔出，使用去离子水洗净，在0.01M稀盐酸中浸泡1小时，风干至含水量为16％，切碎，在85℃下干燥4h；

在马弗炉中，初始炉温为200摄氏度，然后以6℃/min的速率程序升温至700℃，保温80min，然后自然冷却至室温，粉碎成粒径小于2.0mm的颗粒备用。

将富铁生物炭和菌剂I按1:22(m/V)的比例混合，置于30℃、120r/min的振荡器上振荡培养24h；过滤，用无菌水充分清洗后进行真空冷冻干燥，获得生物炭-菌剂I复合物，按照土壤干重的2％添加量加入污染土壤中。

然后在土壤中按照2500株每平方米的密度种植黑麦草，种植7天后，在距离土壤表层16cm的位置施加菌剂II，

购得黄孢原毛平革菌和幼套球囊霉，活化后制备孢子悬浮液，使得黄孢原毛平革菌孢子悬浮液的浓度为1.9×10⁶个/mL，幼套球囊霉的孢子悬浮液的浓度为3.4×10⁶个/mL，将二者按体积比为3:8混合，获得菌剂II。每千克土壤(干重)接种250mL菌剂II，分2次接种。

黑麦草种植70天后，收割。

采用气象色谱仪测定土壤中对1,2,4-三氯苯的含量，结果显示：经过修复的土壤，其中对1,2,4-三氯苯的含量下降至0.097μg/g。

由上述可知，采用本发明所述的土壤层挥发性有机物多级接种微生物调控方法修复污染土壤，能够显著提高土壤中挥发性有机物的降解率，且所需修复时间较短。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。

Claims

1.一种土壤层挥发性有机物多级接种微生物调控方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1，向挥发性有机物污染土壤中施加菌剂I；

步骤2，在步骤1处理后的土壤上种植修复植物，施加菌剂II。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，所述菌剂I包括地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和木霉菌。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述菌剂I按照包括以下步骤的方法制备：

步骤1-1，将不同菌进行活化、扩大培养；

步骤1-2，制备不同菌的菌悬液；

步骤1-3，将菌悬液进行培养，制备得到菌剂I。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌剂I与生物炭共同施加，

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，基于1重量份的生物炭，加入15～25体积份的菌剂I，二者混合后共同培养。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤II中，所述修复植物选自水稻、黑麦草、玉米、紫花苜蓿和高羊茅草中的一种或多种。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述修复植物的种植密度为1500～3500株每平方米。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在种植修复植物后5～10天，施加菌剂II。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述菌剂II包括黄孢原毛平革菌和幼套球囊霉。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述菌剂II以孢子悬浮液的形式施加。